Especies RO generadas por citrina que causan detención del ciclo celular que conduce a la apoptosis a través de la vía

mitocondrial intrínseca en la piel del ratón.

Citrinina Micotoxina nefrotóxica y hepatotóxica producida por varias especies de los géneros Aspergillus, Penicillum y Monascus (metabolito secundario). Se sabe además que se produce como un contaminante indeseable en los productos de fermentación del hongo Monascus purpurea (generalmente descrita como arroz de levadura roja ) utilizado en Asia durante siglos para la conservación de carne y como colorante alimentario.

OBJETIVO: estudiar si las ROS inducidas por CTN son responsables del daño del ADN que conduce a la apoptosis en la piel del ratón.

Exposición a Micotoxina Los Humanos y Animales pueden estar expuestos a micotoxinas a través de la ingestión, inhalación o contacto con la piel.

Materiales y métodos Animales Ratones albinos suizos (hembras) de seis a siete semanas de edad (20 ± 3 g),

Marcadores de estrés oxidante● GSH ● La tasa de peroxidación lipídica

(LPO)● actividad de la catalasa ● glutatión peroxidasa

1º grupo Los 4 grupos restantes

Aplicación tópica de 0,2 ml de acetona.

recibieron una única dosis tópica de 50 μg de CTN / 0,2 ml de acetona por ratón

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3830063/

Medición ROS y ensayo de cometa alcalinola viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión con azul de tripano.El daño al ADN se evaluó mediante el ensayo de cometa alcalino.

Análisis del ciclo celular El tratamiento fue el mismo que el descrito en los “marcadores de estrés oxidante”

apoptosisSe detectó mediante citometría de flujo de suspensiones de células individuales mediante una unión a anexina V-FITC

Western BlotEl programa de tratamiento fue el mismo que se describe en la sección de marcadores de “estrés oxidante”. El anticuerpo unido se detectó mediante quimioluminiscencia mejorada usando reactivos de detección de transferencia Western Amersham ELC

CaspasasSe sacrificaron ratones tratados con acetona y CTN a las 12, 24, 48 y 72 horas. Se toma una muestra de piel dorsal sin grasa. Usando BSA como patrón y 100 μg de lisado se sometieron a ensayos de actividad de caspasa usando sustratos específicos conjugados con 7-amino-4-trifluorometil cumarina como fluoróforo

Materiales y métodos

Efecto de los secuestradores de ROS en la generación de ROS inducida por CTN, detención del ciclo celular y apoptosis.

Los animales se dividieron aleatoriamente en ocho grupos de cinco ratones cada uno.

Grupo 1: se trató con 0.2 ml de acetonaGrupo 2: se trató con CTN 50 μ/ratón por 24h. Grupo 4, 6 y 8: fueron tratados tópicamente con con BHA 55μmol/ 100μL, Quer 10μmol/ 100μL ó Toco 40μmol/100μL 30 minutos antes de CTN 50 μ/ratónGrupo 3, 5 y 7: se trataron solo con BHA 55μmol/100μL, Quer 10μmol/ 100μL y Toco 40μmol/100μL respectivamente.

Se extirpó la piel dorsal. Las mediciones de ROS, apoptosis y análisis del ciclo celular se realizaron como en las muestras anteriores.

Análisis estadísticoLas diferencias entre los grupos se analizaron usando ANOVA de una vía con pruebas de comparación Bonferroni de intergrupos p <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Efecto de la aplicación tópica de CTN sobre marcadores de estrés oxidativo en piel de ratones.

(A) Efecto dependiente de la dosis de CTN sobre LPO epidérmico, contenido de carbonilo de proteína, contenido de GSH y actividades de catalasa y GPx de ratones expuestos durante 24 h.

(B) Efecto dependiente del tiempo de CTN (50 μg / ratón) sobre LPO epidérmico, contenido de carbonilo de proteína, contenido de GSH y actividades de catalasa y GPx de ratones expuestos durante 12-72 h.

(C) Medición de la generación de ROS en la piel del ratón después del tratamiento con CTN (50 μg / ratón) para diferentes intervalos de tiempo.

Efecto de la aplicación tópica de CTN sobre marcadores de estrés oxidativo en piel de ratones.

1. aplicación tópica de CTN en una dosis dependiente (25-100 μg / ratón) 24h.causó un cambio significativo en los marcadores de estrés oxidante:❖ LPO (160-208%)❖ Contenido de carbonilo(221-371%)❖ Disminución de GSH (40-47%)❖ Inhibición de la actividad dérmica de catalasa

(48-55%)❖ Inhibición de la actividad de GPx (51-80%)

La dosis de 25 μg/ratón no causó ningún efecto

Efecto de la aplicación tópica de CTN sobre el estrés oxidativo.

2. Efecto dependiente del tiempo de CTN. administración tópica 50μg/ratón 12-72h.

❖ Aumento en LPO (124-211%) ❖ Aumento contenido de carbonilo (154-312%)❖ Disminución de GSH (17-59%)❖ Inhibición catalasa (44-67%)❖ Inhibición de la actividad de GPx (38-74%)

3.Aplicación tópica de CTN 50μg/ratón Mejoró la producción de ROS en la piel de ratón 12-24h. Esto indica que la generación de ROS es un evento temprano que da como resultado alteraciones en marcadores de estrés oxidante (24h).

Efecto de la aplicación tópica de CTN en el daño de ADN en piel de ratón

Para evaluar el potencial dañino para el ADN se utilizó el ensayo cometa.

Exposición a CTN 50μg/ratón 12-72h

Se observó la forma de la cola y el patrón de migración del “cometa”

❖ 12-72 h mejora significativa del momento de la cola (96-232%)

❖ ADN de la cola (64-135%)❖ Longitud de la cola (75-122%) valores máx.

24h.

El DNA de las células epidérmicas con CTN mostró la forma típica del cometa, mientras que los animales control no mostraron daño alguno observando un núcleo circular definido.

Efecto de la aplicación tópica de CTN en la distribución de la fase del ciclo celular y la apoptosis

Exposición de ratones a CTN durante 24-72 h.❖ Aumento significativo en la

proporción de las células fase G0/G1 (45-71%)

❖ Disminución en fase S (44-59%) ❖ Fase G2/M no se vio afectada

Apoptosis Anexina V y PI doble tinción de células epidérmicas.aplicación tópica de ratones con 50μg de CTN durante 24-72❖ Mejora en la apoptosis

(7.6-25 veces)❖ Las células se están

deteniendo en G0/G1 y G2/M para reparar el daño al DNA o provocar apoptosis.

Efecto de la aplicación tópica de CTN en la distribución de la fase del ciclo celular y la apoptosis

Efecto de la aplicación tópica de CTN en la expresión de p53 y p21 / waf1 Proteínas y activación de la ruta intrínseca de la apoptosis

Única aplicación tópica ❖ Expresión dérmica de p53 mejoró

con CTN (12-72h)❖ Expresión p21/ waf1 mejoró de

(24-72 h)Aplicación 24-72h❖ Sobreexpresión Bax ❖ Reducción Bcl2❖ Aumento de citocromo C en

citoplasmaAplicación CTN 12-72h❖ Mejora en la actividad de caspasa 9

(1.2-1.8 veces)❖ Activación caspasa 3 (1.7-2.2

veces) máx. 24h da como resultado la escisión de PARP.

❖ Caspasa 8 no tuvo afectación

Efecto de Scavengers de ROS en ROS inducida por CTN. Generación, detención del ciclo celular y apoptosis

La aplicación tópica de antioxidantes 30 min. antes de la aplicación de CTN. ❖ Toco: reducción de ROS 34%❖ BHA: reducción de ROS 38%❖ Quer: reducción de ROS 53%El pretratamiento con antioxidantes dio como resultado ❖ Reducción (43-49%) de células en G0/G1❖ Reducción (38-56%) en la apoptosis Ambos comparados con el grupo tratado solo con CTN

Discusión Varios estudios han demostrado que el estrés oxidante intracelular es responsable de la toxicidad inducida por CTN

● Hubo un aumento en la generación de ROS● Agotamiento significativo de GSH ● Inhibición de las actividades de GPx y

catalasa● Aumento en el contenido de LPO ● El EO puede provocar daños a nivel de ADN.

.

Para estudiar EO, daño al DNA, paro del ciclo celular y apoptosis en la piel del ratón.

1 aplicación tópica única de CTN (50 mg / ratón) durante 12-72 h causò un realce significativo en.

● (ROS) ● Detención del ciclo celular en la

fase G0 / G1 (30-71%) y fase G2 / M (56-65%) junto con la inducción de apoptosis (3.6-27%)

● Expresión de p53 (guardian) , p21 / waf1

● Relación Bax / Bcl2 y liberación de citocromo c

● Actividades caspasa (inductoras de apoptosis) 9 (22-46%) y 3 (42-54%), así como una mayor división de poli (ADP-ribosa) polimerasa. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1550296/

CTN

https://www.researchgate.net/figure/Cisplatin-induced-DNA-damage-oxidative-stress-and-apoptosis-Cisplatin-cell-interaction_fig1_284724981

Pretratamiento con bio-antioxidantes

( hidroxianisol butilado,quercetina o alfa-tocoferol)

❖ Disminución de ROS, detención en el Fase G0 / G1 del ciclo celular y apoptosis.

Lo que confirma la participación de ROS en la apoptosis y sugieren que estos bio-antioxidantes pueden ser útiles en la prevención de la toxicidad dérmica inducida por CTN.

1 aplicación tópica de CTN en una dosis dependiente (25-100 mg / ratón) 12-72 h.causó un cambio significativo en los marcadores de estrés oxidante:❖ Peroxidación lipìdica ❖ Contenido de GSH ❖ Enzimas antioxidantes

Conclusión

❖ La citrinina en vivo causa EO generando ROS capaces de causar daño en el ADN en la piel de ratón.

❖ El tratamiento tópico de bio-antioxidantes abolió el EO inducido por CTN, detención del ciclo celular y apoptosis, confirmando la participación directa de ROS en manifestaciones toxicológicas inducidas por CTN en la piel del ratón.

CTN

Conclusiones del equipo:

*No se realizó un experimento representativo puesto que la exposición fue aguda para evaluar una vía que en este caso los efectos se verán a largo plazo.

*Los grupos de ratones no fueron bien definidos.

*La necesidad de realizar este estudio es por que no se tiene evidencia de los efectos tóxicos por vía cutánea.

*Existe una correlación directa con la dosis y el tiempo de exposición.

*Se demuestra que los antioxidantes son una forma de prevenir lo efectos nocivos de la micotoxina.