ensayo electroforesis
TRANSCRIPT
Técnicas Moleculares Universidad Técnica Particular de Loja.
Electroforesis, importante y fundamental en la Biología Molecular.
Iliana Ximena Pardo Rojas.
RESUMEN.
Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas en
dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo
eléctrico. En el presente ensayo se da una visión general de la
electroforesis y sus tipos, se incorporan nuevos conocimientos tomados de
la literatura reciente a los conceptos tradicionales de este método y se
reitera su importancia en los estudios moleculares en la Biología.
INTRODUCCIÓN
La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario
del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio
permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la
electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final
del procedimiento (Berkelman et, 1996).
El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las
moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en
el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su
tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las
moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas
deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la
visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán
posteriormente analizadas e interpretadas. En biología molecular, la mayoría
de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin
embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de
estudio que se piensa ejecutar. (Yabar, 2003).
Hay diferentes tipos de electroforesis como son en gel de poliacrilamida en
geles de agarosa, capilar, geles de gradientes, Isoelectroenfoque y
bidimensional su correcta aplicación depende del estudio que se vaya a
realizar. (Garcia, 2000). Es importante señalar que la electroforesis en
asociación con otras técnicas tales como PCR, e hibridación, brinda una gran
ayuda en el campo de la Biología, gracias a esta técnica podemos ayudarnos
en estudios genéticos, moleculares, taxonómicos, etc.
Técnicas Moleculares Universidad Técnica Particular de Loja.
DESARROLLO
La electroforesis es una técnica molecular que nos permite separar
moléculas biológicas en base a su forma, peso y tamaño bajo la influencia de
un campo eléctrico y que es empleada para moléculas de bajo peso
molecular. Fue empleado por primera vez por el año 1937, pero su
importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum
y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona. Es útil además
para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y
número de cadenas poli peptídicas de las proteínas. La electroforesis tiene
como fundamento principal la carga eléctrica de las moléculas que permiten
que estas migren hacia el polo opuesto, el carácter de estas moléculas se
determina por la velocidad de migración en un campo eléctrico al que es
sometido en un líquido portador. Este campo eléctrico generado permite
que una fuerza (Garcia, 2000)
Fundamento de la Electroforesis.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas
en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el
polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las
moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo
negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo
(el polo positivo).
El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas
adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este
movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las
moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano
debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La
energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a
mayor temperatura mayor difusión.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de
una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas
en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un
frente cuya anchura aumentara con el tiempo.
Técnicas Moleculares Universidad Técnica Particular de Loja.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de
las moléculas empleando un medio que oponga más resistencia a dicho
movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel
consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa
moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los
solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas
será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también.
(Southern, 1975)
Tipos de Electroforesis.
Existen muchos tipos de electroforesis pero los más importantes son:
De frente móvil: Aquella en la cual las partículas se mueven de forma
libre en el medio en el que se encuentran dispersas. Las sustancias a
separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un
tampón de pH y fuerza iónica adecuados. Se colocan los electrodos en
sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo
eléctrico, provocando que las moléculas de la muestra (por ejemplo:
proteínas) cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad
opuesta.
De zona: La disolución a tratar se aplica como una mancha, o como
una banda, y las partículas migran a través de un disolvente,
utilizando además un medio soporte inerte y homogéneo, tal como el
papel o ciertos tipos de geles. Esta técnica es utilizada para analizar
mezclas, para determinar la pureza de una muestra, para detectar
cambios de movilidad o de conformación de sustancias. En este tipo
de electroforesis podemos encontrar varios subtipos como es en
papel y en gel.
Las electroforesis más utilizadas en el campo de la Biología son:
a. Electroforesis en gel de poliacrilamida: Los geles de poliacrilamida se
forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente
entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes,
capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma,
además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en
agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de
Técnicas Moleculares Universidad Técnica Particular de Loja.
las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de
que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de
manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez
se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxicidad.
b. Electroforesis en geles de agarosa: La agarosa es un polisacárido
(originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de
composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2
%) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50
grados C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel está
constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda
el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas
grandes de alrededor 20.000 nucleótidos
c. Electroforesis capilar: La electroforesis capilar se basa en los mismos
principios de las técnicas electroforéticas convencionales, pero utiliza
condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie
de ventajas al respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre
un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un
campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente
electroendosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la
superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana
del frente del líquido que contrasta con el frente parabólico de la
cromatografía líquida de alta resolución. La ventaja de esta técnica es
que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una
capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una
ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal
manera que la visualización es on-line. Con esta técnica descripta es
posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y
sustancias no cargadas en forma simultánea.
d. Electroforesis en geles de gradientes: El uso de geles de
poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de
acrilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente
decreciente en el tamaño del poro, pueden tener ventajas sobre los
geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en
gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño
de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el límite del poro
no se produce una migración apreciable aunque no se detiene
completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que
Técnicas Moleculares Universidad Técnica Particular de Loja.
resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas
estrechas, además de incrementar el rango de pesos moleculares que
se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una
concentración fija.
e. Isoelectroenfoque: Esta técnica, habitualmente denominada
electroenfoque se basa en el desplazamiento de las moléculas en un
gradiente de pH. Las moléculas amfotéricas, como los aminoácidos,
se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y
un gradiente de pH . La región del ánodo es Ácida y la del cátodo es
alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las
moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro
del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones
de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente
y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en
medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga
negativa y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una
región dónde el pH coincidirá con su punto isoeléctrico, tendrán una
carga neta nula y se detendrán. De esta forma las moléculas
amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto
isoeléctrico con el pH.
f. Electroforesis bidimensional: La electroforesis bidimensional se basa
en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades
moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se
basa en la separación en una primera dimensión mediante
Isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular
mediante electroforesis en poliacrilamida.
En función del estado de las proteínas a lo largo del proceso
electroforético, éstas se clasifican en electroforesis nativas o
desnaturalizantes
En una electroforesis desnaturalizante, es la que somete a las
(pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la
migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero
no a su forma.
En una electroforesis nativa a las proteínas se les somete a una
migración sin desnaturalización. En esta situación las proteínas
migran en función de su carga, de su tamaño y de su forma. Además
Técnicas Moleculares Universidad Técnica Particular de Loja.
se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y
entre proteínas, separándose los complejos. (Southern, 1975)
Fuentes de error en la electroforesis
La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por
muchos errores experimentales, estos se reflejan a continuación.
1) Temperatura durante la polimerización y la corrida del gel.
2) Velocidad de la polimerización. Niveles de catalizador.
3) Pureza de los reactivos.
4) Tiempo de corrida.
5) Preparación de las muestra (Yabar, 2003)
Conservación de los geles de electroforesis.
Se recomienda sumergir el gel después de electroforesis en una solución de
sacáridos, azúcares, alcoholes de más de 4 carbonos y polímeros solubles
en agua; después se introduce este entre 2 filmes de celofán transparentes
y semipermeables colocado en forma de sándwich a ambos lados del gel o
en uno y en el otro una lámina plástica. De esta forma los componentes
acuosos del gel son reemplazados por los de la solución. Esto permite que
el gel se seque, sin causar su ruptura, deformación, pérdida de la
transparencia y sin necesidad de emplear calor o presión reducida ni ningún
aparato especial. No se han reportado variaciones en geles tratados con
este método después de 2 años. Se recomienda el empleo de un poliol como
el glicerol como un agente «húmedo» cuya función es además de actuar
como un agente de restricción de la difusión, impedir que el gel se seque
por la evaporación durante la conservación, lo que evita la ruptura de este.
(Notsu et, 1997)
CONCLUSIONES.
La electroforesis con su principio fundamental es una técnica muy
importante y muy desarrollada a través de los años para responder a
las inquietudes en el campo Biológico y Molecular que se da a día a
día, ayudando así a los diferentes estudios y proyectos en este
campo.
Técnicas Moleculares Universidad Técnica Particular de Loja.
Los diferentes tipos de electroforesis nos dan una herramienta más
para ampliar nuestros conocimientos, y asi ayudarnos a una pregunta
de investigación que nos hiciéramos ayudándonos de acuerdo al
objetivo planteado en nuestro proyecto.
BiBLIOGRAFÍA.
Berkelman et, a. (1996). Molecular Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 by Pulsed-Field Gel
Electrophoresis and Comparison with That by Bacteriophage Typing. J.Clin. Microbiol, 959-
961.
Garcia. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,actualidad e importancia.
UNIV DIAG., 31-41.
Notsu et, a. (1997). Method for drying polyacrylamide gel after. Daiichi Pure Chemicals, 046.
Southern. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel
electrophoresis. Buenos Aires.: Panamericana.
Yabar. (2003). Manual de Procedimientos de Electroforesis para Proteínas y ADN. Lima-Perú:
ARTES & DISEÑOS LASER S.R.LTDA.