enzimología y bioenergética
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1
I UNIDAD
ENZIMOLOGIA Y BIOENERGETICA
2
ENZIMOLOGIA INTRODUCCION AL METABOLISMO
CELULAR
LLos seres vivos requerimos energía para
desarrollar o cumplir con cada una de
nuestras funciones básicas y para soportar la
actividad física al que estamos sometidos día
a día. Los seres humanos obtenemos nuestro
combustible principalmente a partir de
carbohidratos, lípidos y proteínas de nuestra
dieta, sin dejar de considerar a los minerales,
agua y vitaminas (Fig. 1.1). Para ellos
nuestros alimentos deben ser digeridos y
absorbidos, una vez que llegan a la
circulación ingresan a los diversos tejidos y
son captadas por las células para ser
transformadas a través de una serie de
reacciones llamado metabolismo, en la cual se
algunos metabolitos se oxidan para producir
energía (Catabolismo), generando como
productos finales CO2 y agua y en caso de
proteínas NH3; para que ellos ocurra a
plenitud es necesario la presencia de oxígeno.
Si en nuestra dieta se excede las necesidades
inmediatas del organismo, éstas se almacenan
(anabolismo) en forma de glucógeno o
triglicéridos. Por el contrario cuando la
ingesta es deficitaria, lo almacenado se
degrada para generar energía. Los detalles de
estos procesos serán analizados
posteriormente
Para que nuestros alimentos sean transforma-
dos se requiere la presencia de compuestos
especiales denominados enzimas
ENZIMOLOGIA
GENERALIDADES
En nuestro organismo, un compuesto se
transforma en otro, de diferente naturaleza,
entonces decimos que se ha producido una
reacción química. Esta transformación ocurre
a una determinada velocidad, dependiendo de
varios factores; entre ellos la presencia de un
catalizador que modifica la velocidad de una
reacción química, en los seres vivos estas se
denominan enzimas
Las enzimas son generalmente proteínas, que
actúan como catalizadores biológicos, ya que
incrementan la velocidad de la reacción
enzimática. De manera general se produce
bajo la ecuación:
S + E [ES] [EP] E + Ps
Aunque las enzimas pueden ser modificadas
durante la secuencia, retornan a su estado original
una vez finalizado la reacción. Además,
incrementando la velocidad de las reacciones, las
enzimas proporcionan un medio para regular la
tasa de reacciones en las vías metabólicas del
organismo
Fig. 1.1 Revisión del Metabolismo celular
E S [ES] [EP]
E P
3
ESTRUCTURA
De todas las funciones de las proteínas, la
catálisis es tal vez la más importante. En
ausencia de catálisis, casi todas las
reacciones de los sistemas biológicos se
llevarían a cabo con demasiada lentitud para
suministrar productos al ritmo que los
requiere un organismo metabolizador.
La mayor Parte de nuestras enzimas son de
naturaleza proteica, sin embargo se ha
demostrado que algunos tipos de RNA
tienen elevada actividad catalítica. De la
misma manera algunas tienen una actividad
particular como anticuerpos con actividad
catalítica (abzimas), o las granzimas.
A objeto de particularizar la estructura y
propiedades enzimáticas nos ocuparemos
básicamente de aquellas con naturaleza
proteica.
Las enzimas son los catalizadores más
eficientes que se conocen: pueden aumentar
la velocidad de una reacción en un factor de
hasta 1020
respecto de las reacciones no
catalizadas. Las enzimas son altamente
específicas, incluso al grado de poder
distinguir entre los estereoisómeros de un
compuesto dado. En muchos casos, las
acciones de las enzimas se afinan mediante
procesos reguladores. Son también,
termolábiles y no dializables
Algunas enzimas actúan tan solo contando
con la parte proteica.
Otras, sin embargo, para funcionar
adecuadamente requieren de la presencia de
otras moléculas no proteicas denominadas
cofactores. En este último caso las enzimas
se denominan holoenzimas, y la parte
proteica apoenzima.
Los cofactores son componentes de bajo
peso molecular, usualmente termoestables,
orgánicas o inorgánicas; en base a sus
características pueden denominarse:
coenzima - si la unión es débil y pueden
separarse con facilidad-, grupo prostético –
si su unión es fuerte, de manera covalente, o
ión metálico si actúa bajo esa condición, tal
como Zn2+
, Mg2+
o Cu2+
.
Son ejemplos típicos de coenzima formas
modificadas de vitaminas hidrosolubles,
especialmente las del complejo B, tales
como NAD, NADP, FAD, u otras de forma
no vitamínica como ATP, UDP, Coenzima
Q. Entre los grupos prostéticos tenemos al
grupo Hem, como el de la catalasa. Algunas
pertenecen a iones metálicos tales como
cobre para lisina oxidasa, o el zinc de la
anhidrasa carbónica.
PROPIEDADES GENERALES
SITIO ACTIVO
El sustrato se une a una región específica de
la enzima denominada sitio activo o sitio
catalítico (Fig. 1.2)
Fig. 1.2 sitio activo de la enzima
La proximidad y orientación del sustrato en
el sitio activo contribuye a la fuerza catalítica
de la enzima. El sitio activo puede incluso
contener cofactores, los cuales son metales o
compuestos orgánicos no proteicos. Las
4
interacciones entre el sustrato y grupos
reactivos funcionales sobre los residuos de
aminoácidos cofactores de la enzima
promueven el rearreglo electrónico necesario
para la reacción.
La mayoría de las reacciones catalizadas por
enzimas son muy eficientes y transcurren
desde 106 hasta 10
14 veces más rápido que la
misma reacción no catalizada. Típicamente,
cada molécula de enzima es capaz de
transformar cada segundo de 100 a 1000
moléculas de substrato en producto. El
número de estas moléculas transformadas a
producto por molécula de enzima en cada
segundo, se conoce como el número de
recambio
Características
1. Tamaño. Es relativamente pequeño
cuando se compara con el resto de la
enzima, ya que está constituido por
una región que contiene pocos
aminoácidos.
2. Forma. El Sitio activo de una enzima
tiene forma tridimensional. Algunos
aminoácidos interactúan más
frecuentemente que otros con el
sustrato debido a la carga o
características de sus grupos
funcionales libres (amino, carboxilo,
hidroxilo, etc.) de la cadena peptídica.
3. Unión. El sustrato se une a las enzimas
por fuerzas relativamente débiles
4. Interacción. Al interactuar el sitio
activo con el sustrato, se forma un
complejo compacto que en su espacio
intermolecular no cabe ni la molécula
de agua. El sitio activo contiene varias
zonas polares, que son esenciales para
el enlace y la catálisis; asimismo,
posee otras regiones no polares, que se
comportan como una región en la que
el sustrato interactúa con mayor o
menor intensidad, según sus
características. Especificidad. Un
sustrato debe tener una forma, tamaño
y características de carga para
interactuar en el sitio específico. La
enzima hexocinasa tiene como sustrato
D-glucosa, que no interactúa con la
forma L. Emil Fisher propuso la
metáfora de la cerradura y la llave para
hacer la similitud con las
características de estereospecificidad
del sitio de catálisis; sin embargo,
trabajos recientes sugieren que el sitio
activo de algunas enzimas no es tan
rígido, ya que su estructura se modifica
al unirse con el sustrato. El sitio activo
tiene una forma complementaria
sustrato solamente después de
establecido su unión. Este proceso de
reconocimiento dinámico se llama
inducido.
COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO
El efecto catalítico de una enzima siempre es
precedido por la formación de un complejo
enzima-sustrato.
Características
1. En algunas ocasiones se ha visualizado
directamente con microscopia
electrónica transmisión y con
cristalografía de rayos X.
2. Al constituirse el complejo enzima-
sustrato se modifican algunas de las
propiedades físicas de la enzima, es el
caso de solubilidad y la estabilidad al
calor.
3. Al establecer el complejo, las
características espectroscópicas de
muchas enzimas cambian.
4. El complejo puede ser aislado
experimentalmente en forma pura en
algunos casos.
A una concentración constante de enzima la
velocidad de una reacción se incrementa
directamente en proporción al aumento de la
cantidad de sustrato, hasta alcanzar un
óptimo. En otras palabras, a una
concentración suficientemente alta de
sustratos, los sitios cata1íticos de la enzima se
saturan y la reacción alcanza su velocidad
máxima (ésta es la prueba general más
antigua de la existencia del complejo enzima-
sustrato). En contraste, las reacciones no
catalizadas no presentan este efecto de
saturación.
Por otro lado, la saturación indica también
que la enzima presenta un número finito de
sitios de combinación con el sustrato. Cuando
todos los sitios están ocupados por sustrato,
se puede hablar de saturación y es posible
explicar el tipo de cinética descrito en 1913
por Michaelis y Menten.
5
En este caso, debe considerarse que sólo un
sustrato y un producto son libremente
interconvertibles.
Especificidad
Las enzimas son muy específicas por el
substrato de la reacción que catalizan.
Interactúan con una o muy pocas moléculas
y catalizan únicamente un tipo de reacción,
por lo que las moléculas con las que
interactúan deben ser muy parecidas, tanto
en composición, como en estructura
tridimensional. Se han establecido dos
modelos, el de llave-cerradura y
acoplamiento o encaje inducido
Según el modelo de llave – cerradura existe
un encaje perfecto del sustrato a su lugar de
acción, la misma que sería rígido como una
cerradura (Fig. 1.3). Este modelo, propuesto
por Emil Fisher en 1894, establece que
durante las reacciones enzimáticas, los
compuestos se combinan con ciertos sitios
específicos de las enzimas para convertirse
en productos
Fig. 1.3. Modelo llave-cerradura
En el ejemplo dado una determinada región
de la proteína (radical SH2) se une a la
tirosinfosfatasa, que se adapta al sitio activo
de la enzima como una llave lo hace a su
cerradura
Para el modelo del acoplamiento o encaje
inducido, propuesto por Koshland en 1959,
no existe un sitio de unión totalmente
preformado, sino casi todas las enzimas
sufren un cambio conformacional, que
permiten la ubicación de los aminoácidos en
el sitio activo e incrementan el número de
interacciones en el lugar de unión (Fig. 1.4)
Esto ocurre, por ejemplo, durante la unión de
la glucosa y glucocinasa o hexocinasa, cuyos
cambios conformacionales afectan a toda la
enzima dando lugar a la exclusión del agua
del sitio activo
Fig. 1.4 Modelo del acoplamiento inducido
MECANISMO DE ACCIÓN
ENZIMÁTICA
Aspectos cinéticos y termodinámicos de las
reacciones
La rapidez de una reacción y el grado en que
se favorece termodinámicamente son dos
temas distintos, aunque están muy
relacionados. Esto es verdad para todas las
reacciones, intervenga o no un catalizador. La
diferencia entre las energías de los reactivos
(el estado inicial) y las energías de los
productos (el estado final) de una reacción da
el cambio de energía de esa reacción,
expresado como cambio estándar de energía
libre ( G°).
Fig. 1.5 Mecanismo de acción enzimática
Para sobrepasar la barrera energética, que
existe entre los reactivos y los productos, se
debe de proveer a la reacción, en el inicio de
la misma, de la energía necesaria. A esta
energía, que se recupera en el transcurso de
la reacción, se le llama Energía de
activación y de ella depende la rapidez de
una reacción bioquímica (Fig. 1.5)
Las enzimas, al igual que todos los
catalizadores, aceleran las reacciones pero no
pueden alterar la constante de equilibrio ni el
Energía de activación
6
cambio de energía libre. La energía de
activación de una reacción no catalizada es
más alta que la de una reacción no catalizada:
dicho de otro modo, una reacción no
catalizada requiere más energía para ponerse
en marcha. Por ello, su rapidez es más baja
que la de una reacción catalizada (Fig. 1.6)
La mejor forma de mostrar la energía de
activación y su relación con el cambio de
energía libre de una reacción es con una
gráfica.
Fig. 1. 6 Reacciones catalizadas y no
catalizadas
En la figura anterior 1a. coordenada X
muestra el grado en que se ha efectuado la
reacción, y la coordenada Y, la energía libre
de una reacción idealizada. El perfil de la
energía de activación muestra las etapas
intermedias de una reacción, entre los estados
inicial y final. Los perfiles de energía de
activación son indispensables para estudiar
los catalizadores. La energía de activación
afecta directamente la rapidez de reacción, y
la presencia de un catalizador acelera la
reacción alterando el mecanismo y abatiendo
así la energía de activación.
La elevación de temperatura de una mezcla de
reacción aumenta la energía con que cuentan
los reactivos el estado de transición.
A continuación describiremos el ejemplo de
la catalasa para ilustrar de manera general el
mecanismo de acción enzimática.
Las moléculas de H2O2 deben alcanzar un
nivel de energía equivalente a la energía de
activación para ser transformadas en
productos. Curva (a), energía de activación
para la reacción en ausencia de catalizador.
Curva (b), la energía de activación para la
ruptura de H2O2 se ha reducido en presencia
de un catalizador de hierro. Curva (c)
diagrama de energía para la ruptura de H2O2
catalizada por la enzima catalasa. Esta
reacción tiene el más bajo requerimiento de
energía de activación. Curva (d), diagrama de
energía para la ruptura no catalítica de H2O2 a
una temperatura elevada. Las moléculas de
H2O2 comienzan a reaccionar desde un alto
nivel de energía.
Si se requiere aumentar la velocidad de la
reacción, se pueden hacer dos cosas:
incrementar el nivel de energía promedio de
las moléculas de H2O2 mediante un aumento
en a temperatura: o bien, añadir un
catalizador, La velocidad se incrementa en la
primera opción porque aumenta el número de
colisiones entre las moléculas y, por
consiguiente, la fracción de moléculas de
H2O2 con suficiente energía para vencer la
cima (pasando por el estado de transición).
Los requerimientos energéticos para la
reacción son iguales para las dos temperaturas
No obstante, aumentar la temperatura no es
una opción viable para la mayoría de las
células vivas. La otra alternativa es añadir un
catalizador. Al añadir iones férricos (Fe3+
) y
otros iones metálicos al peróxido en solución,
se incrementa unas 30 000 veces su velocidad
de degradación con respecto a la velocidad
alcanzada sin el catalizador (compare las
(figuras 6.la y 6.lb). Un catalizador funciona
disminuyendo a energía de activación de una
reacción (figura 6.2b, c). El Fe3+
dirige las
moléculas de H2O2 a través de distintas vías
de descomposición en donde existe una
menor barrera energética aumentando así la
velocidad de reacción. La posición de
equilibrio de la reacción anterior no cambia
en presencia del catalizador; sin embargo, el
equilibrio se alcanza mucho más rápido
porque se degradan más moléculas de H2O2
por unidad de tiempo.
Ahora, veamos lo que ocurre en presencia de
una enzima, un catalizador biológico. Cuando
se añade la enzima catalasa a la solución de la
velocidad de reacción es unas 100 000 000
veces más rápida que sin el catalizador (figura
6.2c). La catalasa es una proteína grande (PM
= 250000) formada por cuatro subunidades
idénticas, cada una asociada a una unidad
hemo (protoporfirina con hierro) y se
encuentra en casi todos los tipos de células
7
animal y vegetal. Como todas las enzimas, la
catalasa tiene las propiedades de un verdadero
catalizador:
1. Aumenta la velocidad de una reacción
al disminuir la barrera de energía de
activación.
2. No se consume ni sufre cambio
permanente de su estructura durante el
proceso catalítico.
3. No altera la posición de equilibrio de la
reacción, sólo la velocidad a la cual se
alcanza dicho equilibrio.
4. Por lo general, actúa formando un
complejo transitorio con el reactivo,
estabilizando así el estado de
transición.
NOMENCLATURA Y CLASIFICACION
DE LAS ENZIMAS
A la fecha se han aislado y estudiado miles de
enzimas; y habría mucha confusión si no
existiera un sistema de nomenclatura y
clasificación de enzimas. Los nombres más
comunes para las enzimas se forman
añadiendo el sufijo -asa, al nombre de los
reactivos. Así, la enzima tirosinasa cataliza la
oxidación de tirosina. Estos nombres definen
el sustrato, pero no describen a la reacción
química. Los primeros nombres que se dieron
a las enzimas, como catalasa, tripsina y
pepsina, son todavía menos descriptivos y no
dan pista alguna de su función o sustrato; para
evitar tal confusión, ahora as enzimas tienen
nombres oficiales que reflejan las reacciones
que catalizan. Cada enzima tiene un nombre
oficial internacional terminado en -asa y, se
siguen las reglas establecidas por la IUPAC,
IUB y IEC. Se divide en clases, subclases de
acuerdo a la reacción que catalizan,
asignándole un nombre recomendado, un
nombre sistemático (tipo de reacción),
seguido de un número de cuatro dígitos
separados por puntos y precedido por las
letras EC (Enzyme Commission). Por
ejemplo, el código numérico: para la lipasa
pancreática es: EC 3.1.1.3
El primer 3 por ser una hidrolasa, primer 1,
por hidrolizar un enlace éster, el segundo 1
por ser éster carboxílico, y el segundo 3,
porque es el número de orden que
corresponde a esta lipasa específica.
Por suerte, todas las enzimas conocidas se
pueden clasificar dentro le seis categorías
(tabla 1.1).
PRINCIPIOS DE CINETICA
ENZIMÁTICA
La cinética enzimática estudia la velocidad
de las reacciones catalizadas por enzimas.
Estos estudios proporcionan información
directa acerca del mecanismo de la reacción
catalítica y de la especificidad de la enzima.
La medida se realiza siempre en las
condiciones óptimas de pH, temperatura,
presencia de cofactores, etc., y se utilizan
concentraciones saturantes de sustrato. En
estas condiciones, la velocidad de reacción
observada es la velocidad máxima (Vmax). La
velocidad puede determinarse bien midiendo
la aparición de los productos o la desaparición
de los reactivos.
Aunque las enzimas poseen muchas de las
características de los catalizadores orgánicos
e inorgánicos típicos, sus propiedades
cinéticas, únicas, las sitúan en otro grupo de
catalizadores. Lo primero que se observó del
comportamiento particular de las enzimas, fue
el efecto poco común de la concentración del
sustrato sobre la velocidad de reacción
enzimática. Para estudiar las velocidades de
estas reacciones, se mezclan la enzima y el
sustrato en una solución adecuada
amortiguada para mantener un pH constante,
y a una temperatura fija.
La velocidad inicial (vo) se determina, en los
primeros minutos de la reacción, midiendo ya
sea la disminución de la concentración del
reactivo o el aumento en la concentración del
producto.
Si se quiere estudiar el efecto de la
concentración del sustrato, se plantea un
experimento como el de la figura 8.
Se preparan varios tubos que contienen un
amortiguador con cantidades crecientes de
sustrato; se les añade a cada tubo una cantidad
constante de enzima, se mide la velocidad de
la reacción y, por último, se construye una
gráfica de la velocidad de reacción contra la
concentración de sustrato. Con
concentraciones relativamente bajas de
sustrato, a velocidad inicial de reacción
8
aumenta conforme se añade más sustrato,
como cabría esperar; pero con
concentraciones más altas, el aumento en la
velocidad es cada vez más lento hasta el
punto en que la velocidad se hace constante
sin importar cuánto sustrato esté presente;
esto es, la curva tiene la forma de una
hipérbola.
Tabla 1.1 Clasificación de enzimas
CLASE
Tipo de
reacción
catalizada
Ejemplo
1
Oxidorredutasas
Transferencia
de electrones,
casi siempre
en forma de
iones hidruro o
átomos de
hidrógeno. usan con
frecuencia
coenzimas
como NAD+,
NADP+,
FAD+, lipoato
Succinato
deshidrogenasa
Citocromo
oxidasa
2
Transferasas
Transferencia
de grupos
funcionales de
una molécula a
otra.
Glucocinasa
3
Hidrolasas
Ruptura de
enlaces por
hidrólisis.
lactasa
4
Liasas
Formación de
dobles enlaces
por
eliminación de
grupos o
adición de
grupos o un
doble enlace.
Aldolasa
Citrato liasa
5
Isomerasas
Transferencia
de grupos
dentro de una
molécula para
dar formas
isoméricas.
Fosfotriosa
isomerasa
epimerasa
6
Ligasas
Formación de
enlaces C-C,
C-S, C-O y C-
N por
condensación
acoplada con
la ruptura de
ATP.
Piruvato
carboxilasa
La velocidad constante se define como la
velocidad máxima o Vmáx, Este
comportamiento catalítico que se observa en
la mayoría de las enzimas, se puede describir
como un efecto de saturación de sustrato. Los
primeros investigadores que analizaron
explicaron la forma de esta curva de
velocidad fueron los bioquímicos Leonor
Michaelis y Maud Menten
Análisis cuantitativo de la cinética
enzimática:
Se basa en los estudios de Michaelis - Menten
y de Haldane. Los estudios sistemáticos del
efecto de la concentración inicial del sustrato
sobre la actividad enzimática comenzaron a
realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882
se introdujo el concepto del complejo enzima-
sustrato como intermediario del proceso de
catálisis enzimática. En 1913, Leonor
Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta
teoría y propusieron una ecuación matemática
de velocidad que explica el comportamiento
cinético de los enzimas.
Ellos propusieron que las moléculas de
enzima, E y las moléculas de sustrato, S, se
combinan en forma reversible y por etapas
para formar un complejo ES:
E + S
1k
2k
ES
3k
4k
E + P
Los términos k1, k2, k3 y k4 definen las
constantes de velocidad de las etapas
individuales. El complejo ES tiene dos
posibles destinos: revertirse, liberando la
enzima y el sustrato, o proceder por medio de
una reacción reversible para formar la enzima
libre y un producto, P. la reacción anterior es
la mínima reacción secuencial necesaria para
explicar la acción enzimática. Se ha propuesto
una versión más complicada de la reacción, la
cual muestra un complejo enzima-producto,
pero requiere de un análisis matemático más
complicado y no mejora sustancialmente
nuestra comprensión de la función
enzimática:
E + S ES EP E + P
La ecuación básica desarrollada por Michaelis
y Menten para explicar la reacción catalizada
por una enzima es:
9
vo = ]S[K
]S[V
M
máx
donde:
vo = velocidad inicial dada por la
concentración de sustrato [S]
Vmáx = velocidad máxima
KM = constante de Michaelis
Michaelis y Menten hicieron varias
suposiciones para simplificar su ecuación.
Decidieron no considerar la reacción que
revierte el producto P y la enzima libre al
complejo ES (definida por k4 en la reacción
secuencial). Esta reacción se vuelve
significativa sólo cuando se han producido
concentraciones relativamente altas de
producto. Cuando los bioquímicos utilizan la
ecuación de Michaelis-Menten en el
laboratorio, sólo miden las velocidades
iniciales, cuando la reacción representada por
k4 es muy, muy lenta (por lo regular durante
los primeros minutos). Otra suposición
necesaria para desarrollar esta ecuación es
que el complejo ES es un intermediario en
estado estacionario; es decir, después de
mezclar E y S, se forma rápidamente una
cierta cantidad del complejo ES y su
concentración permanece relativamente
constante porque se produce con la misma
velocidad con la que se degrada.
Otras dos constantes importantes de la
ecuación de Michaelis-Menten, KM y Vmáx,
merecen una descripción más amplia. La
constante de Michaelis, KM, se expresa en
términos matemáticos como una combinación
de constantes de velocidad
Expresado con palabras, KM equivale a la
concentración de sustrato que produce una
velocidad inicial de ½ Vmáx. Los valores de
KM de las enzimas van desde 10-1
M hasta
valores tan pequeños como 10-8
M. Para las
enzimas que emplean más de un sustrato,
existe un valor de KM que define a cada una
de ellas.
Bajo ciertas condiciones de KM es una medida
de la afinidad entre E y S. Cuando KM es
relativamente grande (10-1
a 10-3
M), k2, la
constante de velocidad de disociación de ES,
también lo es, y por lo tanto, el complejo ES
se mantiene muy débilmente unido. Por el
contrario, un valor pequeño de KM (de menos
de 10-3
M) representa una alta afinidad entre
E y S (se forma un complejo fuerte).
Ya se mencionó que Vmáx es la velocidad
máxima de una reacción catalizada por una
enzima para un valor dado de [E]. Este
término, que se puede medir de manera
experimental, es una constante importante
muy útil para caracterizar una enzima y
optimizar las condiciones de reacción. Pero lo
más relevante es que conociendo el valor de
Vmáx podemos calcular otra constante: el
número de recambio k3 de una enzima.
El número de recambio es el número de moles
(o moléculas) de sustrato transformado en
producto por moles (o molécula) de enzima
en un tiempo determinado, usualmente un
segundo.
Las constantes KM, Vmáx y k3 nos dan mucha
información acerca de una reacción catalizada
por una enzima, de ahí que sea importante
obtenerlas de manera experimental. En la
mayoría de los métodos se utiliza el análisis
gráfico de los datos experimentales. La curva
de Michaelis-Menten se puede utilizar para
estimar Vmáx y KM, sin embargo, es difícil
medir con precisión el valor de Vmáx porque
se necesitan alcanzar niveles altos de sustrato,
que no son fáciles de realizar
experimentalmente. Por esta razón, Vmáx, se
determina casi siempre de la gráfica de
Michaelis-Menten y el valor de KM como la
concentración de sustrato que produce una
velocidad inicial de ½ Vmáx.
En resumen, en este modelo la enzima se
combina reversiblemente con su substrato
para formar el complejo enzima-sustrato (ES)
que subsecuentemente se rompe para formar
el producto, hecho que regenera a la enzima.
Luego de una serie de análisis, la
representación gráfica de la ecuación de
Michaelis-Menten (v0 frente a [S]0) es una
hipérbola (Fig. 1.9). La Vmax corresponde al
valor máximo al que tiende la curva
experimental, y la KM corresponde a la
concentración de sustrato a la cual la
velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax
10
Fig. 1.9. Grafica de la Ecuación de Michaelis-
Menten
Ecuación de Lineweaver-Burk
En 1934, Hans Lineweaver y Dean Burk
describieron un método para expresar la
ecuación de Michaelis-Menten en una forma
más manejable para el análisis gráfico, puesto
que el de Michaelis y Menten dificultaba la
obtención gráfica de Km y Vmax, por lo que
es más simple utilizar la representación
doble recíproca (1/v0 frente a 1/[S]0), o
representación de Lineweaver-Burk, la
misma que permite el trazo de los datos
experimentales en forma de una línea recta
(Fig. 1.10).
máxmáx
M
o V
1
]S[
1.
V
K
v
1
Una gráfica de 1/vo contra 1/[S] produce una
línea recta con pendiente de KM/Vmáx y con
intersecciones 1/Vmáx en las ordenas y -1/KM
en las abscisas. La gráfica de Lineweaver-
Burk es valiosa porque permite evaluar la
inhibición de las reacciones enzimáticas.
Fig. 1.10. Representación de la Ecuación de
Lineweaver-Burk
De esta forma, a partir de los datos
experimentales se puede calcular
gráficamente, los valores de Km y Vmax de
un enzima para diversos sustratos, e incluso
con ello calcular el valor de la actividad
enzimática, empleando las unidades
correspondientes.
Unidades de actividad enzimática
La unidad de actividad enzimática (U,
UAE) más ampliamente usada se define como
la cantidad que causa la transformación de 1.0
mol de substrato por minuto, a 25°C, en
condiciones óptimas. La actividad específica
es el número de unidades de enzima por
miligramo de proteína (U/mg prot) o por
mililitro de disolución (U/ml). Esto es una
medida de la pureza de una enzima, se
incrementa durante el proceso de purificación
alcanzando el valor máximo cuando la enzima
está en estado puro. La actividad molar o
molecular o número de recambio es el
número de moléculas de substrato
transformadas por minuto por una sola
molécula de enzima, cuando la enzima es el
factor limitante de la velocidad. Para el
cálculo se utiliza la Vmax y el peso molecular
de la enzima.
La Comisión de Enzimas de la Unión
Internacional de Bioquímica ha recomendado
que la actividad enzimática sea expresada en
unidades de mol/segundo, en vez de moles/
min, para adecuarse a las constantes de
velocidad usadas en cinética química, y seguir
al Sistema Internacional de Unidades,
proponiéndose a la nueva unidad, Katal
(Kat), definido como la cantidad de enzima
que transforma 1 mol de sustrato por
segundo. Como 1 mol son 106 µmoles y 1
minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal
equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy
grande, de forma que se utilizan
frecuentemente los submúltiplos como el
microkatal (µkat, 10-6
kat), el nanokatal (nkat,
10-9
kat), o picoKatales (Prat, 10-12
kat).
ALGUNOS FACTORES QUE
CONTROLAN LA ACTIVIDAD
CATALITICA
11
Hasta ahora, sólo hemos revisado la
influencia del sustrato (S} sobre la velocidad
de las reacciones catalizadas por enzimas. La
actividad enzimática está influenciada además
por una serie de factores externos e internos,
sean éstos físicos, químicos y biológicos que
afectan la actividad enzimática, entre ellos
tenemos: por factores experimentales como la
concentración de enzima, el pH de la solución
de reacción y la temperatura, así como
actividad de productos e inhibidores.
Es fácil predecir el efecto que tendría añadir
más enzima, ya que al ser ésta el catalizador,
la velocidad inicial de reacción debe ser
mayor cuanto mayor sea la concentración de
enzima (Fig. 1.11); pero siempre y cuando
haya suficiente sustrato. Las enzimas también
son sensibles a los cambios ambientales. La
mayoría de ellas tienen un pH óptimo para
lograr su eficiencia máxima; éste varía de una
enzima a otra, pero por lo general se
encuentra entre pH de 6-8. La dependencia de
pH se debe a la participación de los residuos
de aminoácidos cargados que tiene la enzima
o a los sustratos, cuyas estructuras iónicas
cambian según varíe el pH (Fig. 1.12)
Fig. 1.11 Efecto de la Concentración de enzima
Fig. 1.12 Efecto del pH sobre la actividad
enzimática
De esta manera, cuando los valores de pH se
incrementan o disminuyen de los rangos
considerados óptimos para cada enzima, la
actividad enzimática siempre disminuye,
debido a que las variaciones de pH afectan el
carácter iónico de los grupos funcionales de la
enzima alterando su conformación o
desnaturalizando a las enzimas al variar a una
acidez o basicidad relativa
De la misma manera, la ttemperatura, de
manera experimental juega un rol muy
importante en la cinética enzimática, aunque
en el organismo del ser humano dado nuestros
mecanismos de control, la temperatura
prácticamente se mantiene en rangos ideales,
dado nuestra homeostasis.
De manera general, a incrementarse esta
variable, la actividad enzimática también lo
hace pero hasta cierto límite, puesto que a
temperaturas superiores a las óptimas las
enzimas se desnaturalizan y por ende la
actividad enzimática disminuye (Fig. 1.13);
de la misma manera, al disminuir la
temperatura, la actividad enzimática
disminuye, en ello se sustenta la criogenia.
Fig. 1.13. Efecto de la Tº sobre la actividad
enzimática
OBSERVACION: Para la mayoría de las
enzimas, la caída en la velocidad comienza en
un intervalo de temperatura de 50 a 60º c.
Asimismo, los iones metálicos y cofactores
orgánicos (coenzimas) influyen en la acción
de muchas enzimas. Aunque muchas enzimas
exhiben la cinética característica de
Michaelis-Menten (curvas hiperbólicas de
velocidad), otras siguen una cinética distinta.
Las enzimas alostéricas son un grupo grande
de enzimas con un comportamiento cinético
particular.
12
Además de actuar como catalizadores en las
células, estas enzimas son responsables de
regular la velocidad total de los procesos
metabólicos. Las enzimas alostéricas o
reguladoras son algo diferentes de las enzimas
no reguladoras. En general, son de mayor
peso molecular y se forman, de dos o más
subunidades; su actividad depende de varios
factores, algunos son los mismos que influyen
en las enzimas no reguladoras: [S], [E],
temperatura, pH, cofactores, etc., además,
muestran unión cooperativa del sustrato y/o
unen otro tipo de molécula llamada
modulador o efector. La unión de un
modulador puede potenciar o disminuir la
actividad de las enzimas reguladoras.
Catálisis general ácido-base
Muchas de las reacciones donde se transfieren
protones, incluidas la hidrólisis de ésteres y
amidas, son catalizadas por ácidos y bases.
Los grupos funcionales del sitio activo de la
enzima pueden actuar como ácidos (—NH3+
;
—COOH) o como bases (—NH2; —COO-), y
ayudar en las reacciones de transferencia de
protones, facilitando la ruptura del enlace.
Los grupos funcionales ácidos y básicos de la
enzima se orientan hacia el sitio activo, de tal
forma que favorecen sus interacciones con el
sustrato unido.
Catálisis mediada por iones metálicos
Los iones metálicos asociados a la enzima o a
las moléculas de sustrato a menudo participan
en la catálisis. Los iones de metales alcalinos
(Na+, K
+) y los metales de transición (Mg
2+,
Mn2+
, Cu2+
, Zn2+
, F2+
, Fe3+
, Ni2+
, y otros)
ayudan en las reacciones enzimáticas lo
menos de tres maneras:
1. Por medio de enlaces covalentes
coordinados fijan al sustrato para que
quede orientado apropiadamente en
esta forma el sustrato se puede unir al
sitio activo de la enzima con una
geometría muy específica.
2. Favorecen una reacción al polarizar el
enlace que va a ser escindido o
estabilizando un intermediario cargado
negativamente.
3. Participan en reacciones biológicas de
oxidación-reducción mediante la
transferencia reversible de electrones
entre iones metálicos y el sustrato
Por lo general, los requerimientos de iones
metálicos de una enzima son específicos, la
actividad enzimática es baja o nula cuando el
ión metálico específico para la enzima
metaloenzima) no se encuentra presente o se
sustituye por otro. Alrededor de 30% de las
enzimas conocidas requieren de un ión
metálico. Las metaloenzimas utilizan una o
varias de las estrategias recién descritas para
llevar a cabo a unión del sustrato y la acción
catalítica.
Catálisis covalente
Este proceso sucede cuando un grupo
funcional nucleofílico (rico en electrones) de
una enzima reacciona con el sustrato
formando un enlace covalente, dando lugar a
un intermediario transitorio, particularmente
reactivo. La catálisis covalente se observa en
las serina proteasas, un grupo de enzimas,
entre las que figura la quimotripsina, que
cataliza la ruptura de enlaces en los sustratos
peptídicos.
ACTIVACION E INHIBICION
Algunas enzimas, gracias a la acción de
algunas moléculas incrementan su actividad
metabólica (activación), mientras otras
disminuyen su actividad (inhibición). Estos
dos términos deben diferenciarse de
inducción y represión, cuyo efecto es
semejante a activación y represión
respectivamente, con la diferencia que actúa
sobre la concentración de la enzima. Por
ejemplo:
Activación por ion (tabla 1.2, Fig. 1.14)
- Directamente en la reacción por
formación de complejos con
coenzima o cosustrato. Ejem. Fe -
FMN, ATP-Mg
- Parte de enzima, y actúa, ya sea como
estabilizador de la conformación
activa, o directamente en el sitio
activo (Mn en isocitrato DHG; Zn o
Cu en carboxipeptidasa)
13
Tabla 1.2 algunos activadores metálicos
Elemento Enzima Activada
Zn++ Deshidrogenasas, anhidrasa carbónica, ARN y
ADN polimerasas.
Mg++ Fosfohidrolasas, RUBISCO, fosfotransferasas,
fosfatasas.
Mn++ Arginasas, peptidasas, quinasas.
Mo Nitratorreductasa, nitrogenasa.
Fe2+, Fe3+ Citocromos, catalasas, ferredoxina,
peroxidasas, nitritoreductasa.
Cu2+ Citocromo oxidasa, tirosinasa, ´cido ascórbico
oxidasa, plastocianina
Ca2+ 1,3 b glucan sintetasa, calmodulina.
K+ Piruvato fosfoquinasa, ATPasa.
Inhibición enzimática
Hasta aquí sólo se ha considerado la
interacción de enzimas con sus sustratos. En
las células y los tejidos las enzimas también
encuentran otros compuestos químicos como:
los productos de reacción, análogos de
sustratos, toxinas, fármacos, complejos
metálicos y otros compuestos bioquímicos;
muchos de los cuales tendrán un efecto
inhibitorio sobre la acción enzimática.
De manera general, inhibición es la
disminución de la actividad enzimática,
entendiendo a un inhibidor como cualquier
molécula capaz de disminuir la velocidad de
una reacción sin desnaturalizar a la enzima,
debido a que tienen la capacidad de unirse a
las enzimas, impidiendo la formación del
complejo ES. Esta inhibición puede ocurrir de
manera natural puesto que forma parte de los
procesos de regulación, o de manera artificial
con el desarrollo de antibióticos, insecticidas,
venenos y diversos medicamentos que alivian
el dolor, la inflamación, las infecciones, el
cáncer, debido a su capacidad de corregir el
funcionamiento de las proteínas celulares, a
través de una enzima específica.
Tal vez sorprenda que los bioquímicos se
interesen en compuestos que disminuyen la
actividad enzimática; sin embargo, de los
estudios sobre inhibición enzimática se puede
obtener información muy valiosa.
Los procesos donde se coordinan las
miles de reacciones que suceden en
una célula se pueden controlar porque
las rutas metabólicas son reguladas
por la presencia de agentes naturales
que inhiben a las enzimas.
Muchos fármacos y toxinas ejercen sus
efectos a través de la inhibición
enzimática.
Al estudiar la acción de inhibidores
específicos, se pueden establecer los
mecanismos de reacción enzimática,
incluyendo el papel que juegan
determinados residuos de
aminoácidos.
Inhibidores reversibles e irreversibles
De acuerdo con su grado de interacción con
las enzimas, se han establecido dos clases
grandes de inhibidores: reversibles e
irreversibles. Un inhibidor irreversible
forma enlaces covalentes o no covalentes muy
fuertes con la enzima. El lugar donde ataca el
inhibidor es en un grupo funcional
aminoacídico de la enzima, que participa en la
unión del sustrato normal o en la acción
catalítica; en consecuencia, la enzima queda
inactiva de manera permanente.
El efecto de los gases nerviosos sobre la
enzima acetilcolinesterasa (ACE) es un buen
ejemplo de inhibición irreversible. El
compuesto fluorofosfato de diisopropilo
(DIFP) reacciona con el residuo de serina del
sitio activo de la ACE. Dado que el grupo
hidroxilo de la serina es esencial para la
actividad normal de la enzima, su forma
químicamente modificada no puede
desempeñar la función normal: catalizar la
hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina.
Fig.1. 14
14
Las personas expuestas al DIFP degradan la
acetilcolina de las uniones nerviosas a
velocidades considerablemente reducidas,
provocando un disparo continuo de impulsos
nerviosos. Los residuos de serina, cisteína e
histidina son particularmente susceptibles a
las modificaciones químicas por los
inhibidores irreversibles.
Estos inhibidores también pueden tener
efectos positivos. La aspirina ácido
acetilsalicílico) actúa como analgésico y
antiinflamatorio al bloquear la síntesis de
prostaglandinas que producen dolor. La
aspirina modifica covalentemente e inactiva
de esta forma a ciclo oxigenasa y la
prostaglandina sintetasa, la enzima que
cataliza el primer paso de la síntesis de
prostaglandinas.
Inhibidores Suicidas: son inhibidores de
sitio activo que ejercen reacción parcial y
forman inhibidores irreversibles, por ejemplo
la penicilina, para poder actuar es convertida
a un compuesto que no puede disociarse del
glicopeptidil transpeptidasa una de las
enzimas responsables de la síntesis de la
pared bacteriana, por lo tanto al no poseer
pared (protoplasto) se lisan con gran
facilidad. Muchos investigadores a este grupo
de inhibición lo incluyen dentro de las
irreversibles
Los inhibidores reversibles son compuestos
que se pueden disociar fácilmente de la
enzima y sólo la inactivan cuando están
unidos.
El complejo EI se mantiene unido por
interacciones débiles no covalentes, como
sucede en el complejo ES. Los inhibidores
reversibles se clasifican en tres tipos
comunes: competitivos, incompetitivos, no
competitivos.
Los inhibidores competitivos (Fig. 1.15)
tienen una estructura semejante a la del
sustrato normal y también se unen en el sitio
activo de la enzima (fig. 1.16). La unión del
sustrato y del inhibidor competitivo en el sitio
activo de la enzima es un proceso
mutuamente excluyente: cuando el inhibidor
está unido, el sustrato no puede unirse y
viceversa. El esquema cinético de la
inhibición competitiva es el siguiente:
E + S ES E + P
+
I
EI
La magnitud de la inhibición depende de la
proporción de concentración de sustrato y de
inhibidor, así como de la afinidad de cada uno
por la enzima. Una concentración muy alta de
sustrato atenúa el efecto del inhibidor
competitivo, a menos que éste tenga más
afinidad por la enzima que el sustrajo. La
molécula del inhibidor no puede ser
transformada en ‗producto‖ porque no tiene
los grupos funcionales sobre los que actúa
normalmente la enzima. No obstante, si el
inhibidor es capaz de unirse al sitio activo,
debe tener alguna similitud estructural con el
sustrato normal. Un ejemplo claro del proceso
de inhibición competitiva es la inhibición por
malonato, oxalato y pirofosfato de la enzima
succinato deshidrogenasa, una enzima del
ciclo del ácido cítrico. Estas tres pequeñas
moléculas tienen estructura y carga
semejantes a las del succinato, el sustrato
normal, pero no pueden ser deshidrogenadas
por la enzima.
Algunos de los mejores inhibidores
competitivos que se han descubierto son los
análogos de estado de transición:
compuestos que se diseñan tomando como
modelo las estructuras de los posibles estados
de transición. De hecho, el sitio activo de la
enzima es más complementario con el estado
de transición que con los reactivos o
productos de la reacción. De aquí se
desprende que una molécula diseñada a
semejanza del estado de transición predicho
deberá unirse en forma muy selectiva con el
sitio activo y ser un potente inhibidor
competitivo. Actualmente. muchas compañías
farmacéuticas utilizan esta estrategia para
diseñar fármacos potenciales. Un ejemplo
bioquímico clásico es el de la succinato
deshidrogenasa por el malonato, un
compuesto semejante al sustrato clásico
succinato. Entre los fármacos con esta acción
podemos citar a la sulfas, que
estructuralmente se parecen a PABA,
precursor para la síntesis del ácido fólico
bacteriano, coenzima importante para la
síntesis de ácidos nucleicos. Así mismo los
15
antihipertensores captopril, enalapril, que
inhiben a la ECA, el fluorouracilo para tratar
el cáncer.
1/Km [S]
Fig. 1.16 Inhibición competitiva
En la inhibición no competitiva (Fig. 1.17),
reversible, el inhibidor no se une directamente
al sitio activo, sino en un lugar contiguo, sin
embargo altera su conformación perdiendo su
actividad catalítica, o puede ser análogo del
sustrato pero no pude ser desplazado por
concentraciones elevadas de la misma. Por
ejemplo la iodoacetamida, actúa sobre
enzimas que tienen grupos sulfhidrilo, la
peroxidasa y catalasa, contienen Fe como
grupo prostético y son inhibidas por
compuestos que forman complejos con este
metal, como por ejemplo el cianuro; los iones
fluoruro y oxalato inhiben a las enzimas que
requieren Ca o Mg.
En el siguiente esquema cinético se representa
la inhibición no competitiva:
E + S ES E + P
+ +
I I
EI + S EIS
En este tipo de inhibición, el sustrato se puede
unir simultáneamente con la molécula de
enzima. Es claro que las dos moléculas deben
unirse en lugares distintos de la enzima. La
cercanía del inhibidor no debe ser la unión del
sustrato pero si interfiere con la función
catalítica de la enzima. El verdadero
mecanismo de acción del inhibidor va a
depender del tipo de enzima.
Un tipo más frecuente de inhibición no
competitiva es la reacción entre el grupo
funcional de una enzima, por ejemplo, un
grupo sulfhidrilo de un residuo de cisteína, y
un ión metálico tal como: Ag+, Hg
2+ o Pb
2+.
1/km [S] Fig. 1.17 Inhibición no competitiva
El inhibidor Acompetitivo (Fig. 1.18) es
semejante al no competitivo, se une en un
sitio distinto del sitio activo. Sin embargo, el
inhibidor acompetitivo sólo se une con el
complejo ES:
E + S ES E + P
+
I
ESI
Como el inhibidor sólo se combina con el
complejo ES y no con la enzima libre, única
mente influirá sobre la actividad enzimática
cuando las concentraciones del sustrato. y por
tanto del complejo ES, sean altas.
Los tres tipos de inhibición reversible se
pueden distinguir realizado una serie de
experimentos convenientes en el laboratorio:
para los cuales se utilizan distintas
concentraciones de sustrato (como en los
experimentos diseñados para determinar KM y
Vmáx) en presencia de cantidades fijas de
enzima y de inhibidor.
Se analizan los datos de velocidad en una
grafica de Lineweaver-Burk, a fin de
determinar si el inhibidor es competitivo, no
competitivo o incompetitivo. La familia de
líneas obtenidas para cada tipo de inhibición
se muestra en la figura. En la inhibición
competitiva, Vmáx no cambia al añadir el
inhibidor de modo que las líneas se cruzan en
el eje I/vo (figura). En la inhibición no
competitiva, la familia de líneas tiene una
intersección común sobre el eje I/[S] (el valor
+ I sin I
+ I
sin I
1/Vmax
1/Vmax
16
de KM no cambia, figura). En la inhibición
competitiva se obtienen líneas paralelas y
cambian tanto Vmáx y KM (figura).
1/km [S]
Fig. 1.18. Inhibición acompetitiva
En la tabla 1.3 se resumen los cambios
cinéticos experimentales para los tres tipos de
inhibición reversible.
Tabla 1.3. Características cinéticas de la
inhibición reversible
Efecto cinético sobre la reacción inhibida a
Tipo de
inhibición
KM Vmáx KM/ Vmáx
Competitiva mayor inalterada Aumenta
No competitiva inalterada menor Aumenta
Acompetitiva mayor menor inalterada
OTRAS FORMAS DE MODULACION
ALOSTERICA (Fig. 1.19): participación de
co-sustratos con rol central en el metabolismo
(efectores, modificadores o moduladores),
tales como Acetil CoA, ATP, AMP. Ejem.
Para PFK ATP (-); AMP (+), existiendo un
lugar especial para su localización llamado
―sitio alostérico‖. Estos metabolitos pueden
inhibir o activar la actividad enzimática. Su
representación esquemática no sigue el
modelo de Michaelis-Menten. De estas se
pueden distinguir tres clases:
1) Homotrópicas: cuando el sustrato puede
actuar como efector sobre la rapidez de la
reacción enzimática, por lo general,
incrementándola.
2) Heterotrópicas: La inhibición o
estimulación es causada por sustancias de
origen natural que no sea el sustrato.
3) Mixtas: muestran ambas características
Fig. 1.19. Modulación alostérica
La curva que se grafica con concentración de
sustrato es sigmoidal, la misma indica que la
unión de las primeras moléculas de sustrato
mejora la unión de las primeras moléculas
posteriores.
Las miles de reacciones del metabolismo
celular se agrupan en secuencia, y cada una
tiene una determinada función de síntesis o de
degradación. Por ejemplo, las reacciones de la
glucólisis catalizadas por diez enzimas
transforman la glucosa en piruvato. El
comportamiento de la mayoría de las enzimas
del metabolismo puede explicarse con la
cinética de Michaelis-Menten. Esto es, las
curvas de velocidad (vo contra [S]) son
hipérbolas y las constantes KM, Vmáx y k3 de
cada una, se pueden medir
experimentalmente. En una secuencia
metabólica por lo menos un paso es
catalizado por una enzima reguladora que
controla la velocidad de toda la secuencia. La
(s) enzima (s) reguladora (s) pueden ser
influenciadas por: (1) la concentración del o
los producto (s) final (es) de la secuencia
metabólica, (2) la concentración inicial del
sustrato y (3) del intermediario formado en la
secuencia, (4) por algunos factores externos
como una hormona, o (5) quizás por todos los
factores mencionados. En muchas secuencias
metabólicas, la primera enzima es la principal
sin I
+ I
1/Vmax
17
enzima de control y está influenciada por la
concentración del material inicial (A), o del
producto final (P), o por ambos. Las enzimas
reguladoras son de varios tipos y se clasifican
por su modo de acción. De ellas, las enzimas
alostéricas, son modificadas por la unión
reversible no covalente de una molécula de
señal (Fig. 1.20).
A B C D F P
En lo anterior se aprecia una secuencia
hipotética de reacciones que forman parte en
una ruta metabólica. La biomolécula A es
convertida al producto final, P, a través de
varios intermediarios (B, C, D y F). Las
enzimas se representan como E1, E2, etc.
Efectores positivos y negativos
Las biomoléculas que influyen en la acción de
una enzima alostérica se conocen como
efectores o moduladores. Estos pueden actuar
como estimulantes (efectos positivos) o
inhibidores (efectores negativos) de la
enzima. Por ejemplo, una alta concentración
de A y una baja concentración de P, en la
figura, son indicadores de que la secuencia
metabólica procedería hacia la formación de
P. En este caso, A puede actuar como efector
positivo y sustrato. Cuando el producto P
alcanza un cierto nivel deseado, puede actuar
como inhibidor (efector negativo). Este modo
de regulación es una forma muy lógica y
práctica de controlar la velocidad de síntesis
de P. con una regulación precisa, se producirá
la cantidad adecuada de P sin que se agote por
completo A.
En los primeros estudios detallados del
comportamiento de las enzimas alostéricas, se
observó que la mayoría no exhiben curvas de
velocidad hiperbólicas; es decir, no siguen la
cinética típica de Michaelis-Menten y la
inhibición no puede ser descrita con las
gráficas tradicionales de Lineweaver-Burk.
Las curvas de velocidad de vo contra [S] para
las enzimas alostéricas son sigmoideas
(figura). La presencia de un efector positivo o
negativo también da lugar a una curva
sigmoidea, pero con una velocidad
incrementada o inhibida respectivamente.
Como las enzimas alostéricas no siguen una
cinética de Michaelis-Menten, no es posible
definir KM de la forma usual. En lugar de ello,
la concentración de sustrato que produce una
vo y de ½ Vmáx se representa con el término
[S]0.5.
Las moléculas erectoras actúan mediante la
unión no covalente, reversible con una región
de la enzima. Todas las enzimas alostéricas
hasta ahora estudiadas son mucho más
grandes y complejas que las no alostéricas y
poseen dos o más subunidades; p.e. son
oligoméricas. Además de de los sitios activos
(sitios catalíticos) para la reacción, las
enzimas alostéricas tienen sitios reguladores
para unir efectores especificas. El principio
general que sustenta el concepto de
alosterismo consiste en que la unión o el
evento catalítico que ocurre en un sitio,
influye en la unión o catálisis efectuada en
otro sitio. Los mensajes se transmiten de un
sitio a otro mediante cambios
conformacionales de la estructura proteica. El
término alostérico se puede traducir como
―otras formas‖. La unión de moléculas
efectoras cambia a conformación de la
proteína en modo tal que se comunica dicha
unión a las demás subunidades. En las
enzimas alostéricas se transmiten mensajes. a
través de cambios conformacionales, entre los
sitios de unión que están en distintos planos
CONTROL POR RETROALIMENTA-
CIÓN o FEED BACK (Fig. 1.21)
Las enzimas reguladoras con comportamiento
alostérico controlan varias vías en su forma
más simple, el que se conoce como
retroinhibición o inhibición por producto
final. Se ha encontrado que estas enzimas
alostéricas se localizan en o cerca del
comienzo de una vía enzimática y que son
inhibidas o estimuladas por el producto final
de esa vía.
COVALENTE (Fig. 1.22) Estado de
fosforilación o desfosforilación
Algunas enzimas se regulan por la
interconversión reversible entre sus formas
activa e inactiva, producidas por
modificaciones covalentes, dando lugar a un
estado de fosforilación y desfosforilación, a
través de cinasas y fosfatasas
respectivamente, ya que estas enzimas poseen
1 2
18
residuos específicos que le permiten estos
cambios.
Fig. 1.21 Inhibición por Feed back
La actividad catalítica de estas enzimas se
altera por cambios covalentes reversibles en
las cadenas laterales de determinados
aminoácidos de la enzima. Las alteraciones
químicas más comunes que cambian la
actividad de una enzima son:
1. Fosforilación de los grupos hidroxilo de
serina, treonina o tirosina.
2. Acoplamiento de un adenosin monofosfato
a un grupo hidroxilo semejante.
3. Reducción de puentes disulfuro de cisteína.
Otras enzimas sirven de catalizadores para los
cambios químicos de los residuos de
aminoácidos. En algunos casos, el
acoplamiento de un grupo químico u otra
modificación química en determinados
residuos de aminoácidos transforma una
enzima activa en su forma inactiva; en otros
casos, da lugar a la activación de una enzima
inactiva Este proceso de regulación pareciera
bastante extraño porque la enzima que es
alterada covalentemente es en realidad un
sustrato de otra enzima que cataliza la
reacción de modificación. Aunque la mayoría
de los sustratos para las enzimas son
moléculas pequeñas, también encontraremos
algunos ejemplos de moléculas grandes, tales
como proteínas y ácidos nucleicos, que sirven
de sustratos. Como cabría esperar, las
enzimas que catalizan los cambios químicos
de otras enzimas, también están sujetas a un
estricto control de regulación.
Fig. 1.22 Modulación por covalencia
El control de la enzima reguladora, glucógeno
fosforilasa, es un ejemplo excelente de una
modificación covalente. Como vamos a
estudiar más adelante, esta enzima cataliza
una reacción importante, que convierte el
carbohidrato almacenado (glucógeno) en
glucosa, una forma que es degradada
fácilmente para obtener energía. Un residuo
específico de serina de cada uno de los dos
dímeros idénticos de la enzima es fosforilado
en una reacción catalizada por la enzima
fosforilasa cinasa, para asegurar la máxima
actividad de la glucógeno fosforilasa:
Fosforilasa + 2ATP fosforilasa + 2ADP
| | | |
OH OH OP OP
Forma menos activa forma más activa
Un grupo fosforilo (23
PO ) es transferido
desde el ATP hacia cada uno de los grupos
hidroxilo de serina de la glucógeno
fosforilasa. Otra enzima, la fosforilasa
fosfatasa, cataliza la eliminación por
hidrólisis de los grupos fosfato, Pi.
La regulación de la glucógeno sintasa es
justamente lo opuesto de la glucógeno
fosforilasa.
La enzima glutamina sintetasa también
experimenta una reacción similar de
modificación covalente. Esta enzima
bacteriana desempeña una función importante
en el metabolismo del nitrógeno. El grupo
AMP (adenosin monofosfato) es transferido
desde el ATP al grupo hidroxilo de un residuo
específico de tirosina de la glutamina
sintetasa, liberando pirofosfato, PPi, como
19
producto. La forma adenilada de la enzima es
inactiva.
enzima + ATP enzima + PPi
| |
OH OH AMP
Forma activa forma inactiva
Activación por ruptura proteolítica
(Proteólisis selectiva)
Algunas enzimas son sintetizadas
inicialmente en forma inactiva y deben pasar
por una etapa de modificación covalente para
adquirir una actividad enzimática completa.
El precursor inactivo, llamado zimógeno,
experimenta una ruptura en uno o varios
enlaces peptídicos específicos para que se
produzca la forma activa de la enzima. La
ruptura proteolítica puede parecer, en
principio, un tipo de regulación por
modificación covalente como la que se acaba
de describir en la sección anterior. Sin
embargo, la ruptura proteolítica es un proceso
irreversible y sólo sucede una vez en la vida
de una molécula de enzima. En la
modificación covalente, la enzima es
transformada en forma reversible por un
conjunto de enzimas reguladoras, un proceso
que se puede repetir muchas veces con la
misma molécula de enzima.
Diversos procesos biológicos importantes son
regulados por a ruptura proteolítica. Muchas
de las peptidasas digestivas (enzimas que
degradan proteínas) del estómago y del
páncreas, incluidas la quimotripsina, pepsina
y carboxipeptidasa, están reguladas por este
mecanismo (tabla 1.4). El proceso de
coagulación de la sangre depende de una serie
de etapas de activación. y cada una se inicia
mediante una ruptura proteolítica. Algunas
hormonas proteicas, como la insulina, son
producidas en forma de zimógeno
(proinsulina) se activan por eliminación
proteolítica de un fragmento peptídico.
Solo como un ejemplo se va a detallar el
mecanismo de activación de la quimotripsina.
Esta enzima colabora en la degradación de las
proteínas de la dieta en el intestino delgado,
hidrolizando a nivel de los aminoácidos:
fenilalanina, tirosina y leucina.
Tabla 1.4 Enzimas digestivas (peptidasas)
que existen como zimógenos
Enzima activa
Forma de
zimógeno
Lugar de síntesis
del zimógeno
o -Quimotripsina
Pepsina
Tripsina
Carboxipeptidasa
Elastasa
Quimiotripsinógeno
Pepsinógeno
Tripsinógeno
Procarboxipetidasa
Proelastasa
Páncreas
Estómago
Páncreas
Páncreas
Páncreas
Su zimógeno, o quimotripsinógeno es
sintetizado por el páncreas y secretado en el
intestino delgado. El quimotripsinógeno es
una sola cadena polipeptídica de 245 residuos
de aminoácido con cinco enlaces disulfuro
entrelazados en la cadena. El zimógeno es
activado tras la hidrólisis catalizada por la
tripsina del enlace peptídico entre la arginina
15 y la isoleucina 16 (figura 1.23).
Fig. 1.23 Activación de la quimotripsina
El producto. denominada -quimotripsina, es
una enzima totalmente activa; sin embargo
dura poco tiempo, porque es susceptible al
ataque de otras moléculas de -quimotripsina.
En este proceso de ruptura, se eliminan dos
fragmentos de dipéptido (Ser-Arg; Thr-Asn),
dando origen a la enzima activa -
quimotripsina. La forma final de esta enzima
consta de tres cadenas polipeptídicas unidas
por dos enlaces disulfuro. Los procesos de
ruptura específica esquematizados en la figura
dan lugar a una serie de cambios
conformacionales en la estructura terciaria.
Estos cambios dejan al descubierto residuos
de aminoácidos de los sitios activos de la -
quimotripsina y -quimotripsina que estaban
ocultos en la forma del zimógeno
20
La coagulación de la sangre también requiere
una serie de activaciones proteolíticas en las
que interviene varias proteínas, en especial las
conversiones de protrombina en trombina y
de fibrinógeno en fibrina. En el último paso
de la formación de coágulos, que es el mejor
caracterizado, la proteína soluble fibrinógeno
se convierte en la proteína insoluble fibrina
como resultado de la hidrólisis de cuatro
enlaces peptídicos.
Regulación por isoenzimas
Algunos procesos metabólicos están
regulados por enzimas que existen en
diferentes formas moleculares, llamadas
isoenzimas o isozimas, que tienen secuencias
de aminoácidos semejantes pero no idénticas.
Todas las formas presentan la misma
actividad enzimática es decir catalizan la
misma reacción bioquímica, pero pueden
diferenciarse por tener distintas propiedades
cinéticas (diferente KM y Vrnáx) reguladoras
(diferentes efectores); preferencias por las
coenzimas, e incluso por su distribución
celular.
La enzima mejor conocida y una de las
primeras que se encontraron en formas de
isoenzimas, es la lactato deshidrogenasa
(LDH), la cual cataliza una reacción clave en
el metabolismo muscular; la conversión
reversible de piruvato a lactato. La LDH es un
tetrámero que consta de dos tipos posibles de
subunidades, M y H. Las dos cadenas
polipeptídicas, que se forman de dos genes
distintos, se asemejan en su secuencia de
aminoácidos, pero se pueden separar
mediante electroforesis. La forma M4 de LDH
es la que predomina en el músculo
esquelético. Por el contrario, la LDH de
músculo cardiaco tiene la fórmula de
subunidad, H4. Otros tejidos como el hígado
tienen una mezcla de cinco posibles formas
incluyendo híbridos (M4, M3H, M2H2, MH3,
H4). No se conoce bien la razón por la que
existen isoenzimas de LDH y de otras
enzimas; sin embargo, se ha observado que
las distintas formas de LDH de otras enzimas
muestran propiedades cinéticas y reguladoras
excepcionalmente distintas. Por ejemplo, la
isoenzima M4 de LDH tiene mayor afinidad
por el piruvato que las otras formas, mientras
que la isoenzima H4 tiene mayor afinidad por
lactato.
El análisis de de las formas de isoenzima de
LDH del suero sanguíneo ha sido de gran
utilidad en el diagnóstico y tratamiento de
ciertas enfermedades. En el daño celular
provocado por infarto del miocardio (ataque
cardiaco) o por hepatitis infecciosa (una
enfermedad hepática) o en trastornos del
músculo esquelético, la LDH y otras enzimas
se liberan hacia el torrente sanguíneo. El
tejido dañado se refleja en el patrón de
isoenzimas de LDH que se encuentra en a
sangre. La figura 1.24 muestra un patrón
electroforético de las formas de isoenzima de
LDH.
Figura 1.24
Electroforesis de las formas isozímicas de lactato
deshidrogenasa (LDH.
Mutagénesis de lugar dirigida catalíticas
Hasta 981, se suponía que la catálisis de las
reacciones bioquímicas se limitaba a las
proteínas que se encontraban en forma
natural. Desde entonces, se han hecho
importantes descubrimientos que han abierto
nuevas fronteras en la catálisis biológica:
1. Empleando una técnica denominada
mutagénesis de lugar dirigida, los
científicos pueden modificar la secuencia
de aminoácidos de enzimas conocidas y de
otras proteínas para cambiar su actividad,
especificidad e incluso su conformación.
De hecho, ahora es posible crear proteínas
de prácticamente cualquier composición y
secuencia de aminoácidos.
2. Utilizando análogos del estado de
transición como antígenos, se han
preparado anticuerpos proteicos que
funcionan como catalizadores biológicos;
de ahí que se les conoce como anticuerpos
catalíticos.
21
El diseño de nuevos catalizadores proteicos
ha llevado al desarrollo de nuevos tipos de
catalizadores para la industria biotecnológica,
la medicina y la investigación básica.
Mutagénesis de lugar dirigida
Cuando se estudia la estructura y actividad de
una enzima, resulta muy valioso poder
sustituir un residuo de aminoácido por otro o
modificar la estructura de un aminoácido ya
existente. Por ejemplo, si uno supone que la
cadena lateral hidroxilo de un residuo
específico de serina es necesaria para la
actividad catalítica de una enzima, se puede
remplazar esa serina por un residuo de
alanina. Posteriormente se analiza la actividad
catalítica de la proteína modificada. Ahora los
científicos han desarrollado vanas estrategias
para alterar la secuencia de las proteínas.
En la actualidad se cuenta con técnicas donde
se utilizan los nuevos procedimientos de
DNA recombinante para alterar los genes en
cualquier lugar del DNA. Con el empleo de
enzimas que catalizan su ruptura, la síntesis
del nuevo DNA y la replicación de sus
hebras, es posible modificar el mensaje de un
gen particular para cambiar la secuencia de
aminoácidos expresada en el producto
proteico final. El gen modificado, preparado
por síntesis química o biológica se introduce
en una célula huésped, donde es donado y
expresado para producir la proteína alterada
en cantidad suficiente para estudios
posteriores. Se pueden sintetizar genes que
produzcan proteínas de prácticamente
cualquier secuencia de aminoácidos. Esto
permite diseñar proteínas por ingeniería con
nuevas propiedades estructurales catalíticas.
Anticuerpos catalíticos (Abzimas)
Los anticuerpos proteicos de la sangre
(inmunoglobulinas) funcionan como
moléculas de protección al unir fuertemente y
neutralizar las sustancias extrañas que pueden
dañar a las células y a los organismos. Los
anticuerpos se producen en la sangre de los
animales superiores como respuesta a la
invasión de moléculas extrañas llamadas
antígenos. Hace muchos años, Linus Pauling
postuló que la diferencia fundamental entre
las enzimas y los anticuerpos estriba en que
las enzimas unen selectivamente a las
moléculas de sustrato en el estado de
transición de una reacción, mientras que los
anticuerpos unen específicamente moléculas
semejantes a los antígenos en su estado basal.
En consecuencia, ¿es posible producir un
anticuerpo con la actividad catalítica del tipo
de las enzimas, utilizando un análogo del
estado de transición como antígeno? Si así
fuera, esto ofrecería la oportunidad de generar
anticuerpos que no sólo unan moléculas, sino
que también sirvan como catalizadores muy
selectivos de las reacciones químicas que se
quieran.
El estudio de anticuerpos catalíticos
(Abzimas) en su totalidad ha aumentado
sumamente la conversión actual de los
mecanismos de la catálisis de la enzima y
representa otro paso adelante en las tentativas
de crear las enzimas biológicas artificiales
dirigidas.
El primer anticuerpo comercializado como
abzima ha sido una con actividad de aldolasa
desarrollada en el Grupo Lerner, U.S.A. Sin
embargo, el uso masivo de ellas aún está en
sus primeros pasos. La aldolasa del Grupo
Lerner es utilizada para la síntesis del
Epothilone A, un nuevo compuesto
anticanceroso.
Otra manera de utilizar las abzimas ha sido
propuesta por diferentes laboratorios,
utilizando las propiedades hidrolíticas, de las
abzimas para activar prodrogas.
Quizás el uso más emocionante de la
tecnología de las abzimas es incidir de
manera específica sobre las células
cancerígenas para generar su destrucción Las
células del cáncer contienen los determinantes
únicos, llamados los antígenos de la célula del
tumor, ausentes en células normales.
Utilizando los anticuerpos que unen
específicamente estos antígenos de la célula
del tumor, las drogas del cáncer se pueden
dirigir directamente al tumor. En la caja de
abzimas, los científicos han previsto
anticuerpos con dos sitios obligatorios del
antígeno distinto: Un sitio ata con alta
afinidad a un antígeno de la célula del tumor,
mientras que el segundo sitio cataliza la
hendidura de un prodroga, éste es un
precursor no tóxico de una droga citotóxica.
Primero, el anticuerpo se administra a los
pacientes, y ata las células del tumor con alta
22
afinidad. En segundo lugar, el prodroga se
introduce en la circulación sanguínea pero
solamente se activa en la vecindad del
anticuerpo apuntado. Por esta técnica, los
tumores son destruidos selectivamente
mientras que las células sanas se ahorran del
tóxico afectan drogas del cáncer.
De las misma manera, otras posibles
aplicaciones de las abzimas contra virus. Los
primeros estudios indican que pueden
inactivarlos; por ejemplo, se han aislado las
abzimas que hienden las proteínas virales de
la capa del virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH). Los investigadores también
han desarrollado los abzimas que catalizan la
destrucción específica de genes virales.
Quizás en el futuro, tendremos las
herramientas para tratar una variedad amplia
de enfermedades con el uso de la tecnología
catalítica del anticuerpo.
RNA catalítico (ribozimas)
Hasta 1981, los estudiantes de bioquímica
leían en sus libros de texto y escuchaban en
las clases que ―todas las enzimas son
proteínas‖.
El estudio de los catalizadores biológicos se
volvió muy intenso en la segunda mitad del
siglo XIX por las investigaciones que se
hacían sobre el metabolismo de los azúcares.
En esa época a los catalizadores se les
llamaba ―fermentos‖ y se desconocía su
naturaleza química.
En la década de los veinte (1920) se purificó
y cristalizó la primera enzima, la ureasa. El
análisis químico que ésta se componía
principalmente de proteína. Desde esa época
hasta 1981 todas las enzimas purificadas y
analizadas fueron proteínas. Para entonces, la
idea de que todas las enzimas eran proteínas
se volvió un dogma bioquímico. El
descubrimiento de moléculas de RNA que
actuaban como enzimas fue realizado por dos
distintos grupos de investigación entre 1981 y
1982, así comenzó una revolución de la
bioquímica. Muchos bioquímicos se
mostraron escépticos cuando se anunciaron
por primera vez los resultados de la
investigación sobre el RNA catalítico. Sin
embargo, como a evidencia experimental que
sustentaba la existencia de las enzimas de
RNA se acumulaba y se iban descubriendo
diversos tipos en diferentes organismos, aún
el más incrédulo quedó convencido de su
existencia. El verdadero significado del
descubrimiento de que ciertas formas de RNA
pueden servir como catalizadores biológicos,
fue reconocido al otorgarse el Premio Nóbel
de Química de 1989 a los autores del
descubrimiento de estos catalizadores únicos.
Sidney Altman (de la Universidad de Yale) y
Thomas Cech (de la Universidad de
Colorado-Boulder). El término ribozima se
utiliza ahora para describir las enzimas de
RNA.
Las ribozimas presentan una gran
especificidad de sustrato, esta es la
característica en que se fundamenta la idea de
que las ribozimas pueden ser utilizadas como
supresores génicos específicos y servir de
base para el desarrollo de nuevos agentes
terapéuticos. Las ribozimas actuarían
bloqueando la transmisión de información
genética a nivel del RNA mediante la
destrucción de genomas RNA (virus RNA) o
de ARN m. y por lo tanto tienen un potencial
enorme como terapia para el control de genes.
Se han generado hasta hoy, bajo el
procedimiento del ADN recombinante más de
100 ribozimas nuevas, con perfiles catalíticos
distintos de los que se encuentran en
moléculas naturales. Se están empleando
como potenciales agentes terapéuticos en una
amplia variedad de enfermedades, que
incluyen infecciones virales, cáncer, diabetes,
enfermedades cardiovasculares y
osteoporosis.
Ribonucleasa P
El primer indicio del RNA catalítico viene de
los estudios de la enzima ribonucleasa P, a
cual se encuentra en todos los organismos.
Los sustratos para la enzima son una serie de
moléculas precursoras de tRNA inactivo. Para
preparar el tRNA funcional, maduro, se
elimina un fragmento del ribonucleótido por
ruptura hidrolítica del enlace fosfodiéster,
dejando la conocida estructura de hoja de
trébol del tRNA para seleccionar y activar
aminoácidos para la síntesis proteica. La
ribonucleasa P puede reconocer y romper por
lo menos 60 precursores distintos de tRNA.
23
El componente de RNA actúa como una
verdadera enzima: sigue la cinética de
Michaelis-Menten, sólo se necesita en
pequeñas cantidades, permanece con su
estructura terciaria para ser activa y no
modifica dicha estructura en el proceso de
reacción.
Granzimas
Pertenecen a una familia de proteasas-serina
estructuralmente relacionadas a la
quimotripsina y todas muestran actividad
catalítica por una triada His-Asp-Ser en su
sitio catalítico.
Son clave del inicio de muchos procesos de
apoptosis que ocurren en células blanco
marcadas para ser destruidas por las células
citotóxicas. Son producidas como zimógenos,
y se activan por acción de catepsinas C,
también conocidas como dipeptidil peptidasa
I, una proteasa.
Existen por lo menos 12 granzimas
conocidas, cinco de éstas: A, B, H, K y M han
sido descritas en humanos, de ellas las
granzimas A y B son las más estudiadas.
ENZIMAS PLASMATICAS
Las enzimas que se encuentran en el plasma
se dividen en dos grupos principales:
1. Enzimas plasmáticas específicas: El
plasma es su sitio normal de actividad y
ubicación y aquí sus concentraciones son
mayores que en los sitios de síntesis, por
ejemplo, hígado, proteínas de coagulación,
seudocolinoesterasa etc.
2. Enzimas plasmáticas n o específicas: Se
caracterizan porque su función no ocurre
en este líquido corporal. Se dividen en:
Enzimas de secreción. Provienen de
glándulas exocrinas, como el
páncreas.
Enzimas del metabolismo
intermedio: Su concentración en
suero es muy elevada debido a un
daño celular o necrosis, lo cual
propicia la fuga de una fracción de
estas enzimas hacia el plasma u otros
líquidos corporales.
APLICACIONES DE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA EN EL CAMPO
BIOMEDICO
La acción de las enzimas no se limita a la
catálisis de las reacciones metabólicas dentro
de las células biológicas. Por sus
características de especificidad y eficacia, las
enzimas resultan idóneas para utilizarse en
algunos tratamientos clínicos, en el
procesamiento de alimentos, en la limpieza de
depósitos de desecho contaminados con
químicos, e incluso en la manufactura de
ropa.
La industria de la biotecnología ha
desarrollado varias enzimas con fines
terapéuticos. Recientemente se ha
recomendado utilizar la enzima
desoxirribonucleasa (DNasa) para el
tratamiento de los pacientes con fibrosis
quística. Uno de los principales problemas
clínicos que se presentan en los nacientes con
la FQ es la producción de grandes volúmenes
de moco sumamente viscoso en los pulmones
y vías respiratorias. Esto induce falta
respiratoria con bastante frecuencia y es la
causa más común de muerte en este tipo de
pacientes. El moco contiene bacterias que
provocan infecciones pulmonares crónicas y
la DNasa ayuda a disminuir la viscosidad del
moco.
Las enzimas tienen diversas aplicaciones en el
campo biomédico, por ejemplo como auxiliar
de diagnóstico o pronóstico de enfermedades,
como tratamiento, como reactivo de
laboratorio, entre otros. Ello debido a que
tienen alta especificidad y eficacia catalítica,
características muy apreciadas en su
aplicación como agentes terapéuticos, o
diagnóstico. Sin embargo, requieren de un
alto grado de pureza, alta estabilidad a las
condiciones de temperatura y pH fisiológicos,
así como una baja antigenicidad y
accesibilidad al sitio corporal de destino
Al analizar este tipo de aplicaciones, es
conveniente diferenciar entre aquellas
convencionales de administración oral o
tópica, de aquellas sofisticadas en las cuales
se pretende utilizar la enzima para suplir una
deficiencia metabólica congénita, resolver un
trastorno funcional o atacar selectivamente
células malignas. Su uso clínico en pacientes
24
es muy reducido a la espera de recoger
abundante información sobre los efectos
colaterales en los animales de prueba, que
permitan cumplir las estrictas normas de
seguridad exigidas.
El uso terapéutico no es reciente. Se
comercializó antes de la primera guerra
mundial: Takadiastasa, producido por la
fermentación en estado sólido de Aspergillus
oryzae (hongo) como ayuda digestivo. Las
convencionales son principalmente hidrolasas
de origen animal o vegetal
En años recientes la aplicación terapéutica de
las enzimas ha cobrado un nuevo impulso
como consecuencia de la posibilidad
tecnológica de desarrollar sistemas
enzimáticos de aplicación extra o
intracorporea. Aunque últimamente con el
uso de la tecnología del DNArec se están
obteniendo logros muy importantes, ya que se
puede clonar genes humanos productores de
enzimas en bacterias, principalmente E. coli.
Podemos destacar las siguientes:
1. Tratamiento de deficiencias metabólicas
congénitas: catalasa, para el tratamiento
de acatalasemia; fenilalanina hidroxilasa
y fenilalanina amoniaco liasa, para
tratamiento de fenilcetonuria, Galactosa,
1- P uridil transferasa, para el tratamiento
de la galactosemia
2. Eliminación de metabolitos tóxicos por
malfuncionamiento de órganos: ureasa y
uricasa, para eliminar urea y ácido úrico
por mal funcionamiento renal; UDP
glucoronil transferasa y bilirrubina
oxidasa para la remoción de bilirrubina en
casos de ictericia derivados de
malfuncionamiento o inmadurez hepática;
anhidrasa carbónica y catalasa en
intercambio gaseoso de O2 y CO2 en
respiradores artificiales
3. Eliminación selectiva de nutrientes
específicos de células malignas:
asparaginasa y glutaminasa en la
eliminación de L-asparagina y L-
glutamina en el tratamiento de leucemia;
carboxipeptidasa G1 y fenilalanina
amoniaco liasa en la eliminación de ácido
fólico; fenilalanina y tirosina en el control
del crecimiento de tumores.
Dificultades de uso:: inestabilidad en
las condiciones de uso, susceptibilidad a
la acción de proteasas, respuestas
inmunológicas del paciente
Alternativas: inmovilización de
enzimas a soportes sólidos o
confinamiento a fibras o cápsulas
artificiales o biológicas
APLICACIONES EXTRACORPOREAS
El torrente sanguíneo del paciente es derivado
(derivación arterio-venoso) hacia un circuito
externo a través de un reactor enzimático, en
el que se logra el efecto deseado. Este tipo de
aplicación es adecuado para la remoción
selectiva de metabolitos tóxicos y nutrientes
de células malignas. Ejemplo: eliminación de
urea mediante ureasa inmovilizada (riñón
artificial enzimático), eliminación de
asparagina mediante asparaginasa
inmovilizada
APLICACIONES INTRACORPOREAS
Es la que presenta mayores problemas dados
el pH y temperatura desfavorables, y por
respuesta inmunológica del paciente y acción
de proteasas endógenas. Puede hacerse a nivel
subcutaneo, intramuscular, gastrointestinal,
intraperitoneal, intravenoso o intraarterial. Es
esencial la biocompatibilidad de los
materiales empleados, a fin de evitar la aguda
respuesta inmunológica
ENZIMAS COMO VALOR
DIAGNOSTICO
Está comprobado que la medida de la
actividad de ciertas enzimas en el plasma
tiene valor diagnóstico o pronóstico en varias
enfermedades. Se debe diferenciar las
enzimas intracelulares de las extracelulares, y
de los que accidentalmente se han vertido al
medio extracelular, por alteración de las
células que habitualmente los contienen. Debe
conocerse también la estructura química y el
comportamiento físico de las enzimas.
COMO REACTIVOS DE ANALISIS
Como auxiliares de análisis son mucho más
específicos que los reactivos químicos. Ejem.
Para medir el nivel de glucemia y glucosuria,
se emplea glucosa oxidasa y peroxidasa.
25
Dado la importancia del dosaje de enzimas
como marcadores de órganos o tejidos y para
el diagnóstico de enfermedades, se
describirán algunas de ellas en base a
ejemplos concretos y muy frecuentes en la
vida cotidiana del médico.
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
MEDIANTE LA CUANTIFICACIÓN DE
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN
SUERO
Marcadores hepáticos
Cuando existe daño hepatocelular, con o sin
necrosis u obstrucción biliar, se liberan
enzimas intracelulares hacia la corriente
sanguínea, lo que facilita la detección de
enzimas de origen hepático en suero. Las
enzimas que se pueden detectar son las
siguientes:
1. Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)
2. Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)
3. Lactado deshidrogenasa (LDH)
4. -Glutamiltransferasa (γ GT)
5. Fosfatasa alcalina (ALP)
6. Glutatión sulfurotransferasa (GS)
La cuantificación de la actividad enzimática
hepática, junto con la concentración de
bilirrubinas y albúmina permiten una mayor
valoración del funcionamiento hepático.
Un incremento significativo de la actividad
enzimática de transferasas se observa en las
alteraciones de la célula hepática, así como en
la colestasis y en la cirrosis.
A continuación se presentan algunas
características de los marcadores hepáticos:
Alanina aminotransferasa (ALT). Su
sinónimo, transaminasa glutámico-pirúvica
(TGP); se distribuye en orden decreciente de
frecuencia, en hígado, riñón, corazón,
músculo esquelético y catalasa la
transferencia de un grupo amino de la L-
alanina o la L-glutamato o los
correspondientes cetoácidos, cetoglutarato y
piruvato.
Aspartato aminotransferasa (AST). Su
sinónimo, transaminasa glutámico-
oxaloacética (TGO), se ubica en la
mitocondria y en el citoplasma, y se
distribuye, en orden decreciente de
frecuencia, en corazón, hígado, músculo
esquelético y riñón. Cataliza la transferencia
de un grupo amino de un aminoácido L-
glutamato o L-aspartato a cetoácidos,
cetoglutarato y oxaloacetato. El fosfato de
pirodoxal en forma de coenzima forma parte
del ciclo activo de la enzima.
Gamma-Gutamiltransferasa (GGT). Su
sinónimo es -glutamiltranspeptidasa
(GGTP). Se distribuye en orden creciente de
frecuencia, en riñones, páncreas e hígado y
cataliza la transferencia de un grupo -
glutamilo o un aminoácido o péptido. Esta
enzima forma parte del ciclo del glutatión. Se
conocen diferentes isoenzimas.
5-Nucleotidasa (5-NT). Es una fosfatasa que
cataliza la hidrólisis de los cinco
monofosfatos de ribonucleótidos y 5-
desoxinucleósidos y se encuentra asociada
con la membrana celular de los hepatocitos.
Su actividad enzimática se incrementa en las
alteraciones hepatobiliares, ya que las sales
biliares favorecen la liberación de células
hepáticas.
Marcadores pancreáticos
Endocrinos
Un marcador por excelencia es glutamato
descarboxilasa (GAD), involucrado en casos
de autoinmunidad que desencadenan diabetes
mellitus tipo 1.
Exocrinos El diagnóstico diferencial entre pancreatitis
aguda y otros trastornos intraabdominales con
síntomas similares se lleva a cabo con las
mediciones de la actividad enzimática de
amilasa sérica, o urinaria, o ambas, y de
lipasa y tripsina.
A continuación se describen algunas
características de estas enzimas.
Amilasa. Se conoce un mínimo de siete
isoenzimas distribuidas en saliva, jugo
pancreático, leche humana y suero. La
medición de su actividad es de gran
importancia para el diagnóstico de
pancreatitis aguda; sin embargo, ésta es de
mayor utilidad si se cuantifica
simultáneamente la actividad de la lipasa.
26
Lipasa. Su sinónimo es: triacilglicerol
acilhidrolasa. Se ha demostrado su presencia
en el páncreas y posiblemente se encuentre en
el riñón. También la detección de la lipasa es
de gran utilidad diagnóstica en casos de
pancreatitis, comparada con la de amilasa. Al
igual que la amilasa, la concentración de la
lipasa se incrementa en la circulación de
pacientes con insuficiencia renal.
Tripsina. Se detectan concentraciones altas
de esta enzima en pancreatitis aguda y en
50% de los casos de carcinoma pancreático, y
las cifras están disminuidas en pancreatitis
crónica por insuficiencia exocrina.
Marcadores cardiacos
Un avance muy importante de la enzimología
es el uso de enzimas como marcadores para la
detección inmediata de un infarto de
miocardio. En el decenio de 1960, para este
fin se utilizaba la cuantificación de la
actividad enzimática de la deshidrogenasa
láctica, aspartato aminotransferasa (AST) y
creatinfosfocinasa (CK). En el decenio de
1970 se obtuvo una mayor especificidad de
los marcadores al separar por medio de
electroforesis las isoenzimas de la
creatinfosfocinasa. En el decenio de 1990 se
inició el uso de anticuerpos monoclonales
para identificar de manera rápida y específica
la creatinfosfocinasa del miocardio y
cuantificar proteínas específicas, como
mioglobina y troponina, que son marcadores
muy específicos de daño miocárdico.
A continuación se presenta algunas
características de los marcadores cardiacos.
Creatinfosfocinasa (CK). Se conocen tres
isoenzimas, CK-BB, CK-MB, CK-MM; éstas
se ubican en el citoplasma y mitocondrias;
catalizan la formación del trifosfato de
adenosina (ATP) y la fosforilación reversible
de creatina con ATP.
Se sugiere que su cuantificación se lleve a
cabo antes del ejercicio, ya que la actividad
de CK aumenta.
La enzima CK es dimérica; cada una de sus
subunidades se denominó M y B, y existen
tres variedades de esta enzima: CK-MM, CK-
MB y CK-BB. La fracción
musculoesquelética de creatin-fosfocinasa
(CK-MM) se encuentra fundamentalmente en
el músculo esquelético; la fracción
miocárdica de creatinfosfocinasa (CK-MB),
en el músculo cardiaco, y la fracción
encefálica e intestinal de creatinfosfocinasa
(CK-BB), en cerebro e intestino, como sus
nombres lo indican.
En las primeras 4 horas de dolor precordial, la
cuantificación de CK-MB es la prueba de
elección y se pueden tomar muestras de suero
cada dos o cuatro horas. Otra ventaja
adicional de medir la CK-MB es la de
detectar un reinfarto, ya que su actividad
enzimática retorna a sus valores de referencia
a las 36 horas.
Deshidrogenasa láctica (LAD o LDH). Se
encuentra en concentraciones importantes en
hígado, músculo esquelético, músculo
cardiaco, eritrocitos, suero, riñón y cerebro.
Cataliza la reacción de deshidrogenación del
lactato para convertirlo en piruvato. Esta
enzima se encuentra en el citoplasma de las
células somática y se compone de cuatro
cadenas polipeptídicas. La subunidad de tipo
H predomina en tejidos aeróbicos como
músculo cardiaco, y la subunidad M, en
tejidos anaeróbicos, como músculo
esquelético e hígado, lo cual hace necesario
medir las concentraciones de isoenzimas por
electroforesis o inmunoprecipitación para
discriminar el origen de la enzima.
Esta enzima es un tetrámero compuesto dos
pares de diferentes subunidades: 1) H
(abreviatura en inglés de corazón), y 2) M
(abreviatura en inglés de músculo). Por las
combinaciones presentes se encuentran cinco
isoformas de la enzima o isoenzimas: LDH-1,
que está en grandes concentraciones en
corazón, corteza suprarrenal y eritrocitos;
LDH-2, LDH-3 LDH-4, que se ubican en las
glándulas endocrinas, pulmones, ganglios
linfáticos y plaquetas, y LDH-5, que se halla
en concentraciones elevadas en hígado y
músculo. La cuantificación de la isoenzima
deshidrogenasa láctica es importante en
quienes no se sospecha la presencia de infarto
de miocardio en las primeras
24 horas.
Pese a no ser específicamente enzimas, dado
su importancia y sensibilidad se considera en
corazón a:
27
Mioglobina y troponina. La mioglobina es
una proteína intracelular que se encuentra en
grandes cantidades en el músculo cardiaco. Se
libera a la circulación sanguínea en las
primeras seis horas de dolor precordial. La
troponina IT sólo se presentan en suero
cuando existe necrosis cardiaca; sin embargo,
la concentración de éstas permanece elevada
de 3 a 14 días. Actualmente, la mioglobina y
troponina se identifican por anticuerpos
monoclonales. La troponina (TN) es una
molécula esférica constituida por tres
subunidades diferentes, las cuales se
denominan de acuerdo con su función: 1) TN-
T, que es la unidad que se une a
tropomiosina; 2) TN-I, que es la unidad
inhibidora (TN-I); y 3) TN-C, que es la
unidad que se une al calcio.
Marcadores musculares
Creatinfosfocinasa. Diversas enzimas sirven
para valorar afecciones musculares; la CK
sérica es más específica y sensible que la AST
y la LDH, y más predictiva que la aldolasa.
Se observa un incremento de la actividad de
estas enzimas en la poliomielitis, las distrofias
musculares, las distrofias miotónicas y
algunos trastornos metabólicos.
Estas afecciones musculoesqueléticas causan
un daño directo al músculo y, en
consecuencia, las enzimas pasan al suero.
Aldolasa. Pertenece a las liasas. Es una
enzima importante en la vía de Embden-
Meyerhof del metabolismo de la glucosa. Su
principal función es romper el enlace
fructosa-1,6--bifosfato para formar fosfato de
hidroxiacetona y gliceraldehído-3-fosfato. Se
distribuye, en orden decreciente de
frecuencia, en músculo esquelético, hígado y
cerebro.
Marcadores óseos
En diferentes padecimientos óseos es
importante conocer las reacciones enzimáticas
características para valorar la función de los
osteoblastos y de los osteoclastos.
Fosfatasa alcalina (ALP). Se produce en
placenta, hígado, hueso y bazo, La actividad
primaria de la ALP refleja cambios en la
función ósea y hepática.
Es probable que los incrementos de la
concentración de ALP se deban a una gran
actividad de los osteoblastos, como en la
enfermedad de Paget. Otras alteraciones óseas
que aumentan los valores de ALP son
osteoporosis, raquitismo y osteomalacia por
deficiencia de vitamina D, y metástasis óseas
por enfermedades malignas de próstata,
pulmón o glándula mamaria.
Marcadores prostáticos
La hipertrofia prostática benigna es una de las
enfermedades más frecuentes en los varones
mayores de 50 años, lo cual hace necesario
contar con métodos para identificar
enfermedades prostáticas.
Fosfatasa ácida (ACP). Se distribuye en
próstata, eritrocitos, plaquetas, hígado, bazo,
riñón y médula ósea. La ACP se usa para
mediciones medicolegales del líquido seminal
en la vagina después del coito. Los valores de
la actividad de ACP sérica siempre son
anormales en los estadios finales de
carcinoma prostático metastásico.
Isoenzimas de fosfatasa ácida. La isoenzima
2 separada por electroforesis también se
conoce como PAP y sólo se encuentra en la
circulación en el carcinoma prostático.
Enzima específica de la próstata (PSA). Su
sinónimo es antígeno específico de próstata
circulante. Es una proteasa de la familia de las
calicreínas, con un peso molecular de 34 000
Da. Se produce por la próstata y se secreta al
plasma seminal. La PSA se encuentra en
pequeñas cantidades en in dividuos normales
y la actividad de ésta aumenta en la
hipertrofia prostática y en el adenocarcinoma
de próstata. Actualmente se identifica por
medio de anticuerpos monoclonales, tanto la
fracción libre de PSA como la fracción de
PSA ligada antiquimiotripsina. Los
individuos con cáncer de próstata presentan
menos fracción libre de antígeno prostático y
éste se puede cuantificar mediante el método
de ensayo inmunoadsorbente enzimático
(ELISA). El límite superior normal de la
actividad de PSA en suero es de hasta 6.5
ng/ml.
Inhibición de enzimas en el tratamiento del
SIDA
Una estrategia clave en el tratamiento del
síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA) ha sido el desarrollo de inhibidores
específicos que bloquean selectivamente la
acción de enzimas exclusivas del virus de
inmunodeficiencia humana (VIH), que causa
28
el SIDA. Muchos laboratorios están
explorando este enfoque de desarrollo de
agentes terapéuticos.
Una de las enzimas más importantes que se
han escogido como blancos en la VIH
proteasa, una enzima indispensable para la
producción de nuevas partículas de virus en
las células infectadas. La VIH proteasa sólo
se encuentra en este virus, y cataliza el
procesamiento de proteínas virales en la
célula infectada. Sin estas proteínas, no es
posible liberar partículas viables de virus para
diseminar la infección. La estructura de la
VIH proteasa, incluido su sitio activo, se
determinó mediante cristalografía de rayos X.
Con esta estructura en mente, los científicos
han diseñado y sintetizado compuestos que se
unen al sitio activo. Se mejoró el diseño del
medicamento obteniendo las estructuras de
una serie de inhibidores que se unen al sitio
activo de la VIH proteasa. Dichas estructuras
también se determinaron por cristalografía de
rayos X. En última instancia, el proceso llevó
a varios compuestos que han comercializado
diferentes compañías farmacéuticas. Estos
inhibidores de VIH proteasa incluyen
saquinavir de Hoffman-LaRoche, ritonavir de
Abbot, indinavir de Merck, viracept de
Agouron Pharmaceuticals y amprenavir de
Vertex Pharmaceuticals. (Estas compañías
mantienen páginas base muy informativa en
la World Wide Web).
Los tratamientos del SIDA son más eficaces
cuando se usa una combinación de terapias
medicamentosas, y los inhibidores de la VIH
proteasa desempeñan un papel importante.
Se obtienen resultados especialmente
prometedores (como un abatimiento de los
niveles de virus en el torrente sanguíneo)
cuando los inhibidores de VIH proteasa
forman parte de terapias medicamentosas
para el SIDA.
29
PROBLEMAS DE ESTUDIO
1. Defina los siguientes términos con 25
palabras o menos.
a. Vitamina
b. Niacina
c. Coenzima
d. Grupo prostético
e. Micronutriente
f. Efector negativo
g. Sitio regulador
h. Cooperatividad
i. Isoenzimas
j. Modificación
covalente
k. Zimógeno
l. Mutagénesis de lugar
dirigida
m. Anticuerpos
catalíticos
n. Ribozima
o. [S]0.5
2. ¿Por qué es lógico que el primer paso de
una serie de reacciones metabólicas sea el
principal paso de regulación?
3. Explique ¿Por qué razón la ruptura
proteolítica no se considera como una
forma de modificación covalente?
4. ¿Por qué las enzimas proteolíticas
producidas en el páncreas y estómago
deben ser sintetizadas en forma inactiva?
5. Un individuo que tenía el dolor en el
pecho, fue a la sala de emergencias del
hospital de la zona para que le dieran
tratamiento. El análisis de la sangre del
paciente mostró niveles elevados de la
enzima lactato deshidrogenasa (LDH) con
predominancia de la isoenzima H4.
Sugiera una posible causa que explique
los niveles elevados de LDH. Explique
los posibles procesos bioquímicos que
sustentan el diagnóstico que usted
propone.
6. Compare y contraste las características de
los cuatro tipos de regulación enzimática
descritos en este capítulo: alosterismo,
modificación covalente, ruptura
proteolítica e isoenzimas.
7. La acción catalítica de una enzima sucede
con el sustrato unido en el sitio activo.
¿Cómo puede alterarse la actividad
catalítica del sitio activo, por la unión de
otro tipo de compuesto en un punto
distante de dicho sitio activo?
8. ¿Cuáles de los siguientes enunciados son
ciertos para las isoenzimas?
a. Catalizan las mismas reacciones
químicas.
b. Tienen la misma estructura cuaternaria.
c. Se distribuyen por igual en los órganos
y tejidos.
d. Tienen el mismo nombre y número de
clasificación enzimática.
9. ¿Cuál es el papel del componente de
RNA en el sistema de la enzima
ribonucleasa?
10. ¿Qué diferencias existen entre los
términos coenzima y grupo prostético?
11. Abajo se muestra la ruta de la síntesis de
colesterol en los animales. Sólo se
muestran algunos de los numerosos
intermediarios y enzimas. Utilizando los
principios de la regulación enzimática,
responda: ¿Cuál reacción es el paso
determinante de la velocidad de esta ruta?
¿Esperaría que la enzima fuera reguladora
en ese punto?
HMGCoA mevalonato intermedarios de isopreno
Escualeno Lanosterol Colesterol
12. Relacione cada una de las vitaminas
incluidas en la primera columna de la
tabla con su coenzima respectiva que se
encuentra en la lista de la segunda
columna.
Vitamina Coenzima relacionada
Riboflavina (vitamina
B2)
Vitamina B6
Niacina
Ácido fólico
Vitamina B1
Fosfato de piridoxal
NAD+
FAD
Coenzima A
Tetrahidrofolato
Pirofosfato de tiamina
Biotina
1 2
3 4 5
30
BIOENERGETICA
GENERALIDADES Las células y seres vivos en general requieren
de energía para efectuar trabajo para vivir,
crecer, y reproducirse. Para ellos tienen la
capacidad de captar energía de diversas
fuentes y canalizarlo para desarrollar trabajo,
constituyéndose en una de las propiedades
fundamentales de los seres vivos, en todos los
niveles de la escala evolutiva. Los organismos
llevan a cabo una serie de transducciones
energéticas, conversiones de una forma a otra
de energía, usando para ello la energía
química como combustible para la síntesis de
moléculas complejas (macromoléculas) a
partir de moléculas simples.
Esta serie de reacciones que se producen en
los seres vivos la denominamos
metabolismo. En el metabolismo se
involucran miles de coordinadas, complejas,
eficientes e integradas reacciones químicas,
ordenadas en las llamadas vías metabólicas, -
secuenciadas e intricadas rutas- controladas
por enzimas.
De manera general al metabolismo (Fig. 1.25)
se le divide en anabolismo y catabolismo.
Fig. 1.25 Resumen de Metabolismo
Rutas catabólicas: liberan energía
almacenada en moléculas complejas, a través
de la ruptura o degradación de estas
moléculas en sus componentes más simples.
Rutas anabólicas: requieren energía para
unir moléculas simples y sintetizar
macromoléculas ordenadas estructural y
fisiológicamente. El acoplamiento de las rutas
catabólicas y anabólicas es la energía
Para qué se usa la energía en las células
vivientes
1. Biosíntesis de proteínas y ácidos nucleicos
2. Fosforilación de proteínas catalizada por
cinasas, para provocar cambios de
conformación
3. Superenrrollamiento del DNA
4. Conversión de azúcares simples en
fosfatos de azúcar y NDP-azúcares, y de
ácidos grasos en tioésteres
5. Funcionamiento de los sistemas de
transporte activo
Todos los seres vivos estamos constituidos
por miles de compuestos orgánicos diferentes,
que abarcan desde moléculas relativamente
METABOLISMO CELULAR
METABOLISMO: CAMBIOS EN LA ENERGIA LIBRE CELULAR
RESPIRACION SINTESIS
G CO2 + H2O
Monómeros Macromoléculas
Reacciones
Catabólicas
Reacciones anabólicas
ENTALPIA
ENTALPIA
- Δ H + Δ H - Δ G EXOTERMICA ENDOTERMICA + Δ G
ENTROPIA
ENTROPIA
+ Δ S - Δ S
EXERGONICA ENDERGONICA
ATP
31
simples como monosacáridos, aminoácidos,
ácidos grasos, vitaminas y otros, hasta
macromoléculas muy complejas como
polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos.
Estos a su vez pueden organizarse en
agregados macromoleculares extremadamente
complejos como los ribosomas, complejos
multienzimáticos, nucleosomas y muchos
otros. Todas estas moléculas tienen en
particular el de estar constituidas por los
mismos elementos que conforman la materia
inerte, y al igual que ellos están regidos por
los mismos principios y leyes de la física y la
química, como las de la termodinámica.
Lo anterior se basa en que todo organismo
puede ser considerado como un sistema
fisicoquímico, entendiéndolo como parte del
universo con la cual nos relacionamos. En el
caso de los seres vivos somos un sistema
abierto puesto que hay intercambio de materia
(nutrientes, productos finales o de excreción)
y energía (calor) con nuestro entorno. Estas
interrelaciones son estudiadas por la
Termodinámica, y de manera particular para
los seres vivos están involucradas la 1ra y 2da
Ley.
Conceptos Termodinámicos
Un sistema posee un contenido energético que
comprende un sinnúmero de formas de
energía y a la suma de todas se conoce como
energía interna (E) del sistema. En física se
dice que energía es todo aquel capaz be
producir trabajo. Sin embargo, de todo ese
contenido energético de un sistema, sólo una
porción está disponible para realizar trabajo y
es la energía útil a esa porción de a energía
total se le conoce como energía libre (F o G)
o de Gibbs. Un sistema es un conjunto de
cuerpos que contienen materia y energía,
cuyo estado se define en términos de presión,
temperatura y composición. El contenido total
de energía de un sistema antes de que ocurra
un proceso se designa como estado inicial. y
el contenido de energía del sistema después
de ocurrido el proceso que interesa estudiar se
conoce cono estado final.
Medir los cambios de energía que ocurren
durante un determinado proceso puede
resultar difícil, pero resulta más fácil y
preciso determinar el contenido energético del
sistema en el estado inicial y en el estado final
y calcular el cambio, que se acostumbra
simbolizar con la letra griega delta mayúscula
( ).
Si presión y temperatura son constantes, los
cambios de energía se relacionan únicamente
con composición del sistema. Existen varios
tipos de sistemas: se define como sistema
aislado aquel que no intercambia materia y
energía con su medio. Sistema cerrado es
aquel que intercambia energía pero no
materia, y se denomina sistema abierto al que
intercambia materia y energía con su entorno.
Los sistemas biológicos se presentan como
sistemas abiertos, isotérmicos (igual
temperatura) e isobáricos (igual presión). Un
sistema biológico puede ser una célula, un
organismo, una colonia o hasta el mundo
entero.
El comportamiento de un sistema, biológico o
inorgánico, se rige por leyes o principios
establecidos por una rama de la fisicoquímica
que estudia los fenómenos energéticos de los
sistemas, la termodinámica. La aplicación de
las leyes de la termodinámica a los seres
vivos resulta de extraordinaria utilidad si se
considera que los procesos bioquímicos son
reacciones químicas que deben ajustarse en
todo a las leyes que rigen el comportamiento
de los procesos termodinámicos.
La primera ley de la termodinámica establece
que la energía total de un sistema, más la de
su entorno permanece constante. A esta ley se
le conoce también como ―Ley de la
conservación de la energía‖, que significa
que: la energía no se crea ni se destruye,
sólo se transforma. Sin embargo, dentro de
ese sistema total, la energía puede
transformarse de una a otra forma; por
ejemplo, la energía eléctrica puede
transformarse en energía térmica, energía
radiante o energía mecánica.
La forma de energía más usual es el calor (Q);
puede afirmarse que casi todos los eventos
físicos o químicos que ocurren en a
naturaleza, absorben o desprenden calor al
efectuarse, es decir, son procesos exotérmicos
o endotérmicos.
Imaginemos un sistema aislado, al cual se le
administra una determinada cantidad de calor
(Q), lo cual puede provocar un cambio en la
32
energía interna del sistema ( E) o un trabajo
que realiza el sistema.
Q es la cantidad de calor que se absorbe o se
libera en un proceso a presión constante y se
denomina entalpía (H). Los cambios de
entalpía se representan por H, por lo que la
primera ley de la termodinámica se puede
representar así:
E = H - P V o H = E + P V
donde H es el cambio de entalpía o cantidad
de calor absorbido o liberado por el sistema,
cuando a presión constante realiza un trabajo.
Si en estas condiciones se libera calor al
medio, H es negativo y se dice que la
reacción es exotérmica. Si en la reacción se
absorbe calor del exterior, H es positivo y el
proceso es endotérmico.
La primera ley de la termodinámica no dice
nada acerca de la dirección de flujo de energía
en un proceso y es necesario establecer una
segunda ley que utiliza otro concepto, la
entropía (S). La segunda ley de la
termodinámica establece que si un proceso
ocurre espontáneamente, la entropía total
del sistema debe aumentar. Dicho de otra
manera, en un sistema cerrado las únicas
reacciones espontáneas son aquellas que
tienden al equilibrio y a un aumento de
entropía o desorden. Esta segunda ley se basa
en observaciones experimentales como son el
flujo de calor unidireccional desde la
temperatura más elevada a otra menor.
Supongamos que se coloca un trozo de metal
frío junto a uno caliente: en un sistema
aislado se observará que la temperatura del
objeto caliente baja y la del frío sube. Este
flujo de energía es espontáneo y sólo se
detiene cuando T1 = T2.
Cuando un sistema alcanza el equilibrio, ya
no se produce ningún cambio energético. A
diferencia de la entalpía, la entropía es una
función matemática que no tiene análogo
físico sencillo y su significado es más bien
abstracto. La termodinámica establece que la
entropía es una medida de la distribución al
azar de la energía o una ―medida del
desorden‖. Cuanto más caótico o desordenado
es un sistema, más grande es su entropía;
cuanto más ordenado y estructurado es un
sistema, más pequeña será su entropía.
Finalmente, la tercera ley de la
termodinámica establece que ―un cristal
perfecto en el cero absoluto tiene entropía‖.
Ciclo de la Energía en los Seres Vivos
La realización de todas y cada una de las
funciones celulares requiere energía. Los
organismos autótrofos, utilizan la energía de
la luz solar, y a partir de CO2 y H2O sintetizan
moléculas del tipo de los carbohidratos y
oxígeno. El proceso por el cual se transforma
la energía radiante del sol y se captura en
forma de energía química en la glucosa, se
denomina fotosíntesis. Otro tipo de
organismos, los heterotróficos, mediante la
respiración, que requiere oxígeno, utilizan a
energía química acumulada en los alimentos
durante el proceso de la nutrición y liberan
CO2 y H2O al ambiente, con los cuales los
autótrofos vuelven a generar alimento
químico y repetir el ciclo
Algunos procesos vitales como la síntesis de
macromoléculas, la conducción de impulsos
nerviosos, la contracción muscular y el
transporte activo, requieren energía para
llevarse a cabo. Las reacciones metabólicas
involucradas en los procesos de síntesis se
denomina rutas o vías anabólicas o
anabolismo son reacciones que requieren
energía y se denominan endergónicas.
Para que estas reacciones ocurran, se deben
acoplar a otro tipo de rea que liberan energía
(exergónicas).
Las reacciones metabólicas que producen
energía se denominan catabólicas. En estas
reacciones se convierten las moléculas
complejas, como: carbohidratos o grasas, en
moléculas más pequeñas (CO2 y H2O en
último término). Al ocurrir este tipo de
reacciones se ibera a energía almacenada y se
consume oxígeno. Estas reacciones
transcurren con cambio de energía libre
negativo son espontáneas e irreversibles y,
por tanto, exergónicas.
En la práctica, un proceso endergónico no
puede ocurrir en forma independiente, debe
formar parte de un sistema acoplado
exergónico-endergónico cuyo cambio global
33
debe ser exergónico. El conjunto de procesos
exergónicos (catabólicos) y endergónicos
(anabólicos) constituye lo que se conoce
como metabolismo.
Un ejemplo clásico de acoplamiento
energético es la fosforilación de la glucosa:
Glucosa + H3PO4
Glucosa-6-fosfato + H2O F = +3.2 Kcal/Vmol
La reacción no es viable termodinámicamente
en la dirección propuesta. Sin embargo,
acoplada a la hidrólisis de ATP:
ATP + H2O ADP + Pi F° = -7.3 Kcal/mol
La hidrólisis del ATP confiere a la reacción
global un cambio exergónico que le permite
transcurrir en la dirección propuesta:
Glucosa + H3PO4 Glucosa-6-P + H2O F°=+3.2 kcal/mol
ATP + H2O ADP + H3PO4 F°=-7.3 Kcal/mol
∑ : Glucosa + ATP Glucosa-6-P+ADP F°= -4.1 Kcal/mol
En los sistemas biológicos, muchas
reacciones exergónicas-endergónicas están
acopladas de esta manera, es decir, con un
intermediario común obligado. El principal
compuesto intermediario o portador de alta
energía en la célula viva es el ATP (Fig.
1.26).
Fig. 1.26 Ciclo del ATP
A continuación describiremos las reacciones
que dan lugar a la formación de este
importante intermediario.
En el humano, en el metabolismo podemos
distinguir dos grandes aspectos:
- El intercambio de materia y energía
dentro del propio organismo y con su
entorno
- La transmisión de información
genética, tanto de unos a otros
compartimentos de la propia célula, y
de una célula a su progenie
El intercambio de materia y energía se inicia
con el aporte de material exógeno, es decir la
ingesta de alimentos, las mismas deben ser
digeridas hasta sus monómeros, absorberse e
incorporarse a las diversas células. Estos
monómeros pueden seguir la vía de la
degradación oxidativa o catabolismo (Fig.
1.27) hasta CO2, agua, amoniaco –que se
convierte a urea-, con producción de energía
(ATP, calor) o la biosíntesis de nuevo
material celular o anabolismo (Fig. 1.28) para
almacenamiento o reposición de moléculas
usadas, para ello consumen energía en forma
de ATP, lo cual explica la eficiente
conservación y utilización de la energía
química metabólica y el flujo adecuado de
intermediarios metabólicos a través de las
diversas rutas bioquímicas; es decir se cumple
el principio de acoplamiento que establece
que una reacción favorable desde el punto de
vista energético está ligada a la formación de
producto (s) que de otra forma sería
desfavorable.
Fig. 1.27 Catabolismo
34
Fig. 1.28 Anabolismo
Para que se cumplan los procesos energéticos,
tiene suma importancia las mitocondrias.
Las mitocondrias (Fig. 1.29) son organelos
fundamentales para la respiración celular en
todo organismo eucarionte, se encuentran
dispersas en el citoplasma y tienen como
característica el de poseer su propio DNA. Al
microscopio electrónico se aprecia como
estructuras cilíndricas, rodeada por una
membrana mitocondrial externa, la cual
está en contacto con el medio citoplasmático
o citosol, se caracteriza por ser permeable a
iones y moléculas de pequeño tamaño. Esta
permeabilidad se debe a la existencia de poros
o canales formados por una proteína
transmembrana llamada porina. Por debajo
de la membrana externa, se encuentra la
membrana mitocondrial interna (Fig. 1.30),
con una permeabilidad muy selectiva, sólo
puede ser atravesada libremente por el agua,
el O2, el CO2, el NH3 y algunos
monocarboxilatos; que emite pliegues hacia el
interior formando invaginaciones
denominadas crestas, las cuales son más
abundantes en mitocondrias de células con
intensa actividad respiratoria. Estas crestas,
en la cara interna, presentan un gran número
de formaciones esferoidales (partículas
submitocondriales) que, implantadas en un
corto tallo, hacen saliencia hacia la matriz.
Entre las dos membranas mitocondriales se
forma un espacio intermembranoso, o
también cámara externa, mientras que por
debajo de la membrana interna ubicamos a la
cámara interna llena de un material
denominado matriz mitocondrial.
En las crestas se localizan las enzimas
responsables de la cadena respiratoria y la
fosforilación oxidativa, y en la matriz casi
todas las enzimas que participan en el ciclo de
Krebs.
Fig. 1.29 Esquema de una mitocondria
Fig. 1.30. Esquema de la membrana mitocondrial
El genoma mitocondrial es el más compacto y
eficiente que se conoce. Para sintetizar sus
proteínas dispone de sus propios ribosomas,
capaces de descifran un código genético
diferente en algunos codones al código
universal. La acción de este genoma se
coordina estrechamente, con la del núcleo de
la célula. El genoma de la mitocondria existe
en múltiple copias, cuyo número varía en
distintos momentos de la vida de la organela,
o según el tipo de célula, pero su estructura
es la misma. Por ejemplo el huevo o cigoto
humano contiene unos 100 000; las células
diferenciadas, por su parte, de acuerdo a sus
necesidades energéticas requieran en cada
momento. Entre las más necesitadas están las
neuronas así como las células del corazón y
35
los músculos. Sus mutaciones son muy
frecuentes debido entre otros factores a que
las mitocondrias no han evolucionado
suficientes mecanismos de reparación de su
ADN. Estas mutaciones desfavorables causan
muchos problemas en la que se incluyen la
encefalomiopatías, distrofias y otros, con
gravedad proporcional a la edad del
organismo. El ADN mitocondrial está
constituido por dos hebras circulares: H
(heavy) y L (light) y todo lo que afecte la
producción de energía tiene consecuencias
negativas sobre la vida de la célula, de
manera particular se ha demostrado que las
mitocondrias tienen una función directriz en
la apoptosis celular.
Justamente, son las mitocondrias las
organelas en las cuales tiene lugar la
transferencia ordenada de electrones y la
captación de la energía que ese flujo de
electrones produce; y dado su importancia se
han ideado procedimientos para separar
ambas membranas mitocondriales y estudiar
la localización de sus componentes. Con ello,
se ha determinado que hay varias enzimas
ubicadas en la membrana externa y en el
espacio intermembrana. En la masa gelatinosa
de la matriz se encuentra un gran número de
enzimas integrantes de importantes vías
metabólicas. En la membrana interna existen,
incluidas en la doble capa lipídica, muchas
proteínas que le confieren gran importancia
funcional. En ella se encuentran los
componentes de la cadena respiratoria, las
estructuras y enzimas responsables de la
captación de energía y síntesis de ATP y los
distintos sistemas de transporte de sustancias
a través de la membrana.
Antes de describir las rutas bioquímicas
involucradas en la obtención de energía,
revisaremos algunos conceptos básicos,
necesarios para entender mejor dichos
procesos.
REACCIONES DE OXIDORREDUC-
CIÓN
Conceptos de Oxidación y Reducción
En la vida diaria se encuentran varios
ejemplos de oxidación, como la combustión
del gas usado en las cocinas, estufas, la leña
que se quema en las chimeneas o la oxidación
del hierro dejado a la intemperie. En los
primeros casos, el carbono y el hidrógeno de
los combustibles se combinarán con el
oxígeno del aire para formar CO2 y H2O y
desprender energía calórica. En el último
ejemplo, el hierro al combinarse con el
oxígeno formará óxido de hierro. El factor
común a estos dos procesos oxidativos es la
participación de oxigeno.
En la célula, la oxidación de la glucosa hasta
CO2 y H2O con liberación de energía se
realiza en etapas, algunas de las cuales
transcurren sin la participación de oxígeno.
Por ejemplo, la transformación del lactato en
piruvato:
COO- COO
-
| |
CH-OH C=O + 2H
| |
CH3 CH3
Lactato Piruvato
En esta reacción de oxidación se pierden
hidrógenos. Muchas reacciones de oxidación
que ocurren en el metabolismo se realizan por
pérdidas de hidrógenos o deshidrogenación.
Ya sea que el mecanismo de oxidación ocurra
con ganancia de oxígeno o con pérdida de H+,
en ambos procesos se implica la pérdida de
electrones. Así, una reacción de oxidación
puede ocurrir por cualquiera de estos tres
mecanismos:
a) Ganancia de oxígeno:
4Fe + 3O2 2Fe2O3
C3H8 + 5O2 3CO2 + 4H2O
b) Pérdida de hidrógeno:
Lactato Piruvato + 2H
NADH+ H+ NAD
+ + 2H
c) Pérdida de electrones:
Fe++
(ferroso) Fe+++
(férrico) + 2e-
Feo (metálico) Fe
++ (ferroso) + 2e
-
El fenómeno contrario se denomina
reducción. Este puede ocurrir por pérdida de
oxigeno, ganancia de hidrógeno o ganancia de
electrones. En toda reacción química, los
hidrógenos o electrones que una molécula
pierde, otra molécula los debe ganar. Es decir,
Deshidrogenasa
láctica
36
una se oxida y la otra se reduce; a la reacción
global, se llama reacción de oxidorreducción.
Potencial de Oxidorreducción
La facilidad con la que un donador de
electrones (agente reductor) cede sus
electrones a un aceptor electrónico (agente
oxidante) se expresa como potencial de
oxidorreducción (potencial redox) del
sistema. El potencial redox de un par de
oxidorreducción se determina (en voltios)
comparándolo con una hemipila patrón de
referencia.
El potencial del electrodo de referencia se
sitúa por convención en 0.0V a un pH de 0.0,
a concentración 1M y 25°C; sin embargo,
cuando se corrige este potencial para un pH
de 7.0, el potencial de referencia es -0.42V.
Este potencial se conoce como potencial
redox estándar (E°).
En la Tabla 1.5, se indican los potenciales
redox estándar de interés especial en
bioquímica. Esta lista permite predecir la
dirección del flujo de electrones de un par
redox a otro. Los electrones fluirán de la
reacción E fuertemente negativa a la reacción
con E° más positivo.
Tabla 1.5. Potenciales redox estándar de
diversas reacciones bioquímicas
Sistema n E° voltios
½ O2 + 2 H+ /H2O
Citocromo a Fe+3/Fe+2
Citocromo c Fe+3/Fe+2
Citocrorno c1 Fe+3/Fe+2
Coenzima Q + 2H+/CoQH2
Citocrorno b Fe+3/Fe+2
Mitocondrial
Fumarato +2H+/succinato
Citocromo b Fe+3/Fe+2
Microsomal
Oxalacetato + 2H+/malato
Piruvato + 2H+/lactato
2
1
1
1
2
1
2
1
2
2
+0.82
+0.29
+0.25
+0.22
+0.10
+0.08
+0.03
+0.02
-0.166
-0.185
Acetaldehido + 2H+/etanol
FAD+2H+/FADH2
NAD+ + 2H+/NADH + H+
NAD+ + 2H+/NADPH + H+
2H+/H2
Ferrodoxina Fe+3/Fe+2
Acetato + 2H+/acetaldehido
Cetoglutarato + 2H+/succinato +
CO2
Piruvato +2H+/acetato + CO2
2
2
2
2
2
1
2
2
2
-0.197
-0.219
-0.320
-0.320
-0.421
-0.430
-0.60
-0.70
-0.70
Número de Oxidación
En las reacciones de oxidorreducción se
maneja a menudo el concepto de número de
oxidación que se defina como el número de
electrones que se transfieren en una reacción
de oxidorreducción.
Respiración celular
Lo que se entiende por respiración, antes de
conocer las bases bioquímicas de los procesos
oxidativos, se refiere realmente al transporte
de oxígeno desde el ambiente a la célula y,
dentro de ésta, a la mitocondria. Es aquí
donde se realiza la verdadera respiración o
respiración celular. El proceso consiste en la
transferencia de sustratos reducidos que
cederán, primero sus hidrógenos, y luego los
electrones hasta el oxígeno como aceptor
final.
CICLO DE KREBS (ACIDO CICTRICO,
O ACIDOS TRICARBOXILICOS)
El Ciclo de Krebs comprende una serie de
reacciones encargadas de la oxidación de
Acetil CoA (Fig. 1.31) un producto común de
la degradación de la glucosa, ácidos grasos,
aminoácidos cetogénicos, y aminoácidos
glucogénicos que se convierten a
intermediarios del Ciclo de Krebs, hasta CO2
y H20, con la producción de NADH+ + H
+ y
FADH2, las que se acoplan con la cadena
transportadora de electrones y luego la
37
fosforilación oxidativa responsable de la
producción de ATP en el organismo.
El ciclo del ácido cítrico, es considerado el
núcleo del metabolismo, puesto que actúa
como vía central que integra el flujo
metabólico del carbono entre las diversas
biomoléculas, estableciéndose procesos
catabólicos y anabólicos, como la
gluconeogénesis, lipogénesis, transaminación,
desaminación, es decir es un proceso
anfibólico. Estas reacciones se llevan a cabo
en casi todos los tejidos, pero es el tejido
hepático el único donde ocurren todas
Los estudios del ciclo se inician a principios
de los 30´s al demostrarse que al agregar
succinato, fumarato y malato a músculos
machacados se incrementaba la velocidad de
consumo de Oxígeno. El oxaloacetato se
incorporó a la lista de ácidos dicarboxílicos
cuando se descubrió que se podía formar en
condiciones aeróbicas a partir del piruvato.
En 1935 A. Szent-Györgyi propuso que
ciertos pares de ácidos dicarboxílicos eran
interconvertidos por la acción de
deshidrogenasas y que este proceso estaba
relacionado con la respiración.
El ácido cítrico fue descubierto en 1784 por
Carl Wilhelm Scheele en el jugo de limón, y
recién en 1937 se pudo demostrar su
participación en el metabolismo. Carl Martius
y Franz Knoop mostraron que el ácido cítrico
es convertido en α-cetoglutarato a través del
isocitrato, así como el α-cetoglutarato puede
ser oxidado a succinato.
La formación del citrato era la pieza faltante
para poder armar completamente la secuencia,
hecho que sucedió en 1937 por Sir Hans
Krebs y W.A. Jonson, quienes demostraron
que el citrato es derivado del piruvato y del
oxaloacetato completando lo que se conoce
como el ciclo del ácido cítrico. Por estos
aportes, en 1953 Krebs ganó el premio Nóbel.
Sin embargo, fue necesario de una década
para demostrar que el Acetil CoA, derivado
del piruvato, es la fuente intermediaria de los
fragmentos de dos Carbonos que se combinan
con el oxaloacetato para formar citrato.
En 1948 E.P. Kennedy y A. Lenhinger
descubrieron que en mitocondrias aisladas de
homogenados de hígado de rata, se llevaban a
cabo la oxidación del piruvato y de todos los
intermediarios del ciclo de Krebs con gasto de
O2, por lo que se generalizó que contenían
todas las enzimas necesarias para catalizar las
reacciones del ciclo y del transporte
energético. La mayor parte de las enzimas que
participan en el ciclo de Krebs se encuentran
en la matriz mitocondrial, excepto succinato
deshidrogenasa que está adherida a la
membrana interna. En algunos tejidos, en el
citosol, se encuentran la aconitasa (hidrolasa),
isocitrato deshidrogenasa (NADP+
dependiente), la fumarasa y la malato
deshidrogenasa.
Fig.1.31. Visión General del Ciclo de Krebs (Reproducido con Modificaciones de Bioquímica de Harper.
Murria et al. 16ª Ed)
REACCIONES DEL CICLO, ENZIMAS
Y COENZIMAS
Los componentes del ciclo se encuentran en
todos los tejidos en las mitocondrias, aunque
algunas enzimas y metabolitos también se
encuentran en el citosol (extramitocondrial).
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Dentro de las mitocondrias, las enzimas se
localizan en la membrana interna y en la
matriz mitocondrial, y próximas a las de la
cadena respiratoria. Esta proximidad facilita
el adecuado acoplamiento de ambos procesos.
La conexión de la glucólisis (última etapa de
la degradación de la glucosa) con el ciclo de
Krebs consiste en la descarboxilación
oxidativa del piruvato a acetil-CoA. Esta
transformación es catalizada por un complejo
multienzimático llamado piruvato
deshidrogenasa.
El complejo piruvato deshidrogenasa (Fig.
1.32) posee tres actividades enzimáticas:
piruvato descarboxilasa (con pirofosfato de
tiamina), dihidrolipoil transacetilasa (con
ácido lipoico y coenzima A) y dihidrolipoil
deshidrogenasa con (FAD+ y NAD+). La
reacción global es esencialmente irreversible.
Fig. 1.32. Reacción de la piruvato deshidrogenasa.
La acetil-CoA puede provenir también de la
-oxidación de los ácidos grasos y de algunos
aminoácidos.
La siguiente reacción, propiamente la inicial
del ciclo, es la condensación de la acetil-CoA
con oxalacetato (Fig. 1.33) catalizado por la
citrato sintasa. La reacción supone la
hidrólisis del enlace tioéster de la acetil-CoA,
lo que implica la liberación de energía en
forma de calor, haciendo el proceso
prácticamente irreversible.
Fig. 1.33. Reacciones del Ciclo de Krebs
El citrato es convertido en isocitrato por
medio de la enzima aconitasa (aconitato
hidratasa). La reacción tiene lugar en dos
pasos: deshidratación hasta cis-aconitato (el
cual permanece unido a la enzima) y
rehidratación hasta isocitrato; hay 90% de
citrato, 3% de cis-aconitato y 7% de
isocitrato, por lo que se encuentra desplazada
hacia la formación de citrato. Sin embargo, el
consumo de isocitrato y la producción
continua de citrato in vivo, por ley de acción
de masas, hace que la reacción está
desplazada hacia la isomerización citrato
isocitrato.
El isococitrato es oxidado por
deshidrogenación, en una reacción catalizada
por la isocitrato deshidrogenasa. La enzima
requiere NAD+ y Mg
++. La reacción se lleva a
cabo en dos pasos: una deshidrogenación en a
que se forma oxalosuccinato, el cual
permanece unido a la enzima, y luego se
descarboxilasa -cetoglutarato. En esta
reacción irreversible se produce CO2 y el
primer NADH + H+ del ciclo. El citosol posee
también isocitrato deshidrogenasa pero
requiere NADP+ como coenzima, a diferencia
de la del ciclo, que requiere NAD+.
La conversión de -cetoglutarato (o 2-oxo-
glutarato) en succinil-CoA es catalizada por
un complejo multienzimático -cetoglutarato
deshidrogenasa, cuya acción es análoga a la
piruvato deshidrogenasa y utiliza los mismos
cofactores: pirofosfato de tiamina (TPP) ácido
lipoico, NAD+, FAD y coenzima A. La
reacción es prácticamente irreversible y en
ella se forma el segundo CO2, que proviene
ENZIMAS
1. Citrato sintasa, 2. aconitasa, 3. isocitrato DHG
4. α KG DHG 5. Succinil CoA sintetasa
6. Succinato deshidrogenasa, 7. fumarasa
8 malato deshidrogenasa
39
de oxalacetato. Para que la acetil-CoA
convierta en CO2, su radical acetato, el ciclo
ha de dar dos vueltas,
El ciclo continúa por acción de la succinato
tiocinasa (o succinil-CoA sintetasa, por la
reacción en sentido inverso) que convierte la
succinil CoA en succinato con la transferencia
del enlace de alta energía a la fosforilación de
GDP que pasa a GTP (o de IDP que pasa a
ITP). Ambos nucleótidos pueden ser
utilizados para la formación de ATP por
acción de un nucleósido difosfato cinasa o
fosfocinasa. Este as el único sitio del ciclo en
que se genera ATP a nivel del sustrato. Una
reacción alternativa en tejidos extrahepáticos
es a conversión de succinil-CoA en succinato
catalizada por la succinil CoA transferasa (o
tioforasa) acoplada a la conversión de
acetoacetato en acetoacetil-CoA. Esta es una
reacción que permite la incorporación de
cuerpos cetónicos al ciclo de Krebs.
Por acción de la succinato deshidrogenasa, el
succinato es deshidrogenado a fumarato, pero
esta enzima utiliza FAD+ como grupo
prostático, el cual en estado reducido
(FADH2) constituye una fuente directa de
electrones para la cadena respiratoria a nivel
de la coenzima Q. Esta es la única enzima del
ciclo integrada a la membrana mitocondrial
interna, directamente ligada a la cadena
respiratoria. Se reúnen así, anatómica y
fisiológicamente, el ciclo de Krebs, el
transporte de electrones y la fosforilación
oxidativa.
El fumarato presenta luego una serie de
cambios para regenerar el oxalacetato que
comprende una hidratación catalizada por la
fumarasa (fumarato hidratasa) para formar L-
malato, el cual luego se oxida a oxalacetato
por medio de la deshidrogenasa málica y el
NAD+ como coenzima.
PAPEL ANFIBÓLICO DEL CICLO DE
KREBS. PROCESOS ANAPLERÓTICOS
Una vía metabólica es anfibólica cuando
puede funcionar tanto en sentido catabólico
como en sentido anabólico (Fig. 1.34). Desde
este punto de vista el ciclo de Krebs puede
considerarse como una verdadera ―glorieta
bioquímica‖ ya que material que llega de
fuentes hidrocarbonadas puede abandonarlo
para formar grasa, mientras que los
aminoácidos que llegan pueden abandonarlo
para formar carbohidratos. Sólo una vía
parece cerrada; la que conduce de grasas a
carbohidratos. En la figura muestran las
interconversiones más comunes de los
intermediarios del ciclo.
Fig. 1.34. Papel anfibólico del ciclo de Krebs.
En la figura puede observarse cómo se
sintetizan ácidos grasos a partir de citrato que
sale de la mitocondria, así como la síntesis del
grupo hemo proveniente de succinil-CoA. El
oxalacetato es el intermediario que mayor
demanda muestra para mantener el ciclo.
Aunque en realidad con sólo una pequeña
cantidad de oxalacetato se forman grandes
cantidades de citrato para el ciclo, por lo que
se considera que desempeña un papel
catalítico, la verdad es que si se incrementan
las demandas de oxalacetato para formar otros
compuestos como el aminoácido aspartato, o
bien fosfoenolpiruvato para la gluconeo-
génesis, entonces se requerirán vías
metabólicas que aseguren la disponibilidad de
oxalacetato para mantener el flujo de
metabolitos del ciclo. A esas reacciones
auxiliares se les denomina anapleróticas, y
son las catalizadas por piruvato carboxilasa y
por la enzima málica (Fig. 1.35)
La piruvato carboxilasa es una enzima de la
gluconeogénesis que cataliza a carboxilación
de piruvato a oxalacetato:
40
Fig. 1.35. Vías anapleróticas y formación de ácido
gama-aminobutírico (GABA) en el ciclo de Krebs.
La otra reacción anaplerótica es catalizada por
una deshidrogenasa dependiente de NADP+,
llamada enzima málica. Esta enzima produce
la carboxilación y reducción del piruvato,
transformándolo en malato (Fig. 1.36)
Fig. 1.36. Enzima málica
Posteriormente, el malato se transforma en
oxalacetato por la malato deshidrogenasa del
ciclo. De estas dos reacciones anapleróticas,
la más importante es la catalizada por la
piruvato carboxilasa, cuya actividad aumenta
en situaciones que depletan el oxalacetato
como el ejercicio, el ayuno y la diabetes. La
actividad de la enzima varía en forma inversa,
disminuyendo en la diabetes y aumentando
por administración de insulina.
Incorporación de aminoácidos al ciclo
Dentro de las funciones catabólicas del ciclo
de Krebs se encuentra la incorporación de
aminoácidos con fines energéticos; o bien con
fines anabólicos (Fig. 1.37), la transformación
de metabolitos del ciclo en aminoácidos para
biosíntesis de proteínas
Fig. 1.37. Rutas de entrada de los aminoácidos en el
ciclo de Krebs. Reproducida con autorización de J.M.
Orten y O. W Neuhaus, Human Biochemistry, 10ª
edición, C.V. Mosby. Co., St. Louis, 1982, p. 344.
Desaminación oxidativa y formación de
GABA
En condiciones normales, existe en las
neuronas inhibidoras del cerebro una vía
colateral del ciclo de Krebs en la que se forma
un neurotransmisor inhibidor derivado de un
intermediario del ciclo; se trata del ácido -
aminobutírico (GABA) formado por
desaminación oxidativa del ácido glutámico,
proveniente a su vez del -cetoglutarato por
transaminación.
Al faltar o estar disminuida la actividad de la
piruvato deshidrogenasa, que alimenta al ciclo
de Krebs con acetil-CoA, o la piruvato
carboxilasa, que cataliza la principal reacción
anaplerótica, se presenta la acidosis pirúvica
congénita. Este padecimiento se acompaña de
convulsiones al faltar el GABA inhibidor con
predominio del neurotransmisor excitador:
ácido glutámico.
Participación de lípidos en el ciclo
Existen dos vías de entrada de material
lipídico al ciclo de Krebs con fines
degradativos: a través del glicerol o a través
de ácidos grasos, provenientes ambos de
41
triglicéridos. Por otro lado, del ciclo salen
intermediados al citosol que permiten la
síntesis de ácidos grasos, la cual es
extramitocondrial. En virtud de que la síntesis
de grasas es extra. mitocondrial, necesitan
transportarse al citosol indirectamente los
precursores (acetil-CoA), ya que la membrana
mitocondrial es impermeable a derivados de
CoA. El citrato formado intramito-
condrialmente sale al citosol donde es
transformado en oxalacelato y acetil-CoA por
acción de la ATP-citrato liasa
extramitocondrial (Fig. 1.38):
La acetil-CoA es la precursora de la
biosíntesis extramitocondrial de los ácidos
grasos
Incorporación de glicerol vía
gliceraldehído
El glicerol proveniente de triacilgliceroles
puede entrar al ciclo de Krebs
transformándose en gliceraldehído-3-fosfato
por medio de la acción concertada de tres
enzimas: glicerolcinasa, glicerol-3-fosfafo
deshidrogenasa y fosfotriosa isomerasa (Fig.
1.39)
Incorporación de ácidos grasos vía acetil-
CoA
Los ácidos grasos provenientes de
triglicéridos son degradados
intramitocondrialmente hasta acetil-CoA en
un proceso conocido como -oxidación.
Fig. 1.38. Participación del ciclo de Krebs en la síntesis
de ácidos grasos a partir de la glucosa. deshidrogenasa.
Fig. 1.39. Incorporación del glicerol al ciclo glucolítico
y luego al ciclo de Krebs.
CADENA RESPIRATORIA
Toda la energía útil liberada durante la
oxidación de los nutrimentos energéticos se
aprovecha en las mitocondrias bajo la forma
de equivalentes reductores (hidrógeno o
electrones). El más importante de los sistemas
de oxidorreducción en las células es la cadena
respiratoria que es un sistema de transferencia
de hidrógenos y electrones catalizada por
proteínas enzimáticas ordenadas en forma
secuencial en la membrana mitocondrial
interna. Los equivalentes reductores son
extraídos de los
sustratos en el ciclo de
Krebs o la -oxidación
de ácidos grasos y
transportados a través
de la cadena de
transporte electrónico
hasta el último aceptor
de electrones, el
oxígeno molecular,
para formar agua.
Destacaremos el rol de
algunos grupos
enzimáticos y sus
coenzimas.
42
Deshidrogenasas
Se puede considerar el descubrimiento de las
deshidrogenasas realizado por Thunberg a
principios de siglo, como el inicio de lo que
hoy se conoce como cadena respiratoria.
Thunberg descubre la acción de enzimas
deshidrogenasas capaces de catalizar la
oxidación de ciertos sustratos en ausencia
absoluta de oxigeno, utilizando azul de
metileno como aceptor de hidrógeno, el cual
al reducirse se decolora transformándose en
leucobase. Las deshidrogenasas pertenecen al
grupo de enzimas llamadas oxidorreductasas.
Coenzimas de oxidorreducción
Algunas deshidrogenasas poseen como
coenzimas a derivados de la vitamina
nicotinamida, como por ejemplo el
nicotinamida adenina nucleótido (NAD+).
Coenzima de deshidrogenasas es el NADP-,
cuya estructura es muy parecida al NAD+ con
un fosfato más en la ribosa adenílica.
Muchas deshidrogenasas utilizan coenzimas
de la vitamina B2 (riboflavina) como son el
flavín mononucleótido (FMN) y el flavín-
adenin-dinucléotido (FAD).
La coenzima Q (CoQ), también llamada
ubiquinona por su estructura química y
ubicuidad, no pertenece al grupo de los
dinucleótidos, tiene una estructura
isoprenoide muy semejante a las vitaminas K
y E. La CoQ sirve como transportador
―móvil‖, que opera con deshidrogenasas
ligadas a flavina como la NADH
deshidrogenasas. La coenzima Q es el único
eslabón de la cadena respiratoria no unido a
proteínas. Debido a su carácter hidrofóbico
(estructura isoprenoide) se puede alojar en la
zona hidrofóbica de la bicapa lipídica de la
membrana interna de la mitocondria y puede
actuar como un portador móvil de electrones.
La ubiquinona acepta hidrógenos y se reduce
a dihidroquinona (CoQH2). En la siguiente
etapa al reoxidarse cede dos electrones al
sistema de citocromos y quedan dos protones
libres en el medio.
Los equivalentes de reducción (hidrógeno) se
extraen de los sustratos en el ciclo de Kebs, -
oxidación de ácidos grasos o indirectamente
de la glucólisis y se dirigen secuencialmente,
de acuerdo con su potencial redox, a los
diferentes eslabones de la cadena respiratoria.
Los equivalentes de reducción se introducen
en la cadena respiratoria a nivel del NAD+ o
CoQ a partir de las reacciones de las
deshidrogenasas ligadas a NAD+ o FAD. Este
sistema de transporte está dispuesto de tal
manera que los miembros reducidos de los
pares redox se oxidan por el miembro
oxidado del siguiente componente del sistema
(Fig. 1.40).
Fig. 1.40. Transporte de hidrógeno
Donadores de hidrógenos
Los equivalentes reducidos (hidrógenos)
provenientes de sustratos del ciclo de Krebs,
-oxidación y otras vías metabólicas son
catalizados por deshidrogenasas especificas y
llegan a la cadena transportadora de
hidrógenos a diferentes niveles.
CITOCROMOS
Paralelamente al descubrimiento de las
deshidrogenasas por Thunberg, Warburg
descubre que el cianuro, sustancia a la que
son insensibles las deshidrogenasas, inhibe la
respiración a bajas concentraciones. A la
43
enzima por cianuro, Warburg la denomina
―antirespiratoria‖.
Los citocromos con Fe de las hemoproteínas
que contienen hierro, a diferencia del grupo
hemo de la hemoglobina en la que el hierro
del hemo permanece en estado ferroso (Fe++
),
el hierro del grupo hemo de los citocromos
está alternadamente oxidado (Fe3+
) o reducido
(Fe2+
) en la transferencia de electrones hacia
el aceptor más ávido de ellos, el oxígeno.
Los citocromos de las mitocondrias se
designaron como a, b y c, tomando como base
la banda a de su espectro de absorción y al
tipo de grupo hemo.
Transporte de electrones
En las reacciones de transferencia del NADH
a la coenzima Q se transportan dos
hidrógenos (dos protones y dos electrones).
Al llegar a la CoQH2, se continúan
transportando dos electrones por los
citocromos, pero un par de protones (H+) se
liberan al espacio intermembrananoso, el cual
se acidifica.
El transporte de electrones, se inicia al ser
captados por el citocromo b; el hierro del
grupo hemo oxidado (Fe3+
), al aceptar un
electrón (e-) se transforma en hierro reducido
(Fe2+
).
Nivel de energía de las reacciones
Durante la transferencia de hidrógenos y
electrones desde el par NADH/NAD+ a la
molécula de oxigeno se produce un descenso
de potencial redox de 1.14V que, de acuerdo
con la ecuación de Nerst, produce un cambio
de energía libre de 52.6 Kcal por mol. Esta
caída de potencial tiene lugar en etapas a
medida que los hidrógenos o electrones pasan
por los distintos eslabones de la cadena.
En todas las reacciones de la cadena se
produce liberación de energía, pero sólo en
tres de ellas existe un sistema fosforilante
acoplado que permite la síntesis de ATP; el
resto de la energía liberada en las otras
reacciones se pierde en forma de calor
(energía no útil) que, sin embargo, mantiene
la temperatura corporal de los organismos
homeotérmicos (mamíferos) en forma casi
constante (36.5°C).
Ultimo aceptor de electrones: oxígeno
El oxígeno es uno de los elementos de mayor
electronegatividad en la tabla periódica. Esto
significa que es el elemento más ávido de
electrones, y en la cadena transportadora de
electrones mitocondrial determina el flujo
electrónico. Finalmente llegan al oxígeno dos
electrones que completarán su orbital con
ocho, pero lo dejan con carga eléctrica
negativa.
½ O2 + 2e-
½ 2O
Los dos protones (hidrogeniones, H+)
producidos al ceder a CoQH2 los dos
electrones de cada hidrógeno al cit b, son
captados por el oxígeno iónico (½ 2O ) y
forma una molécula de agua:
½ 2
2O + 2H+
H2O
La importancia que tiene el oxigeno como
agente que determina el flujo de electrones y
con ello la liberación de energía para formar
ATP, se demuestra cuando un tejido sufre la
falta de oxígeno (hipoxia tisular) como en el
infarto de miocardio, o cuando un tejido
como el músculo esquelético demanda
mayores cantidades de oxígeno durante el
ejercicio intenso.
El 2O (radical superóxido) es un producto
aberrante de la cadena respiratoria. El 5% del
O2 se transforma en 2O , porcentaje que
aumenta con la edad.
2 2O + 2H+ H2O2 + O2
La enzima superóxido dismutasa, que
transforma el radical superóxido en H2O2, se
encuentra en las mitocondrias de todas las
células aerobias. La catalasa, que degrada
posteriormente el peróxido de hidrógeno
(H2O2) en H2O y ½ O2, constituye 40% de las
proteínas de los peroxisomas.
Los niños pretérmino o prematuros no tienen
aún desarrolladas las superóxido dismutasas
(metaloenzimas que contienen Se) y cuando
son tratados con concentraciones
excesivamente altas de oxígeno puro (que
Superóxido
dismutasa
44
produce 2O ) pueden presentar una retinopatía
bilateral, caracterizado por dilatación,
proliferación y tortuosidad vasculares, edema
y desprendimiento de retina, microftalmia y
en ocasiones ceguera.
Oxidación extramitocondrial
Existe otro tipo de transporte electrónico que
se encuentra en el sistema retículo
endoplásmico o en la fracción microsomal del
hígado, si como en tejido esteroidogénico
como la corteza suprarrenal, testículo, ovario
y placenta.
Este sistema de transporte electrónico utiliza
NADPH+ como fuente de equivalentes de
reducción y un citocromo exclusivo de este
sistema que no se encuentra en la
mitocondria, el citocromo P450, llamado así
porque la forma reducida tiene una banda de
absorción a 450 nm, y es útil por ejemplo en
la oxidación extramitocondrial de
medicamentos
Medicamento-H + O2 + cit P450 Fe
++ + NADPH
Medicamento-OH + H2O + cit P450 Fe+++
+
NADP+
Esta cadena de transporte electrónica no es
fosforilante puesto que no se sintetiza ATP.
El fin de este sistema es la hidroxilación de
ciertos metabolitos o fármacos (como
fenobarbifal, aminopirina, morfina y otros)
esteroides o esteroles, ácidos grasos,
hidrocarburos policíclicos y algunos
aminoácidos. Este sistema permite la
hidroxilación del colecalciferol (vitamina D3)
a las formas activas 24,25
dihidroxicolecalciterol y 1,25
dihidroxicolecalci-ferol.
FOSFORILACION OXIDATIVA
(FORMACIÓN DE ATP)
Se ha mencionado anteriormente, que la
energía contenida en los equivalentes de
reducción (hidrogenes) ha sido liberada para
ser finalmente almacenada en forma de
compuestos ricos en energía. Estos
compuestos son las sustancias clave del
metabolismo energético celular.
Lipmann introdujo el concepto de enlace de
alta energía ( ) y de enlace fosfato de alta
energía ( P) y con ello se apreció con
claridad el papel de estos compuestos en
bioenergética. De hecho, la conservación y
transferencia de la energía celular se lleva a
cabo gracias a la transferencia de grupos
fosfatos. Los compuestos más ricos en
energía ceden su energía al ADP y lo
transforman en ATP, el cual a su vez la
distribuye donde la requieren las necesidades
celulares. Por consiguiente, el ATP es la
figura central en el sistema de transferencia
de energía en la célula, y con toda razón se le
considera ―la moneda energética celular‖.
Esto se ilustra en la Tabla 1.6, donde el ATP
ocupa una posición intermedia entre los
fosfatos y otros compuestos con alta energía y
los fosfatos de baja energía.
Tabla 1.6. Energía libre estándar de hidrólisis de
algunos compuestos ricos en energía
Compuesto
- F°
(Kcal/mol)
- F°
(KJ/mol)
Fosfoenolpiravato
Carbamil fosfato
1,3-bisfosfoglicerato
Fosfocreatina
S-adenosil-metionina
Acil-CoA
14.8
12.3
11.8
10.3
10.0
7.7
61.9
51.4
49.3
43.1
41.8
32.2
ATP 7.3 30.5
Pirofosfato
Glucosa-1-fosfato
Fructosa-6-fosfato
AMP
Glucosa-6-fosfato
Glicerol-3-fosfato
6.0
5.0
3.8
3.4
3.3
2.2
25.1
20.9
15.9
14.2
13.8
9.2
La célula cuenta con dos mecanismos
generadores de ATP que son: a) a partir de
compuestos con un contenido de energía
mayor que el ATP, denominado fosforilación
a nivel del sustrato y b) la fosforilación
oxidativa acoplada a la cadena respiratoria.
45
A NIVEL DE SUSTRATO
Intermediarios ricos en energía de la ruta
glucolítica como el 1,3-difosfoglicerato (1,3-
DPG) y el fosfoenolpiruvato (PEP) pueden
transferir su fosfato de alta energía al ADP en
reacciones catalizadas por la
fosfogliceratocinasa y piruvatocinasa,
respectivamente. Los F° de estas dos
reacciones son -11.8 y -14.8 Kcal/mol,
respectivamente, y. por tanto, la transferencia
del fosfato es termodinámicamente posible y
da como resultado la síntesis de ATP.
Sustancias como la fosfocreatina y
fosfoarginina (llamadas tradicionalmente
fosfágenos) sirven como almacén de energía
en el músculo. En condiciones fisiológicas, la
reacción de la creatinfosfocinasa permite que
las concentraciones de ATP se mantengan
constantes en el músculo, aunque se utilice en
forma continua.
En el ciclo de Krebs se lleva a cabo una
reacción catalizada por la succinatotiocinasa,
en la que se forma a nivel de sustrato un ATP
a partir de GTP. En esta reacción el
compuesto de alta energía no es un fosfato
sino un derivado de la coenzima A, succinil-
CoA.
Por fosforilación oxidativa se entiende la
fosforilación del ADP para dar ATP
utilizando la energía liberada en la oxidación
de las coenzimas de la cadena respiratoria.
Los sitios de fosforilación son aquellos
lugares de la cadena respiratoria, donde el F
es suficiente para permitir la síntesis de ATP
acoplada al transporte electrónico.
Las ferroproteínas no hémicas pertenecientes
a las ferrosulfoproteínas: unas están asociadas
a la NADH deshidrogenasa, otras a la
succinato deshidrogenasa y, finalmente, a los
citocromos b y c. La importancia de las
ferrosulfoproteínas en la cadena respiratoria
se debe a que coinciden con los sitios de
fosforilación I y II. También se han
descubierto dos especies diferentes de
citocromo (b y c que difieren en su potencial
redox.
Para comprender más acerca del
comportamiento de la fosforilación oxidativa
con la cadena respiratoria es necesario
conocer la disposición espacial de los
componentes de la cadena (Fig. 1.41)
Fig. 1.41. Complejos de Green (I, III y IV) de la cadena
respiratoria. FeS = ferrosulfoproteínas
En la figura se ilustran los complejos
formados por coenzimas de oxidorreducción
y citocromos denominados complejos de
Green. Se muestran también los sitios donde
se encuentra acoplada la fosforilación con los
complejos de la cadena. La razón
fósforo/oxígeno indica las moléculas de ATP
sintetizadas por átomo de oxígeno
consumido. En este sentido, la razón
fósforo/oxigeno es igual a tres para el caso de
los sustratos que utilizan NAD+ a dos para el
caso de los sustratos FAD y a uno para el
caso del ascorbato. Así, tenemos que los sitios
de fosforilación están situados como sigue:
Sitio 1: Entre la flavoproteína 1 (FMN) y la CoQ
Sitio 2: Entre el cit b y el cit c1
Sitio 3: Entre el cit a.a3 y el oxígeno
La membrana interna posee numerosas
estructuras esféricas orientados hacia el
interior, unidas a la membrana por un
pedículo. Estas estructuras, se denominaron
en un principio ―partículas elementales‖ y
hoy, más comúnmente ―unidades
46
fosforilantes‖, esferas o partículas
mitocondriales. Se ha establecido que estas
partículas están relacionadas con los sitios de
fosforilación (Fig. 1.42)
Fig. 1.42. Partículas elementales o esferas
mitocondriales
Al conjunto acoplado que se encuentra
dispuesto en un orden funcional dentro de la
membrana interna se le conoce como unidad
respiratoria. Es conveniente conservar en
mente este esquema que permite explicar
algunas de las teorías propuestas para la
fosforilación.
Hasta el momento se han enunciado tres
hipótesis que intentan explicar cómo la
energía originada en el transporte de
equivalentes reducidos y electrones puede ser
traducida en energía utilizable en forma de
ATP. Estas hipótesis son las siguientes:
Hipótesis química. (Slater, l953). Postula
Slater que la fosforilación se lleva a cabo de
una manera similar a la que ocurre a nivel del
sustrato en la glucólisis. Esta teoría postula la
existencia de un intermediario químico muy
inestable con un potencial energético que
actuaría como intermediario entre la cadena
respiratoria y la síntesis de ATP.
Teoría quimiosmótica. Esta hipótesis,
propuesta originalmente por Peter Mitchell en
1961 y modificada por él mismo en 1981 y
luego por Lehninger (1984) es actualmente la
más aceptada y la que tiene más apoyo
experimental.
La hipótesis del acoplamiento quimiosmótico
de Mitchell compara los sistemas generadores
de energía de la membrana mitocondrial con
una batería electroquímica común; de la
misma manera que la energía se puede
almacenar en baterías debido a la separación
de las cargas positivas y negativas en los
diferentes compartimientos, se puede
establecer un gradiente electroquímico de
protones a través de la membrana
mitocondrial interna durante el transporte
electrónico.
Los postulados de la teoría quimiosmótica de
Mitchell (Fig. 1.42), son los siguientes:
1. La membrana mitocondrial interna es
impermeable a los protones.
2. La cadena respiratoria está situada
asimétricamente en la estructura de la
membrana, lo que favorece la expulsión de
protones.
3. La síntesis de ATP se realiza en las
partículas submitocondriales que funcionan
como una ATP sintetasa (ATPasa). Es tas
partículas están dispuestas asimétricamente
y se ―activan‖ por el retorno de protones al
interior de la mitocondria del espacio
intermembrananoso.
4. Existencia de un sistema de difusión
(probablemente H+/K
+) que tiene por
objeto disipar el gradiente de pH, sin
eliminar el potencial de membrana.
Fig. 1.42. Hipótesis del acoplamiento quimiosmótico
Según la hipótesis de Mitchell, no existen
sitios de fosforilación propiamente dichos,
sino que la síntesis de ATP tiene lugar
siempre que exista un gradiente protónico
(fuerza protomotriz).
47
La hipótesis ha recibido gran apoyo
experimental:
1. La adición de protones (ácido) al medio
externo de las mitocondrias conduce a la
generación de ATP.
2. La cadena respiratoria contiene sus
componentes organizados lateralmente
(asimetría transversal) como los requiere la
teoría.
3. El cociente fósforo/hidrogenión de la
ATPasa (ATP sintetasa más propiamente)
es 1:2, y los cocientes hidrógeno/oxigeno
para la oxidación del succinato y del -
hídroxibutirato son 4 y 6, respectivamente,
en concordancia con las proporciones
fósforo/oxigeno esperadas de 2 y 3.
En resumen, de acuerdo a la Teoría
Quimiosmótica de Mitchell, la energía
potencial acumulada como un gradiente de
protones, denominada Fuerza Protomotriz ,y
dado que la membrana es básicamente
impermeable a los protones, el gradiente se
mantiene por una constante reentrada de los
mismos, y considerando que la ATP
sintetasa contiene el único canal para la
entrada del protón, se produce la siguiente
reacción: ADP + Pi > ATP, que acoplada a
la formación de agua se le llama
Fosforilación Oxidativa, pero para que ello
ocurra debe acoplarse a la reacción en la cual
se forma el agua, porque de lo contrario dado
los Δ G sería imposible que esta reacción se
realice
2H + 2 e- + ½ O2 H2O
ΔG o = -56.7 kcal/mol (reacción exergónica)
ADP + Pi ATP + H2O
ΔG o = + 7.3 kcal/mol (reacción endergónica)
Por otra parte, gran parte de los
conocimientos actuales sobre la ATPasa
(ATP sintetasa) se deben al grupo de Racker.
La fracción purificada de ATPasa está
constituida por esferas de unos 90 Å
procedentes de las ―unidades fosforilantes‖.
Consta de una porción hidrosoluble
denominada F (subunidades 3 3 ) que
contiene el centro activo y una porción
hidrofóbica denominada F enterrada en la
membrana mitocondrial que actúa como canal
protónico. Entre ambas porciones y la
membrana se encuentra un factor (F que
recibe el nombre de OSCP (―oligomycin-
sensitivity- confering- protein‖),
imprescindible para la acción de la
oligomicina, y que es un verdadero
―cancerbero protónico‖, puesto que de éste
depende el transporte de protones (Fig. 1.43).
Fig. 1.43 Estructura del ATP sintetasa
mitocondrial
Formación de productos de reducción
parcial del oxígeno
La etapa final de la cadena respiratoria es la
reducción de una molécula de oxígeno por la
cesión de cuatro electrones (O2-
)2. El
problema de la convergencia simultánea de
cuatro electrones a este punto terminal es de
gran importancia, pues si la reducción del
oxígeno no es completa se forman productos
tóxicos, con acción deletérea sobre moléculas
constituyentes de las células.
Esos productos tóxicos son el peróxido de
hidrógeno (H2O2) y los radicales libres
superóxido (O2-) e hidroxilo (OH-). El
peróxido de hidrógeno y el anión superóxido
se forman en reacciones que normalmente
ocurren en el organismo. El anión superóxido
es el resultado de la reducción incompleta del
oxígeno (una molécula de O2 adquiere un
electrón); los radicales hidroxilo se generan
por interacción del peróxido de hidrógeno con
el anión superóxido:
H2O2 + O2- O2 + OH- + HO
-
48
Los radicales hidroxilo son mucho más
reactivos que el peróxido de hidrógeno y el
anión superóxido y, por lo tanto, son más
tóxicos. Se cree que la toxicidad de O2 y el
H2O2 se debe a su capacidad de generar
radicales hidroxilo.
Los efectos nocivos de estos radicales se
ejercen sobre diferentes componentes de las
células, como ADN, proteínas, lípidos y
diversas enzimas:
Producen ruptura de ADN y
modificaciones químicas de sus bases
nitrogenadas
Oxidan grupos sulfhidrilos de
proteínas (se forman enlaces –S-S),
alterando la estructura de la molécula
Atacan ácidos grasos insaturados de
lípidos componentes de membranas
(formación de peróxidos).
Todo esto causa, además de cambios
conformacionales, disminución de la
hidrofobicidad de las cadenas hidrocar-
bonadas y desestabiliza las membranas
celulares. Por otra parte, los hidroperóxidos
formados actúan como inhibidores de ciertas
enzimas.
El pulmón y el cerebro son particularmente
sensibles a estos agentes oxidantes. Respirar
concentraciones elevadas de oxígeno durante
un tiempo prolongado favorece la formación
de H2O2, O2 y OH- y causa alteraciones a
veces muy graves en el sistema nervioso y el
pulmón.
La acción bactericida de los fagotitos
(leucocitos, neutrófilos, eosinófilos,
monocitos y macrófagos) es en parte
dependiente de la producción de anión
superóxido y peróxido de hidrógeno en las
vacuolas fagocíticas. Distintos gérmenes y
otros agentes extraños pueden desencadenar
una respuesta inflamatoria en el organismo
atacado, que moviliza fagotitos hacia el lugar
de la injuria. A veces, la exagerada
producción de radicales libres en el lugar de
la inflamación puede afectar células del
propio individuo. En procesos inflamatorios,
algunos de causa autoinmune, los radicales
libres son la causa de daño tisular. Estos
agentes también han sido implicados como
factor de envejecimiento.
Dada la toxicidad del peróxido de hidrógeno
y de los radicales superóxido e hidroxilo, el
organismo dispone de mecanismos eficaces
de protección. En condiciones normales, a las
tensiones de O2 del aire atmosférico, las
concentraciones de estos agentes tóxicos se
mantienen en niveles muy bajos. Los
principales medios de defensa son:
a) Los aniones superóxido son eliminados
en una reacción catalizada por una
enzima extraordinariamente activa,
distribuida en todos los tejidos, la
superóxido dismutasa. En la reacción
participan dos aniones superóxido y dos
protones:
O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2
La cesión de un electrón de un anión
superóxido a otro corresponde a las
llamadas reacciones de disimulación. Se
forma peróxido de hidrógeno, que
también es un producto tóxico y debe ser
eliminado.
La superóxido dismutasa presenta dos
isozimas; una de ellas contiene Zn y Cu y
se encuentra en citosol; la otra Mn y se
localiza en mitocondrias del hígado.
b) La descomposición del peróxido de
hidrógeno es catalizada por la catalasa,
hemoproteína existente en casi todas las
células, particularmente en el hígado,
riñón, médula y glóbulos rojos. Tiene
gran actividad y cataliza la reacción.
2H2O2 2H2O + O2
La catalasa se encuentra en los
peroxisomas, pequeñas organelas que,
además de catalasa, contienen oxidasas
productoras de peróxido de hidrógeno.
Se han descrito casos de personas con
muy baja actividad de catalasa en sus
tejidos; se trata de un defecto genético
llamado acatalasemia. Curiosamente, esta
deficiencia no produce trastornos
importantes. Es probable que otras
enzimas compensen la falta de catalasa.
c) Existe una enzima. Llamada glutatión
peroxidasa, que cataliza la reducción de
hidroperóxidos orgánicos y de peróxido
de hidrógeno en reacciones en las que
participa el glutatión (GSH):
49
ROOH + 2GSH GSSG + ROH + H2O
H2O2 + 2GSH GSSG + 2H2O
La glutatión peroxidasa está localizada en
el citosol y las mitocondrias, pero no en
los peroxisomas. Esta enzima ayuda a
mantener muy baja la concentración de
peróxido de hidrógeno en los tejidos:
convierte ácidos grasos peróxidos en
derivados hidroxilados y también puede
revertir la oxidación de grupos
sulfhidrilos.
El glutatión oxidado es reducido por
acción de la glutatión reductasa, enzima
que utiliza NADPH como dador de
equivalentes de reducción:
GSSG + NADPH + H+ GSH + NADP
+
Existen otras peroxidasas que contribuyen
a la eliminación de peróxido de
hidrógeno. Son hemoproteínas muy
comunes en vegetales que también se
encuentran en los leucocitos y en la leche.
Catalizan la reacción:
H2O2 + AH2 2H2O + A
AH2 representa a distintos sustratos
donantes de hidrógenos que pueden ser
utilizados por la peroxidasas. En el caso
de la glutatión peroxidasa, los H son
provistos por el glutatión reducido. La
enzima de granulocitos neutrófilos puede
emplear NADPH como dador de
hidrógeno.
d) Una importante función protectora in vivo
contra los radicales libres es ejercida por
compuestos naturales como el tocoferol o
vitamina E, los -carotenos o
provitaminas A y el ácido ascórbico o
vitamina C; son provistos por la
alimentación normal y ejercen acción
antioxidante. En el plasma sanguíneo, los
principales agentes antioxidantes son la
bilirrubina, pigmento derivado del hemo,
y los uratos, producto de la degradación
de bases púricas.
Utilización de ATP
Como consecuencia de la posición intermedia
del ATP, éste puede actuar como donador de
fosfato a los compuestos que están por debajo
de Sen la lista y c aceptor de energía
proveniente de los que están por encima. Así,
un ciclo ATP/ADP conecta estos procesos
que generan a las reacciones que la utilizan
(Fig. 1.44).
Fig. 1.44. Relación entre la producción la
utilización de energía.
INHIBIDORES Y DESACOPLANTES
Gran parte de los conocimientos que se tienen
sobre la cadena respiratoria han sido
obtenidos por el uso de inhibidores. Los
inhibidores son compuestos químicos capaces
de inhibir específicamente el flujo electrónico
en tres puntos diferentes de la cadena (Fig.
45). El primero de ellos es inhibido por
barbitúricos como el amital el veneno
rotenona y antibiótico piercidina. El segundo
sitio entre el citocromo b y el c, es inhibido
por el dimercaptopropanol (dimercaprol o
BAL). EL antibiótico antimicina A inhibe la
reacción entre la coenzima Q y el citocromo
b. los venenos clásicos, cianuro (CN),
monóxido de carbono (CO), ácido sulfhídrico
(H2S) y ácido hidrazoico (HN3) inhiben a la
citocromo oxidasa (cit aa3).
Según el teorema de Chance, en presencia de
un inhibidor los intermediarios de la cadena
situados por encima (en electronegatividad)
del punto de inhibición estarán muy
reducidos, mientras que los situados debajo
del punto de bloqueo aparecerán muy
oxidados.
50
Fig. 1.45. Sitios de inhibición en la cadena
respiratoria
Otro grupo de compuestos llamados
desacoplantes o desacopladores impiden la
síntesis de ATP pero permiten el flujo de
electrones por la cadena respiratoria. En
efecto, existen sustancias naturales, tales
como el dicumarol y las hormonas tiroideas, y
algunos sintéticos como el dinitrofenol (DNP)
capaces de desacoplar (―desconectar‖) la
respiración de la fosforilación. La adición de
estas sustancias a una suspensión
mitocondrial provoca un marcado aumento
del consumo de oxígeno, sin que exista
síntesis de ATP.
El efecto desacoplante de la tiroxina ha
permitido explicar, por un lado, el efecto de
esta hormona sobre el metabolismo basal en
el hipertiroidismo y, por otro, su uso, al igual
que el dinitrofenol, en el tratamiento de la
obesidad.
El antibiótico oligomicina bloquea
completamente la oxidación y la fosforilación
en mitocondrias intactas. Actúa uniéndose al
tallo de la ATPasa, lo que provoca el cierre
del canal y por ende, el flujo de protones y la
síntesis de ATP. Sin embargo, en presencia de
dinitrofenol, la oxidación procede sin
fosforilación, indicando que la oligomicina no
actúa en la cadena respiratoria, sino a través
de su unión con la proteína OSCP.
Intoxicación por cianuro
La ingestión de cianuro de potasio (KCN)
produce una rápida inhibición de la cadena
respiratoria a nivel de la citocromo oxidasa.
El cianuro se fija al Fe3+
del hemo del cit aa3 e
impide que el oxígeno reaccione con éste.
Cesan la respiración mitocondrial y la
generación de energía (ATP) y se produce la
muerte rápida por hipoxia tisular, muy
especialmente en el sistema nervioso.
Intoxicación por monóxido de carbono
El monóxido de carbono (CO) e un gas
incoloro e inodoro, con gran afinidad por la
hemoglobina (200-300 veces más que el
oxígeno) y por el cit a3. Los efectos serios se
presentan a dosis bajas de monóxido (0.02% a
0.03%) cuando 40% de la hemoglobina se ha
transformado en carboxihemoglobina (CO-
Hb). Este gas se produce en la combustión
incompleta de los hidrocarburos como en la
inspiración del escape de un vehículo de
gasolina o un calentador de leña o carbón en
espacios cerrados. Los síntomas de
intoxicación incluyen alteraciones visuales,
cefalea, taquicardia, taquipnea y finalmente
coma y muerte. La piel muestra coloración
rojo cereza, sobra todo en los labios por CO-
Hb.
REGULACIÓN DE LA RESPIRACION
CELULAR
La proximidad intracelular física y funcional
del ciclo del ácido cítrico y la cadena
respiratoria determinan que la actividad de
uno dependa de la otra y viceversa, A su vez,
ambas vías metabólicas están reguladas por
las concentraciones relativas de ATP/ADP y
NADH/NAD+.
El rendimiento del ciclo corresponde al
número de equivalentes reducidos y al ATP
formado:
3 NADH x 3 ATP (fosforilación oxidativa) = 9 ATP
1 FADH x 2 ATP (fosforilación oxidativa) = 2 ATP
1 GTP x 1 ATP (nivel del sustrato) = 1 ATP
Total = 12 ATP
A esta cantidad habría que agregar 3 ATP
más en caso de considerar la formación de
acetil-CoA, a partir de piruvato donde se
forma 1 NADH intramitocondrial. Es
evidente que la acumulación excesiva de
compuestos de alta energía (ATP y NADH)
inhiban ciertas reacciones del ciclo, y la
acumulación de ADP y NAD determinan la
estimulación de ciertas enzimas. De modo
general, el ciclo no puede funcionar más
rápidamente que o que le permite la
utilización del ATP generado.
Efecto de la concentración de ATP/ADP
La regulación del ciclo ocurre a nivel de
algunas enzimas. Por ejemplo, la isocitrato
51
deshidrogenasa es activada por ADP e
inhibida por ATP, y la KM de la citrato
sintetasa para la acetil-CoA es aumentada por
el ATP. Además, el ATP y las acil-CoA de
cadena larga son inhibidores alostéricos de la
citrato sintetasa.
En resumen, un aumento de la relación
ATP/ADP inhibe la actividad del ciclo de
Krebs.
En la cadena respiratoria, la fosforilación del
ADP es también dependiente de esa relación.
Control a nivel de la relación NAD+/NADH
Una disminución de la cadena respiratoria
disminuye la regeneración de NAD, lo que
inhibe las reacciones de la isocitrato
deshidrogenasa, -cetoglutarato deshidroge-
nasa, al acumularse la coenzima NADH
reducida común a estas deshidrogenasas. La
activación alostérica de la isocitrato
deshidrogenasa mitocondrial por el ADP es
contrarrestada por el NADH y el ATP. La
succinato deshidrogenasa es inhibida por el
oxalacetato, y la disponibilidad de oxalacetato
es controlada por la malato deshidrogenasa y,
en última instancia, por el cociente
NAD+/NADH.
Control a nivel de la piruvato
deshidrogenasa
El piruvato ocupa una posición clave en el
metabolismo, ya que puede ser reconvertido
en glucosa, reducido a lactato, transaminado
para formar alanina, o finalmente ser
descarboxilado oxidativamente hasta acetil-
CoA. Es, por lo tanto, importante el control
de su metabolismo a nivel de esta enzima, la
piruvato deshidrogenasa, que determina su
entrada al ciclo.
La mayor parte del piruvato se oxida a acetil-
CoA, pero una cierta cantidad se convierte en
oxalacetato (proceso anaplerótico),
permitiendo que la acetil-CoA se combine
con este último para que el ciclo de Krebs
funcione adecuadamente. Así, la acetil-CoA
proveniente de los ácidos grasos o de ciertos
aminoácidos (cetogénicos), no puede entrar al
ciclo a menos que esté ya presente el
oxalacetato proveniente de la carboxilación
del piruvato.
Se han encontrado dos tipos de regulación del
complejo de la piruvato deshidrogenasa. El
primero se realiza por inhibición competitiva
por parte de la acetil-CoA y el NADH; de esta
manera, cuando el aporte de acetil-CoA es
suficiente a expensas de los ácidos grasos, la
enzima es inhibida, evitando así el
desperdicio innecesario de piruvato derivado
de la glucosa. El segundo tipo de regulación
se lleva a cabo por la existencia de dos formas
interconvertibles de la piruvato
deshidrogenasa: una fosforilada, o forma
inactiva, y la otra desfosforilada, la forma
activa. La existencia de una u otra es
catalizada por dos enzimas: la piruvato
deshidrogenasa cinasa, que requiere ATP, y la
piruvato deshidrogenasa fosfatasa. De hecho,
ambas enzimas forman parte del complejo,
asociadas a la dihidrolipoil transacetilasa (Fig.
1.46).
La principal función reguladora es ejercida
por la cinasa, que al fosforilar a piruvato
deshidrogenasa con hidrólisis de ATP la
convierte en su forma inactiva: esto ocurre
cuando hay exceso de ATP en la célula. Cabe
destacar el papel estimulador que ejercen
sobre la cinasa la acetil-CoA y el NADH, y el
papel inhibidor del piruvato y el ADP. Por el
contrario, si baja el ATP celular, la fosfatasa
remueve un fosfato a la piruvato
deshidrogenasa y la reactiva.
La fosfatasa es inhibida por exceso de
NADH: esta inhibición es revertida por el
NAD+.
La actividad del complejo piruvato
deshidrogenasa también es regulada por
algunas hormonas. Entre ellas, cabe destacar
la insulina, que incrementa la forma activa
(desfosforilada) en tejido adiposo; las
catecolaminas como la adrenalina pueden
activar la piruvato deshidrogenasa en el tejido
cardiaco. Estos efectos hormonales no están
mediados por cambios en los niveles de
AMPc tisulares ya que la cinasa y la fosfatasa
son insensibles a éste (Fig. 1.47).
Niños con deficiencia de algunas de las
subunidades reguladoras del complejo
piruvato deshidrogenasa presentan en suero
cifras elevadas de piruvato y alanina, lo cual
les causa acidosis láctica crónica. Estos niños
muestran, además, graves trastornos
52
neurológicos como ataxia (de Friedrich) y
convulsiones, que en la mayoría de los casos
pueden conducir a un desenlace fatal. El
tratamiento consiste en dar una dieta alta en
lípidos y megadosis de tiamina.
Fig. 1.46. Reacción del complejo piruvato
deshidrogenasa. E1 = piruvato deshidrogenasa; E2 =
dihidrolipoato acetiltransferasa: E3 = dihidrolipoato
deshidrogenasa. Se indica en negritas el destino de los
carbonos del piruvato en acetil-CoA.
Fig. 1.47. Regulación hormonal, alostérica y por
producto de la piruvato deshidrogenasa PDH. La
actividad cinasa fosfatasa forman parte del complejo
PDH.
53
ENZIMOLOGIA Y
BIOENERGETICA
CASOS CLÍNICOS CON APLICACIÓN
BIOQUÍMICA
CASO CLINICO 1
Paciente varón de 45 años, bebedor de
diversos licores desde los 20 años a
consecuencia de una decepción amorosa.
Manifiesta que desde hace unos dos meses
presenta dolor tipo ardor en el epigrastrio,
pero cada vez que él ingiere alimentos su
dolor disminuye. Hace un día acudió a una
fiesta familiar donde ingirió abundante
comida y alcohol, intensificándose su dolor a
nivel de epigastrio y mesogastrio con
irradiación hacia la espalda, y mostró vómitos
biliosos por lo que es conducido al hospital
Los exámenes de laboratorio revelaron
leucocitosis, hiperglicemia, amilasa sérica de
650 U/L y la lipasa sérica en 110 U/L.
Cuestrionario
1. Explique la importancia de las enzimas en
el metabolismo
2. Explique las funciones de la amilasa y la
lipasa séricas, y su importancia médica
3. Defina isozimas y determine la
importancia que tendría para este paciente
que se pudieran determinar las isozimas
de la amilasa y la lipasa séricas.
4. Analize la probable relación entre la
ingesta de alcohol y los signos y síntomas
observados.
CLINICO Nº 2
Paciente femenino de 4 años de edad con
retraso somático y psicomotor profundo con
problemas de deglución, tetraparesia
espástica, convulsiones tónicas con frecuencia
de varias crisis al día y atrofia cortical y
subcortical (microcefalial). Hay antecedentes
de hipoxia neonatal prolongada con cianosis.
Las niveles de biotina en plasma se
encontraron en el límite inferior de lo normal
(261.5 pg/ml; normal 500±200). Nunca ha
tenido manifestaciones clínicas ni químicas
de acidosis metabólica ni cetosis.
Estudios metabólicos demostraron elevación
anormal, en plasma y orina, de alanina y
ácidos pirúvico y láctico. Las anormalidades
bioquímicas se corrigieron con dosis altas de
biotina, pero no de tiamina.
Cuestionario:
1. Explique bioquimicamente los signos y
síntomas principales
2. ¿De qué deficiencia enzimática se trata?
3. ¿Cómo explicaría las convulsiones
observadas en este caso?
4. ¿A qué atribuiría el daño neurológico?
CASO CLINICO 3:.
Un recién nacido nació a término después de
una gestación y un parto normales. A los dos
meses de edad fue trasladado al hospital
porque no ganaba peso y era hipotónico. Una
muestra de sangre reveló que el lactato
sanguíneo, el piruvato y la alanina estaban
muy elevados, Se intentó tratamiento con
tiamina, lo cual redujo el valor de lactato en el
plasma. Sin embargo, a los cinco meses de
edad se incrementó el lactato, por lo que tuvo
que aumentarse la dosis de tiamina.
El complejo PDH de los extractos de células
linfoblastoides tenía una actividad muy
reducida y mostraba afinidad por el TPP
(pirofosfato de tiamina).
Cuestionario
1. Explique bioquimicamente los signos y
síntomas principales determinados
2. Esquematice las vias metabólicas
involucradas en el caso, explicitando sus
enzimas y formas de regulación
3. Explique la importancia de la PDH para
la obtención de energía
4. Relacione el caso con el ciclo de Krebs,
cadena respiratoria y fosforilación
oxidativa
Caso adaptado de Bioquímica: casos y texto, de
Montgomery, Conway, Spector y Chappell, 6ª edición,
Harcourt Brace editores. 1998 p. 167
54