estudio de la síntesis de un nuevo fluoróforo basado en
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Estudio de la síntesis de un nuevo fluoróforo basado en
formilpirazolocumarina
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de químico
Presentado por:
Alejandro Camacho Castro
Asesor:
Jaime Antonio Portilla Salinas, Dr. Sc.
Grupo de Investigación en Compuestos Bio-orgánicos (GICOBIOR)
Departamento de Química − Facultad de Ciencias
Universidad de los Andes − Bogotá D.C Diciembre de 2018
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Tabla de contenido
1. Introducción y antecedentes .................................................................................................. 4
Definición, importancia y utilidad de los quimiosensores fluorescentes ................... 4
Mecanismos fotofísicos principales en la detección de cationes1 ............................... 7
Síntesis de pirazolo-cumarinas como compuestos bicromóforos de interés ........... 9
2. Planteamiento del problema ................................................................................................. 11
3. Objetivos .................................................................................................................................... 11
4. Metodología ............................................................................................................................... 12
5. Resultados y discusión .......................................................................................................... 12
5.1. Síntesis de 3-acetil-7-dietilaminocumarina ............................................................... 12
5.2. Síntesis de 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina. ....................... 13
5.3. Síntesis de 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-
4-carbaldehido) 6. ..................................................................................................................... 14
5.4. Estudios de fluorescencia: solvatocromismo e interacción con cationes ....... 18
Conclusiones ................................................................................................................................. 21
6. Procedimiento experimental ................................................................................................. 22
Bibliografía ..................................................................................................................................... 25
Anexos ............................................................................................................................................ 26
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Resumen
En este trabajo se realizó la síntesis de un nuevo fluoróforo funcionalizado con un
grupo formilo, basado en el sistema hibrido pirazolo-cumarina. La síntesis de este
compuesto se desarrolló de forma lineal partiendo desde la obtención del anillo de
cumarina que más tarde por medio de la condensación con una hidrazina y de la
reacción de Vilsmeier-Hack, permitió la obtención y activación química del anillo
pirazólico (Esquema 1). Debido a los inconvenientes presentados durante el
proceso de síntesis y el tiempo de desarrollo de este trabajo, la pirazolo-cumarina
obtenida no fue post-funcionalizada con receptor especifico.
Esquema 1. Ruta de síntesis desarrollada para la formación del sistema híbrido 6
Vale la pena mencionar que a pesar de no extender el trabajo sintético y
considerando el potencial fotofísico de la estructura del aldehído obtenido 6 como
sistema de arquitectura D-π-A extendido heteroaril-sustituido, se realizó un estudio
preliminar del solvatocromismo del fluoróforo y de la interacción con algunos
cationes divalentes.
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1. Introducción y antecedentes
Definición, importancia y utilidad de los quimiosensores fluorescentes
En la actualidad los sensores se utilizan en todos los aspectos de la vida cotidiana
aplicados en diversas áreas como la medicina, la industria y la investigación.1 En la
química supramolecular la detección, que se define como el reconocimiento de un
analito por medio de un dispositivo especial, recae sobre el diseño de dispositivos
moleculares capaces de detectar materia o energía produciendo una señal medible
en respuesta, es decir sobre el diseño de quimiosensores. El uso de quimiosensores
ofrece por medio de métodos ópticos, que requieren equipos y procedimientos de
análisis sencillos, la obtención de respuestas selectivas y sensibles en tiempo real.
En contraposición, las técnicas analíticas tradicionales tienen como principal
limitación la toma y preparación sistemática de muestras, la disponibilidad de
equipos complejos y la demora de largos periodos de tiempo en el análisis y
procesamiento de los datos. Diferentes estrategias se han desarrollado con éxito en
el diseño de quimiosensores, sin embargo, la obtención de quimiosensores
fluorescentes ha recibido especial interés en las últimas décadas por las ventajas
características que ofrece la espectroscopia de fluorescencia, entre ellas la amplia
versatilidad y bajo costo de la técnica, la alta sensibilidad del método, el uso de
bajas concentraciones del sensor, y la posibilidad de aprovechar la dependencia de
la fluorescencia de una molécula para estudiar factores del entorno que la rodea
como el pH, la fuerza iónica y la polaridad.2
Un sensor fluorescente puede definirse como una maquina molecular capaz de
señalizar la presencia de un analito iones o moléculas, por el cambio en las
propiedades fotofísicas (Esquema 2a). Un sensor fluorescente tiene en su
estructura tres partes fundamentales: una unidad señalizadora (el fluoróforo), un
espaciador y la unidad de reconocimiento (el receptor) (Esquema 2b). El fluoróforo
tiene la función de transformar el reconocimiento del analito en una señal óptica
medible mientras que la unidad de detección es responsable de la interacción con
el analito de forma eficiente y selectiva. Estas unidades estructurales requieren
comunicación activa que permita debido al cambio en la unidad de reconocimiento,
modular las propiedades fotofísicas y la emisión de energía por parte del fluoróforo
siendo el espaciador la estructura clave encargada del acoplamiento y la
comunicación entre estas dos unidades.
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Esquema 2. a) Mecanismo general de la transducción de la señal característica del quimiosensor.
b) Estructura general de un sensor con arquitectura FER, fluoróforo, espaciador, receptor.
En general, la luminiscencia desde un estado excitado consiste en dos categorías
principales: la fluorescencia, que es la emisión partiendo de un estado excitado
singlete y la fosforescencia, que es la emisión desde un estado excitado triplete.
Estos estados se forman por la promoción de un electrón desde un estado basal o
un orbital basal HOMO a un estado de mayor energía u orbital de mayor energía
LUMO por medio de la irradiación con luz. Así pues, la diferencia de energía entre
los orbitales HOMO y LUMO y el mecanismo de relajación del sistema determina la
energía de emisión de la fluorescencia. La desactivación de un estado excitado
puede ocurrir por vías diferentes a la luminiscencia como la desactivación térmica y
la transferencia de energía a otras moléculas.
La intensidad de la luminiscencia de una molécula depende de multitud de variables
que abarcan desde la estructura y el mecanismo de emisión hasta la polaridad del
solvente en que se realiza la excitación. Según el diseño y la estructura del sensor,
determinados mecanismos de emisión y relajación se presentan comúnmente en
las moléculas. En particular, sensores polares con un fragmento donor y otro
aceptor en su estructura presentan principalmente debido a la excitación fenómenos
de transferencia de carga interna (ICT) o transferencia de carga interna por rotación
(TICT), que suelen ser útiles tanto en la detección de cationes como de aniones3.
La transferencia de carga interna en una molécula ocurre mediante la formación de
estados localmente excitados (LE) por trasferencia de energía a través de sistemas
conjugados extendidos o por medio de la formación de estados excitados por
transferencia de electrones (ET) que forman radicales cargados en la estructura
estabilizados por cambios en la disposición espacial. En general, el efecto neto
sobre el sistema por la presencia de fenómenos de transferencia de carga interna
es el aumento del momento dipolar del sensor en el estado excitado (Esquema 3a).
En estos sistemas, la naturaleza del solvente puede tener un efecto significativo en
las propiedades foto-físicas del fluoróforo ya que la longitud de onda de emisión, el
rendimiento cuántico y el tiempo de vida puede ser dependientes de la estabilización
que ofrezca el solvente al estado excitado con cargas formales según su momento
dipolar y contante dieléctrica (Esquema 3b). La estabilización de los dipolos en el
estado excitado ocurre según el tiempo de vida de la especie. El primer factor de
estabilización casi inmediato a la excitación del fluoróforo corresponde polarización
electrónica del solvente de acuerdo con la aproximación de Franck-Condon y el
segundo factor, de mayor intensidad, corresponde a la alineación entre los
momentos dipolares del estado excitado del fluoróforo y el solvente. Otras
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interacciones importantes como la formación de puentes de hidrogeno,
desplazamiento de cargas, interacciones entre las moléculas del sensor, cambios
conformaciones y desactivación no radiativa pueden conducir al aumento del
desplazamiento de stocks, la reducción del rendimiento cuántico y el apagado de la
fluorescencia (Esquema 4).
Esquema 3. a) Efecto del solvente en la absorción de un fluoróforo con ICT en estado excitado.
(E.E. FC): estado excitado según Franck-Condon (FC). b) Efecto del solvente en la emisión de un fluoróforo con ICT en estado excitado. (E.E.T.E): Estado excitado térmicamente estabilizado.
Esquema 4. Efectos del microambiente en la energía del estado excitado. Las flechas punteadas indican que el fluoróforo puede o no ser fluorescente según la estabilización del estado excitado.
De acuerdo con el momento dipolar, el índice de refracción y la constante dieléctrica
del solvente, es posible calcular el desplazamiento de Stockes esperado por medio
de la ecuación de Lipper-Mataga.4 El rendimiento cuántico interpretado como la
eficiencia de la emisión, es en su definición más simple la razón entre el número de
fotones absorbidos y el número de fotones emitidos. Este valor depende
principalmente de la relación entre las constantes de decaimiento no radiativo y de
decaimiento radiativo, además, esta proporción depende de la velocidad con
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ocurren los demás fenómenos fotofísicos que se presentan en las moléculas y de la
interacción de la molécula y sus estados excitado con el entorno5.
Mecanismos fotofísicos principales en la detección de cationes1
Los sensores con la capacidad de responder selectivamente a cationes se han
convertido en una herramienta invaluable en estudios bioquímicos. Comparado con
el método de tinción basado en absorción, el uso de colorantes fluorescentes ofrece
mayor sensibilidad y la posibilidad de seguir procesos bioquímicos a nivel molecular.
Debido a las propiedades características de los quimiosensores: reducido tamaño
molecular, la capacidad de llegar al interior de la célula por difusión pasiva y su
potencial uso no invasivo, se han desarrollado múltiples sondas para los principales
cationes involucrados en procesos biológicos como el calcio, magnesio, sodio,
potasio, zinc, cobre y hierro. En sistemas donde el fluoróforo interactúa con el metal
suelen presentarse tres mecanismos de transducción y emisión principales: la
transferencia fotoinducida de electrones (PET), el apagado o encendido de
fluorescencia por inversión de estados excitados (ESI) y la transferencia de carga
foto inducida (PCT).
Transferencia de electrones fotoinducida (PET): Este fenómeno ocurre en sensores
con estructura Donor-Aceptor en donde el fragmento donor del fluoróforo rico en
electrones actúa como base Lewis y el fragmento aceptor como acido de Lewis.
Antes de la interacción con el catión, los estados localmente excitados (LE) tienden
a formar radicales cargados (𝐷.+-𝐴.−) por la transferencia de un electrón donde el
fragmento aceptor se reduce parcialmente. En general la relajación hasta el estado
basal resulta en un proceso no radiativo causando la disminución o el apagado de
la fluorescencia donde la constante de transferencia electrónica Ket resulta, mayor
que la constante de decaimiento radiativo Kr (Esquema 5a). En general, cuando el
fluoróforo interactúa con el catión objetivo, la transferencia electrónica ocurre del
fragmento donor al metal, evitando la formación de cargas parciales en el fluoróforo
y reduciendo a la vez la constante de transferencia electrónica Ket entre los
fragmentos donor y aceptor (método de estabilización de los estados localmente
excitado) por tanto disminuyendo la razón del decaimiento no radiativo de la
excitación. La interacción con el metal produce entonces el encendido de la
fluorescencia (Esquema 5b).
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Esquema 5. Transferencia electrónica fotoinducida (PET). a) En ausencia de catión Mn+, la
transferencia ocurre del resto donor (D) al aceptor (A), siendo la constante Ket > Kr, resultado en el apagado de la fluorescencia. (b) La coordinación del metal con el fragmento donor, disminuye la fuerza motriz de la PET, la emisión radiativa compite con la PET y la fluorescencia se enciende.
Apagado o encendido de fluorescencia por inversión de estados excitados (ESI):
Muchos fluoróforos contienen uno o más heteroátomos, que en la mayoría de los
casos tienen uno o más pares libres de electrones. Dependiendo de la simetría, los
pares libres de electrones se pueden ver involucrados de forma permanente en la
molécula por medio de resonancia directa con sistemas π adyacentes al
heteroátomo o por medio de absorción de energía generado estados excitado del
tipo (n-π*) o (π-π*) donde la significancia de la interacción depende de la
participación del orbital n o π del par libre, en el orbital molecular y del fenómeno de
cruce entre sistemas. Si el fenómeno de cruce entre sistema Kics (ISC) ocurre con
mayor rapidez que la emisión radiativa Kr, la fluorescencia se ve apagada. Ahora
cuando el catión interactúa con un orbital n, el potencial de ionización del par libre
aumenta haciendo inviable la interacción (n-π*) desestabilizando el estado excitado
disminuyendo y la constante de conversión intersistema Kics con relación a la
contante de emisión radiativa Kr (Esquema 6).
Esquema 6. Respuesta de la fluorescencia según la interacción de los pares libres (n-π*) o (π-π*)
con el sistema π molecular. a) En presencia de estados (n-π*) el fenómeno ISC apaga la
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fluorescencia. b) La interacción del catión con los pares libres en orbitales n desestabiliza los estados (n-π*) provocando mayor competencia entre los mecanismos de desactivación.
Transferencia de carga foto inducida (PCT): Si la nube π del fluoróforo se encuentra
conjugada con sustituyentes donores y aceptores la foto excitación conduce a la
transferencia de carga intramolecular desde el fragmento donor hasta el fragmento
aceptor. Esta transferencia de carga genera el aumento drástico en el momento
dipolar del fluoróforo y distorsiones espaciales que estabilizan el estado excitado
disminuyendo la intensidad y la energía de la emisión sin cargar formalmente la
estructura. Por general estado localmente excitados (LE) derivados de (PCT), tienen
buena elasticidad en la emisión por lo que los rendimientos cuánticos que se
presentan suelen ser altos mientras que la estabilización de estados del tipo (ET)
derivados de (PET), suelen abordar vías no radiativas (principalmente por la
interacción con el solvente) que causan el apagado de la fluorescencia (Esquema
7). En la mayoría a de los casos el metal electropositivo interactúa con el fragmento
donor del fluoróforo, reduciendo el grado de transferencia de carga y del estado
excitado por polarización. Como resultado la energía de excitación y emisión
presenta un corrimiento hipocrómico. Por otra parte, la interacción del catión con el
fragmento aceptor del fluoróforo, ocasiona el corrimiento batocrómico de la emisión
por la estabilización de las cargas en la estructura. Estructuras π-anfóteras, como
piridinas, diazoles y cumarinas pueden comportarse como π-aceptores y σ-donores.
Esquema 7. Diagrama de Jablonski de interacción Mn+ con el estado excitado (PCT) del fluoróforo.
Síntesis de pirazolo-cumarinas como compuestos bicromóforos de interés:
El amplio desarrollo científico y tecnológico que se ha presentado en las últimas décadas alrededor de moléculas orientadas al diseño de fluoróforos funcionales, ha centrado el interés en la síntesis y estudio de compuestos híbridos. En particular, las pirazolocumarinas que se destacan por sus propiedades fotofísicas excepcionales y por el marcado espectro de actividades biológicas que presentas diversos derivados de pirazol y de cumarina (Esquema 8). Por lo anterior, este tipo de compuestos se han convertido en referente de aplicación en diversos campos, principalmente en el diseño de sensores fluorescentes útiles en sistemas biológicos, medioambientales e industriales.
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Esquema 8. Antecedentes en la síntesis y aplicación de pirazolocumarinas6–14.
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2. Planteamiento del problema
Teniendo en cuanta la descripción previa se nota la importancia que tienen los
quimiosensores moleculares en el tecnológico y aún más el desarrollo de fluoróforos
capaces de provocar la transducción sensible de las señales mediante el cambio en
sus propiedades fotofísicas. En particular, se destacan aquellos fluoróforos
derivados de cumarina y los de pirazol (surgidos recientemente como nuevos
fluoróforos). Por lo tanto, emergen los interrogantes respecto a la síntesis de los
nuevos fluoróforos a obtener y su potencial uso: ¿será posible que a hidrazona 5
reaccione de forma selectiva en condiciones de Vilsmeier-Hack conllevando a la
formación de un anillo pirazólico? ¿Es posible la funcionalización 4-fomil sobre el
pirazol en una reacción “one pot”? ¿será posible que a hidrazona 5 reaccione de
forma selectiva en condiciones de Vilsmeier-Hack y forme el sistema híbrido
esperado 6? y ¿presentará fluorescencia el nuevo sistema híbrido sintetizado?
(Esquema 2).
Esquema 9. Ruta de síntesis propuesta para la formación del sistema híbrido 6
Para resolver los anteriores interrogantes, se trazan unos objetivos y metodología
de trabajo que conduzcan el proceso de investigación. Se verifica que las
racionalidades químicas de los procesos involucrados en esta propuesta de
investigación están de acuerdo con los proyectos de trabajo desarrollados
previamente en el GICOBIORG, es decir, el grupo cuenta la experiencia para
alcanzar con éxito y por completo lo que se propone, siempre y cuanto se trabaje
con toda la constancia y dedicación del caso.
3. Objetivos
General
Estudiar la síntesis de sistema híbrido fluorescente basado en 4-formil-pirazolil-
cumarina 6.
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Específicos
▪ Obtener 3-acetil-7-(dietilamino)cumarina 3 desde 4-dietilaminosalicilaldeído 1 y
acetoacetato de etilo 215.
▪ Sintetizar la hidrazona 5 mediante la reacción de condensación de la cetona 3 con
2-piridilhidrazina 4.
▪ Estudiar la reacción conjunta formilación-cliclación-formilación en condiciones de
Vilsmeier-Hack de la hidrazona 5 para obtener el nuevo sistema híbrido 616.
▪ Estudiar el potencial fotofísico del sistema bicromóforo 6 y hacer ensayos
preliminares en la detección cationes metálicos.
4. Metodología
La síntesis consta de tres etapas encadenadas de forma lineal como se muestra en
el Esquema 2. El primer paso consiste en una reacción de condensación-ciclación
para la formación de la 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3. La segunda etapa, a partir
del primer producto 3, permite la obtención de la hidrazona 5 por medio de la
funcionalización de la cetona con 2-piridilhidrazina 4 en medio ácido. En la tercera
etapa en condiciones de Vilsmeier-Hack se desarrolla la reacción en cadena de
formilación-ciclación-formilación para obtener el 4-formilpirazol sustituido 6. En
próximos estudios se pretende estudiar la funcionalización de la molécula 6,
realizando reacciones de condensación con el grupo formilo presente en la posición
4, para obtener sistemas FER (Fluoróforo Espaciador Receptor) sensibles a
variedad de analitos aprovechando el potencial fluorescente de la
formilpirazolocumarina sintetizada.
5. Resultados y discusión
5.1. Síntesis de 3-acetil-7-dietilaminocumarina
La síntesis de la 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3 (Esquema 10) se realizó por medio
de una condensación de knoevenagel seguida de una segunda condensación
intramolecular entre el 4-(dietilamino)-2-hidroxibenzaldehido 1 y el acetoacetato de
etilo 2 utilizando piperidina como base en cantidades catalíticas. La reacción se llevó
a cabo en 6h de reflujo utilizando etanol como disolvente y el rendimiento que se
obtuvo fue del 95%.
Esquema 10. Síntesis de la 3-acetilcumarina.
La secuencia de reacciones que conducen a la ciclación es posible gracias a la naturaleza 1-eletrofilica, 2-nuclofilica de ambos reactivos. La piperidina puede desempeñar la catálisis actuando como base durante el proceso y/o por medio de
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la formación de enaminas y sales de iminio17. El producto obtenido 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3 fue identificado por medio de espectroscopia de NMR y de GC-MS. Los espectros se presentan en los anexos (Ver anexo 1, 2, 3 y 4) y los datos coinciden con los valores reportados en la literatura (Ver sección experimental).
5.2. Síntesis de 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina.
La hidrazona se sintetizó por medio de la reacción de condensación entre la
cumarina 3 y piridilhidrazina 4 (Esquema 11).10 En el proceso se utilizó metanol a
reflujo y medio ligeramente ácido con el fin de favorecer el proceso de
deshidratación. El producto obtenido resultó ser muy soluble en medio ácido debido
a la protonación del grupo dietilamino, sin embargo, es posible observar la
precipitación del producto independiente del pH con una notable variación del color
de amarillo a naranja según el medio sea ácido o básico respectivamente.
Esquema 11. Síntesis de 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina.
En esta reacción a pesar de usar los precursores puros y en cantidades
equimolares, la piridil hidrazina resultaba ser el reactivo limite, debido
probablemente a la rápida oxidación del compuesto y a la formación de dímeros
insolubles, así pues, utilizar bajas temperaturas, atmosfera de nitrógeno y exceso
del reactivo 4 fue clave durante el proceso para lograr la conversión completa de la
cumarina de partida. La conversión completa de la cumarina era a su vez importante
por la alta polaridad de la hidrazona obtenida y la sensibilidad del compuesto a
medio altamente ácido, por lo que la purificación por cromatografía en columna
resultaba inviable. Tras lograr la conversión completa de la cumarina, la reacción se
neutralizó y precipitó el compuesto en medio básico. La purificación se redujo
entonces a la recristalización del compuesto en metanol. El producto obtenido 7-
dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina fue identificado por medio de
RMN y GC-MS. Los espectros se presentan y relacionan con la estructura en los
anexos y las medidas obtenidas (Ver anexos 5, 6, 7 y 8). En el espectro 1H-RMN
del compuesto 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina 5 se destaca
conforme a lo esperado el aumento de la señales en la zona aromática (ver anexo
5), el mayor componente de deslocalización electrónica y la menor extracción de
carga en el doble enlace C=N manifiesto en la protección el protón en posición 7 γ
en desplazamiento a campo alto de la señal 3-CH3 de δ 2.61 ppm en la cumarina 3
a δ 2.42 ppm en la hidrazona 5. En el espectro 13C-RMN del compuesto 7-
dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina (Anexo 6) se encuentran 18
señales que corresponden con la formula molecular del compuesto C20H22N4O2, de
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las cuales 13 corresponden a la estructura base del reactivo de partida 3 y las 5
restantes corresponden con la estructura de la piridina. El espectro APT-RMN,
(Anexo 7) confirma la asignación realizada en C13-RMN a los carbonos cuaternarios
del sistema 8-C, 9-C, 14-C, 10-C, 11-C, 12-C y 13-C de acuerdo con la intensidad
de la señal y el desplazamiento químico. La asignación de las nuevas señales 15-
CH, 16-CH, 17-CH, 18-CH como carbonos terciarios, resulta consistente con el
sistema aromático que se espera representa.
5.3. Síntesis de 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-
1H-pirazol-4-carbaldehido) 6.
El tercer paso de la síntesis planeada consistió en la síntesis del compuesto 3-(7-
(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-4-carbaldehido) 6,
por medio de un proceso conjunto de formilación, ciclación, formilación, realizado
en condiciones de Vilsmeier-Hack. (Esquema 12).
Esquema 12: Síntesis del compuesto 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-
pirazol-4-carbaldehido) 6.
La síntesis de pirazoles tiene como regla general la utilización de diazocompuestos,
dado que la formación del enlace N-N resulta problemática en síntesis orgánica. La
reacción de Vilsmeier-Hack sobre la hidrazona 5 conduce a la obtención del pirazol
6 de forma regio especifica debido a que el enlace C=N se forma previamente. La
hidrazona 5 tiene dos inconvenientes principales frente a la reacción de Vilsmeier-
Hack, que son: La presencia de un heterociclo fusionado altamente activado como
la dietilaminocumarina que puede formilarse como reacción secundaria e interferir
o no el proceso de formilación, ciclación, formilación para la obtención del pirazol y
el segundo inconveniente, la hidrolisis de la hidrazona 5, por la presencia de ácido
en el sistema que rompe el enlace C=N produciendo nuevamente la cumarina 3 que
a su vez es reactiva en las condiciones de Vilsmeier-Hack. El mecanismo de la
reacción se presenta en el (Esquema 13), donde para la formación del reactivo de
Vilsmeier por medio de la interacción de la dimetil formamida con cloruro de fosforilo
es fundamental en el proceso general de la reacción. Una vez formado el reactivo
de Vilsmeier, la hidrazona 5 que se comporta como un compuesto 1,4-binucleoflico
por la presencia de la base shift en su estructura realiza dos ataques nucleófilos no
concertados sobre este, conllevando a la ciclación y la aromatización del compuesto
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en la segunda etapa de la reacción. Posteriormente el pirazol obtenido en exceso
del reactivo de Vilsmeier, ataca nuevamente debido al carácter nucleófilo del anillo
y a la activación que le aporta la cumarina como sustituyente en la posición 3. Al
final de la reacción se realiza un proceso de hidrolisis básica que hidrata la sal de
Vilsmeier formada conduciendo a la obtención del grupo formilo en la posición 4 y a
la neutralización del medio.
Esquema 13: Mecanismo para la formación del reactivo de Vilsmeier-Hack y la reacción de la
hidrazona 5 en la obtención del pirazol.
Durante la formación del 4-formilpirazol 6 se presentó una reacción colateral
principal. Esta reacción fue la hidrolisis de la hidrazona 5 y la correspondiente cloro-
formilación de la cumarina 3 cuyo mecanismo se presentan en el (Esquema 14).
Esta reacción sucedió dada la sensibilidad de la hidrazona al acido que se obtiene
como subproducto en la formación del pirazol y a la presencia del cloruro de fosforilo
en exceso necesario para que la reacción conjunta de formilación, ciclación,
formilación ocurra. El mecanismo plantea que el enol de la cumarina estabilizado
por el cloruro de fosforilo que actúa como acido de Lewis puede atacar el reactivo
de Vilsmeier. Dado que el fosforo es oxofílico y las cargas negativas se estabilizan
por resonancia en el cloruro de fosforilo, es posible que el cloruro de fosforilo se
oxide y sea desplazado nucleofílicamente por el cloro que tras la hidrolisis de la sal
de Vilsmeier formada, conduce a la obtención del compuesto 3.1.
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Esquema 14: Reacción secundaria durante la formación del pirazol que conduce a la obtención del
compuesto 3-cloro-3-(7-(dietilaminocumarin-3-il))-acrilaldehido 3.1.
Los compuestos obtenidos 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-
1H-pirazol-4-carbaldehido) 6 y 3-cloro-3-(7-(dietilaminocumarin-3-il))-acrilaldehido
3.1 fueron identificados por medio de espectroscopia de NMR 1H-RMN, 13C-RMN,
DEPT-135 y de GC-MS. (Ver anexo 9-12 y 13-15).
El espectro H1-RMN del pirazol 6 (ver anexo 9) muestra tres cambios característicos
con relación al espectro H1-RMN de la hidrazona 5 (anexo 5) e ilustra con estos
cambios la reacción de ciclación y formilación. El primer cambio característico es la
desaparición del singlete correspondiente a los protones 3-CH3 que de acuerdo con
el mecanismo de la reacción ocurre por la inclusión de este carbono en la estructura
base del heterociclo aromático 1,3,4-trisustituido, es importante resaltar que
ninguna señal adicional en el espectro H1-RMN se puede asociar con un cambio
químico que altere la multiplicidad o el desplazamiento químico de los protones
enlazados al carbono 3, así pues, el carbono debió cambiar su modo de enlace de
primario a cuaternario. El segundo y tercer cambio consisten en la aparición de dos
señales δ 9.12 (s, 1H) ppm y δ 10.07 (s, 1H) ppm. Estas señales se asocian según
la estructura esperada con el protón en la posición 5 del pirazol y el protón del
aldehído que sustituye la posición 4 del anillo. El protón en 5 aunque hace parte de
un sistema aromático, se encuentra a un campo más bajo del esperado porque la
posición 5 del pirazol es en general electrofílica como consecuencia de la estructura
electrónica del anillo y la presencia de los heteroátomos más electronegativos y en
particular debido al aldehído que sustituye la posición 4.
En el espectro C13-RMN del pirazol 6 (Anexo), se encuentran 20 señales
correspondientes a 22 carbonos y en comparación con el mismo espectro de la
hidrazona 5 la aparición de dos señales a desplazamiento químico δ 185.63 ppm y
δ 143.74 ppm. Además, se hace evidente el cambio diametral que presenta la
estructura en el carbono 3. La señal del carbono 3 (3'-C) para el compuesto 6 se
encuentra en δ 150.52 ppm con intensidad baja similar a la de otros carbonos
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cuaternarios y en el predecesor sintético. Por otra parte, en la hidrazona 5, la señal
del carbono 3 (3-CH3) se encuentra en δ 14.31 ppm con intensidad de carbono
primario. Este cambio se explica, como se ha sugerido en el análisis del espectro
H1-RMN, a causa de la inclusión del carbono 3 en la estructura principal del pirazol
1,3,4-trisustituido planteado como producto principal de la reacción. Las señales 19-
CH y 20-CH concuerdan con el carbono incluido en cada paso de formilación
durante la reacción para la obtención del producto 6. Se encontró que, tras la
reacción, los carbonos de la piridina 14, 15, 16, 17 y 18, que es un sistema π
deficiente, presentaron un desplazamiento conjunto a campo bajo. Esto se explica
dado que la formación del anillo pirazólico, la corriente electrónica que implica y la
conjugación de orbitales π a nivel molecular, contribuye a la distribución uniforme
de la carga entre los sustituyentes.
Otro efecto interesante que se observa tras la formación del heterociclo aromático
y el establecimiento del sistema π conjugado molecular es el rencendido de la
fluorescencia que en el compuesto 5 había disminuido notablemente por la rápida
foto-isomerización del compuesto como mecanismo de relajación no radiativo.9 La
formación del sistema π conjugado molecular asegura la planaridad y la rigidez del
sistema lo que justifica en buena medida la reducción en la proporción del
decaimiento no radiativo de la energía absorbida. Por último, en el espectro DEPT-
135 del compuesto 6 se mantiene la correlación de señales asignadas y se confirma
que la señal (3′-C) corresponde a un carbono cuaternario mostrando que la
ciclación, la aromatización y la formilación en la posición 4 del pirazol ocurrieron de
acuerdo con el plan de síntesis desarrollado.
El espectro H1-RMN del subproducto principal en la reacción de Vilsmeier-Hack
presenta las señales (anexo 13): 1H-RMN(400 MHz, CDCl3) δ 10.28 (d, J=6.9 Hz,
1H), 8.37 (s, 1H), 7.67 (d, J=6.9 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.68-6.52 (dd, J =
9.0 Hz, 1.9 Hz, 1H), 6.48(d, J= 1.9 Hz, 1H), 3.47 (q, J= 7.1 Hz, 4H), 1.17(t, J= 7.1
Hz, 6H). A excepción de las señales 10.28 (d, J=6.9 Hz, 1H) y 7.67 (d, J=6.9 Hz,
1H) adyacentes entre sí por el acoplamiento que experimentan y que además
ilustran el cambio estructural por la reacción de cloro-formilación sobre el carbono
del grupo 3 acetilo en la cumarina 3, las demás señales en el espectro resultan
análogas en desplazamiento, multiplicidad, acoplamientos e integración con la base
estructural de la cumarina, por lo que se puede asegurar que el heterociclo
fusionado no se vio afectado en contraste con la consideración de posibles
reacciones de formilación no deseadas en el anillo, en particular, sobre las
posiciones bencénicas 4, 5 y 6 dada su alta densidad electrónica. El espectro C13-
RMN (anexo 14) muestra que el carbono primario (3-CH3) de la cumarina 3 cambia
su entorno químico y modo de enlace, lo que provoca el desplazamiento de la señal
desde δ 30.57 ppm hasta δ 120.29 ppm por la inclusión de un grupo altamente
electro atractor adyacente a este carbono. Específicamente, la inclusión del grupo
aldehído es sugerida por la desprotección y la integración del protón en 14-CH δ
10.28 (d, J= 6.9 Hz, 1H) y por la nueva señal incluida en el espectro C13-RMN que
18
se encuentra en δ 192.38 ppm. Adicionalmente se prueba según el espectro DEPT-
135 (anexo15) que las señales 3'-CH y 14-CH corresponden con carbono terciarios
en la estructura, lo que termina por confirmar la obtención del 3-cloro-3-(7-
(dietilaminocumarin-3-il))-acrilaldehido 3.1 como principal subproducto de la
reacción de Vilsmeier-Hack sobre la hidrazona 5.
5.4. Estudios de fluorescencia: solvatocromismo e interacción con cationes
Para el pirazol 6 obtenido se realizaron estudios preliminares de fluorescencia
considerando que esta estructura tiene potencial químico para ser funcionalizada
debido al sustituyente 4-formil y como fluoróforo señalizador debido a su esqueleto
heterocíclico aromático. Dado que el mecanismo de relajación del estado excitado
de una molécula depende en parte del entorno químico en el que ocurre el
fenómeno, se estudió la absorción y la emisión del pirazol 6 en cinco solventes
diferentes a saber: ciclohexano, tetrahidrofurano, acetonitrilo diclorometano y
etanol, obteniendo los siguientes resultados (Gráfica 1).
Grafica 1. Espectros de absorción y emisión del pirazol 6
Tanto en absorción como en emisión, se presenta la estabilización del estado
excitado por el aumento en la polaridad del solvente, por lo que con seguridad dada
la naturaleza del pirazol 6, que es según su estructura es un sistema donor
(cumarina) aceptor (4-formilpirazol), se presentan fenómenos de transferencia de
carga interna. De acuerdo con la forma del espectro de emisión (en el caso del ciclo
hexano) la transferencia de carga en el sistema (ICT) depende en principio de al
menos dos fenómenos coexistentes: la formación de estados localmente excitados
(LE) y la transferencia electrónica (eT). Teniendo en cuenta los mecanismos de
fluorescencia descritos en la introducción, se reconoce que ambos fenómenos (LE)
y (TE) se encuentran respectivamente favorecidos en la estructura de la molécula
por la alta conjugación del sistema y por formación de radicales cargados. Las
19
formas resonantes posibles del estado excitado (LE) y (eT) se presentan en el
(Esquema 15). Se plantea la formación de los radicales sobre el aldehído y el
nitrógeno del grupo piridilo en el estado excitado, ya que como se mostró por medio
de la espectroscopia RMN y de acuerdo con el mecanismo de los fenómenos (PET),
la densidad de carga de estos sustituyentes se encuentra altamente conjugada con
la estructura heteroaromática.
Esquema 15. Formas resonantes por conjugación y separación de cargas del estado excitado3.
La separación de cargas conduce a la estabilización del estado excitado en mayor
medida que la conjugación en solventes polares por la torsión del grupo dietil amino,
por lo que en el espectro de emisión para solventes diferentes a CHX: THF, ACN,
DCM y EtOH, la banda principal asociada con la emisión a partir de estados
localmente excitado (LE) no se presenta y la banda asociada con fenómenos de
transferencia de carga (eT) domina la emisión. Esto provoca y justifica el mayor
desplazamiento de Stokes a medida que la polaridad del solvente aumenta.
20
El rendimiento cuántico del pirazol 6 en cada solvente, usando el antraceno como
referencia se presenta en la (Tabla1). Se observa que a medida que la polaridad
disminuye la elasticidad de la oscilación entre los estados excitados produciéndose
en general el apagado de la fluorescencia.
Tabla 1. Resultados del experimento de solvatocromismo. Absorción Fluorescencia
(exc. 360 nm) Desplazamiento
de Stokes (nm) Solvente λmax
Abs (nm)
ε (Lmol-1cm-
1)
λmax Em (nm)
φ (%)
CHX 390 31054,8 441-460 5.36 70-51
THF 405 29062,4 470 4.88 65
DCM 470 31389,2 471 4.54 64
ACN
EtOH
401
407
34381,9
59092,8
480
480
2.62
0.01
79
73
Por último, se realizaron estudios de la interacción del pirazol 6 con diferentes
metales de transición en estado de oxidación (II) (Esquema 16) ya que estos
cationes presentan alta afinidad hacia átomos de nitrógeno donores, al ser especies
blandas. Se considera que la interacción entre los cationes y el ligando no genera
tensiones estéricas debido a la rigidez característica del fluoróforo, pero se observa
que cambia los mecanismos de fluorescencia basales, favoreciendo mecanismos
de relajación no radiativos. Esta situación es común con metales de transición
debido a que cationes con orbitales d parcialmente llenos dependiendo de la
distancia de interacción metal ligando se ven involucrados en fenómenos de
transferencia de carga ligando metal (LMTC) y de transferencia de energía que
estabilizan como regla general el estado excitado y apagan la fluorescencia. En
solventes polares donde el estado excitado (eT) es principal, el apagado de la
fluorescencia tiene mayor proporción por la transferencia de la carga formal del
ligando al metal, fenómeno que se observa en la interacción con todos los cationes
divalentes.
Por otra parte, es probable que el ligero encendido de la fluorescencia que se
presenta con el Al+3 se deba a la interacción directa de este catión con el grupo
amino de la cumarina (interrupción de (PET) y transiciones (n-π*)), evitando que el
par libre del nitrógeno interactúe con el orbital LUMO molecular (lo que produce
estados localmente excitados) o con el orbital LUMO del fragmento aceptor (que
genera un estado excitado por separación de cargas). Al interrumpir la interacción
(n-π*) entre el grupo dietilamino y el sistema heteroaromático no se presenta la
separación de cargas en la molécula y se impide la relajación (TICT), por lo que no
solo se disminuye el efecto del solvente en el sistema, sino que se evita el fenómeno
21
(LMCT) tenga lugar, manteniendo la intensidad y energía de la emisión próxima a
la emisión del pirazol 618.
Esquema 16. Formas resonantes por conjugación y separación de cargas del estado excitado.
6. Conclusiones
En este trabajo se desarrolló a pesar de los inconvenientes sintéticos que se presentaron la síntesis del sistema hibrido 4-formil-pirazolo-cumarina 6 y se realizaron estudios preliminares de su fluorescencia e interacción con algunos cationes metálicos. Aunque resulta necesario el estudio a fondo de la reacción de Vilsmeier para optimizar las condiciones de reacción, el sistema 4-formil-pirazolo-cumarina fue obtenido de acuerdo con el plan inicialmente propuesto en una metodología “one-pot” a partir de la hidrazona 5 identificando y caracterizando también el principal producto secundario de la reacción. En relación con los estudios preliminares de fluorescencia, se encontró la interacción poco selectiva con los cationes metálicos divalentes, pero a su vez fue posible la se identificación de algunos de los fenómenos fotofísicos principales que ocurren de acuerdo a la estructura del sensor. Se espera en estudios futuros, aprovechar el grupo 4-formil en la estructura para la post-funcionalización de la molécula orientada a la obtención de quimiosensores fluorescentes.
22
7. Procedimiento experimental
Synthesis of 3-acetyl-7-(diethylamino)-2H-chromen-2-one.
2.593 g (10 mmol, 1 eq) of 4-(diethylamino)-2-hydroxybenzaldehyde 1 were
mixed with ethyl acetoacetate 2 (1.431 g, 11 mmol, 1.1 eq) and then dissolved in
10 mL of ethanol. Subsequently, 0.02 mL of piperidine were added and brought
this three-compound mixture to reflux until the appearance of an intense yellow
crystalline solid suspended was evidenced and complete conversion of 1 was
observed through TLC. After stopping the heating and allowed the reaction
mixture to cool at room temperature, it was cooled at 2°C for 12 hours. The solid
precipitated in crystalline form was filtered and washed with small portions of
ethanol giving a yield of 95%. Finally, the solid product 3 was characterized using
NMR and GC-MS.
3-acetyl-7-(diethylamino)-2H-chromen-2-one 3: C15H17NO3 95%, yellow
crystalline solid, 1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ 8.37 (s,
1H), 7.33 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.55 (dd, J= 9.0, 2.5 Hz,
1H), 6.40 (d, J=2.5 Hz, 1H), 3.39 (q, J= 7.1 Hz, 4H), 2.61
(s, 3H), 1.17 (t, J= 7.1 Hz, 6H). 13C-NMR (400 MHz,
CDCl3) δ 195.7, 160.8, 158.8, 153.0, 147.8, 131.8, 116.3,
109.8, 108.2, 96.6, 45.1, 30.5, 12.4. m/z: 259.2
2-hydrazinylpyridine 4 synthesis:
2-hydrazinylpyridine was obtained through reaction of 2-Chlropyridine (3 mL,
31.8 mmol, 1eq) with hydrazine hydrate 23.7 mL, 486 mmol, 15 eq). The mixture
was brought to reflux for 6 hours and then, excess of hydrazine hydrate was
distillate using temperature between 210 and 220 ° C. After reaction mixture
cooling, it was carried out a liquid-liquid extraction with diethyl ether. The resulting
organic layers were dried with anhydrous sodium sulfate and solvent was
removed under reduced pressure. The product was characterized using NMR.
23
2-hydrazinylpyridine 4: C5H7N3 74%, mp 43-45°C, needlelike pale yellow solid, 1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 7.43 (t, J=
6.8 Hz, 1H), 6.66 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.62 (t, J= 6.1 Hz, 1H),
6.19(s, 1H), 3.79 (s, 2H). 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 161.2,
147.5, 137.4, 114.2, 106.9.
The synthesis of 7-(diethylamino)-3-(1-(2-(pyridin-2-yl)hydrazono)ethyl)-2H-
chromen-2-one 5 was performed by dissolving (0.778 g, 3 mmol, 1 eq) of
compound 3 and (0.486 g, 4.5 mmol, 1.5 eq) of pyridyl hydrazine 4 in 5 mL of
methanol adding 0.5 mL of a HCl solution 5N. The reaction mixture was refluxed
until the complete conversion of coumarin 3 was achieved. To quench the
process, the pH of the reaction was taken up to 9 using a concentrated solution
of NaOH and after allowing the precipitation for 12 hours at 2 ° C, the intense
orange solid was filtered and some washings were done with small portions of
methanol. The yield obtained was 84%. The product was characterized using
NMR and GC-MS.
7-(diethylamino)-3-(1-(2-(pyridin-2-yl)hydrazono)ethyl)-2H-chromen-2-one
5:
C22H22N4O2 84%, Intense orange solid, 1H-
NMR(400 MHz, CDCl3) δ 8.01 (d, J= 4.9 Hz, 1H),
7.93 (s,1H), 7.74 (t, J= 7.9 Hz, 1H), 7.54 (d, J= 8.6
Hz, 1H), 7.35 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 6.83 (t, J= 6.2 Hz,
1H), 6.60 (dd, J= 8.8, 2.1 Hz, 1H), 6.50 (d, J= 2.1
Hz, 1H), 3.44 (q, J= 7.0 Hz, 4H), 2.42 (s, 3H), 1.23 (t, J= 7.0 Hz, 6H). 13C-NMR
(400 MHz, CDCl3) δ 161.4, 156.9, 156.7, 150.8, 147.8, 142.6, 140.9, 138.0,
129.5, 119.9, 115.9, 109.1, 108.8, 107.5, 97.0, 44.5, 14.3, 12.5. m/z: 348.2
24
3-(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromen-3-yl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazole-4-
carbaldehyde 6 synthesis:
Vilsmeier-Haack reaction was used to synthetize 6 through three steps: formylation,
cyclization and formylation again. As first step, 2 apart solutions were prepared: 0.5
mL (0.822 g, 5.36 mmol) POCl3 in 2.5 mL CHCl3 and 0.6 mL (0.566 g, 7.75 mmol)
DMF in 10 mL CHCl3. Then, Vilsmeier reactant was prepared by mixing 1 mL of each
solution above, which contents (0.166 mL, 0.274 g, 1,78 mmol, 6.2 eq) POCl3 and
(0.056 mL, 0.053 g, 0.725 mmol, 2.5 eq) DMF, and leaving under nitrogen
atmosphere for 15 minutes at 0 °C. After this time 0.100 g of hidrazone 5 (0.285
mmol, 1 eq) dissolved in 1 mL of CHCl3 was added to reactant flask and an 85°C
heating was initiated. After two hours and a half it was verified that hydrazine 5 has
been completely consumed, proceeding to product cooling and then to pH 9 with a
saturated NaOH solution. Subsequently aqueous layer was extracted with
dichloromethane on a liquid-liquid extraction. The organic layer was collected and
dried with anhydrous sodium sulfate and after concentrating the product, small
portions of toluene were added and extracted under reduced pressure to reduce
DMF volume. Finally, purification of pirazole 6 was carried out through column
chromatography using a mixture (100: 1 DCM: MeOH) as mobile phase. The product
was characterized by NMR.
3-(7-(diethylamino)-2-oxo-2H-chromen-3-yl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazole-4-
carbaldehyde 6: C22H20N4O3 50%, green-yellow solid, 1H-NMR(400 MHz, CDCl3) δ
10.07 (s, 1H), 9.12 (s, 1H), 8.47 (d, J= 4.0 Hz, 1H), 8.06
(m, J= 5.1 Hz, 2H), 7.86 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 7.37 (d, J= 8.8
Hz, 1H), 7.29 (d, J= 5.5 Hz, 1H), 6.71-6.59 (m, 1H), 3.45
(q, J= 6.9 Hz, 4H), 1.24 (t, J= 7.0 Hz, 6H). 13C-NMR (400
MHz, CDCl3) δ 185.6, 161.1, 157.1, 151.4, 150.5, 149.6,
148.4, 143.7, 138.8, 130.9, 129.6, 123.7, 122.6, 113.0,
121.1, 109.2, 108.5, 97.2, 44.9, 12.4. m/z: 360.2
25
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(18) Carey, F. A.; Sundberg, R. J. Advanced Organic Chemistry, 5th ed.; Springer: New York, 2007.
Anexos
Anexo 1 . Espectro 1H-RMN de la 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3
27
Anexo 1.1. Espectro 1H-RMN de la 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3, ampliación de la zona
aromática.
Anexo 2 . Espectro 13C-RMN de la 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3
28
Anexo 3. Espectro DEPT-135 de la 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3
Anexo 4. Espectro GC-MS de la 3-acetil-7-dietilaminocumarina 3
29
Anexo 5. Espectro 1H-RMN de la 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina 5
Anexo 5.1. Espectro 1H-RMN de la 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina 5,
ampliación de la zona aromática.
30
Anexo 6. Espectro 13C-RMN de la 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina 6
Anexo 7. Espectro 13C-RMN de la 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina
31
Anexo 8. Espectro MS de la 7-dietilamino-3-(1-(2-piridilhidrazono)etil)-cumarina 5
Anexo 9. Espectro 1H-RMN del 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-
4-carbaldehido) 6
32
Anexo 9.1. Espectro 1H-RMN del 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-
pirazol-4-carbaldehido) 6, ampliación de la zona aromática.
Anexo 10. Espectro 13C-RMN del 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-
pirazol-4-carbaldehido).
33
Anexo 10.1. Espectro 13C-RMN del 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-4-carbaldehido) 6, ampliación de la zona aromática.
Anexo 11. Espectro DEPT-135 del 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-
pirazol-4-carbaldehido 6
34
Anexo 12. Espectro MS de la 3-(7-(dietilamino)-2-oxo-2H-chromen-3-il)-1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-4-carbaldehido 6.
Anexo 13. Espectro 1H-RMN del 3-cloro-3-(7-(dietilaminocumarin-3-il))-acrilaldehido 3.1
35
Anexo 13.1. Espectro 1H-RMN del 3-cloro-3-(7-(dietilaminocumarin-3-il))-acrilaldehido 3.1,
ampliación de la zona aromática.
Anexo 14. Espectro C13-RMN del 3-cloro-3-(7-(dietilaminocumarin-3-il))-acrilaldehido 3.1
36
Anexo 15. Espectro DEPT-135 del 3-cloro-3-(7-(dietilaminocumarin-3-il))-acrilaldehido 3.1