Errores en la valoración de la

Testosterona en la mujer

Mesa Redonda:

”Endocrinología del Envejecimiento”

2do Congreso Bioquímico2do Congreso Bioquímico

Córdoba 2013

Hugo E Scaglia

e-mail info@iabe.com.ar

Andrógenos y crecimiento del pelo

Andrógenos

Son el principal regulador del crecimiento del pelo

Edad másavanzada

Testosterona

Pubertad y edadreproductiva

DHT

Pequeños folículosvello, virtualmente

invisible

Inhiben

ALOPECIA

Somani y col Dermatologic therapy 21: 376-391, 2008

Estimulan

Grandes folículosintermediosterminales y pigmentados

HIRSUTISMO

Hiperandrogenismo

clínico

Hiperandrogenismo Bioquímico

(Hiperandroginemia)

Alguno o todos de los siguientes niveles

TT > 0.50 ng/ml

T bio > 0.30 ng/ml

TL > 10 pg/ml

DHEAs <3000 ng/ml

A4: < 4.0 ng/ml

Frecuencia de diferentes patología

en mujeres hirsutas

Neoplasmas productores andrógenos (NPA): 0.23 %

Hiperplasia suprarrenal clásica (HAC): 0.69 %

Hiperplasia suprarrenal no clásica (HSNC): 2.06 %

HAIRAN: 3.78 %

SOP: 82.02 %

Hiperandrogenismo-Hirsutismo/ Ovulatorias: 6.75 %

Hirsutismo Idiopático: 4.47 %

Hirsutismo Idiopático

CRITERIOS DIAGNOSTICOS

1) Hirsutismo sin disfunción ovárica

(Verificada por temperatura basal y/o P4 en fase lútea)

y andrógenos normales

(Testosterona libre y DHEAs)2) Excluir patologías relacionadas

(HSNC, patologías tiroideas e ingestión de andrógenos)

DEFINICION

Hirsutismo ovulatoria

y andrógenos normales

Hirsutismo Idiopático

Azzis, R. Y col: Idiopathic Hirsutism. Endocrine Reviews

21 (4): 347-362, 2000

Hirsutismo Idiopático

( T/DHT normales – ciclos ovulatorios – sin imágenes de OP)

Hiperactividad del Receptor Conversión

periféricaReconocimiento del ERA Estabilidad

CAG

Cys

Cys

Cys

Cys

COOHNH2 AF2

Glutamina

Cys

Cys

Cys

Cys

AF1

HSPs

DHT

ZnZn

Otros factores

activan el receptor

PTHrP – TGF β - IL6

DHT5α R

Aumento de

la actividad

T

Sumamente

dificultosa

de evaluar

Hiperandrogenismo

oculto

T normal

Test de ACTH

Hiper respuesta

ORIGEN ADRENAL

Proteína

RNA Pol II

TATA

box

FAT’s

FGT’s

ERA

CBP

pCAF

AF1

AF2

AF1

AF2

Remodela

Cromatina

Actividad- Histona

acetil transferasa

Modifica el

complejo Histona

RNAm

Aumento de

la actividad

IGF 1

folículo

piloso

ACCION

LOCAL

Test de GnRH (a)

Hiper respuesta

ORIGEN OVARICO

Ovarios Poliquísticos

Ecografía: Criterios

Progesterona < 5.0 ng/ml

Sangrado ≥ 35 días

Sangrado < 10/año Polimenorrea ≤ 25 días

Algunos o todas de las

siguientes características

Oligo anovulaciónHiperandrogenismo

Bioquímico

Alguno o todos de

lossiguientes niveles

TT > 0.50 ng/ml

T bio > 0.30 ng/ml

TL > 10 pg/ml

DHEAs <3000 ng/ml

A4: < 4.0 ng/ml

Hiperandrogenismo

clínico

Parámetros clínicos y bioquímicos para defiinir el SOP

Ovarios Poliquísticos

Ecografía: Criterios

Equipo en condiciones y personal

entrenado

En lo posible transvaginal

12 o más folículos de 2-9 mm de

diámetro en uno o ambos ovario

y/o Aumento del volumen ovárico

(> 10ml)

Fórmula de vol. del elipsoide oblongo: 0.5 x largo x ancho x espesorMomento de la realización:

a) Menstruación regular: día 3-5

b) Oligo/amenorrea día 3-5 luego

de sangrado inducido con P4

Androgen Excess Society PCOS

Posibles fenotipos del Síndrome de Ovario Poliquístico

según tres diferentes consensos internacionales

Criterio: Hiperandrogenismo clínico o bioquímico (HC / HB)

más Oligoanovulación (OA) y/o Imagen de ovarios poliquísticos (OP)

Alguno o todos de los

siguientes niveles

TT > 0.50 ng/ml

T bio > 0.30 ng/ml

TL > 10 pg/ml

Alguno o todos de los

siguientes niveles

TT > 0.50 ng/ml

T bio > 0.30 ng/ml

TL > 10 pg/ml

Azziz R, Carmina E, Dewailly D, Diamanti-Kandarakis E, Escobar-Morreale HF, Futterweit W, Janssen OE, Legro RS, Norman RJ, Taylor AE, Witchel SF. The Androgen Excess and PCOS Society criteria for the POCS: the complete task force report. Fert Steril 91: 456-488, 2009

T bio > 0.30 ng/ml

TL > 10 pg/ml

DHEAs <3000 ng/ml

A4: < 4.0 ng/ml

TL > 10 pg/ml

DHEAs <3000 ng/ml

A4: < 4.0 ng/ml

Progesterona < 5.0 ng/ml

y /o Sangrado ≥35 días

Sangrado < 10/año y/o Polimenorrea≤ 25 días

HC y/o HB + OA HC y/o HB + OP

Parámetros

B

+

+

+

A

+

+

+

D

+

-

+

C

+

+

-

F

+

-

-

E

+

-

+

H

-

+

+

G

-

+

+

I

-

+

-

Hiperandrogenismo

Clínico (HC)Hirsutismo, acné, alopecia

Hiperandrogenismo

Bioquímico (HB)TT y/o TL, y/o DHEAs y/o A4

Oligo-anovulación (OA)Sangrado ≥35 dias< 10/año Polim ≤ 25 días

Posibles fenotipos

J

-

-

+

-+ ++ +- -+ +

< 10/año Polim ≤ 25 días

Poliquistosis Ovarica

NIH ▲ ▲ ▲ ▲ ▲▲

▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲Róterdam

+

NO▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲ ▲AES-PCOS

Consenso AES – PCOS - 2009

Criterio: HC / HB

más OA y/o OPResultados falsos negativos no permite

el diagnóstico de SOP

▲

Conclusiones

La exactitud en la determinación de TT

resulta de significativa relevancia en elresulta de significativa relevancia en el

diagnóstico de Hirsutismo Idiopático o en

el subtipo de SOP sin hirsutismo pero con

ovarios poliquísticos y/o alteraciones del ciclo

Introduccion

Diagnóstico de hiperandroginemia en la mujer

requiere la demostración del incremento de los

niveles en suero de Testosterona.

Sin embargo ha sido demostrado por numerosos Sin embargo ha sido demostrado por numerosos

estudios que los inmunoensayos comerciales

han mostrado una gran disparidad en los resultados

cuando los niveles son bajos, por ejemplo en las

mujeres y niños

Principales recomendaciones

POSITION STATEMENT: Utility, limitations and pitfalls

in measuring Testosterone: An Endocrine Society position

statement

W Rosner, RJ Auchus, R Azziz, PM Sluss and H Raff J Clin Endocrinol Metab 92:405-413, 2007

The Endocrine Society reached a consensus

as to TT determination.

Los ensayos directos como el RIAELISA o CLIA son técnicamentesimples, rápidos y baratos. Puedenser automatizados.

Pero♦ La T frecuentemente es sobre o

subvalorada♦ Susceptible de efecto matriz♦ No están convalidadas♦ Límite de exactitud > a 3.0 ng/ml

El RIE seguido de extracción ypurificación cromatográfica del extracto permite usar mayor volumen de suero, aumentando la sensibilidad

Pero:Susceptible de efecto matrizMuy laboriosoInsume mucho tiempoRequiere un alto grado de entrenamiento técnico

A falta de otra información, los ensayos directos tiene

muy pobre exactitud a bajas concentraciones y

y deben tratar de no ser empleados en la práctica

RESUMEN DE LOS PRINCIPALES

RESULTADOS Y RECOMENDACIONES

Los inmunoensayos realizados con el extracto del suero

purificado cromatográficamente han mostrado mayor

probabilidad de obtener resultados de mayor exactitud y

deberían ser preferidos

QUANTIFICATION OF TESTOSTERONE (T)

BY 8 IMMUNOASSAYS, AND BY

LIQUID CHROMATOGRAPHY IN TANDEM WITH

MASS SPECTROMETRY (LC-MSMS)

IN NORMAL AND HIRSUTE WOMEN.

A MULTICENTER STUDY.

PART 2: HIRSUTE WOMEN

Scaglia HE*, Aquilano DR, Buccini G; Chichizola C, Corazza N,

Corthey C, Fuillerat S, Guevel L; Ibañez G, Lacoste E, Mohr A,

Nosetto S, Orsi M, Piaggio R, Riesco O, Sandoz S, Scaglia J,

Laboratory of hormonal assay

Hospital Italiano, La Plata, ARGENTINA

Corthey C, Fuillerat S, Guevel L; Ibañez G, Lacoste E, Mohr A,

Nosetto S, Orsi M, Piaggio R, Riesco O, Sandoz S, Scaglia J,

Viola AM, Wolfthal D, Zylbersztein CC

* e mail: info@iabe.com.ar

MétodosProtocolo

Alícuotas de muestras de

sueros obtenidas de:

24 mujeres normales

15 mujeres hirsutas

En cada alícuota se

Axsym

Electroquimio

luminiscencia

(EQL)

Immulite (IMM)

Architect (arch)

Vidas

Número de

laboratorios

3

4

2

2

1En cada alícuota se

determinó TT en 18

laboratorios empleando:

kit comerciales

RIA desarrollado

LC MSMS

(Quest Diagnostic)

Vidas

RIA:

Siemens

DSL

DiaSource

Desarrollado

LC MSMS

1

3

1

1

1

1

Column set up and ether extraction of sera

Wash:Ethanol

MethanolCl2CH2: Methanol

Cl2CH2Transfer solvent layer

to alumina column

PasteurPipette

Extract purificación - Elution:

1) Ethanol 1.2 % in Hexane5 fraction of 1 ml

2) Etanol 3.0 % in Hexane5 fraccion of 5 ml

Pipette

Neutral alumina

3 cm80-200 mesh

(Fisher Sci Co)

Discard

Hexano:ether(4:1) 2 mlExtract

Serum +~8000dpm3H-T

0.5 ml ♂1.0 ml ♀

0.2 ml de every tube for measuring radioactivityRecovery:cpm supernartant x 5 / added dpm x 100

tubes 1 -5 Androstenedionetubes 5 – 10: Testosterone

3 4 5 6 8 9 101 2 7

Tube dpm Final % Extraction

Mean ± SD

n: 20 assay

10 ♀ 10 ♂

Recovery

Eligible for RIA

Evaporate

0.8 ml

Resuspend

in 0.8 ml Buffer

0.2 and 0.4 ml

to RIA ( ♂ )

100-200 µ of

serum

0.2 and 0.4 ml

to RIA ( ♀ )

200-400 µ of

serum

7 7

1

2

3

4

5

6

7

8

9

15

12

7

10

12

44

950

230

116

-

-

-

-

-

2.7

59.3

14.4

7.2

89.4%

serum serum

a) Policlonal antibody (Antigen = 6-oxime : T : BSA)

b) Tracer: 3HT ~30000dpm /0 0.1 ml

c) Standard curve: Dilution of a mixture of sera pre – measured by LC-MSMS

with values from 0.15 to 9.6 ng/ml

d) Free / bound separation: charcoal / dextran

The method allow to work in a curve zone with a coefficient of variation

lower than 6 % for T values between 0.6 – 7.2 with the following features:

a) The dilution employed show paralellism to the standard curve

b) It is possible to reliably measure TT levels from 0.3 ng / ml in men and

from 0.15 ng / ml in women

9

10

116

90

7.2

4.5

Resultados de TT por LC MSMS en Mujeres

Normales e Hirsutas con o sin acné o alteraciones

del ciclo (Quest Diagnostics, USA)

1.5

2.0

Conclusiones

1) Las mujeres consideradas

normales tenían niveles de

TT normal por LC MSMS

0 3 6 9 12 15Mujeres Hirsutas

(Número de muestras)

0 10 200.0

0.5

1.0

1.5

Mujeres normales

TT

LC

MS

MS

(ng

/ml)

(Número de muestras)

TT normal por LC MSMS

2) Dos de las 15 pacientes

con hirsutismo tuvieron

niveles normales de TT

Resultados similares han

sido publicados en el

Hirsutismo idiopático

Axs

ym (

ng

/ml)

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

upperlimit

upper limit

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

EQ

L

Ro

che

(ng

/ml)

upper limit

upperlimit

Valoración de TT por diferentes métodos y por

LC- MSMS en el suero de 15 pacientes hirsutas

TT – LC MSMS (ng/ml)

TT

–A

xsym

(n

g/m

l)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2limit

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

TT – LC MSMS (ng/ml)

TT

–E

QL

R

och

e (n

g/m

l)

limit

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4Immulite

Immulite

Architect

Architect

Vidas Bio M

upperlimit

upper limit

TT

(n

g/m

l)

Valoración de TT por diferentes métodos y por

LC- MSMS en el suero de 15 pacientes hirsutas

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

TT – LC MSMS (ng/ml)

TT

(n

g/m

l)

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4RIA - DPCRIA - DSL

RIA Dia Source

TT

Co

mm

erci

al R

IA (

ng

/ml)

upperlimit

upper limit

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

TT

in

ho

use

RIA

(n

g/m

l)

upper

upper limit

Valoración de TT por diferentes métodos y por

LC- MSMS en el suero de 15 pacientes hirsutas

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TT

Co

mm

erci

al R

IA (

ng

/ml)

TT – LC MSMS (ng/ml)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

TT

in

ho

use

RIA

(n

g/m

l)TT – LC MSMS (ng/ml)

upperlimit

The table shows the number of laboratories for every method

and the percentage of samples from hirsute women with

normal T values that were actually high by LC-MS

Method 1 2 3 4 5 6 7 8 9

(# of labs) 3 4 2 2 3 1 1 1 1

Samples with

normal T (%) 85 52 42 70 64 31 31 14 69

References:1: Axsym; 2: Elecsys; 3: Immulite; 4: Architect; 5: RIA Siemmens;

In all these cases the methods understimated TT values

1: Axsym; 2: Elecsys; 3: Immulite; 4: Architect; 5: RIA Siemmens;

6: RIA DSL; 7: RIA DIASource; 8: Developed RIA; 9: Vidas BioMerieux

Conclusiones

Ninguno de los métodos utilizados con mayor frecuencia en

nuestro País están convalidados con LC MSMS cuando los

niveles circulantes de TT son menores a 1.5 ng/ml

Todos los métodos subvaloran los niveles de TT en mujeres

hirsutas en un promedio de 58.1%.

12141618

# o

f p

ati

en

ts w

ith

no

rm

al T

T l

eve

ls

TT por LC MSMS

Results obtained by other methods from different

labs underestimated TT levels compared with those

of LC MSMS by 31 to 85 % and overestimated

TT levels in 16.7 % of cases

These difference become more

moticeable with lower

TT concentrations

0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.502468

1012

upper limit# o

f p

ati

en

ts w

ith

no

rm

al T

T l

eve

ls

TT - LC MSMS ( ng/ml)

TT por LC MSMS

(ng/ml)

>0.90.47 -0.74

71.0 38.5% of discordant

results (average)

Posibles soluciones temporarias

Algunas consideraciones:

1) Si bien es importante la determinación de TT, si la

paciente tiene hirsutismo es posible definir el SOP

con la positividad de algunos de los parámetros

diagnósticos

2) El problema lo constituyen las pacientes sin

hirsutismos con algunos de los parámetros

diagnósticos positivos. donde los niveles de TTdiagnósticos positivos. donde los niveles de TT

hacen el diagnóstico diferencial entre alteraciones

del ciclo menstrual y SOP, con el consiguiente

sub diagnósticos de posibles factores de riesgo

3) Como ha sido visto si la TT en el hirsutismo por

cualquiera de los métodos empleados está

aumentada, también lo está por LC MSMS.

Los casos en que los niveles de TT sean normales,

con parámetros positivos la confirmación de la TT

debería realizarse por métodos gold standard

150

200

250

Tes

tost

eron

a lib

re (

pg /

ml)

R

IA L

ab. D

PC

9

12

15

Tes

tost

eron

a lib

re (

pg /

ml)

RIA

Lab

. DP

C

150

200 7.5

Testosterona libre (pg / ml)

HOMBRES MUJERES

Métodos para la determinación de Testosterona libre

0 50 1001502002500

50

100

150

Tes

tost

eron

a lib

re (

pg /

ml)

R

IA L

ab. D

PC

Testosterona libre (pg / ml) Cálculada por el programaDunn, Nisula y Roadbard (21)

0 3 6 9 12 150

3

6

9

Tes

tost

eron

a lib

re (

pg /

ml)

RIA

Lab

. DP

C

Testosterona libre (pg / ml) Cálculada por el programaDunn, Nisula y Roadbard (21)

0

50

100

150

Calculada RIA Lab. ICN

0.0

2.5

5.0