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Elementos requeridos para un diagnóstico deLaboratorioPublicado el: 21/06/2010

Autor/es: MVZ MC Juan Carlos Valladares de la Cruz, Asesoría Avícola Independiente. Nuevo León, México

El Laboratorio de Diagnóstico es un recurso esencial para el manejo adecuado de una empresa avícola, yaque proporciona una gran cantidad de información que puede incrementar de manera significativa laeficiencia productiva de la empresa. Los métodos de diagnóstico disponib les en la actualidad puedendetectar lesiones microscópicas, cantidades mínimas de anticuerpos, toxinas, residuos químicos,microorganismos, antígenos o ácidos nucleicos las aves, insumos o en el medio ambiente, lo que permitecontrolar de manera eficiente la sanidad y la productividad de las aves y la calidad e inocuidad de losproductos avícolas. El ob jetivo de esta presentación es analizar las técnicas y los criterios de interpretación delos resultados de laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades de las aves de producción comercial.

INTRODUCCION: El incremento en la tecnificación de la industria avícola moderna ha modificado los sistemas de producción,manejo y alimentación de las aves destinadas a la producción comercial, para hacer a ésta industria máseficiente y competitiva. La modernización se ha debido a la integración de grandes compañías de produccióny a la globalización de la economía y la comercialización de los productos agropecuarios. Factoresinherentes a temas como la seguridad alimentaria, la protección al medio ambiente, el cuidado del bienestaranimal y las restricciones en el uso de antibióticos en la alimentación animal han modificado lascaracterísticas de los sistemas de Producción. La industria avícola ha generado la necesidad de unametodología de diagnóstico precisa, confiable, rápida, oportuna e integral.

Un Diagnóstico Integral es un procedimiento mediante el cual se analizan todos los factores involucrados enla presentación de una o varias enfermedades, incluyendo: 1) factores inherentes a las aves afectadas comoedad, sexo, función zootécnica, estado de producción, signos lesiones, respuesta a las terapias; 2) posiblesagentes involucrados como agentes infecciosos, toxinas, antimetabolitos, deficiencias o imbalancesnutricionales, factores genéticos o hereditarios y 3) las condiciones medioambientales en las que sepresenta el cuadro, incluyendo a la región o zona donde se encuentra la explotación, la situaciónepidemiológica de la misma con respecto a las enfermedades de las aves, los antecedentes sanitarios de laexplotación, el clima, la estación del año, las condiciones de producción como humedad, temperatura,ventilación interna de las casetas, el manejo de las aves, los sistemas de bioseguridad y control deenfermedades en la granja, los programas de vacunación, las terapias de prevención y/o tratamiento de lasaves, los programas de nutrición y alimentación, así como los parámetros productivos de la explotación(Figura 1)

Figura 1.- Factores a considerar para la obtención de un Diagnóstico Integral en aves de produccióncomercial.

Avicultura / Artículos técnicos / Manejo

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Los sistemas de diagnóstico en aves comerciales están enfocados a la detección de las enfermedades queafectan la salud y la productividad de las aves, a la detección de los padecimientos que afectan la calidad delos productos avícolas y a la detección de los agentes que afectan a la salud de los consumidores. Lainterpretación correcta de un resultado de laboratorio permite evaluar de manera oportuna las medidas debioseguridad, manejo, nutrición y sanidad utilizadas. Por medio del laboratorio se puede determinar elestado de salud de una parvada, detectar problemas sanitarios subclínicos e inaparentes, evaluar la eficaciade los programas de inmunización, cuantificar el grado de microbismo ambiental y evaluar la calidad de losinsumos y de los productos obtenidos.

1.- RECOMENDACIONES PARA EL USO DEL LABORATORIO DE DIAGNOSTICO

Para que los resultados de los estudios de laboratorio sean útiles, los análisis deben estar incluidos dentrode un programa de trabajo constante y permanente como parte del sistema de producción. El uso constantedel laboratorio permite crear un historial de pruebas y resultados cuya interpretación es más fácil y adecuada;la interpretación de un solo grupo de resultados es difícil y puede conducir a conclusiones erróneas. Enocasiones los cambios en el comportamiento de las parvadas tras un cambio de manejo, del calendario devacunación o de un tratamiento se establecen en forma gradual y progresiva y no de manera drástica einmediata y esto sólo podrá ser detectado en el laboratorio mediante estudios seriados.

CARACTERISTICAS DE UN LABORATORIO DE PRUEBAS. Un laboratorio de pruebas debe contar con instalaciones adecuadas que permitan el establecimiento demedidas de contención y bioseguridad que eviten la contaminación entre el medio ambiente y el laboratorio,para evitar que este se contamine del exterior o bien que se vuelva un foco de contaminación al medioambiente; las instalaciones deben garantizar la seguridad del personal y debe prevenir la contaminacióncruzada entre las muestras. El Laboratorio debe de contar con una plantilla de personal capacitado,constante y suficiente para la realización de las pruebas y para minimizar las variaciones atribuibles a larealización del procedimiento. El laboratorio debe de contar con equipos e instrumentos de mediciónconfiable y suficiente, que este sujeto a un programa permanente de mantenimiento y calibración, conpatrones de medición adecuados para garantizar la trazabilidad de las mediciones.

El Laboratorio debe tener definida su política de Calidad y todas sus políticas y procedimientos deben estardocumentadas en un Manual de Calidad, un Manual de Procedimientos Técnicos y un Manual deAseguramiento de Calidad y debe poseer toda la evidencia documental que sustente que el sistema decalidad se está llevando adecuadamente. En México los laboratorios de diagnóstico en materia zoosanitariadeben contar con una autorización oficial para su funcionamiento de acuerdo a la NOM-003-ZOO1994:Criterios para la operación de laboratorio de pruebas aprobado en materia zoosanitaria.

Es preferible usar el mismo laboratorio y que se usen las mismas técnicas, los mismos reactivos y personalconstante para minimizar los errores atribuidos a los procedimientos utilizados.

CARACTERISTICAS DE LAS PRUEBAS DE LABORATORIO Las técnicas usadas en un Laboratorio de Diagnóstico de Enfermedades de las Aves deben estarestandarizadas, científicamente validadas y universalmente aceptadas, considerando su sensibilidad,especificidad, repetitividad y reproducibilidad. La Validación de una Prueba es un proceso que sirve para determinar si la prueba es adecuada para un usoparticular. Un análisis validado genera, de manera consistente, resultados que identifican a animales comopositivos o negativos a la presencia de un analito o de un proceso particular (ej. presencia de anticuerpos oinduración de la piel), y por inferencia, la prueba predice adecuadamente el estado de infección de un animal,con un grado predeterminado de certeza estadística. El proceso de validación de un análisis debe sercontinuo durante el período en el que la prueba se utiliza y puede requerir ajustes en las condiciones derealización conforme la prueba se va utilizando de manera masiva. Es importante hacer notar que existenmuchas pruebas de laboratorio tradicionales que son usadas ampliamente y que nunca han sido sujetas aun proceso completo de validación.

Las variables que pueden afectar el resultado de una prueba de laboratorio pueden ser atribuidas a: 1)características de la muestra (la cual es producto de la interacción agente-hospedador), 2) características delensayo (factores físicos, químicos, biológicos y/o técnicos de la prueba) y 3) características del resultado dela prueba para predecir con exactitud el estado del hospedador con respecto al analito evaluado.

La sensibilidad diagnóstica de una prueba es la capacidad que tiene ésta para detectar los casos positivosaún a un nivel mínimo; una prueba altamente sensible no deberá dar resultados falsos negativos (resultadosnegativos a partir de muestras positivas). La especificidad diagnóstica de la prueba es la capacidad quetiene ésta para detectar los casos negativos y distinguirlos de los positivos; una prueba altamente específicano debe dar resultados falsos positivos (resultados positivos a partir de muestras negativas). La sensibilidady especificidad de cada técnica no necesariamente están correlacionadas entre sí, existen pruebas muysensibles y poco específicas ó muy específicas y poco sensibles.

La repetitividad de la prueba se refiere a su capacidad de dar resultados similares en las mismas muestras;mientras que la reproducibilidad se refiere a la capacidad de la prueba de dar resultados similares endiferentes laboratorios. Generalmente las técnicas de laboratorio deben tener índices de repetitividad yreproducibilidad mayores al 95% bajo condiciones similares de realización. La prevalencia de la enfermedad es el otro factor que afecta la precisión de un resultado de laboratorio, lavalidación de una prueba diagnóstica se aplica a una población donde se ha conocido la prevalencia de laenfermedad.

Las pruebas de Laboratorio además deben ser prácticas, accesibles y no ser demasiado costosas; lasventajas que se obtienen con su uso deben ser superiores al costo de los análisis. Los resultados de laspruebas deben ser relevantes y de preferencia deben ser cuantificables para poder ser analizados de formacomparativa.

Una consideración importante se refiere al usuario del Laboratorio de Diagnóstico; El Médico Veterinario,propietario y/o, administrador debe estar convencido de la importancia y la utilidad del uso de las pruebas deLaboratorio. El usuario del Laboratorio debe estar consciente de que los resultados de las pruebas tienen

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que ser interpretados racionalmente.

2.- PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO

En el caso de las aves de producción comercial, debido a la gran cantidad de animales que son explotadosde manera simultánea en espacios relativamente pequeños, los procedimientos de análisis de lainformación tienen ciertas particularidades. La medicina que se practica se clasifica como Medicina dePoblaciones, usualmente se muestrea una proporción muy reducida de la población total a estudiar y losresultados obtenidos en esa pequeña proporción de muestras se infiere que son válidos para toda lapoblación, por lo tanto la representatividad de las muestras se convierte en un factor esencial para laconfiabilidad de los resultados.

El primer factor que determina la validez de un resultado de Laboratorio es la representatividad de lasmuestras seleccionadas. Los resultados obtenidos con las pruebas de Laboratorio únicamente representanlas características de las muestras sometidas a su análisis. Estos resultados pueden o no representar elestado general de una parvada o de un lote de ingredientes o alimentos, dependiendo de la precisión con laque las muestras fueron seleccionadas. En ocasiones se tiene la impresión que la variación en losresultados depende de la variación analítica de las pruebas o de errores en su realización por parte delLaboratorio y esto puede no ser correcto. La variabilidad analítica (variabilidad de la prueba) no es la principalfuente de error en un resultado de Laboratorio; la variabilidad más importante en los resultados deLaboratorio se debe a errores en las técnicas de muestreo.

Los tipos de muestreo utilizados con mayor frecuencia en la Industria Avícola son el Muestreo Confirmatorio yel Muestreo Exploratorio.

1. Muestreo Confirmatorio: es el muestreo que se realiza para confirmar y/o descartar un Diagnóstico Clínico.Cuando las aves son muestreadas para confirmar un diagnóstico clínico, es usual obtener las muestras deun "porcentaje representativo del problema" seleccionando aves con el cuadro clínico desarrollado; Losresultados obtenidos serán válidos para las aves seleccionadas en ese momento en particular y la validezde los resultados depende de la representatividad de los animales muestreados. En el caso de las aves esnecesario conocer a profundidad la historia natural de la enfermedad que se desea detectar, incluyendo losíndices de morbilidad y mortalidad, así como el curso y la duración del proceso, para determinar el momentomás adecuado para realizar la toma de las muestras, por ejemplo, en el caso de las enfermedadesinfecciosas, el aislamiento del agente causal es más probable en los estadíos iniciales de la enfermedad,mientras que la demostración de la respuesta serológica hacia dicho agente requerirá de un muestreo enlos estadíos avanzados de la misma o en período de convalecencia, es muy frecuente que se requieran porlo menos dos muestreos serológicos consecutivos con un intervalos de 10 a 15 días para demostrar laseroconversión o el incremento en los títulos de anticuerpos contra un agente en particular.

Este tipo de muestreo puede ser aplicable a muestras de diverso origen, como los insumos e ingredientesusados en la fabricación de los alimentos o bien para determinar la calidad y la inocuidad de los productosavícolas, como carne, huevo o subproductos.

2.-Muestreo Exploratorio: es el muestreo que se realiza sin que existan evidencias detectables de lapresencia de un problema en particular. El objetivo de dicho muestreo es la detección de problemas antesde que estos se manifiesten, y usualmente son utilizados para conocer de manera permanente el estado sanitario de las aves, alimentos, ingredientes, insumos o productos y subproductos.Debido a que no existen indicios que orienten la selección de las muestras, el muestreo exploratorio es unproceso complicado. La literatura científica menciona que para garantizar la representatividad de lasmuestras colectadas, la selección de estas debe ser completamente al azar. El tamaño y número demuestras colectadas dependen del tipo de muestras y de los exámenes de laboratorio que se deseanrealizar. En el caso de las enfermedades infecciosas, el número de muestras requeridas depende de laprevalencia esperada de la enfermedad en cuestión en una zona determinada. En el caso de losingredientes y de los alimentos, el tamaño y el número de muestras depende del volumen total del materialpara muestrear.

En el caso de la industria avícola, es común utilizar este tipo de Muestreos Exploratorios, para realizarexámenes de laboratorio rutinarios y preestablecidos, estos exámenes se conocen como "Monitoreos" (delinglés: "monitoring": revisión, inspección) y tienen como objetivo principal evaluar de manera permanente elestado de salud general de la parvada.

Su uso continuo incrementa la posibilidad de la detección temprana de un problema, con lo que se puedenestablecer medidas correctivas rápidamente. Estos estudios se pueden realizar a partir de muestras de avesvivas seleccionadas específicamente para tal fin, de la mortalidad, del alimento, los insumos del equipo y delas instalaciones en general (Figura 2).

Figura 2.- Ejemplos de diferentes procedimientos de muestreo

Para la evaluación de un programa de Sanidad Avícola no es necesario hacer un monitoreo extensivo a ungran número de animales, pero sí es muy importante que las aves a analizar sean representativas del

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estado general de la parvada. La metodología del muestreo debe ser constante. La selección de las aves amuestrear debe ser completamente aleatoria, para garantizar la representatividad del estado general de laparvada. Generalmente un número de entre 10 y 20 aves de las mismas características son suficientes paraobtener resultados confiables. Entre mayor sea el número de muestras la representatividad será mayor perolos costos de la evaluación se incrementan proporcionalmente.

Existen Monitoreos serológicos, microbiológicos, parasitológicos, patológicos ó químicos, con objetivos muyparticulares en cada caso. Existen también "Monitoreos Integrales" que evalúan en cada muestreo una seriede parámetros en varias pruebas. Los Monitoreos serológicos y microbiológicos has sido esenciales para elfuncionamiento de las campañas Oficiales para el Control y la Erradicación de la Influenza Aviar, laEnfermedad de Newcastle y la Salmonelosis Aviar en nuestro país. Los Monitoreos de Laboratorio para evaluar los programas de Sanidad Avícola pueden variar en el tipo ynúmero de muestras colectadas, así como en los tipos de pruebas que se realicen en cada caso, sonadaptables a las necesidades particulares de cada empresa.

Una consideración importante en los programas de Monitoreo de Laboratorio es la frecuencia delprocedimiento. No existen reglas que determinen cual es la periodicidad del muestreo que puedan aplicarseen todos los casos. Cada empresa debe establecer un criterio propio de acuerdo a sus necesidades yposibilidades. Sin embargo, se debe recordar que la eficacia del procedimiento depende de su ejecución yevaluación constantes. En el caso de los Monitoreos Integrales de aves vivas, un criterio importante esestablecer la edad de las aves a muestrear, ya que los resultados obtenidos y su interpretación varíandependiendo de la edad y de la función zootécnica de aves analizadas.

3.-SELECCIÓN, CONSERVACIÓN Y ENVIO DE LAS MUESTRAS PARA ESTUDIOS DE LABORATORIO

El segundo factor que determina la validez de un resultado de Laboratorio es el procedimiento para laconservación de las muestras que serán sometidas a análisis. Los métodos de conservación tienen comoobjetivo preservar las características físicas, químicas y microbiológicas originales de las muestras, por lomenos durante el período comprendido entre su selección y su recepción en el Laboratorio. En algunoscasos estos métodos también permiten la preparación de las muestras para su procesamiento en elLaboratorio. Los métodos de conservación dependen del tipo de análisis que se va a realizar y del tipo de muestraenviada; el período en el que las muestras conservan sus características originales también depende deltipo de método utilizado, sin embargo, es recomendable que las muestras sean trasladadas al Laboratoriolo más rápido posible después de ser colectadas, preferentemente en plazo no mayor de 24 horas.

Cuando se envían aves vivas para su análisis de Laboratorio, éstas deben de enviarse en contenedoresadecuados para su transporte, que garanticen un trato humanitario, que no comprometan su viabilidad, queno causen lesiones y que no induzcan períodos innecesarios de tensión durante el transporte. Es importanteno mezclar aves que se van a enviar a estudios diferentes, por ejemplo casos clínicos y monitoreosrutinarios, ya que se corre el riesgo de contaminación cruzada durante el transporte. También es importanteenviar a las aves directamente de la granja al Laboratorio, cumpliendo con las medidas de bioseguridad queeviten que las aves transportadas representen un riesgo de contaminación para otras aves. El envío de avesvivas al Laboratorio permite colectar muestras para diversos estudios bajo condiciones controladas y reducela probabilidad de que dichas muestras se alteren antes de su procesamiento, sin embargo, puede sercomplicado sobre todo cuando la distancia entre la granja y el Laboratorio es muy grande; El transporte deaves vivas para estudios de Laboratorio debe también respetar los lineamientos vigentes descritos en lasCampañas para el Control y la Erradicación de la Influenza Aviar, la Enfermedad de Newcastle presentaciónVelogénica y Salmonelosis Aviar.

En ocasiones, debido al número de muestras, a la distancia entre la granja y el Laboratorio y al tipo demuestras remitidas, es más práctico colectar las muestras en la granja y enviarlas al Laboratorio, lo cualrequiere ciertas consideraciones. Uno de los errores principales es la identificación de las muestras. Elmétodo de identificación debe ser permanente aun bajo los efectos del sistema de conservación.

Las muestras para estudios de Histopatología deben conservarse en una solución de formalina al 10%amortiguada, pH 7.0-7.5, con una relación 1:10 muestra formalina. Las muestras para estudios de Serologíadeben de conservarse en refrigeración del suero, es importante no refrigerar ni congelar las muestra concoágulos sanguíneos ya que se corre el riesgo de que el coágulo sufra hemólisis que interfiere con larealización de las pruebas. Las muestras para estudios de Microbiología y de Biología Molecular debenconservarse en refrigeración ó en congelación, evitando su contaminación externa; en el caso de lasmuestras de hisopos, estos deben conservarse sumergidos en medio de transporte específico para elanálisis que se desea realizar (medios selectivos, adicionados con antibióticos, etc.). Las muestras paraestudios de Parasitología deben conservarse en refrigeración para evitar la fermentación de la muestra; eluso de dicromato de potasio K2Cr2O7 está siendo cuestionado debido a la toxicidad de la solución. Lasmuestras para estudios de Toxicología pueden variar en su conservación, dependiendo del estudio que sedesea realizar, sin embargo, en estos casos es muy importante que los recipientes contenedores de lasmuestras tengan cierre hermético para evitar contaminación externa (Figura 3)...

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Figura 3.- Procedimientos recomendables para la conservación y el envío de muestras para análisis delaboratorio.

4.- TIPOS DE ANALISIS DE LABORATORIO E INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los tipos de pruebas usadas rutinariamente en un Laboratorio de Patología Aviar son:

1.- Pruebas de Patología: Las pruebas de patología tienen como objetivo identificar y cuantificar las lesionesmorfológicas de los tejidos, especificando los tipos de lesiones, su distribución, curso y grado de severidad;las pruebas más utilizadas son las necropsias y la histopatología. Las necropsias pueden ser realizadas tanto en el campo como en el laboratorio, pueden realizarse de avesespecíficamente seleccionadas y sacrificadas para tal fin o bien utilizar las aves de la mortalidad. En lasnecropsias se pueden identificar las lesiones macroscópicas en general y también se utilizan con fines másespecíficos como para evaluar lesiones en distintos órganos, tal es el caso de la técnica de J. Johnson y W.Reíd para evaluar las lesiones producidas por coccidias ó la técnica de Rountree que sirve para laevaluación del desarrollo del sistema inmunológico. El resultado de la necropsia se emite como un"Diagnóstico Morfológico Post Mortem" donde las lesiones observadas son ordenadas de acuerdo a suimportancia; el resultado es sugestivo de un padecimiento, aunque rara vez es concluyente a cerca de lacausa de enfermedad (Figura 4). Cuando la necropsia se realiza inmediatamente después del sacrificio las aves no presentan cambios postmortem, cuando se realiza en aves procedentes de la mortalidad natural es común que los cadáverespresenten cambios post mortem avanzados que impidan una observación adecuada de las lesiones.

Figura 4.- Procedimiento para la realización de una necropsia.

La histopatología tiene como objetivo identificar y describir las lesiones microscópicas de los tejidos. Loserrores más comunes en la conservación de las muestras incluyen: exceso en el volumen de las muestras y/ o falta de volumen del fijador, derramamiento del fijador por falta de cierre hermético en el recipiente, falta depenetración del fijador por muestras excesivamente gruesas y refrigeración o congelación de la muestras,antes de fijarse o durante el proceso de fijación. El congelamiento de las muestras cristaliza el aguaintracelular causando ruptura de las membranas celulares y destrucción de los tejidos.

El estudio histopatológico usualmente ayuda a orientar el diagnóstico, la interpretación puede ser descriptiva,identificando las lesiones microscópicas de los tejidos. El resultado puede ser concluyente en algunoscasos, por ejemplo, en las enfermedades neoplásicas es esencial para determinar el tipo de tumor(Enfermedad de Marek, Leucosis Linfoide, Leucosis Mieloide y Reticuloendoteliosis); en algunasenfermedades virales la presencia de cuerpos de inclusión es patognomónica, como en los casos deViruela Aviar, Laringotraqueítis Infecciosa, Hepatitis con Cuerpos de Inclusión y Síndrome de Baja de Postura;en otros casos se puede observar el agente en las lesiones, como en la coccidiosis o en la aspergilosis(Figura 5). .Finalmente en algunas ocasiones la histopatología sirve para cuantificar el grado de daño que lasaves están teniendo en algunas enfermedades como en las micotoxicosis y en la Infección de la bolsa deFabricio, donde incluso se puede determinar sí las aves están o no protegidas contra los desafíos de campo;en este caso se han desarrollado varios sistemas para cuantificar el grado de lesión bursal como unsistema indicador de protección.

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Figura 5.- Lesiones microscópicas con valor diagnóstico concluyente.

2.- Pruebas de Serología: las pruebas de serología sirven para detectar la inmunidad humoral contradiferentes antígenos; las pruebas usualmente detectan anticuerpos séricos (de ahí su nombre de Serología)pero eventualmente pueden ser utilizadas para detectar anticuerpos en yema o en cualquier líquido corporal.Una prueba positiva indica que el ave posee anticuerpos contra el antígeno evaluado, lo que puede tenersignificados diversos.

Las pruebas de serología pueden ser cuantitativas o cualitativas. En las pruebas cualitativas, como laaglutinación en placa y la inmunodifusión en gel de agar, el resultado se expresa como positivo ó negativo,suelen ser poco sensibles y el suero no se diluye para ser procesado. Las pruebas cuantitativas permitendetectar la cantidad de anticuerpos que hay en la muestra, en este caso los sueros se diluyen en dilucionesdobles seriadas y el resultado usualmente se expresan como el "título de la muestra", que indica la diluciónmayor en la que se observa una reacción positiva, el titulo es directamente proporcional a la cantidad deanticuerpos que hay en la muestra, tal es el caso de la inhibición de la hemaglutinación, la micro aglutinacióny la virus suero neutralización; el resultado se expresa como la dilución, ej. 1:256 o su inverso ej. 256,también se pueden expresar en Logaritmo base 2 ej. 1:256 = Log 2 8. En otros casos, como en las pruebasde ELISA, el suero sólo es diluido una vez antes de ser procesado y el titulo del mismo es calculadomatemáticamente haciendo una comparación con los títulos de los controles positivos y negativos de laprueba.

Las pruebas más comunes en avicultura son la aglutinación en placa para Mycoplasma y Salmonella; lamicro aglutinación para S pullorum, inmunodifusión en gel de agar para Adenovirus, Encefalomielitis,Infección de la bolsa de Fabricio, Reovirus e Influenza Aviar; inhibición de la hemaglutinación paraEnfermedad de Newcastle, Influenza Aviar, Síndrome de Baja de Postura, Mycoplasma, Bronquitis Infecciosay Coriza Infecciosa; virus suero neutralización para Infección de la bolsa de Fabricio, Adenovirus Aviar,Enfermedad de Newcastle, Reovirus, y otros agentes y finalmente la técnica de ELISA (ensayoinmunoenzimático) que actualmente es de las más utilizadas debido a su alta sensibilidad, facilidad derealización, disponibilidad de reactivos estandarizados, rapidez de los resultados y a que fácilmente seadapta a un sistema computarizado para hacer la evaluación estadística de los resultados, existen estuchescomerciales para un gran número de enfermedades aviares como Enfermedad de Newcastle, Infección de labolsa de Fabricio, Bronquitis Infecciosa, Reovirus, Mycoplasma gallisepticum, Mycolasma synoviae,Pasteurella multocida, Salmonella enteritidis, Encefalomielitis Aviar, Influenza Aviar, Pneumovirus Aviar,Leucosis Linfoide tipos A-B y J, Laringotraqueítis Infecciosa, Anemia Infecciosa Aviar, etc.

En las pruebas de ELISA el suero se diluye una sola vez, y se utiliza un antisuero marcado con una enzima, elresultado se basa en una reacción colorimétrica que es medida con un espectrofotómetro, cuya intensidades proporcional a la cantidad de anticuerpos de la muestra, los resultados son además clasificados en"grupos o perfiles" en un histograma, que puede ser 3, 14 o 18 perfiles dependiendo del estuche comercial ydel tipo de antígeno evaluado; la expresión gráfica de los resultados facilita en gran medida su interpretación.

Generalmente en las pruebas de serología se evalúa un grupo de muestras, usualmente un mínimo de 10para que la evaluación sea confiable y los resultados obtenidos son individuales de cada muestra. En losresultados se expresa el título de cada suero; para una interpretación adecuada de los resultados esnecesario conocer el título de cada suero y el promedio del grupo, generalmente expresado como mediageométrica, lo que indica el comportamiento general del grupo. En la interpretación de los resultadostambién es necesario considerar la uniformidad de los resultados, por lo que se hace, sobre todo en laspruebas de ELISA, con un análisis estadístico de los resultados, mostrando la media aritmética, la mediageométrica, la desviación estándar y el coeficiente de variación. Los valores de las medias indican lacantidad de anticuerpos, los valores de la desviación estándar y del coeficiente de variación indican launiformidad de los resultados. En general se piensa que títulos altos con variaciones pequeñas indican unaprotección adecuada y que títulos bajos y desviaciones altas indican falta de protección o exposición decampo, sin embargo en este tema las generalizaciones son difíciles de establecer. La interpretación variarádependiendo del tipo de antígeno, del tipo y edad de las aves analizadas y del calendario de vacunación quese está utilizando.

En aves recién nacidas la presencia de anticuerpos es un reflejo de los anticuerpos maternos, esto puedeindicar protección (Infección de la bolsa de Fabricio, Enfermedad de Newcastle) o infección materna y muyprobablemente infección de la progenie (Mycoplasma, Salmonella). En aves mayores a dos semanas lapresencia de anticuerpos contra antígenos no incluidos en el programa de inmunización indica exposición decampo a dicho agente y casi seguramente infección (Pneumovirus Aviar, Influenza Aviar, Anemia InfecciosaAviar, Micoplasmosis, etc.); en el caso de las enfermedades donde existe un programa de vacunación lainterpretación de los resultados de serología es más complicada, ya que se debe diferenciar el efecto de lavacunación del efecto de las exposiciones de campo; las vacunaciones deben generar un título de

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anticuerpos homogéneo y moderado; sí el promedio es muy alto y la variación entre las muestras esexcesiva los resultados sugieren protección inadecuada y exposición de campo no controlada. Actualmentese han desarrollados algunos sistemas conocidos como "DIVA" que sirven para diferenciar los anticuerposde aves vacunadas y aves infectadas. Se debe ser muy cuidadoso al evaluar el coeficiente de variación, yaque por efectos matemáticos, los títulos muy bajos y con valores negativos en algunos de ellos resultan encoeficientes de variación muy elevados (hasta mayores del 100%) mientras que títulos promedio muyelevados pueden resultar con coeficientes de variación bajos (menores al 50% aún con gran variación entrelas muestras), la graficación de los resultados de ELISA en forma de histogramas facilita en gran medida lavaloración de las variaciones entre las muestras. En algunos estuches comerciales para Anemia InfecciosaAviar y Salmonella enteritidis se utiliza una técnica de ELISA llamada "de competencia" o "por bloqueo" dondela cantidad de anticuerpos es inversamente proporcional a la intensidad de la reacción colorimétrica y losvalores altos indican ausencia de anticuerpos, mientras que las lecturas bajas indican la presencia de losmismos. En las pruebas de virus suero neutralización la evaluación lleva implícita la capacidad delanticuerpo para neutralizar el efecto del antígeno homólogo, desafortunadamente estas pruebas son máslentas, costosas y no permiten evaluar un gran número de muestras de manera simultánea.

Sin embargo ninguna de las pruebas de serología por sí mismas indica grado de protección, todas indicanel nivel de anticuerpos específicos contra un antígeno en particular, este nivel de anticuerpos debe serracionalmente interpretado para poder decir si indica protección, exposición de campo o infección activa. Laevaluación rutinaria y periódica del título de anticuerpos deberá correlacionarse con los calendarios devacunación, el comportamiento clínico y el desempeño productivo de la parvada para establecer losparámetros esperados de acuerdo a la edad y a la función zootécnica de las aves para establecer los nivelesconsiderados "normales" e interpretar adecuadamente las variaciones de la "normalidad" como inmunidadinsuficiente, exposición de campo no controlada o enfermedad clínica aparente. Las llamadas "líneas debase" indican el nivel normal esperado de anticuerpos en una parvada a una edad determinada, permitenidentificar con facilidad los cambios en el nivel de anticuerpos debidos a cambios en las vacunaciones o aexposiciones de campo y se pueden correlacionar con los objetivos de rendimiento productivo, paraestablecer estas líneas de base se sugiere muestrear semanalmente un mínimo de 10 parvadas.

En el caso de las pruebas de serología, es frecuente que se requiera de un muestreo seriado de la parvadapara detectar seroconversión o bien, un incremento en el título de anticuerpos de las aves, lo cual es muysugestivo de una exposición de campo hacia el agente evaluado (Figura 6).

Figura 6.- Incremento en el título de anticuerpos contra Bronquitis Infecciosa, indicando exposición de campohacia el virus.

3.- Pruebas de Parasitología: Las pruebas de parasitología identifican el tipo y el número de parásitosexistentes en las aves, ya sea externos y/o internos. Las técnicas utilizadas en avicultura son flotación,McMaster y observación microscópica. Su aplicación depende de la función zootécnica de las aves a analizar.Para la detección y cuantificación de los endoparásitos más frecuentes de las aves domésticas la muestrade elección es de heces.

Las evacuaciones de las aves pueden consistir en heces fecales y heces cecales; las heces fecales soneliminadas junto con los desechos del tracto urinario. En el análisis de las evacuaciones aviares esnecesario conocer el tipo de evacuación, sus características físicas como color y consistencia, la cantidad delíquido de las excretas y la presencia de materiales extraños, como sangre o restos de alimento semidigerido o no digerido. El análisis más frecuente es para la detección de coccidias por la técnica deMcMaster. Si las muestras son remitidas al Laboratorio inmediatamente después de su colección esrecomendable enviarlas en condiciones de refrigeración sin ningún otro conservador adicional.

En el caso del pollo de engorda la parasitosis más importante es la coccidiosis y en la mayoría de lasempresas se utiliza un programa continuo de control de la enfermedad, basándose en el uso demedicamentos preventivos y/o vacunas. La prueba más usada es la de McMaster y debe incluir además ladiferenciación de las especies de Eimeria involucradas, las que se identifican con criterios morfológicosconvencionales (Figura 7). La prueba detecta al parásito es su fase de oocisto y puede realizarse a partir deheces, contenido cecal o cama. Las muestras de heces reflejan la cantidad de coccidias que los pollosestán eliminando en ese momento, se requiere de una técnica de muestreo constante en un programapermanente; se prefiere usar muestras de heces frescas colectadas a todo lo largo de la caseta y lasmuestras suelen trabajarse por caseta; es importante no mezclar nuestras de aves de diferentes edades yaque la eliminación de oocistos puede variar enormemente de una semana a otra; un control intensivorequiere de un muestreo semanal por lo menos desde la 2° o 3° semana de edad. Los resultados se emitencomo el número de oocistos por gramo de muestra (o/gh), especificando además el porcentaje de cadaespecie.

Bajo un programa de uso continuo de anticoccidianos en el alimento, un conteo de 0 a 5,000 o/gh seconsidera normal, un conteo entre 6,000 y 70,000 o/gh no indica riesgo de brote sí el conteo de la semanaanterior no tiene marcadas variaciones con relación al presente; los conteos cercanos a 100,000 o/ghindican riesgo inminente de brote clínico, las heces pueden estar acuosas u manchadas con sangre y elgrado de pigmentación se verá afectado en un 5-10%; los conteos superiores a 100,000 indican brote de laenfermedad. Hay que tomar en cuenta algunas consideraciones en la interpretación de estos resultados. Eacervulina se es la coccidia de replicación más abundante y los conteos generalmente son más altos quelos de E tenella, por otro lado E máxima es de replicación escasa y puede generar problemas con conteossuperiores a 10,000; la eliminación masiva de oocistos ocurre entre 4 y 7 días después de que sedesarrollaron las lesiones intestinales más severas; los conteos en cama no reflejan la cantidad de oocistos

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eliminados en un momento determinado, generalmente los oocistos están esporulados y la diferenciaciónde especies es más difícil y una cantidad excesiva de amoniaco en la cama puede destruirlos. El contenidocecal es una muestra adecuada pero refleja sólo lo que está ocurriendo en el ave muestreada. En el casode las reproductoras, el uso de las vacunas es común y el alimento no contiene coccidiostatos, esimportante analizar la eliminación de oocistos una y dos semanas después de la vacunación; en avesmayores de 12 semanas los problemas más frecuentes se asocian a E necatrix.

En aves de vida prolongada, como reproductoras y gallinas de postura, es posible encontrar infestación porcestodos y nematodos cuyos huevos se pueden detectar en heces por la prueba de flotación, aunque laevaluación del grado de parasitosis es más confiable si se observa la cantidad de parásitos adultos a lanecropsia. Con los ectoparásitos la situación es similar, estos se identifican morfológicamente con elmicroscopio y el grado de infestación puede interpretarse como leve, moderado o severo dependiendo delnúmero de parásitos y de los signos que provoquen en las aves.

Figura 7: Ejemplo de una evaluación semanal del programa de control de coccidiosis durante 12 años pormedio de la prueba de McMaster en heces

4.- Pruebas de Microbiología: estas pruebas detectan bacterias, hongos o virus, ya sea por medio de suaislamiento, identificación y tipificación o bien por la demostración de sus antígenos; usualmente se realizana partir de tejidos de aves seleccionadas específicamente para tal fin, pero también se pueden hacerestudios a partir de alimento, agua, ingredientes, cama, instalaciones, equipo, etc. Los métodos másutilizados para la conservación son la refrigeración y la congelación, particularmente en aquellas muestrasque por su naturaleza posean una flora bacteriana normal, ya que el sobre crecimiento de dicha flora puedeinhibir el crecimiento de los agentes patógenos. El aislamiento bacteriano o micótico requiere de muestrasen refrigeración mientras que para el aislamiento viral la congelación es el método más recomendable; eneste caso, el uso de sustancias crio protectoras, como la glicerina, puede prolongar la vida útil de lasmuestras. Existen medios de cultivo especialmente diseñados para la conservación y el transporte de lasmuestras y en algunos casos tiene propiedades de inhibición de microorganismos comensales ypropiedades selectivas de protección para algunos microorganismos, particularmente bacterianos. El hechode que algunas muestras de tejidos que se utilizan para el aislamiento microbiológico pueden contenercantidades importantes de bacterias saprófitas, restos celulares, anticuerpos, enzimas, índices extremos depH o algunas otras sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos patógenos, enocasiones es más práctico colectar la muestra mediante la utilización de un hisopo estéril y luego conservareste en un medio de transporte adecuado. Por ejemplo, las muestras para aislamiento de Salmonellapueden ser adecuadamente conservadas en medios de transporte como agua peptonada o selectivos comoel caldo tetrationato o el caldo selenito. Las muestras para aislamiento viral son conservadasadecuadamente en un medio protector como el caldo triptosa de fosfato adicionado de un amortiguador paraevitar cambios bruscos de pH, la adición de una mezcla de antibióticos de amplio espectro evita lacontaminación bacteriana de la muestra. Además de la utilización de los medios de conservación, lasmuestras deben ser transportadas en refrigeración. El error más común en el envío de muestras paraestudios microbiológicos es la contaminación bacteriana de las muestras, el origen de esta contaminaciónestá influenciado por la técnica de muestreo y por la conservación inadecuada de las muestras en cuanto ala temperatura en el transporte.

El aislamiento de un microorganismo a partir de una muestra implica que este esta viable ("vivo") en dichamuestra (Figura 8). Sin embargo, la interpretación de las pruebas de aislamiento microbiano deben serinterpretadas con cautela. El aislamiento de un microorganismo no implica necesariamente su papel comopatógeno en un proceso de enfermedad, puede eventualmente tratarse de flora saprofita o un agentevacunal. El microorganismo aislado puede requerir de una tipificación posterior, como una tipificaciónantigénica, la demostración de factores de virulencia, etc. Así mismo, la falta aislamiento del microorganismono implica necesariamente que éste no sea la causa de la enfermedad, En bacteriología se usan mediosenriquecidos y selectivos artificiales, pruebas bioquímicas y en algunos casos identificación por medio deantisueros. Los resultados se expresan como género y especie bacteriana aislada y en ocasiones sucantidad relativa (crecimiento abundante, moderado o escaso). La interpretación de estos resultadosdepende del tipo de ave analizada, el tipo de bacteria aislada y el órgano o tejido donde se aisló la bacteria.En condiciones ideales todas las muestras deben ser negativas a Salmonella pullorum, Salmonellagallinarum y Salmonella enteritidis, en todos los tipos de aves (progenitoras, reproductoras, postura,engorda), en ingredientes, alimentos, agua, cama e instalaciones, particularmente de la planta incubadora yde la planta de procesamiento. Una característica de calidad de las aves recién nacidas es la bacteriologíadel saco vitelino y la micología del pulmón, que deberían de ser estériles, ocasionalmente se aíslancoliformes y cocos de saco vitelino así como Aspergillus y Penicillium de pulmón, lo que refleja la higiene dela planta incubadora y eventualmente la salud de las reproductoras. Salvo el tracto digestivo y la piel, el restode los tejidos aviares en condiciones normales debe ser bacteriológicamente estéril, así que el aislamientobacteriano a partir de cualquier órgano fuera del tracto digestivo es relevante, particularmente si la bacteriaaislada es causa conocida de enfermedad, como en los casos de Escherichia coli, Salmonella sp,Avibacterium (Haemphilus) paragallinarum, Pasteurella multocida, Ornitobacterium rhinotracheale y

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Staphylococcus aureus. En aves mayores se recomiendan estudios bacteriológicos del tracto respiratorio(tráquea, pulmón, sacos aéreos) donde se pueden aislar Escherichia coli y organismos similares conrelativa frecuencia y pueden representar los organismos complicantes de las enfermedades viralesrespiratorias aunque la literatura no los reconozca como patógenos primarios, como Gallibacterium anatis(Pasteurella haemolytica), Bordetella avium y algunos cocos gram positivos. En las plantas deprocesamiento el interés principal es el aislamiento de bacterias potencialmente patógenas para elconsumidor, como Escherichia coli, Salmonella sp, Campylobacter sp, Listeria monocytogenes yStaphylococcus aureus.

Las pruebas de virología más frecuentemente usadas en avicultura utilizan el aislamiento en embrión depollo, para virus como Influenza Aviar, Enfermedad de Newcastle, Bronquitis Infecciosa, LaringotraqueítisInfecciosa y Viruela Aviar; la presencia de anticuerpos en embriones de parvadas que no son libres depatógenos específicos (LPE ó SPF por sus siglas en ingles) puede dificultar el aislamiento viral en embrión,particularmente en los casos de Adenovirus, Reovirus e Infección de la bolsa de Fabricio. Existe también elsistema de cultivos celulares primarios, líneas celulares establecidas o cultivo de órganos para cierto tipo devirus de crecimiento difícil. Las pruebas de aislamiento viral usualmente se realizan a partir de tejidos deaves seleccionadas para tal fin, pero también pueden realizarse a partir de hisopos traqueales o cloacales,alimento, equipo o instalaciones. El aislamiento viral de algún agente en parvadas que no se vacunaroncontra dicho agente usualmente es de elevado valor diagnóstico (salvo en el caso de algunos Reovirus,Enterovirus y Adenovirus no patógenos); en parvadas vacunadas en condiciones normales el virus vacunal desaparece en un período de 8 días, sí el aislamiento es positivo después de éste período es probable queel aislamiento sea den virus de campo y/o que la cepa vacunal no ha podido ser controlada por la parvada.Es necesario identificar y tipificar los aislamientos virales para conocer el serotipo y/o subtipo de virusaislado, generalmente este proceso se hace con pruebas de virus suero neutralización utilizando antisuerosmono específicos monoclonales y posteriormente usando embriones de pollo o cultivos celulares; en elcaso de los aislamientos del virus de la Enfermedad de Newcastle, por ejemplo, es necesariala caracterización del aislamiento mediante las pruebas de tiempo de mortalidad embrionaria, índice depatogenicidad intracerebral en pollos de un día e índice de patogenicidad intravenosa en pollos de 6semanas. En general, para la mayoría de los virus aviares es difícil de determinar sí el virus aislado tiene ono un origen vacunal.

En la Figura 8 se presentan algunos ejemplos de los resultados de aislamiento de microorganismos.

Figura 8: Ejemplos de los resultados de aislamiento viral, aislamiento bacteriano y aislamiento micológico.

Es posible detectar la presencia de microorganismos sin que se lleve a cabo su aislamiento, demostrandosus antígenos en tejidos, improntas, líquidos corporales o macerados de órganos. La presencia deantígenos puede realizarse con antisueros específicos marcados con sustancias que después pueden servisualizadas en un microscopio, como en los casos de la inmunofluorescencia y la inmunoperoxidasa(Figura 9); estas técnicas son cualitativas y la especificidad de los antisueros utilizados permite identificarcon certeza subtipos antigénicos o cepas variantes, como en los casos de Bronquitis Infecciosa e Infecciónde la bolsa de Fabricio. Existe una técnica de ELISA llamada "de captura" que detecta antígenos a partir demuestras de líquidos corporales o de macerado de órganos, como la detección del antígeno p-27 de losvirus del grupo Leucosis - Sarcoma o de los antígenos del virus de la Infección de la bolsa de Fabricio.

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Figura 9: Detección de antígenos en las muestras por Inmunoperoxidasa (A) y por Inmunofluorescencia (B)

RELACION ENTRE VARIAS PRUEBAS: AISLAMIENTO MICROBOLOGICO Y SEROLOGIA

Existen ocasiones en que los resultados de dos pruebas para la detección de un mismo agente no sonconcordantes, estos es especialmente frecuente entre las pruebas de aislamiento microbiológico y laspruebas de serología. En los estadíos iniciales de la enfermedad (7 días) es mas factible obtener unaislamiento microbiano y no detectar presencia de anticuerpos en las mismas aves; conforme transcurre laenfermedad (después de 14 días) es mas probable detectar seroconversión y la probabilidad de obtener unaislamiento microbiano se reduce, ya que la concentración del microorganismo en los tejidos tiende adisminuir. Existe un período crítico, conocido como "periodo de ventana" donde es muy probable que tantolas pruebas de aislamiento microbiano como las pruebas de serología sean negativas, en animalesrealmente infectados (Figura 10). Es en estos casos donde es vital conocer la naturaleza de la enfermedad yla etapa de la infección en la que las muestras son obtenidas para interpretar los resultados con precisión.

Figura 10: Relación entre el aislamiento del agente y la detección de serología positiva en un proceso deenfermedad.

5.- Pruebas de Biología Molecular: Los métodos más modernos para la detección de patógenos aviaresutilizan la tecnología de la biología molecular y se basan en la detección del material genético (ácidodesoxirbonuleíco ó DNA y/ó ácido ribonucleíco o RNA) del agente. Para poder realizar la identificación serequiere tener una cantidad suficiente de material genético, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR porsus siglas en ingles) permite amplificar la cantidad de DNA hasta niveles detectables, posteriormente laidentificación específica del material genético se puede realizar por diferentes técnicas. Estas técnicas sebasan en la detección de una porción altamente específica del genoma de los microorganismos. Lasventajas de estas técnicas incluyen su rapidez, su alta sensibilidad y la posibilidad de tipificación de losmicroorganismos. Las desventajas de estas técnicas incluyen su costo, su elevado nivel de tecnología, lacomplejidad en la conservación de las muestras, y el requerir del conocimiento previo del material genéticode los microorganismos. Con estas técnicas no pueden determinar la viabilidad del microorganismodetectado. Existen pruebas para la detección y pruebas para la tipificación de los microorganismos. Laspruebas de detección incluyen PCR, RT-PCR, PCR en Tiempo Real y PCR Anidada.

En las pruebas clásicas de PCR, un fragmento conocido del DNA se amplifica e identifica. La identificaciónse realiza por tamaño y peso molecular en geles de agarosa teñidos con bromuro de etídio; se handesarrollado sistemas de detección para una gran cantidad de agentes infecciosos como los virus de laEnfermedad de Marek, Laringotraqueitis Infecciosa y Adenovirus Aviar (Figura 11). La identificación delfragmento de DNA amplificado también puede hacerse por hibridación con una sonda marcada fácilmenteidentificable ("dot-blot"), por ejemplo para Mycoplasma. En la prueba de RT-PCR el genoma de los virus RNAes convertido en DNA con una enzima Retrotranscriptasa (RT), para posteriormente ser amplificado, porejemplo, para Influenza Aviar, Enfermedad de Newcastle, Bronquitis Infecciosa, Infección de la bolsa de

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Fabricio y Reovirus. En la Prueba de PCR en Tiempo Real, la prueba es cuantitativa, tiene mayor sensibilidady la detección de los fragmentos amplificados es inmediata, sin el uso del paso de separación eidentificación en geles de Agarosa, por ejemplo para el virus de Influenza Aviar. La prueba de PCR Anidada("nested" PCR ó nPCR) es una doble prueba de PCR, donde la segunda reacción de PCR usa como patrónel producto amplificado de la primera reacción de PCR ("amplicón"), lo que aumenta la sensibilidad y puedehacer la prueba cuantitativa; la prueba de PCR Anidada puede utilizarse para tipificar algunos virus y se hautilizado para la detección del Pneumovirus Aviar y para la identificación de los subtipos A y B del mismo.

Figura 11: Prueba de detección por PCR y separación de los segmentos amplificados en gel de agarosateñidos con bromuro de etidio, la identificación de los fragmentos se hace por peso molecular.

Las pruebas de tipificación molecular son capaces, además de identificar al microorganismo, de tipificarlo yclasificarlo. En la prueba del Análisis del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción(PCR-RFLP), el DNA amplificado es cortado con diferentes enzimas de restricción y el patrón de los cortes secompara con un patrón conocido de un agente en particular, esta técnica ha sido muy utilizada para identificarlas cepas variantes de los virus de Bronquitis Infecciosa e Infección de la bolsa de Fabricio. En la prueba deAnálisis de DNA Polimorfo Ampliado al Azar (PCR-RAPD) el DNA es ampliado en pequeños fragmentos quetambién son separados por electroforesis para obtener un patrón de bandas que se compara con un patrónconocido; se utiliza para microorganismos con DNA más complejo, por ejemplo, para diferenciar Mgallisepticum de M synoviae.

La secuenciación genética es la prueba más específica, En esta prueba el material genético es amplificado yposteriormente es analizado para identificar el orden de los nucleótidos que lo componen, utilizandonucleótidos marcados con fluoro cromos. Posteriormente estas secuencias son comparadas consecuencias conocidas del microorganismo para determinar qué grado de similitud genética existe entreellos y así poder clasificar al microorganismo identificado; generalmente la comparación se hace consecuencias conocidas publicadas en Internet, como el banco de secuencias NCBI (National Center forBiothecnology Information).

Que permiten comparar la secuencia obtenida con secuencias de todo el mundo de manera rápida y sencilla(Figura 12). Para realizar estas comparaciones es necesario el uso de programas bio- informáticos quecomparan y agrupan estas secuencias en función de sus similitudes. La forma gráfica más sencilla derepresentar las similitudes de todas las cepas comparadas es un árbol filogenético (Figura 13).

Figura 12: Secuenciación de la región hipervariable del gene de la Proteína VP-2 del Virus de la infección dela Bolsa de Fabricio para la clasificación de las cepas del virus

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Figura 13: Relación filogenética de aislamientos del virus de Bronquitis Infecciosa por comparación de lassecuencias del gene S-1

5. Pruebas de Bromatología y Análisis Químicos: un programa de Sanidad Avícola debe incluir el control de lacalidad de los alimentos y de los ingredientes usados en su elaboración; este control también debe serperiódico y constante. Cada empresa deberá fijar sus propios parámetros de calidad que deberán ser

respetados en la planta de alimentos (Figura 14). Es importante la selección adecuada de las muestras para análisis, así como su volumen. Un muestreorepresentativo implica la colección de varias muestras en forma seriada; posteriormente todas las muestrasson mezcladas y homogeneizadas y se colecta una sub muestra, pudiéndose repetir el proceso hastareducir la muestra hasta un volumen adecuado para el análisis, que puede requerir de unos cuantos gramosde muestra final. El análisis bromatológico usualmente incluye los porcentajes de proteína cruda, grasacruda, cenizas, humedad, elementos libres de nitrógeno, calcio, fósforo y sal y los resultados obtenidos en elanálisis del alimento deben coincidir con los valores teóricos formulados para cada ración; las pruebas demezclado se hacen con un componente de la ración de baja concentración, como cenizas, cloruros, fósforo o

algún aditivo o medicamento, el coeficiente de variación en la concentración del componente deberá serinferior al 10%. En el caso de los granos, se deben especificar sus características para ser utilizados, elporcentaje de humedad deberá ser menor al 14%, un peso específico de 0.76-0.78, el porcentaje de granoquebrado debe ser m enor al 3% y el porcentaje de impurezas debe ser menor al 1%; además la muestradebe estar libre de contaminación con plaga viva y en el caso del sorgo, la cantidad de taninos debe sermenor a 0.6%.

Figura 14: Determinación de la concentración de proteína y del perfil de aminoácidos con el Sistema deEspectroscopia de Reflactancia del Infrarrojo Cercano (NIR).

6.- Pruebas de Toxicología: Los análisis toxicológicos se utilizan para garantizar la inocuidad de los

ingredientes para la fabricación de alimentos, en los alimentos para las aves y en los productos avícolasdestinados al consumo humano, particularmente carne de pollo y huevo. Existe una gran cantidad deanálisis toxicológicos que pueden detectar concentraciones muy pequeñas de residuos tóxicos, del orden depicogramos o nanogramos, como las espectrometrías de masas, la espectrometría infrarroja y laespectrometría de absorción atómica, así como las cromatografías de gases y de líquidos de alta resolución.Con el uso de estas técnicas se obtiene mayor sensibilidad, mayor precisión y mayor repetitividad, paragarantizar la inocuidad alimentaria y las exigencias del comercio internacional. Son especialmenteimportantes para la detección de micotoxinas, metales pesados, dioxinas, hormonales, beta agonistas yresiduos de antibióticos, para que los productos agropecuarios puedan cumplir con las especificaciones

descritas en el Codex Alimentarious para la comercialización internacional de los mismos.

Un factor de calidad importante es la concentración de micotoxinas y debido a que la concentración de lasmismas puede ser muy variable dentro de un mismo lote, se requiere de un sistema de muestreo ymezclado de las muestras que garantice la representatividad de los resultados. Las técnicas actuales parael "monitoreo" de micotoxinas en granos y alimentos incluyen el uso de columnas de inmunoafinidad yfluorometría, ELISA y cromatografía en capa fina o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sussiglas en inglés) (Figura 15). El establecimiento de los valores máximos permitidos para cada micotoxina esun asunto que aún es motivo de controversia y únicamente existe legislación oficial para aflatoxinas, por lo

que también en este caso cada empresa, por medio de análisis constantes y secuenciales, deberáestablecer sus propios parámetros de acuerdo a sus necesidades y posibilidades; para sorgo y maíz se hansugerido los siguientes valores como máximos permisibles en una muestra: 20 ppb de aflatoxina total, 100ppb de ochratoxina total, 150 ppb de Toxina T-2, 500 ppb de Zearalenona, 1500 ppb de Vomitoxina (DON) ynegativo a la presencia de esclerocios por flotación y de alcaloides de Ergotamina en prueba cualitativa.

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Figura 15: Detección de aflatoxinas con la técnica de Cromatografía de Liquidos de Alta Resolución (HPLC)

SISTEMA DE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD Todos los laboratorios deben de contar con un Sistema de Aseguramiento de Calidad que constate la

confiabilidad de los resultados, incluyendo Políticas de Calidad, Control de Calidad en insumos, equipos yprocesos, uso de patrones de referencia y trazabilidad de los sistemas de medición y procedimientos dereconfirmación de resultados. Puede haber discrepancias entre los resultados obtenidos y los esperados,eventualmente pueden presentarse errores en los análisis.

El procedimiento de reconfirmación de resultados tiene cuatro pasos que pueden realizarse de manerasecuencial o simultanea, y son los siguientes: a) Repetición del análisis con la misma muestra y la misma técnica. b) Realización del análisis con la misma muestra y con una técnica alternativa (confirmatoria)

c) Realización del análisis con la misma técnica y con muestras nuevas (usualmente se incrementa elnúmero de muestras) d) Realización del análisis con una técnica alternativa y con muestras nuevas (usualmente se incrementa elnúmero de muestras). No existe ninguna prueba que sea 100% infalible.

Los errores en un resultado pueden ser atribuidos a los procedimientos del análisis, a las características dela muestra o al sistema de muestreo utilizado. La mayoría de los investigadores coinciden en señalas que elprocedimiento de muestreo es el factor más importante que afecta la confiabilidad de un resultado de

laboratorio.

Un Resultado Falso Negativo, es decir, un resultado erróneamente negativo en una muestra positiva puedeser debido a los siguientes factores: La prueba usada tiene una sensibilidad baja; error en el tiempo demuestreo (un muestreo precoz o un muestreo tardío); muestra no representativa: número inadecuado demuestras, selección inadecuada de las muestras; concentración baja del agente en la muestra; inactivacióndel agente en la muestra.

Un Resultado Falso Positivo, es decir, un resultado erróneamente positivo en una muestra negativa puede

ser debido a los siguientes factores: La prueba usada tiene una especificidad baja; contaminación cruzadade la muestra durante el muestreo; contaminación cruzada entre las muestras; contaminación de la muestraen el laboratorio; reacciones cruzadas por agentes similares; reacciones inespecíficas.

RECOMENDACIONES FINALES

Use el Laboratorio de manera preestablecida, periódica y rutinaria Correlacione los resultados conlos antecedentes sanitarios y epidemiológicos de la empresa; con el comportamiento clínico yproductivo de las aves; con las medidas de bioseguridad, manejo, alimentación y nutriciónutilizadas y con la calidad genética de las aves. Forme un banco de información de resultados y establezca los "parámetros normales oesperados" de acuerdo a las características de la explotación. Evalúe periódicamente los programas de Sanidad Avícola utilizados en su empresa. Use el Laboratorio cuando lo considere necesario. Seleccione, tome y conserve las muestras para análisis de acuerdo a las recomendaciones de su

Laboratorio.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA 1) - A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, Fourth Edition, 1998. Editedby D. Swaine, J. Glisson, M. Jackwood, J. Pearson and W. Reed. Published by The American Association ofAvian Pathologist, University of Pennsylvania, USA. 2) - Avian Histopathology, Third Edition, 2008. Edited by O. Fletcher. Published by the American Association of

Avian Pathologist, University of Pennsylvania, USA, 3)- Diseases of Poultry, eleventh edition 2003, editor in Chief Y.M. Saif, Iowa State Press, USA 4) - Grain Inspection Handbook. U. S. Department of Agriculture. Grain Inspection, Packers and StockyardsAdministration. Federal Grain Inspection Service, 1997. 5) - Long, P., B. Millard, L. Joyner and C. Norton: A guide to laboratory techniques used in the study anddiagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria. Latina VI: 200-217, 1976 6) - Manual de ProcedimientosTécnicos de Laboratorio, 5° Edición 2007. Editado por MVZ J.C. Valladares, 2007, Laboratorio de Control deCalidad y Patología Aviar, PAPSA, 7) - NCCLS. Performance Standars for Antimicrobial disk and DilutionSusceptib ility Test for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard. NCCLS Document M31A (ISBN 1-

56238-37739), 1999. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA. 8). NOM-003-ZOO-1994. Criterios para la operación de laboratorio de pruebas aprobado en materiazoosanitaria. 9)- NOM-056-ZOO-1995, Especificaciones técnicas para las pruebas diagnósticas que realicen loslaboratorios de pruebas aprobados en materia zoosanitaria.

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10) - Officials Methods of Analysis of A.O.A.C. International, 17ª Ed.2002. Edited by Dr. William Horwitz. AOACInternational, USA 11) - OIE Manual of Diagnostic Test and and vaccines of terrestrial Animals 5TH Edition, 2004 12)- Tejada, I.: Control de Calidad y análisis de alimentos para animales, Ed. Trillas. México, 1992.

13) - United States Pharmacopeia, the National Formulary, USP 27 NF22, 2004 the United StatesPharmacopeial Convention, Inc, USA

PRESENTADO EN EL CURSO DE INTEGRACION DEL DIAGNOSTICO EN LA INDUSTRIA AVICOLAY CURSO DE PATOLOGIA COMPARADA DE AVES COMERCIALES Y ESPECIES NOCONVENCIONALES DE LA ASOCIACION NACIONAL DE ESPECIALISTAS EN CIENCIAS AVICOLAS DE

MEXICO (ANECA) EL 02-02-2009

Autor/es

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

22/06/2010 | Juan Carlos

te felicito por el articulo y por hacer notar la importancia del uso del laboratorio de

diagnostico en nuestra profesion, esta manera de trabajar demuestra el profesionalismo y

la etica de un buen MVZ, debemos usar todas las herramientas disponibles para

diagnosticar y tomar las desiciones necesarias para prevenir, erradicar o evitar la

propagacion de las enfermedadez infecciosas o virus dentro del sector agricola de

produccion animal

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

22/06/2010 | Felicitaciones por el articulo, tengo casi 15 años de experiencia en

Laboratorio de Diagnóstico de Patología Aviar en la empresa privada y considero que ha

hecho una muy buena explicación de la importancia de nuestro trabajo para la industria

avícola, le agradezco su contribución al respecto.

Slds. cordiales,

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

23/06/2010 | Excelente articulo, bastante detallado de lo importante que es el Laboratorio

de diagnóstico para Confirmar o detectar algún problema de salud sanitaria en las aves.

Mis sinceras felicitaciones, y se que muchos que lean este articulo aprenderan algo nuevo

y de utilidad de él.

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

23/06/2010 | Excelente articulo,ha resaltado en forma resumida y completa las actividades

Juan Carlos ValladaresMexico, México

Medico Veterinario Zootecnista, Maestro en Cie…

(11966) (8)

Francisco A GomezDallas, Texas, Estados Unidos de América

Médico Veterinario Zootecnista

Smithfield Beef Group - MOPAC

(1) (0)

Hector MontillaGuayaquil, Guayas, Ecuador

Médico Veterinario

(1) (0)

Julio CastrellónCiudad de Panama, Panama, Panamá

Bioquímico

Grupo Melo

(0) (0)

IrisjustacaraMaracay, Aragua, Venezuela

Médico Veterinario

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que en forma continua realizamos en el area de diagnostico a nivel de empresa .sin dejar

atras la importancia de cada uno de los analisis realizados. Saludos

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

01/07/2010 | Felicitaciones a el autor de el artículo, ya que está muy completo y leyendolo

detenidamente, aclara muchas dudas siempre es de gran ayuda el laboratorio,

especialmente en la serologia y titulos de anticuerpos para evaluar el estado sanitario y de

defensas de la parvada, para poder lograr planear unos planes vacunales mas exactos me

gustaría comentara´mas sobre el coeficiente de variacion, para determinar la uniformidad

serológica de el lote ó si es respuesta vacunal ó de campo.

Muchas gracias, Danilo Agudelo

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

03/07/2010 | Realmente DR. le felicito por tan explícito artículo en el cual se resume la

labor que realizamos los Laboratorios de Diagnosticos y se le da la importancia requerida

como Herramienta para el Control de Enfermedades zoosanitarias desde todos los puntos

de vista, bacteriano, micologico, viral, perfiles serologicos , auditorias de incubadoras,

ananlisis moleculares, entre otras. Dios permita que muchos Técnicos profesionales

puedan leer este articulo para que se le de el valor al Diagnóstico en las operaciones

avicolas y se den cuenta que mas que un gasto es una gran inversión.

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

13/07/2010 | Para felicitarle por el importante artìculo, en el que realza la herramienta de

ayuda para los profesionales de la producciìon ,como es el trabajo de los laboratorios yà

que pueden analizar los resultados, las tendencias y tomar sus desiciones mejor

encaminadas.

Re: Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio

21/07/2011 | Muchas gracias por su articulo, me parece muy interesante, y me gustaría

preguntar a usted y a los compañeros foristas, desde el punto de vista practico, para hacer

un análisis de Síndrome de Baja Postura (EDS) ¿Cuál es su recomendación para elegir la

mejor prueba de laboratorio y por qué?

Apreciaría mucho sus comentarios. Gracias

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Danilo Jose AgudeloSan Jose de Cucuta, Norte de Santander, C…

Ing. Zootecnista

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Delida BarbozaVenezuela

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Jenny Pinto HigashiArequipa, Arequipa, Perú

Biólogo

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Rico Pollo

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Josaffat GalazTepatitlan de Morelos, Jalisco, México

Médico Veterinario Zootecnista

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15/01/14 Elementos requeridos para un diagnóstico de Laboratorio - Engormix

www.engormix.com/MA-avicultura/manejo/articulos/elementos-requeridos-diagnostico-laboratorio-t2905/p0.htm 16/16

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