Electroforesis Método de laboratorio

en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas (ácidos nucleicos, proteínas) según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

Técnicas

• Northern blot: separación de moléculas de ARN transferencia a una matriz se fija

• Southern blot: separación de moléculas de ADN transferencia a una matriz se fija

• Western blot: separación de proteínas transferencia a una matriz se adhiere anticuerpo específico se fija

Procedimiento General A) Cultivo tisular

B) Lisado celular y obtención de proteínas. C) Electroforesis en gel de poliacrilamida . D) Transferencia de las proteínas a un papel de nitrocelulosa. E) Incubación del papel con suero del paciente. F) Si existen anticuerpos para el Antígeno en el suero, éstos se unirán fuertemente a las proteínas transferidas al papel y se detectarán como bandas oscuras (f).

Procedimiento General

Los anticuerpos primarios pueden detectarse a través de dos métodos:1) Usando proteína A o proteína G2) Con la participación de un segundo anticuerpo

Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que se aislan de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La proteína G tiene una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A.

Anticuerpos secundarios:

-Anticuerpos anti-anticuerpos

-Anticuerpos monoclonales

-Fragmentos Fab2, producidos mediante digestión con pepsina de los anticuerpos puros

Ensayo de transferencia Western para VIH

Es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la detección in vitro de anticuerpos frente a los virus de VIH-1 y VIH-2, en suero o plasma humanos.

Es más especifico para la detección de VIH en plasma o suero.

Se utiliza electroforesis y electrotransferencia para la adhesión de antígeno vírico del VIH-1.

Péptido sintético específico contra VIH-2.

Control interno para reducir el riesgo de falsos negativos.

Principios quimicos y biologicos

Componentes del kit

• Tiras de nitrocelulosa• Control no reactivo• Control reactivo fuerte• Control reactivo debil• Tampón de blotting concentrado (10x)• Tampon de lavado concentrado (20X)• Conjugado• Sustrato• Polvo de blotting

Control de Calidad Debe cumplir con las siguientes

condiciones:Control no reactivo: no bandas específicas

de VIH1 u VIH2. la banda control debe ser visible.

Control reactivo fuerte: todas las bandas de peso molecular que corresponda deben ser visibles.

Control reactivo débil: medida de sensibilidad del kit. Las bandas del control de suero deben ser visibles.

Interpretación de los resultados

• Tiras deben estar completamente secas.

• Se determina comparando cada tira de nitrocelulosa con las tira de control de ensayo con los controles No reactivo, Reactivo Fuerte y Reactivo Débil.

• Algunos antígenos derivan de las mismas proteínas precursoras y pueden tener epitopos superpuestos.

Verificar que la banda de control del suero sea visible

Identificacion del peso molecular de cada banda de la tira de analisis utilizando como guia las tiras de control reactivo Fuerte, Debil o ambos.

Interpretacion de las tiras de analisis según las autoridades pertinentes.

PMENV GEN Antígeno Descripción

Gp 160 ENV Forma polimerica de la gp41

Ancha y difusa de glucoproteina

Gp 120 ENV Membrana externa

Difusa de glucoproteina

p66 POL Transcriptasa inversa

Banda discreta

p55 GAG Proteina precursora

Banda discreta

p51 POL Transcriptasa inversa

Banda discreta justo por debajo de p55

p39 GAG Fragmento de p55 Banda discreta

gp41 ENV Transmembrana Difusa de glucoproteina

p31 POL Endonucleasa Doblete

p24 GAG Proteína central (core)

Banda ancha

p17 GAG Proteína central (core)

Banda ancha

Todas las bandas deben ser detectadas e interpretarse como Negativo, Positivo o Dudoso.

Patron Interpretacion

Ninguna banda virica especifica presente

Negativo

Deteccion de anticuerpos p17 unicamente

Negativo

Deteccion de dos ENV y GAG o POL VIH-1 positivo

Deteccion de dos ENV y GAG o POL y banda especifica de VIH-2 visible

VIH-1 positivo con VIH-2 señalado

Cualquier banda virica especifica presente, pero el patro no cumple con los patrones de positivo

Dudoso

Cualquier banda virica especifica presente ,pero el patron no cumple los criterios para positivo con una banda especifica de IH-2 visible

Dudoso con VIH-2 señalado