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ESTABLECIMIENTO DE UN MODELO DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL
TUMORAL
CAROL STEFANY RODRÍGUEZ JIMÉNEZ
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE
CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BOGOTÁ D. C.
2017
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ESTABLECIMIENTO DE UN MODELO DE CULTIVO TRIDIMENSIONAL
TUMORAL
CAROL STEFANY RODRÍGUEZ JIMÉNEZ
Proyecto de Trabajo de Grado para optar por el Título de Licenciado En Biología
Modalidad Pasantía
Directora
MSc. CARMEN HELENA MORENO DURÁN
Directora Externa
MSc. JOSEFA ANTONIA RODRÍGUEZ GARCÍA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE
CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
BOGOTÁ D. C.
2017
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NOTA DE ACEPTACIÓN
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___________________________________
_________________________________
Director
_________________________________
Co-Director
________________________________
Evaluador
2017
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NOTA ACLARATORIA
La universidad no se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo
debido a que estas hacen parte única y exclusivamente de sus autores.
Cap. XV, artículo 117, acuerdo 029. Consejo Superior de la Universidad Distrital
Francisco José de Caldas, Junio de 1988.
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CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................................. 6
INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 7
JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................... 9
MARCO TEÓRICO.............................................................................................................. 10
OBJETIVOS ......................................................................................................................... 13
METODOLOGÍA ................................................................................................................. 14
RESULTADOS..................................................................................................................... 19
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 30
ANEXOS .............................................................................................................................. 33
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RESUMEN
El desarrollo de técnicas de cultivos celulares 3D ha empezado a ofrecer resultados
promisorios para el campo de la investigación en la biología del cáncer en los últimos años,
sin embargo, es necesario seguir experimentando con protocolos para células tumorales y
analizar sus ventajas o falencias con nuevas líneas celulares y/o material extraído de biopsias
de diferentes tipos de tumores para los cuales aún no se han estandarizado técnicas de cultivo
de ninguna clase. Es por ello que este trabajo tuvo como objetivo establecer un modelo de
cultivo tridimensional tumoral con la técnica de esferoides tumorales multicelulares (MTS
por sus siglas en inglés) a partir de líneas celulares tumorales y biopsias de tumores de cáncer
gástrico y de endometrio, estableciendo protocolos para su siembra y análisis. Los esferoides
fueron sembrados a partir de la línea celular SiHa, partiendo de cultivos en monocapa que
posteriormente fueron tripsinizados para establecer una concentración ideal que fue
sembrada en pozos recubiertos con agarosa al 1%. Con los esferoides ya formados, se están
realizando ensayos para realizar cortes que permitan observar la estructura interna de los
mismos, los cuales aún siguen en fase análisis. Al finalizar el tiempo de trabajo se logró
establecer el protocolo para la siembra de un cultivo celular tridimensional con la técnica de
esferoide tumoral multicelular (MTS) a partir de la línea celular SiHa, así como también se
espera sembrar dichos esferoides a partir de los cultivos primarios establecidos de células
tumorales de cáncer gástrico y de endometrio. Con este protocolo se abre campo a nuevas
investigaciones de silenciamiento génico y de penetración de virus en sistemas tumorales
más complejos.
PALABRAS CLAVES: Cultivo celular 3D, Esferoides tumorales, líneas celulares.
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INTRODUCCIÓN
En la actualidad los cultivos celulares son de gran importancia para muchas áreas de
investigación científica dadas las ventajas que ofrece para la realización de estudios en tejidos
animales, remontándose a comienzos del siglo XX (Calvo Garcia, 2013) cuando fueron
realizados los primeros montajes con la idea de estudiar el comportamiento de las células
animales en un sistema controlado, cuyas variables no hubieran podido ser registradas en
sistemas in vivo (Freshney, 2007). El avance del sistema se fue dando a medida que se iban
superando los obstáculos encontrados a nivel de asepsia, estandarización de medios de
cultivo para células específicas y la eliminación y control de los múltiples contaminantes que
dificultaban el avance de las investigaciones con dichas técnicas nacientes (Calvo Garcia,
2013).
Una de las técnicas más usadas a nivel mundial es el cultivo celular en dos dimensiones, el
cual, a pesar de presentar una cantidad de ventajas con respecto al estudio de
comportamiento, migración y proliferación celular, también presenta la gran desventaja de
estar desligada de los procesos externos que desarrollan las células en los tejidos in vivo, lo
cual puede arrojar resultados sesgados a la hora de hacer cualquier tipo de pruebas, ya que
no se toma en consideración la interacción entre las células y su matriz extracelular, ni los
complejos procesos que pueden influir en la respuesta a diferentes tratamientos o que podrían
afectar la producción de factores de crecimiento y señalización.
Como respuesta a estas desventajas e imprecisiones del cultivo celular en dos dimensiones,
han nacido las técnicas innovadoras de cultivo celular tridimensional las cuales centran su
teoría en la importancia de la interacción celular y su capacidad de señalización recíproca en
cualquier proceso a observar (Freshney, 2007).
Para objeto de este trabajo se abordará específicamente la técnica de cultivo de esferoides
tumorales multicelulares (MTS por sus siglas en inglés) los cuales están definidos por Walker
(1988) como “agregados celulares que crecen por división en la periferia”. Los MTS in vitro
fueron desarrollados primariamente en los años 40s y 70s y han tenido un gran avance en los
últimos años siendo usados con gran éxito en diferentes campos científicos (Meseguer,
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Esteban, Mulero, Cuesta, & Sepulcre, 2015) y convirtiéndose en los modelos que más se
asemejan a las micro-metástasis durante la fase avascular de su desarrollo (Walker et al.,
1988). Este modelo se ha escogido debido a que los mecanismos básicos de crecimiento
celular, proliferación, y diferenciación pueden ser estudiados en un formato reproducible con
un ambiente interno dictado por el metabolismo y la respuesta adaptativa de las células
(Kunz-Schughart, Kreutz, & Knuechel, 1998).
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JUSTIFICACIÓN
Es bien aceptado el hecho de que los cultivos de células tumorales sembrados en monocapa
emulan pobremente el microambiente de un tumor sólido. Más del 90% de las drogas y las
terapias exitosamente probadas en estudios preclínicos in vitro en cultivos 2D no alcanzan a
tener la eficacia deseada ni los márgenes de seguridad necesarios y requeridos para realizar
las pruebas clínicas (Shin, Kwak, Han, & Park, 2013).
En respuesta a estas falencias aparece la técnica de cultivo celular 3D. Un MTS está
constituido por células cancerosas de líneas celulares ya establecidas o fragmentos
desagregados de tumores sólidos (Nyga, Cheema, & Loizidou, 2011), las cuales están
dispuestas en varias capas, estando las de mayor proliferación en la parte más externa, las
quiescentes en la capa media y las células necróticas en la capa interior. Un esferoide celular
presenta una gran ventaja frente a otros tipos de cultivos 3D ya que no necesita de un soporte
de adhesión ni requiere una base de andamiaje debido a la creación de una matriz celular
propia que se va formando a medida que las células se van uniendo unas a otras imitando el
ambiente del tejido de procedencia, preservando así su fenotipo celular (Nyga et al., 2011).
La investigación en terapias para tratar el cáncer a nivel celular y molecular ha venido
avanzando considerablemente en los últimos años, sin embargo, la verificación de la
efectividad de las nuevas terapias antitumorales se viene realizando sobre líneas celulares
cultivadas en monocapa que no toman en cuenta la estructura tridimensional del tumor ni las
interacciones entre las células tumorales, los otros componentes celulares del tumor, los
componentes del sistema inmune y la matriz extracelular. En este tipo de cultivos todas las
células estarían expuestas al agente terapéutico que se quiera probar, lo cual impediría la
realización de un análisis preciso de la eficacia de su penetración en la masa tumoral. Lo
anterior resalta la importancia de desarrollar y establecer técnicas de cultivo celular en las
que sea posible simular el microambiente tumoral de manera más cercana a las condiciones
in vivo, para predecir con mayor precisión el comportamiento y las interacciones celulares
dentro del tumor (Shin et al., 2013).
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MARCO TEÓRICO
CULTIVO CELULAR 3D: ESFEROIDES
Desde décadas atrás, la investigación en biología del cáncer ha venido estudiando la
heterogeneidad de tumores sólidos in vitro desarrollando cultivos en tres dimensiones, dadas
sus ventajas frente a los estudios realizados en cultivos 2D y su característica de emular más
precisamente ambientes in vivo. Entre los cultivos celulares tridimensionales más usados se
encuentran los esferoides tumorales multicelulares (MTS) los cuales son un modelo
tridimensional de complejidad intermedia entre el cultivo en monocapa y el tumor sólido,
que como se había mencionado antes, refleja mejor el comportamiento del tumor in vivo
(Finocchiaro et al., 2004). Los MTS han servido como modelo para una variedad de
aproximaciones terapéuticas experimentales y para estudios básicos en la regulación
microambiental de la proliferación celular, energía y metabolismo de los nutrientes, invasión
e interacción entre las células y la matriz extracelular. Numerosos estudios demuestran que
los MTS semejan muchas características de sitios tumorales avasculares, regiones
intervasculares de tumores sólidos o micrometástasis, con respecto a la cinética del
crecimiento y el microambiente tumoral, por ejemplo, el suministro de nutrientes y oxígeno,
el patrón de metabolitos y catabolitos, la distribución del pH y la composición de la matriz
extracelular. (Gottfried, Kunz-Schughart, Andreesen, & Kreutz, 2006)
Como se mencionó previamente, los esferoides tumorales son un puente entre el cultivo
monocapa estándar 2D y los modelos in vivo. Como los tumores, los esferoides son agregados
tridimensionales de células cancerosas que, más allá de la distancia de difusión del oxígeno,
naturalmente forma regiones de hipoxia. Adicionalmente, su señalización y perfil metabólico
se asemeja más a las células in vivo que el cultivo en monocapa. Sin embargo, como la
monocapa, los esferoides se pueden obtener en cultivo y son más fáciles de manipular que
los tumores, por lo que han sido ampliamente usados para investigar el desarrollo de tejidos
tumorales. (Grimes, Kelly, Bloch, & Partridge, 2014)
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Estructura
En la formación inicial de esferoides las células tumorales deben interactuar entre ellas
directamente o a través de puentes de matriz extracelular, los cuales interconectan las células
dentro de los esferoides. La agregación de células cancerosas en esferoides puede estar
mediada además por una gran variedad de mecanismos de adhesión celular tales como la
unión entre integrinas, fibronectina y colágeno, y la unión célula-célula mediante
asociaciones de cadherina. (Sodek, Murphy, Brown, & Ringuette, 2012).
El centro del esferoide es una zona de hipoxia donde predominan células
necróticas/apoptóticas, en la zona intermedia predominan células quiescentes y en la periferia
células en división activa. Las zonas de hipoxia pueden desarrollarse en un diámetro de
400µm dependiendo del tamaño del esferoide y de la actividad metabólica de las células
cancerosas y reflejan claramente cómo, en cáncer, la glicólisis es la ruta principal para
generar su energía. Pese a que los esferoides carecen de interacciones con otras células del
carcinoma y no tienen la capacidad de inducir angiogénesis, tienen una compleja red interna
organizada que incluye interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular, en la cual,
cada célula tiene diferentes condiciones de espacio, disponibilidad de nutrientes, oxígeno y
exposición a otros tipos de estrés físico y químico, semejando más adecuadamente el tumor
(Alépée, Bahinski, Daneshian, Wever, & Fritsche, 2014; Kawano, Kantak, Murai, Yao, &
Kramer, 2001; Santini, Rainaldi, & Indovina, 2000)
Crecimiento
Los MTS crecen en un medio suplementado con suero fetal bovino convencional (SFB) sin
suministro exógeno de componentes de la matriz extracelular. Varios métodos pueden ser
usados para su cultivo, pero el principio básico es el mismo: se proveen las condiciones
óptimas para lograr que las fuerzas adhesivas célula-célula sean mayores que las de célula-
sustrato, impidiendo así que las células tumorales se adhieran al material plástico subyacente.
De esta manera se promueve la adhesión entre las células, formando una estructura esférica
redondeada. Dependiendo de la línea celular y el sistema que se use, los MTS pueden ser
obtenidos después de 1 a 7 días de cultivo (Weiswald, Bellet, & Dangles-Marie, 2015).
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Cuando están en crecimiento, los esferoides despliegan un gradiente de células en
proliferación de las capas externas con células quiescentes localizadas en el centro. Cuando
las células centrales son privadas de oxígeno y glucosa, mueren y forman la zona necrótica.
Esta heterogeneidad celular es similar a la que se encuentra en las microregiones avasculares
de los tumores (Sutherland, 1988).
Beneficios y usos
Los MTS pueden producirse fácilmente en el laboratorio y utilizarse para simular el
crecimiento tridimensional, la organización espacial, las interacciones poblacionales, los
contactos célula-célula, la presión selectiva del microambiente tumoral o como modelo para
el estudio del crecimiento avascular (Ward & King, 1997), el papel de la configuración
tridimensional en la expresión génica, la validación de tratamientos citotóxicos, y el estudio
de la penetración de drogas cito-tóxicas, anticuerpos y otras moléculas utilizadas en terapias
dirigidas (Carlson, Pichon, & Treherne, 1977; Sutherland, 1988). También se han utilizado
para estudiar la multi-resistencia puesto que las células expuestas a condiciones de hipoxia,
acidez o menor concentración de nutrientes, modulan su patrón de expresión génica para
sobrevivir, lo que incrementa su resistencia al efecto de la mayoría de las drogas
antitumorales, a la inmunoterapia y a varias clases de radioterapia (Desoize & Jardillier,
2000). Los MTS son particularmente relevantes en el desarrollo de nanomedicinas ya que la
penetración de la droga encapsulada en los tejidos tumorales puede alterarse por las
propiedades del vehículo de entrega (Mikhail, Eetezadi, & Allen, 2013).
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Establecer un modelo de cultivo tridimensional tumoral (MTS) a partir de la línea celular
SiHa de cáncer de cuello uterino y de biopsias de tumores de pacientes con diferentes tipos
de cáncer.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.1.1 Establecer cultivos celulares primarios a partir de biopsias de pacientes con cáncer.
1.1.2 Desarrollar una metodología óptima para el cultivo de esferoides tumorales a partir
de líneas celulares tumorales y de biopsias de pacientes con cáncer.
1.1.3 Analizar la viabilidad, proliferación y microambiente de los esferoides.
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METODOLOGÍA
REQUISITOS EXIGIDOS PARA INICIAR LA PASANTÍA
Curso de buenas prácticas clínicas: Se realizó este curso de 14 horas en línea, en el que se
abordaron temas de historia, leyes y protocolos de las buenas prácticas clínicas, así como
también el trato con los pacientes y el tratamiento de los datos y su confidencialidad.
(Certificado Anexo 1)
Curso de Inducción: Con una duración de 5 horas, este curso comprendió temas de
bioseguridad, salud ocupacional, manejo de residuos y lineamientos para el trato con
pacientes. El curso fue realizado el día 3 de octubre.
1. Cultivos celulares (medio DMEM suplementado al 10% con suero fetal bovino)
1.1 Cultivo primario en monocapa a partir de líneas celulares
Usando la línea celular SiHa (Células de tejido canceroso cervical positivas para HPV-16),
se siembran cajas de 75cm2 con medio DMEM suplementado al 10% con suero fetal bovino.
Al alcanzar la confluencia, se les tripsiniza y se abren en segundas cajas para mantener el
cultivo.
1.1.1. Descongelamiento
Las células SiHa, conservadas en críotubos con medio de congelación (Suero fetal bovino al
10% con Dimetil Sulfóxido), son retiradas del nitrógeno líquido, suspendidas y
descongeladas rápidamente en medio DMEM + suero fetal bovino al 10%, ya que el DMSO
es un reactivo letal para las células en estado líquido. Se centrifuga la suspensión celular a
1500rpm por 7 minutos y se descarta el sobrenadante. El precipitado celular se resuspende
en 3 a 4 ml de medio DMEM+SFB10% y se siembra en cajas de 25cm2. Las cajas se incuban
a 37°C en atmósfera humidificada con 5% de CO2 en aire por 24 horas y se realiza cambio
de medio para eliminar detritos y células muertas que no se hayan adherido.
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1.1.2. Tripsinización
Cuando las células han alcanzado un 80% o más de confluencia, se realiza un pase de células
a una nueva caja. Se inicia retirando todo el medio de la caja de cultivo. Posteriormente, se
lavan las células con PBS para retirar cualquier residuo de medio y se agregan de 1 a 1.5ml
de Tripsina al 0.5% y se incuban a 37°C por 2 minutos y se golpea la caja firmemente. A
continuación, se agregan 3ml de medio DMEM+SFB10% para inactivar la tripsina y se
homogeniza con un pipeteador. La suspensión celular se transfiere a un tubo falcon, se
centrifuga a 1500rpm por 7 minutos, se descarta el sobrenadante y el precipitado se
resuspende en 8 ml de DMEM+SFB10% para transferirlo a cajas de 75cm2. Las cajas se
incuban a 37°C en atmósfera humidificada con 5% de CO2 en aire.
1.2 Cultivo primario en monocapa a partir de biopsia
Los cultivos primarios se establecen a partir de biopsias de pacientes con diferentes tipos de
cáncer. Las biopsias se lavan con medio RPMI 1640 para remover sangre contaminante, se
retira el tejido adiposo o necrótico con un bisturí y la biopsia se corta en fragmentos de 1-2
mm3 y se incuba a 37°C por 1-2 h en medio RPMI con 0.5 mg/ml de colagenasa II (Sigma).
La suspensión celular se filtra con una membrana de nylon con tamaño de poro de 100µm
(Sigma).
Posteriormente, se adiciona Suero Fetal Bovino (SFB) al 10% para bloquear la actividad
proteolítica de la enzima y la viabilidad celular se determina por exclusión con azul de trypan.
La suspensión celular se lava dos veces con Medio RPMI suplementado con SFB, y las
células se distribuyen a razón de 10.000 células/ml en cajas de cultivo celular T-75 y se
incuban en medio RPMI con 20% de suero fetal bovino. El medio de cultivo se cambia dos
veces por semana.
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1.3 Cultivo de MTS
1.3.1. Recubrimiento de pozos con agarosa
Se prepara un recubrimiento para los pozos con el fin de que las células no se adhieran al
material plástico del fondo de los pozos. Se prepara el recubrimiento agregando 0,5 g de
agarosa a 50 ml de DMEM sin suplementar. La mezcla se esteriliza en autoclave a 121°C y
15lb de presión por 15 minutos. Posteriormente, los 8 pozos centrales de una caja de cultivo
celular de 24 pozos, se cubren con 0,5ml de medio de cultivo con agarosa al 1% y se deja
gelificar. Para iniciar el cultivo de MTS a partir de líneas celulares, se usan células
desprendidas de una caja de cultivo de 75cm2 en confluencia con el mismo protocolo de
tripsinización.
1.3.2. Recuento celular
El precipitado celular se resuspende en 1ml de medio DMEM+SFB10%. Se toman 10µl de
la suspensión y se mezcla con 10µl de azul de tripan. A continuación, se ponen 10µl de la
nueva suspensión en la cámara de Neubauer y se realiza el recuento siguiendo los cálculos
de la cámara.
𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 ∗ 10000𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠
𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛= 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 1𝑚𝑙
1.3.3. Determinación de la concentración celular ideal
Se siembran diferentes concentraciones celulares, partiendo de una concentración estándar
de 3,72 x 104 células por pozo (siguiendo protocolo Freshney, 2007). Se ensayan 6
concentraciones diferentes, haciendo dilución de 1:1 en cajas de 24 pozos previamente
recubiertas con medio DMEM más agarosa al 1%, con el fin de no permitir que las células
se adhieran al fondo del pozo y permitirles que se agreguen libremente. Se realiza el
seguimiento del crecimiento de los esferoides mediante un registro fotográfico.
1.3.4. Siembra de esferoides
Se siembra la concentración ideal de células encontrada anteriormente en cada uno de los 8
pozos centrales recubiertos, y se adicionan 500 µl de DMEM+SFB al 10%. Para prevenir la
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deshidratación y posibles contaminaciones del cultivo, se adicionan 500 µl de PBS en los
pozos exteriores. Una o dos veces por semana se agregan 300 µl de medio muy suavemente
de manera que resbale por las paredes del pozo para asegurar que el esferoide no se disgregue.
En caso de tener un medio muy metabolizado se procede a retirar cuidadosamente una parte
del mismo con una pipeta.
1.3.5 Seguimiento
Para verificar el crecimiento y agregación de las células, se observan periódicamente en el
microscopio invertido, y por medio del dispositivo CytoSmart® proporcionado por la
empresa Gen Products, se realiza un seguimiento preciso minuto a minuto. El software del
dispositivo permite tener un registro en vídeo de la formación de los esferoides.
1.4. Análisis
Una vez que los MTS alcanzan un tamaño aproximado de 1mm de diámetro, se realizan
varios ensayos para el montaje de los cortes en láminas y hacer el análisis de su estructura
interna.
Ensayo 1: Se retira el esferoide del pozo cuidadosamente succionándolo con una pipeta
pasteur y se coloca sobre una capa de Tissue-tek® en la placa de corte del criostato. Se coloca
una segunda capa de Tissue-tek® y se procede a realizar cortes de 3µm de diámetro. Estos
cortes son fijados con isopropanol y teñidos con hematoxilina & eosina.
Ensayo 2: Se agregan 10µl de azul de metileno al pozo que contiene el esferoide y se dejan
en tinción por 15 min. Posteriormente se retira el esferoide del pozo cuidadosamente
succionándolo con una pipeta pasteur y se coloca sobre una capa de Tissue-tek® en la placa
de corte del criostato. Se coloca una segunda capa de Tissue-tek® y se procede a realizar
cortes de 3µm de diámetro. Estos cortes son fijados con isopropanol y teñidos con
hematoxilina & eosina.
Ensayo 3: Se agregan 10µl de azul de Evans al pozo que contiene el esferoide y se dejan en
tinción por 15 min. Posteriormente se retira el esferoide del pozo cuidadosamente
succionándolo con una pipeta pasteur y se coloca sobre una capa de Tissue-tek® en la placa
de corte del criostato. Se coloca una segunda capa de Tissue-tek® y se procede a realizar
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cortes de 3µm de diámetro. Estos cortes son fijados con isopropanol y teñidos con
hematoxilina & eosina.
Ensayo 4: Se retira el medio del pozo cuidadosamente sin succionar el esferoide y se fija con
formol. Después de 24 horas, se procesan para embeberlos en parafina y realizar los cortes
en el micrótomo.
Ensayo 5: Se retira el esferoide del pozo cuidadosamente succionándolo con una pipeta
pasteur y se realizan dos lavados con PBS. Posteriormente, se fijan en paraformaldehido al
4% y se embebe en una solución de agarosa al 1.5% para finalmente realizar los cortes como
usualmente se haría con cualquier tejido en el micrótomo.
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RESULTADOS
MTS A PARTIR DE LA LÍNEA CELULAR SiHa
Los MTS en pozos se analizaron mediante la medición regular de su diámetro (2-3 veces por
semana) usando seguimiento fotográfico por dos semanas (Fig 1 - 4), para determinar cuál
de las concentraciones es la que mejor se agrega y determinar si, con el método
implementado, los esferoides estarían proliferando o solo agregándose. La evidencia fue
tomada los días 15,18, 21 y 23 de noviembre. Las fotos fueron tomadas en un microscopio
óptico en aumento de 4x con una cámara de 13MP.
Pozo # Cantidad de células Medio Figura
1 3,72 x 104 500µl 1
2 1,36 x 104 500µl 1-2
3 9,30 x 103 500µl 2
4 4,65 x 103 500µl 3
5 3,72 x 103 500µl 4
6 2,42 x 103 500µl 4
Al hacer el seguimiento fotográfico, es evidente que los esferoides no solo se agregan al pasar
un par de días de sembrados, sino que también empiezan a proliferar y a aumentar su tamaño.
Estos pozos fueron mantenidos por un mes después del último registro fotográfico y allí se
pudo evidenciar que en el de menor concentración (pozo 6) las células seguían proliferando
y agregándose después de 6 semanas (Ver video enlace anexo 2).
La concentración de células ideal escogida para sembrar los MTS fue la de los pozos 3 y 4,
ya que en estos se evidenció una mayor compactación, y no se observaron células dispersas
en el medio de cultivo, lo cual sucedía en los pozos que se sembraron con una mayor
concentración de células (Fig. 6). Los esferoides con esta concentración escogida se
agregaban y proliferaban más rápidamente que en los pozos de menores concentraciones
(Fig. 4) en el término de dos semanas.
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Para evidenciar el movimiento de las células agregándose, se usó el equipo CytoMate® con
el software CytoSmart® proporcionado por la empresa Gen Products (Fig. 5), con el cual fue
posible llevar registro minuto a minuto de varios esferoides, tanto para los primeros minutos
en que se agregaban las células, como también en viejos esferoides que después de un mes
seguían proliferando agregándose (Video enlace anexo 2 y 3).
Al tener la concentración ideal para la siembra de los MTS, se inicia la siembra en masa para
hacer los cortes y el análisis de los mismos. Se siembran todos los esferoides con una
concentración estándar de 9,30 x 103 células por pozo y al cabo de una semana se obtienen
los esferoides agregados que se pueden observar a simple vista (Fig. 7). Estos son
examinados con microscopio invertido en aumento de 10x (Fig. 8) con el fin de revisar la
compactación de las células.
Además del registro fotográfico con el que se hizo seguimiento a los esferoides, se verificó
la viabilidad de los mismos sembrando un esferoide de cada caja de 24 pozos en una caja de
cultivo de 25cm2 (Fig. 9). A partir de esta prueba se inician los ensayos para realizar los
cortes.
Ensayo 1: Los esferoides, al ser de un color parecido al del Tissue-tek® congelado, se
confunden y no es posible determinar donde iniciar la realización los cortes, ya que no se
logra diferenciar el lugar en donde se encuentra el esferoide.
Ensayo 2: La tinción con azul de metileno se realiza en diferentes proporciones, usando los
esferoides más antiguos (1 mes). Se agregan 10µl, 25µl, 50µl y 100µl en pozos diferentes
por 15 minutos, para determinar la cantidad ideal de tinción que permita diferenciar los
esferoides en el momento de transferirlos al Tissue-tek®. Al transferir los esferoides de los
pozos con mayor concentración de tinción, estos se desagregaron casi por completo y no se
pudieron ubicar en la placa para el corte. Los esferoides ubicados en los pozos con 10µl de
tinción estaban más sólidos, y fueron transferidos al Tissue-tek® con éxito. Se realizaron los
cortes (Fig. 10) y se fijaron las láminas con Isopropanol (Fig. 11), sin embargo, al realizar la
tinción no fue posible apreciar su estructura (Fig. 12) debido a que el esferoide se dispersó
por completo en el paso de la fijación.
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Ensayo 3: La tinción con azul de Evans, en la misma proporción de 10µl por 15 min en cada
pozo, da mejores resultados y los esferoides quedan compactos y fáciles de transportar, por
lo cual son transferidos con éxito al Tissue-tek®. En esta oportunidad no es posible realizar
los cortes por problemas de mantenimiento del criostato, por lo cual, a pesar de tener el
esferoide embebido en el Tissue-tek®, debe ser descartado.
Ensayo 4 y 5: Estos ensayos aún están en proceso. Para el ensayo 4, los esferoides fueron
fijados en formol, teñidos con azul de evans y embebidos en parafina, y aún está pendiente
la realización de los cortes. Para el ensayo 5 los esferoides ya han sido sembrados y se espera
embeberlos en agarosa tan pronto alcancen su tamaño ideal.
CULTIVOS PRIMARIOS
Para iniciar el crecimiento de los esferoides a partir de cultivos primarios, se tomaron células
congeladas obtenidas de biopsias de cáncer gástrico y cáncer de endometrio en pase I. Se
inició el cultivo en monocapa siguiendo el protocolo establecido. Actualmente el cultivo
empieza a mostrar avances y aún está pendiente la siembra de los esferoides, pues los cultivos
aun no alcanzan la confluencia necesaria.
Fig.1 Registro fotográfico pozos #1 y #2: En los pozos 1 y 2 se sembraron concentraciones
de 3,72 x 104 y 1,36 x 104 células respectivamente por pozo. A pesar de que la primera sería
la concentración recomendada en el protocolo de Freshney (2007), fue necesario realizar los
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ensayos para la concentración ideal, ya que su protocolo estaba determinado para iniciar los
esferoides en cajas de cultivo de 25cm2 y después ser transferidos a pozos.
Fig. 2: Registro fotográfico pozos #2 y #3: En el último de los pozos #2 (arriba izquierda) se
evidencia la presencia de la capa delgada de células fuera del esferoide fuera de foco, pero al
mirar los pozos #3 con la concentración ideal de células de 9,30x104 células por pozo, se nota
como dicha capa no aparece.
Fig. 3: Registro fotográfico pozos #4: Sólo dos de los pozos #4, con concentración de 4,65
x 103 células por pozo mostró una compactación aceptable. En el pozo 4.3 (arriba derecha)
hubo la presencia de un pequeño artefacto en forma de filamento, en el cual las células
parecieron adherirse y tomar su forma. En el pozo 4.2 (abajo izquierda) no hubo ninguna
proliferación de las células.
23
Fig. 4: Registro fotográfico pozos #5 y #6: A pesar de que la concentración de 3,72 x 103
células por pozo, sembrada en los pozos #5, muestra una compactación óptima en dos de los
pozos (izquierda) no alcanza un tamaño ideal en el término de dos semanas para realizar
ensayos con los cortes. Estos esferoides fueron usados para los ensayos al alcanzar un mes y
medio de sembrados, por lo cual se concluye que no es una concentración adecuada por su
largo tiempo de crecimiento. En los pozos #6 solo hubo uno que se agregó y proliferó, aunque
el registro fotográfico no se incluye en esta figura por calidad de la imagen, sin embargo, en
los otros 3 pozos con concentración de 2,42 x 103 células por pozo no se obtuvieron
resultados promisorios como se puede observar en la imagen (abajo derecha).
Fig. 5 Derecha: Equipo CytoSmart® Lux; Izquierda: CytoMate® Software. Tomado de
www.cytosmart.com – El equipo es versátil e ideal para la ubicación en la incubadora. Fue
muy sencillo de montar y realizar el registro en video, sin embargo, tiene la necesidad de
24
estar conectado a una red de WiFi para enviar los datos, por lo cual no fue posible hacer un
registro de más de un día. (Enlace para los videos en anexo 2 y 3).
Fig. 6 Capa delgada de células no agregadas al esferoide en pozos #1 y #2: Al observar los
esferoides en microscopio óptico se podía enfocar fácilmente esta capa de células no
agregada, la cual proliferaba al igual que el esferoide.
Fig.7 Esferoides formados después de una semana: En la imagen se pueden observar los
pequeños puntos blancos en el centro de cada pozo. Estos son los esferoides ya formados
después de una semana de siembra con la concentración ideal.
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Fig. 8 Esferoides formados. Arriba: Aumento 10x Abajo: Aumento 40x: Al observar los
esferoides en el microscopio invertido se pudo tener más detalle de su formación, a pesar de
que la imagen se vuelve difícil de enfocar por su tridimensionalidad.
Fig. 9 Células desagregadas del esferoide adheridas en monocapa: Para comprobar la
viabilidad de las células, se tomaba un esferoide de cada caja después de dos semanas de
sembrado y se desagregaba para ser sembrado en monocapa. Al día siguiente se revisaba el
cultivo y se evidenciaba que efectivamente las células del esferoide estaban vivas, ya que
estas se adherían al fondo de la caja de cultivo.
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Fig. 10 Proceso de corte en el criostato: En la imagen se puede apreciar el proceso de corte
de la placa de Tissue-tek® (izquierda) y como este se adhiere a la lámina portaobjetos
(derecha).
Fig. 11 Fijación en Isopropanol: Después de que el corte se ha adherido a la lámina
portaobjetos, se realiza el proceso de fijación en pozos de isopropanol.
27
Fig. 12 Ensayo de corte #2. Izquierda: Aumento 4x; Derecha: Aumento 10x: No es posible
apreciar la estructura del esferoide en los cortes hechos en el ensayo #2. Se infiere que en el
paso de fijación hubo una dispersión total de las células, por lo cual en la imagen solo se
ven artefactos y células totalmente desagregadas.
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CONCLUSIONES
Se desarrolló una técnica eficiente y efectiva de cultivo de esferoides tumorales provenientes
de líneas celulares, los cuales pueden obtenerse en un lapso menor a dos semanas y pueden
ser usados en múltiples estudios de respuesta a diferentes tratamientos del cáncer con terapias
de silenciamiento y expresión génica. Los esferoides tumorales son una técnica de cultivo
celular de amplia versatilidad en el campo de la investigación en biología del cáncer, gracias
a su particularidad de ser la fase intermedia entre los cultivos en monocapa y los modelos in
vivo. Sin embargo, para obtener esferoides de cultivos primarios se necesita un mayor tiempo
para que el cultivo en monocapa alcance la confluencia y se puedan sembrar los esferoides
exitosamente.
Es importante tener en cuenta que a pesar de que es posible generar una estructura
tridimensional a partir de un cultivo de células, el MTS es un agregado celular muy frágil y
se requiere de gran cuidado y experticia para la estandarización de un protocolo adecuado
para la realización de los cortes necesarios y así llevar a cabo los análisis.
RECOMENDACIONES
Muchos de los obstáculos para el desarrollo completo de la pasantía se debieron al corto
tiempo que se tuvo para desarrollar los protocolos, por lo cual se recomienda desarrollar
estas técnicas en trabajos de investigación que tengan un mayor lapso de tiempo para su
ejecución y análisis.
La siembra de cultivos primarios es una técnica sensible y su éxito depende de muchos
factores azarosos debido a que son células que hasta ahora deben empezar a desarrollarse
in vitro y muchas de ellas pueden no adaptarse al cambio, por ello se recomienda sembrar
una gran cantidad de cajas de cultivo de manera que aumente la probabilidad de encontrar
aquellas que puedan proliferar y así poder establecer el cultivo.
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AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por brindarme la formación
académica necesaria para la realización de este trabajo, al Instituto Nacional de Cancerología
por abrirme las puertas y darme la oportunidad de desarrollar esta pasantía en sus
instalaciones, al Grupo de Investigación en Biología del Cáncer por acogerme en su familia
y respaldar el proyecto, a mi mentora, la doctora Josefa Antonia Rodríguez por todo el tiempo
que dedicó a guiarme en el proceso y por alentarme cada vez que los obstáculos parecían ser
insuperables, a la investigadora Jessica Ruíz por su acompañamiento y paciencia al
enseñarme los procedimientos básicos de cultivo celular, a la profesora Carmen Helena
Duran por sus consejos y su gran apoyo, a mi familia y amigos y a todas las personas que de
una u otra manera contribuyeron a que este trabajo fuera posible.
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ANEXOS
Anexo 1: Certificado buenas prácticas clínicas
https://drive.google.com/open?id=0B7X1ZxOf5b8AUGktel9iaU85aWs
Anexo 2: Esferoide después de un mes de sembrado aun agregándose
https://drive.google.com/open?id=0B7X1ZxOf5b8AUHFhMHpQTEJ1V2s
Anexo 3: Primera etapa de agregación de las células tumorales
https://drive.google.com/open?id=0B7X1ZxOf5b8ANkFLWFhuZnR4aFk