estudio de los errores innatos del metabolismo. del …enlacesasociados.com › memorias ›...
TRANSCRIPT
Luis Alejandro Barrera Ph.D.Director Instituto Errores Innatos del Metabolismo
Universidad Javeriana. Bogotá
ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL ESTUDIO DE LOS ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO. Del DiagnMETABOLISMO. Del Diagnóóstico a las alternativas stico a las alternativas
terapeterapeúúticasticas
ServicioServicioDocenciaDocencia
InvestigaciInvestigacióónn
•Construcción Vectores Para TG.
•Terapia de Reemplazo Enzimatico.
•Estudio Mutaciones EnfemedadesLisosomales
1111AcidemiaAcidemia cadena mediacadena media
55221122AcidemiaAcidemia PropiPropióónicanica
1111AcidemiaAcidemia PiroglutPiroglutáámicamica
1111AcidemiaAcidemia MetilmalMetilmalóónicanica
332211AcidemiaAcidemia IsovalIsovalééricarica
1111AcidemiaAcidemia IsobutIsobutííricarica
1111AcidemiaAcidemia GlutGlutááricarica IIII
1111AcidemiaAcidemia GlutGlutááricarica II
1111AcidemiaAcidemia 33--OHOH--3ME3ME--glutglutááricarica
TOTAL TOTAL DIAGNOSDIAGNOSTICADOSTICADOS
De 1995 De 1995 a 2002a 2002
De 1992 De 1992 a 1995a 1995
De 1987 De 1987 a 1992a 1992
TRASTORNOS TRASTORNOS IDENTIFICADOSIDENTIFICADOS
Acidemias Organicas
46 8
5
12
36
met
ilmal
oni
co
tiros
inem
ia
isov
aler
ica
prop
ioni
ca
lact
ica
cicl
o de
Kreb
s
otra
s
Total 42
Otras Otras AcidemiasAcidemias
11CicloCiclo de la urea de la urea
11AcilAcil CoACoA deshidrogenasadeshidrogenasa
11succinilsuccinil CoACoA transferasatransferasa
11AcetoacilAcetoacil CoACoA tiolasatiolasa
22GlutaricasGlutaricas
113 3 metilcrotonilglicinametilcrotonilglicina
3333CistinuriaCistinuria1010442244FenilcetonuriaFenilcetonuria2222CannavanCannavan11RefsumRefsum
10105555AdrenoleucodistrofiaAdrenoleucodistrofia
1111AciduriaAciduria 4 OH 4 OH ButButííricarica
3333Acidosis LAcidosis Láácticactica
221111Def. Beta Def. Beta cetotiolasacetotiolasa
55113311HomocistinuriaHomocistinuria
332211HiperglicemiaHiperglicemia No No cetcetóósicasica
2222HiperfenilalaninemiaHiperfenilalaninemia
AMINOACIDOPATIAS
442222GlicogenGlicogenóósissisTipo ITipo I
2222MCardleMCardle
331122PompePompe
4444GalactosemiaGalactosemia
442222FructosuriaFructosuria
DESORDENES CARBOHIDRATOS
771166LeucodistrofiaLeucodistrofiaMetacromMetacromááticatica
331122LeshLesh-- NyhanNyhan
2222KrabbeKrabbe
36363636GaucherGaucher
332211TayTay SachsSachs
NEURODEGENERATIVAS
SINDROME DE SINDROME DE MORQUIO:MPSMORQUIO:MPS IVAIVA
•• DDeficiencia eficiencia galactosaminagalactosamina--66--sulfato sulfato sulfatasasulfatasa(GALANS)(GALANS) ..
•• protusiprotusióónn del del esternonesternon, , cuello corto, baja cuello corto, baja estatura, estatura, hipoplasiahipoplasiaodontoideaodontoidea, , cardiopatcardiopatíía, a, coxacoxa valga, valga, genugenu valgumvalgum
INTRODUCCIONINTRODUCCION
•• HHerenciaerencia :: autosautosóómicamicarecesiva.recesiva.
•• NN--acetilgalactosaminaacetilgalactosamina--66--sulfatasasulfatasa (IVA)(IVA)::16q24.3.16q24.3.
•• 7272 mutaciones mutaciones puntuales (puntuales (IVAIVA)), , 3 en 3 en pacientepacientes cs colombianosolombianos. . (F69V/2, S162F/5, (F69V/2, S162F/5, G301C/9).G301C/9).
•• 50 de las 72 (20.8%) 50 de las 72 (20.8%) TransiciTransicióón (Cn (C------G)G)
MATERIALES Y METODOS:MATERIALES Y METODOS:POBLACIONES DE ESTUDIOPOBLACIONES DE ESTUDIOSABOYA
PAUNA
VIEJO CALDAS
MEDELLIN
DIAGNOSTICO
•Estudios moleculares:
PCRs , PCRs largos
•Fragmentos 14 Exones
F1------ Exon 1------------- 200 pb
F2------ Exon 2, 3, 4------- 2.0 kb
F3-1--- Exon 5,6,7,8------- 2.7 kb
F3-2--- Exon 9-------------- 3.0 kb
F4------ Exon 10,11,12 ---- 5.0 kb
F5------ Exon 13, 14-------- 3.7 kb
R386C/?SeveroM16
R386C/R386CSeveroF15
A75G/A75GSeveroM14
A75G/A75GSeveroF13
G301C/G301CSeveroF12
G301C/G301CSeveroM11
S162F/?SeveroF10
G301C/?SeveroM9
S162F/S162FSeveroM8
S162F/S162FSeveroM7
G301C/G301CSeveroM6
G301C/G301CSeveroF5
F69V/?SeveroM4
G301C/G301CSeveroF3
G301C/G301CSeveroM2
G301C/G301CSeveroM1
GenotipoFenotipoGéner
oPaciente
GenotipoGenotipo de de loslos pacientespacientes colombianoscolombianos con MPS IVAcon MPS IVA
Pares de pacientes con fondo gris son hermanos
0.1540.154??
0.1150.115R386CR386C
0.0380.038F69V/F69V/
0.0770.077A75GA75G
0.1150.115S162FS162F
0.5000.500G301CG301C
FrecuenciaFrecuenciaMutacionMutacion
FrecuenciaFrecuencia de de laslas mutacionesmutaciones
Kato et al, 1997 Human Genetics
Tomatsu et al, 2004 Human Genetics
GAUCHER TIPO 1GAUCHER TIPO 1
Inicialmente, el paciente Inicialmente, el paciente presenta un severo presenta un severo envolvimiento hepenvolvimiento hepáático y tico y esplespléénico. Ilustracinico. Ilustracióón:paciente n:paciente postesplenectomizado. postesplenectomizado. El hEl híígado ocupa toda la gado ocupa toda la cavidad abdominal.cavidad abdominal.Desarrollo de brazos en forma Desarrollo de brazos en forma de arco, debido al compromiso de arco, debido al compromiso óóseo.seo.Los signos de enfermedad Los signos de enfermedad progresiva rprogresiva ráápida son mas pida son mas comcomúúnmente observados en nmente observados en niniñños.os.
GAUCHER TIPO 2GAUCHER TIPO 2
VisceromegaliaVisceromegaliaEstrabismoEstrabismoPulgares corticalesPulgares corticalesRetroflexionRetroflexion del cuellodel cuelloCaquexiaCaquexiaFalla para medrar.Falla para medrar.
GAUCHER TIPO 3GAUCHER TIPO 3
PresentaciPresentacióón tn tíípica de pica de manifestaciones severas a manifestaciones severas a temprana edad.temprana edad.Agrandamiento visceral Agrandamiento visceral masivo.masivo.Desarrollo progresivo Desarrollo progresivo retardado.retardado.
NOMENCLATURA PARA ALELOS COMUNES NOMENCLATURA PARA ALELOS COMUNES EN ENFERMEDAD DE GAUCHEREN ENFERMEDAD DE GAUCHER
cDNAcDNANomenclaturaNomenclatura
1226G1226G84GG84GG1448C1448CIVS2IVS21297T1297T1604160406990699
AminoacidoAminoacidoCambio/ResultadoCambio/Resultado
N370SN370SFrameshiftFrameshiftL444PL444PDeleciDelecióónn exonexon 22V394LV394LR463CR463CR496HR496H
EtapasEtapas
DeterminarDeterminar la prevalencia de la prevalencia de laslas mutacionesmutaciones masmasfrecuentementefrecuentemente encontradasencontradas en en otrasotraspoblacionespoblaciones (N370S, L444P, 84GG e IVS2+, (N370S, L444P, 84GG e IVS2+, V394L, D409H). Pronto Gaucher Kit.V394L, D409H). Pronto Gaucher Kit.DeterminarDeterminar la prevalencia de la prevalencia de laslas mutacionesmutacionesmasmas comunmentecomunmente halladashalladas en la en la poblacipoblacióónnEspaEspaññolaola. (G377S, T134P y 1451delAC).. (G377S, T134P y 1451delAC).DeterminarDeterminar la la existenciaexistencia de de nuevasnuevas mutacionesmutacionesusandousando SSCP y SSCP y secuenciacisecuenciacióónn..HacerHacer laslas correlacionescorrelaciones genotipogenotipo--fenotipofenotipo
Anormalidades Anormalidades exonexon 66
Gen Gen GBAGBA y Sus Mutaciones y Sus Mutaciones
Mutaciones causantes de la EGCerca de 200 mutaciones hasta ahora reportadas en el gen GBA
85% Mutaciones puntuales
15% Inserciones, Deleciones y Alelos Complejos
N370S = 5841A-GL444P = 6433T-C D309H = 5957G-C
84insGGRecNciI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
I II III IV V VI VII VIII IX X
5’ 3’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
I II III IV V VI VII VIII IX X
5’ 3’
7 kb 16 Kb 5 Kb
5’ 3’GBAGBA GBAP GBAP 1q21
Resultados Resultados
Frecuencia de Mutaciones en Frecuencia de Mutaciones en el gen el gen GBAGBA en 26 pacientes en 26 pacientes
ColombianosColombianos
1,00Total
0,06Sin identificar
0,02898 del G
0,02G195W
0,04E236K
0,04Y313H
0,06D380H
0,06K198E
0,06RecNciI
0,08595-96 del CT
0,12L444P
0,44N370S
FrecuenciaMutación
Alelos totales esperados = 52
Total alelos N370S = 23
19 pacientes Heterocigotos
N370S
2 pacientes Homocigotos
N370S
18
15
Total Pacientes Analizados 17Total Pacientes Analizados 17
GBA →h = 0,767
Objetivos Objetivos GeneralGeneral
Identificar cuáles de los alelos de cinco marcadores moleculares de la región 1q21 están asociados con mayor significancia a la mutación N370S en el gen de la β-Glucosidasa Ácida en el grupo de pacientes colombianos con EG.
EspecEspecííficosficos
Establecer las frecuencias de los alelos encontrados para el locus GBA junto con su heterocigosidad (h), en el grupo de pacientes colombianos con Enfermedad de Gaucher.De igual modo, determinar las frecuencias alélicas, en el grupo de pacientes, de cinco de los microsatélites cercanos al gen GBA.
Determinar cuáles de los distintos alelos de los marcadores estudiados en los pacientes se han heredado junto con las mutaciones causantes de la EG, especialmente la mutación mas frecuente, e inferir los haplotipos correspondientes
Estimar por medio de análisis estadístico el Desequilibrio de Ligamiento entre cada uno de los alelos de los cinco loci microsatélites estudiados y la mutación del gen GBA con mayor frecuencia en el grupo de pacientes colombianos con EG.
D1S305: 164/172, D1S2624: 201/209, 5GC3.2: 220/222, D1S2777: 260/262 e ITG6.2: 314/318
Electroferograma: Alelos de los cinco STRs amplificados en uno de los controles
Resultados Resultados
1622012642643143142222222
1682092602603143142222221
1682072602603143142222221
1722032602603143142222221
1742012602603143142222221
1702012602603143142222221
1722012602603143142222224
D1S305D1S2624D1S2777ITG6.25GC3.2No. Cromosomas
Marcadores
Haplotipos para la mutaciHaplotipos para la mutacióón N370Sn N370S
ResultadosResultados
Alelo 201 pb = 73%
Alelo 172 pb = 45%
Fracción Conservada82% y 18%
Fracción Variable
Haplotipo consenso : 36%
Fase GamFase Gamééticatica
A haplotipos Españoles y Judíos
Haplotipos: Sección Conservada Comparten un Ancestro común
¿¿De dDe dóónde proviene ese cromosoma?nde proviene ese cromosoma?
DiscusiDiscusióónn
222 318264 N370S
222 314264 N370S
222 314262 N370S
222 314260 N370S
IntroducciIntroduccióón de la Mutacin de la Mutacióónn
Tres eventos de mutación Step-Wise
Presente
Origen de N370S hace 6700 años
Hace 500 años
Hace 1200 años
Colombia
Tronco Ancestral CaucTronco Ancestral Caucáásicosico
AsquenazíEuropa
Historia de N370SHistoria de N370S
D1S2624 alelo de 201 pb
δ = 0,62θ( D1S2624-GBA) = 0.025
Cormand et al, 1997
La asociación 201-N370S tuvo lugar hace 18.8 generaciones,
esto es hace 470 aproximadamente
RecomendacionesRecomendaciones
Determinar la fase gamética para los ocho cromosomas N370S colombianos que no fueron incluidos en el análisis de Desequilibrio deLigamento y estudiar de manera similar los pacientes recientemente diagnosticados, portadores de la mutación N370S.
Ampliar los haplotipos N370S con al menos un STR mas de la región conservada, localizado a una distancia similar del locus D1S2777 y los polimorfismos localizados en el interior del locus GBA de modo que estos puedan ser comparables con los cromosomas N370S de otras poblaciones.
Una vez obtenido el número máximo posible de haplotipos N370S, llevar a cabo un nuevo análisis de Desequilibrio de Ligamento y emplear las herramientas de coalescencia que permitan datar con mayor certeza la mutación N370S colombiana.
Incluir a la mutación colombiana, 595-96 del CT en un estudio como el que se ha llevado a cabo hasta ahora con la mutación N370S
SINTOMATOLOGÍA
•FASCIES TOSCAS
•DISOSTOSIS MULTIPLE
•ANORMALIDADES ESQUELÉTICAS
•HEPATOESPLENOMEGALIA
•OPACIDAD CORNEAL
•ENFERMEDAD DEL MIOCARDIO
•HIPERTENSIÓN PULMONAR
•ALTERACIONES DE SNC
Iduronato 2-sulfato sufatasa 550 aminoacidos
Modelo de predicción de estructura terciaria de la GALNS
R94CR94CM318RM318RD344ND344NE450VE450VP151SP151SA291TA291TG96VG96VS80LS80LG290SG290SF69VF69VG96CG96CQ111RQ111RW141RW141RG247DG247DA291DA291D
Ubicación (con relación al sitio activo) de 15 mutaciones estudiadas
Todas las mutaciones que se encuentran en regiones conservadas, parecen estar directamente relacionadas con el fenotipo severo.
A291D
Todas las mutaciones que se encuentran en regiones alejadas del sitio activo, parecen estar directamente relacionadas con el fenotipo interemedio o leve.
G247D
Expresion de la iduronato 2-sulfato sulfatasa en E. coli
Vector: pUC13-IDS
-Células E. coli JM109 competentes-Transformación en E. coli JM109 -Amplificación-Purificación-Verificación por corte con enzimas de
restricción,-Induccion de la expression en medio
adecuado
Transformación
Escherichia coli
Pichia pastoris
Levaduras:
Línea 1: P. pastoris nativa,Línea 2 a 5, P. pastoris/IDS28 a las 0, 24, 48 y 72 horas.
Western blot para la Iduronato 2-sulfato sulfatasa humana recombinante expresada en P. pastoris/IDS28.
Expresión de la iduronato 2-sulfato sulfatasa en Pichia pastoris
MEDIO / CONCEPTO BMGliY YPGli YPG MG MGliP. Pastoris clon IDS-10Densidad celular inicial (Xo) (g/l) 0,011 0,091 0,121 0,153 0,091Sustrato crecimiento (S) (g/l) 12,45 20,41 22,22 19,34 13,67Sustrato inducción (S) (%v/v) 0,50 0,50 0,50Densidad celular (X máxima) (g/l) 0,616 6,62 4,34 7,41 4,19X inducción (g/l) Inicial 3,96 4,31 3,59X inducción (g/l) Final 10,22 7,22 7,23Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) creci. 12,75 14,34 8,23 1,35 0,91Actividad proteolítica máxima (UP/mg min) inducción 5,27 (144 h) 6,25 (96 h) 4,93 (48 h)Productividad Máxima ( U*1000/ h) 4,99 (48 h) 8,31 (96 h) 5,50 (96 h)Rendimiento Máxino (U/g Metanol) 6,79 (72 h) 1.47 (96 h) 1,76 (48 h)Actividad IDS-hr Máxima (nmol/mg h) 0,36 (120 h) 0,8 (96 h) 0,53 (96 h)
MEDIO / CONCEPTO BMGliY YPGli YPG MG MGliP. Pastoris clon IDS-28Densidad celular inicial (Xo) (g/l) 0,018 0,091 0,103 0,062 0,091Sustrato crecimiento (S) (g/l) 12,45 15,98 20,41 19,99 12,45Sustrato inducción (S) (%v/v) 0,50 0,50 0,50Densidad celular (X máxima) (g/l) 0,67 4,73 4,50 4,02 2,89X inducción (g/l) Inicial 2,09 3,15 2,53X inducción (g/l) Final 5,61 6,74 8,74Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) creci. 13,09 12,93 8,42 2,30 0,77Actividad proteolítica máxima (UP/mg min) induccion 5,48 (144 h) 7,51 (48 h) 5,69 (144 h)Productividad Máxima ( U*1000/ h) 5,06 (48 h) 9,60 (144 h) 24,25 (96 h)Rendimiento Máxino (U/g Metanol) 1,69 (48 h) 1,63 (144 h) 2,34 (96 h)Actividad IDS-hr Máxima (nmol/mg h) 0,24 (48 h) 1.38 (144h) 2,33 (96 h)
Cultivo / Concepto M2 M3 M4 M6 M7 M8 M9Inóculo MG MG MGli MGli MGli MGli MGliMedio BMGliY BMGliY BSM-PTM1 BSM-PTM1-sF BSM-PTM1-sF BSM-PTM1-sF BSM-PTM1-sFDO inicial a 600 nm 0.56 0.53 0.51 0.57 0.25 0.24 0.27Sustrato crecimiento (S) (%w/v) 1.38 1.34 1 1.13 2.55 4.01 8.34Sustrato inducción (S) (g) 9.56 21.86 28.99 35.15 40.54 30.53 17.08Velocidad de agitación (rpm) 250 250-650 250-900 250-700 250-900 250-950 300-1000Flujo de aire (vvm) 0.4 - 2.5 0.4 - 3.7 0.4 - 1.2 2.0 - 2.5 2.0 - 2.5 2.0 - 2.5 2.0 - 2.5pH 5.37(SinC) 6.36 (SinC) 6.27 5.9 5.86 6.06 6.04T (°F) 83.7 85.9 85.9 85.6 85.7 85.7 85.6Densidad celular (X máxima) (g/l) 7.14 16.27 28.02 11.49 17.88 22.13 (83h) 26.03 (120h)Densidad celular (X inicial inducción) (g/l) 1.55 (24h) 5.99 (24h) 8.82 (22h) 7.01 (20h) 12.08 (26h) 18.29 (28h) 25.53 (108h)Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) crecimiento 0.15 0.22 0.16 0.12 0.13 0.16 0.19Proteinas extra-celulares Promedo (g/l) inducción 0.18 0.32 0.3 0.28 0.17 0.11 0.16Actividad proteolítica Máxima (UP/ml min) inducción 5,530 (24 h) 4,024 (48 h) 0,540 (94 h) 0.175 (57h) 0.185 (95 h) 0.216 (83h) 0.421(132h)Productividad específica Maxima( U*103/h) 5.68 (26 h) 8.47 (35 h) 55.32 (35 h) 327.16 (33 h) 462.03 (47 h) 113.94 (47 h) 0.00Rendimiento Máxino (U/g Metanol) 0.02 (95 h) 0.17 (35 h) 0.09 (58 h) 2.32 (33 h) 1.34 (47 h) 2.44 (47 h) 0.00Actividad IDS-hr Máxima (U) 0.29 (95 h) 0.40 (35 h) 2.75 (58 h) 15.42 (94 h) 29.5 (47 h) 7.67 (71 h) 0.00
Actividad Enzimática de fracciones de IDShrseparadaspor cromatografía de afinidad (Superosa 6 GP-anti-IDS)
14.4214.420.780.78MM--13.313.358.7858.781.111.11MM--13.213.237.6737.671.731.73MM--13.113.12.712.711.161.16MM--1212
32.2132.210.910.91MM--77
Actividad IDSActividad IDS((nmnm/h//h/mgmg de de proteinaproteina))
ProteProteíína total na total ((mgmg//mlml))
Muestra Muestra (Cultivo)(Cultivo)
SULFATASAS HUMANAS LOCALIZACIÓN SUBCELULAR
SUSTRATO NATURAL ENFERMEDAD
Arilsulfatasa A Lisosoma Sulfato de Cerebrósido
MLD, MSD
Arilsulfatasa B Lisosoma Dermatán Sulfato Maroteaux-Lamy (MPS VI)
Arilsulfatasa C Microsomas Esteroides sulfatados
XLI, MSD
Arilsulfatasa D Retículo Endoplasmático
No conocido No conocido
Arilsulfatasa E Aparato de Golgi No conocido MSD, Condrodisplacia punctata
Arilsulfatasa F Retículo Endoplasmático
No conocido No conocido
Arilsulfatasa G No conocido No conocido No conocido
N-Acetilgalactosamina-6-sulfatasa Lisosoma Queratán sulfato Condroitin sulfato
Morquio A (MPS IVA), MSD
N-Acetilglucosamina-6-sulfatasa Lisosoma Heparán sulfato Queratán sulfato
Sanfilipo D (MPS IIID)
Iduronato-2-sulfato sulfatasa Lisosoma Dermatán Sulfato Heparán sulfato
Hunter (MPS II)
Sulfamidasa Lisosoma Heparán sulfato Sanfilipo A (MPS IIIA)
Sulfatase 1 (KIAA 1077) No conocido No conocido No conocido
Sulfatase 2 No conocido No conocido No conocido
VENTAJAS PRODUCCIVENTAJAS PRODUCCIÓÓN N IgYIgY
Distancia Distancia FilogenFilogenééticatica entre aves y entre aves y mammamííferos: alta producciferos: alta produccióón de anticuerpos.n de anticuerpos.No hay sacrificio del animalNo hay sacrificio del animal1 Huevo puede producir 11 Huevo puede producir 1--10mg/ml de 10mg/ml de IgYIgYespecespecíífico.fico.No presentan reactividad cruzada con No presentan reactividad cruzada con IgGsIgGsde mamde mamííferosferos
TTéécnica de Dotcnica de Dot--blot. Se utilizaron los anticuerpos extrablot. Se utilizaron los anticuerpos extraíídos dos de yema de huevo de las Gallinas inmunizadas. Se evidencide yema de huevo de las Gallinas inmunizadas. Se evidencióóel reconocimiento de la proteel reconocimiento de la proteíína IDS por parte de los na IDS por parte de los anticuerpos de gallinas A1, A2, A3, B1 y B3. CP (control anticuerpos de gallinas A1, A2, A3, B1 y B3. CP (control positivo). CN (Control negativo).positivo). CN (Control negativo).
ELISA ELISA ““SANDWICHSANDWICH””
00.5
11.5
22.5
33.5
1/200 1/800 CP
Diluciones anticuerpo
ELISA INDIRECTA IgY A2
Las placas fueron sensibilizadas con antLas placas fueron sensibilizadas con antíígeno (IDS) a una geno (IDS) a una concentraciconcentracióón de 1.7n de 1.7µµg/ml y se realizaron diluciones dobles g/ml y se realizaron diluciones dobles
seriadas de los Anticuerpos A2 seriadas de los Anticuerpos A2