UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

SEMINARIO DE INVESTIGACION I1

\\ APLICACION DE ANTIMICROBIOGRAMAS EN AEROMONAS AISLADAS DE TILAPIA

(Oreochromis aureus 1 ’/

ELABORADO POR: CONTRERAS ANA MARIA

MAGOS GUERRERO HUMBERTO

Qy-7

AGOSTO DE 1993

OBJETIVO GENERAL:PURIFICACION E IDENTIFICACION DE AEROMONAS Y E.COL1

EN MUESTRAS DE LIQUIDO PERITONEAL DE TILAPIA

OBJETIVOS PARTICULARES:

- IDENTIFICACION DE Aeromona hsdrophilla y E. coli.

- EVALUAR LA RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD DE 3 DIFERENTES

ANTIBIOTICOS EN LAS CEPAS DE LAS BACTERIAS AISLADAS.

U. A. M. IZTAPALAPA BlflllCFTECA

INTRODUCCION

I

El desarrollo de la acuacultura durante los últimos años puede ser atribuible a un número de factores preliminares relacionados con el repoblamiento y la provisibn de alimento para el consumo humano. Diferentes especies son cultivadas, varias de las cuales represent,an 1.1n alto valor económico (Allen-Austin, et al 1985a). Sin embargo uno de los principales prgblemas que se presenta en esta actividad son las enfermedades. El mal mane.jo o manejo exagerado.de los organismos aunado a un mal manteni.miento de la calidad del agua puede ser propicio para dar comienzo a un ciclo de enfermedades por cualquier organjsmo patSgeno, entendiendose p o r este cualquier agente capaz de in\.adir y multiplicarse en un organismo superior: guiando este fenómeno de parásitismo a ua enfermedad (Jones, et al., 1985).

En particular las enfermedades bacterianas son responsables de grandes mortalidades, existiendo 25 genéros principalmente de bacterias patógenas de peces de agua dulce y marina, algunos de estos genéros son: Streptococus, Acinobacter, Flaviobacter, Pseudomonas, Aeromonas, etc., (Allen-.\ustin et al., 1985b).

La mayoría de l p s pat6genos muestran una preferencia por ciertas especies y ciertos organos (organotropismo). P o r e.iemplo Aeromona hydrophila es patógeno solo de peces de agua dulce, encontrandose en riñon, liquido peritoneal y sangre. P o r otro lado Pseudomonas sp. tiene igual prefencias por estos mismos organos, pero unicamente ataca a peces del grupo de los salmonidos (Li Shaoqi, 1980; Allen- Austin, et al., 1985a: Roberts, 1981.). Las bacterias patógenas tiene una alta adaptabilidad a los cambios ambientales propiciando la invación de éstas a l o s organismos debido al aumento de su potencial patógeno que se acti\,a cuando estos cambios les son favorables. Por otro lado existe rtn grupo de bacterias que invaden y producen enfermedades s ó l o cuando concurren causas predisponentes de orden metabólico o estructural ya sea de naturaleza congénita o adquirida, que a l d i s m i n t i i r el vigor de los mecanismos de defensa, hacen favorable el terreno para que estas (bacterias oportunistas), penetren en los te.jidos, sobre todo cuando 10s organismos se encuentran en un estado de estress. que ciertas bacteria como Aeromonas y Pseudomonas aprovechan. El papel que han estado expresando como patógenos de los peces, atribuido por su habilidad de causar pequeñas lesiones en la superficie, ulceraciones en e l tegumento, enrojecimiento del abdomen, absesos. Internemente causan inflamaciones del intestino, hemorragias locales ;y septisemia, la cual es indiferenciable si es provocada por Aeromonas y Pseudomonas (Bullock, 1964; Roberts, 1981; Allen-Austin, 1985a).

El método que se utiliza en laboratorio "in vitro", para estimar la sencibilidad o resistencia de una cepa bacteriana a los antimicrobianos es por medio de antimicrobiogramas. La suceptibilidad o resistencia puede s e r una cualidad de especie, cuando los procesos fisiológicos de los microorganismos correspondientes s o n interferidos por un compuesto químico o invulnerables a él.

I

‘rambi4n puede ser atributo de ciertas cepas de indic-fiduos ql.le manifiestan una conducta opuesta al comportamiento de la especie o cepa a c11ue pertenecen. Esta cond~~lcta singular se espl ica p o r fencimerios biol6gicos de mutación trasdllcción o con.jugacionc:s 2ent;ticas ( I ? í S S , 1 9 6 8 ) .

ANTECEDENTES

?íuchos de 1.0s t raba. ios que se han venido realizando en rnicrobiología de ecosistemas acuáticos han sido conernientes c o n l a detección de microorganismos patógenos usados como indicadores de l a calidad del agua, siendo así identificables or,ganismos que son potencialmente peligrosos para la salud pública y para organjsmios del mismo sistema a c u i i t i c o ,

Dentro de los traba.jos realizados en la identificación de las principales bacterias p¿Lt6genas de los peces y sus mecanismos de invasión ha sido est\ttl.iado por Allen-Austin, et al., (1985a); Allen- Austin et a1.,(1985b), l o s cua les han reportado 25 géneros como

. principales patógenos de l o s peces dentro de éstos se encuentran Aeromonas y Pseudomonas. Trabajos paralelos y posteriores a éstos se refieren a la investigación sobre la producción de enterotoxinas de las cttales han s i d o aisladas de diferentes organismos entre ellos de l o s peces, provando su actividad en ratones recien nacidos y en cone.jos Boulanger, et. al., 1977; Dubey .v Sanyal, 1979; Kaper, et al., 1981; Burke et al., 1 9 8 1 a 1983a; Allen- Araujo, et al., 1985; Pathak et. a l 1988). De la cepas de peces moribundos, se encontro que las enterotoxinas presentan una actividad hemolítica, proteolítica y una actividad citotóxica (Roulanger, et al., 1981).

Debido a la potencialidad patógena de la bacteria y sus efectos, se han empleado I I ~ H %ran variedad de antimicrohianos para mitigar o inhibir el crecimiento de estas bacterias, aplicandose diferentes métodos para determinar la concentración míniqma de inhibición (mic). de los antibacterianos y posteriormente probar su sensibilidad y resistencia de las bacterias a éstos. Los métodos empleados son sólidos; l í q u i d o s ; cambios en el pH que dependen de la habilidad de que un organismo fermente carbohidratos usualmente glucosa; el método de conductividad relativa; la detección del crecimiento de l as bacterias, usando ATP-dependiente de la bioluminisencia, ha sido también desarrollado para el estudio del efecto de agentes antimicrobianos (Allen-Austin, et al., 1985: Piddock, 1990).

Algunos grupos de bacterias gram-negativos presentan similares patrones de resistencia a los antibióticos a pesar de ser aisladas de diferentes ambientes, encontrhdose que la resistencia de estas bacterias no es al azar de una manera sistemática. Esto puede resultar de similares exposiciones a antibióticos y por lo tanto a similares presiones de selección; siendo posible que existan algunas interacciones entre ~ s t , a s diferentes bacterias como puede ser la transmición del factor R. e l cual es bien c o n o ~ d o entre E. coli y Psudomonas (Kelch, et al., 1978).

En el estudio de antibiogramas para estas bacterias se k ~ a encontrado que Pseudomonas s o n resistentes a la pe>nicilina, tetraciclina Y sensitivas al carbenicilina, amikacina, tobramicina y colistina de cepas aisladas de aqua dulce y marina, encontrandose que 1.a resistencia a estos antibióticos en ambos ambientes esta ligado a 10s niveles de contaminación fecal (Vicent, et al., 1990 1 . Pa 1' a Aeromonas se han probado diferentes antibióticos para v e r su sensibilidad y resistencia a kstos, se ha encontrado que es resistente a penicilina , ampicilina y sencibles a tetraciclina, colistina y gentamicina (Yelnick, et al 1 9 9 0 ) . En el caso de salmonella la resistencia a agentes antimicrobiales depende del antibiótico y origen de la cepa, encontrándose que es sensible a ácido nalidixic0 y sefalotina, y un 90 % fue sencible a tetraciclina. Estas cepas fueron aisladas de diferentes ambientes acuciticos (Moriñigo, et al., 1990).

JUSTIFICACION

La mayoría de los cultivos de peces se enfrentan'al problema, de las enfermedades causadas por bacterias, debido a que por lo general no se toman medidas preventivas de sanidad acuícola, l o cual pr'opicia el florecimiento e invación de determinados grupos de bacterias, entre las que se encuentran: Aeromonas y Enterobacterias que son objeto de estudio de este proyecto.

En México no se han realizado trabajos referentes a la presencia e identificación de estos grupos de bacterias como patógenos en tilapia. Siendo importante realizar este tipo de estudios que una ves identificada l a bacteria o bacterias permite dar un diagnostico para aplicar el tratamiento más adecuado o específico haciendo uso d e antimicrobioqramas. El uso de l o s antibióticos ha sido basicamente enfocado para aquel las bacterias patógenas del hombre, aplicándolos con baja frecuencia en enfermedades de animales y sobre todo en peces, de ahí que se haya decidido probar tres diferentes antibióticos (ampicilina, estreptomicina y cloranfenicol) en tilapia, por su gran demanda en el consumo humano y su importancia económica,

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AREA DE ESTUDIO

L a s muestras d e peces y a g u a f u e r o n o b t e n i d a d d e u n o d e l o s m o d u l o s e j i d a f l e s q u e c o n f o r m a n l a Un idad de P roducc ión Acu íco la "Las F u e n t e s " .

L a g r a n j a d e p r o d u c c i ó n se u b i c a e n e l m u n i c i p i o d e J i u t e p e c . Mor., a l o s 99 0 7 d e L a t i t u d N o r t e y 18 52 d e L o n g i t u d o e s t e ( F i g , 1 ) . E l a c c e s o a l c e n t r o d e p r o d u c c i ó n e s p o r car re te ra pav imen tada 1;A

c u a l e n t r o n c a c o n l a c a r r e t e r a C u a u t l a - Z a c a t e p e c , q u e a s u \Tez p a r t e d e La ca r r e t e ra Cuernavaca -Yau tepec en e l K m . 7 . Donde aproximadamente a 2 K m . se e n c u e n t r a e l modu lo de p roducc ión .

E l clima d e l a zona es s e m i c á l i d o - subhumedo con l luv iuas en v e r a n o c o n u n a p r e s i p i t a c i ó n m e d i a m e n s u a l d e 2 5 c m . e n l a época de l l u v i a s .

E l modulo cuenta con 10 e s t a n q u e s s e m i r ú s t i c o s c o n u n a s u p e r f i c i e d e O . 1 H a cad,a uno. ' E l s u m i n i s t r o - d e a g u a es tomado tie un m a n a n t i a l p e r m a n e n t e , u b i c a d o a 1 . 5 Km. d e d i s t a n c i a d e l a g r a n j a , e n l a mayor pa r t e d e l t r a y e c t o e l agua se e n c a u z a p o r u n c a n a l a c i e l o a b i e r t o .

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MATERIAL Y METODO

Se realizaron d o s muestreos, de LOS cuales se obtubieron 5 muestras de cada uno de líquido peritoneal de tilapia. Para tomar estas se utilizaron jeringas de 3 ml. extrayendo 1 ml. de líquido tle la cavidad peritoneal del pez, depositandolo en un t u b o de ensaye manteniendo10 a baja temperatura p o r un máximo de 1 h r .

Procedimiento de purificación

Para obtener las cepas de Aeromonas las muestras de líquido se sembraron en agar GSP por 3 dias, a una temperatura de 27 C y de acuerdo al Manual de Merk ( 1 9 9 0 ) se tomo como base la coloración y morfología colonial, para obtenerlas puras se volvieron a sembrar en el mismo medio por un período de 2 4 h r s . a la misma temperatura. Una vez purificadas se sembraron en un medio de enrriquecimiento (Agar B H I ) por 2 4 h r s , para obtener un crecimiento masivo de las cepas a las cuales se les hizó la prueba de Gram y oxidaxa (ENEP- Iztacala), UNAM. y posteriormente las pruebas bioquímicas c o n la ayuda del Api 2 0 E

Para el aislamiento de E. coli se empleó el medio de cultivo EMB, sembrandolas por 2 4 Hrs. a una temperatura de 37 C y de acuerdo a su color caracteristicoa (verde metálico) puedieron ser facilmente aisladas. Identificadas de acuerdo a esta característica se resembraron en este mismo agar, siguiendo el mismo procedimiento de purificación de las Aeromonas.

Método de identificación microbial por pruebas bioquímicas

A las cepas previamente purificadas ( Aeromonas y E. coli) fueron identificadas por pruebas bioquímicas, utilizando el Api 2 0 E . , para confirmar las pruebas de Gram y oxidasa, logrando una correcta identificación de las mismas.

Procedimiento del Api 2 0 E

De las cepas de crecimiento masivo se tomo una peqeña candidad de bacterias con la ayuda de un isopo sin algodón y se depositaron en un tubo de ensaye que contenia 5 m1 de solución salina al 0.85 % agitandose para obtener una muestra homogenea y con esta solución se sembro en las tiras del Api 2 0 E , pero primeramente la base donde se guardan las tiras se llenan de agua unicamente en los pocitos que presenta para mantener un medio humedo, posteriormente con la aguda de una pipeta Pasteur se llena cada uno de los tubitos de las tiras con la solución salina que contiene a las bacterias L a s pruebas que están encerradas se llenan hasta el tope con esta solución y las que las subrayas se llenan con aceite mineral finalmente se cubren con su respectiva tapa y se etiquetan, se incuban por 2 4 Hrs. a 3 7 C.

Después de 2 4 H r s se lee el Kid, y si la glucosa es positiva más tres pruebas, se agregan los reactivos para leer finalmente las reaciones por cambio de color.

Determinación de la resistencia a los antibióticos

De ].as cepas puras del medio de enrriquecimiento, se tomo una determinada cantidad de bacterias, las cuales se disociarán en tubos de ensaye con 1 m1 de solución salina al 0 . 8 5 X hasta alcanzar una turbidez semejante al tubo No 1 de McFarland que cumple con la concentración ya establecida de 1 0 4 cfu, haciendo lo mismo para todas la muestras corno lo establece Piddock, et al., ( 1 9 9 0 ) .

Una vez obtenida la concentración deseada, el inoculo se sembro en una placa de agar Miller-Hinton por vaciado y posteriormente se colocaron 4 antibiogramas del mismo antibiótico y un testigo en cada una de las cepas. Esto se hizó para los tres diferentes antibióticos con las respectivas concentraciones empleadas ( * cloranfenico 5 pg/ml, cloranfenicol 10 pg/ml, estreptomicina 10 pg/ml y ampicilina 2 5 pg/ml). Después de 2 4 Hrs. de incubación se leyeron los antibiogramas midiendose con un bernier el tamaño del halo desarrollado por el antibiótico tanto para Aeromonas como para E. coli.

La respuesta de sensibilidad y resistencia de estas bacterias, se determino unicamente por la existencia de formación de halo el cual indicaba inhibición en el crecimiento de las bacterias, debido a que las concentraciones utilizadas no se encuentran dentro de la establecidad por el Committe National f o r Clinical Laboratory Standars (NCLLS) y el Microbiology Resource Committee. A excepci6n de la estreptomicina.

PROCEDIMIENTO DE AISLAMIENTO PRRA LAS CEPASDE !

E, COLI Y ELABORACION DE ANTIBIOGRAMRS

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Originalmente, se propuso la utilización de 3 diferentes antibióticos a concentraciones ya establecidas por el NCLLS y el Microbiology Resource Committee, debido a que ya se han determinado la concentración mínima de inhibición (MIC), Sin embargo al realizar una prueba preliminar con las concentraciones ya establecidas, Cloranfenicol a 30 pg/ml y ampicilina a 10 pg/ml 9 20 p g / m l * se encontro que el primero inhibia p o r completo el creclmlento de las bacterias y para el segundo las bacteria eran resistente, modificando por esta razón las concentraciones, las cuales fueron para ClOranfeniCO de 5 y 10 pg/ml y para ampicilina de 2 5 pg/ml, -

* Esta concentración fue sugerida por nosotro, ya que dentro de la literatura se menciona que Aeromonas es resistente a la ampicilina.

IDENTIFICACION

RESULTADOS

De un total de 12 muestras de líquido peritoneal de peces enfermos y de agua, se logró identificar hasta nivel de género, para el caso de la Aeromonas y a nivel de especie a la bacteria E. coli, (Tabla 1) observandose que en el 67% de las muestras aparecieron las Aeromonas y en un 25% E. coli. (Fig. 1 )

PORCENTAJE DE RESISTENCIA DE AEROMONAS A LOS DIFERENTES ANTIBIOTICOS

La tabla No. 2 muestra el tamaño del halo desarrollado p o r los diferentes antibióticos en las cepas de Aeromonas aisladas de peces Y- agua, mostrandose en la Fig.1 el porcentaje de sensibilidad de las bacterias a l o s antibióticos, donde se observa que la estreptomicina alcanza el mayor porcentaje de inhibición en el crecimiento de las diferentes cepas d e estas bacterias, tanto de líquido peritoneal como de agua, seguido del cloranfenicol (lO-.g/ml.). Sin embargo el tamaño del halo desarrollado por ambos antibióticos fue menor, que el desarrollado por el cloranfenicol (5-..1g/ml.), en todas las muestras, a excepción de una de agua. En la Fig. 3 se muestra que la media del tamaño del halo para cloranfenicol (5_pg/ml.) es superior que el resto de los antibióticos. En la Tabla 3 se observa que E. c,oli en todas las muestras fue completamente sensible a los antibióticos, mostrandose aún más con estreptomicina y ligeramente más resistente a cloranfenicol ( 5 - p g / r n l . l , pero en general todos los antibióticos presentaron diferente intensidad de inhibición dentro de un pequeño rango de variación para cada una de las muestras,(Fig. 4 ) .

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DISCUSION

De acuerdo a la media total de cada uno de los antibióticos (Fig.3, 3a y 4 1 , el que presenta una mayor eficiencia en la inhibición al crecimiento de las bacterias: Aeromonas y E. coli es la estreptomicina, esto posiblemente se debe a que es un antibiótico de espectro reducido, siendo más específico, La ampicilina y el cloranfenicol son considerados de amplio espectro, principalmente el primero, el cloranfenicol aunque es considerado de .amplio espectro en la practica terapéutica es considerado de espectro reducido, pero posiblemente sea menos específico como agente antimicrobial para l a s bacterias gram negativas. El cloranfenicol (lO-pg/ml,) después de la estreptomicina, presento ligeramnete un menor grado de inhibición.

El 94% -de las cepas aisladas de Aeromonas en peces fue resistente a ampicilina, y el 50 % lo fue para las muestras de agua, similar al mismo patrón de resistencia reportado por Bernard (19801, que menciona que las Aeromonas son resistentes a la Ampicilina, la diferencia que se obtuvo en el % de resistencia en este estudio puede deberse a la concentración usada (25_pg/ml., diferente a la establecida que es'de lO-pg/rnl.), aunado al efecto reducido de las penicilinas en general (antibióticos de amplio espectro) que son más eficientes sobre bacterias Gram Positivas (Abraham, 1 9 8 9 ) ;y a una variación propia de la cepa. E , coli sin embargo presento mayor sensibilidad a este antibiótico siendo el tercero en efectividad de inhivición en el crecimiento de las cepas, con una tamaño de halo promedio de 13.0 mm., y como en el caso anterior debido quiza al incremento de la concentración utilizada, obserbandose que el 100 % de las muestras fueron sensibles a este, contrariamente a esto Kelch (1978) encontró que las cepas aisladas de aguas naturales donde se encontraban presentes coliformes fecales, un 14% eran resistentes a la ampicilina y Bell (1978) encontró que el 16.2% eran resistentes, siendo estos l o s datos que se han reportado para coliformes fecales en los que se incluye a E. coli.

De acuerdo al análisis de varíanza por una vía ( = 0 . 0 5 ) , las cepas de las bacterias presentan una variabilidad de respuesta a la sensibilidad y/o resistencia al antibiótico al que fueron sometidas presentando una (p=O.OOOO), siendo significativa la diferencia entre el tamaño del halo desarrollado por los antibióticos, es decir que existe una diferencia entre las cepas a la acción del antibiótico. El 94% de las muestras de Aeromonas son resistentes a la ampicilina (Fig.1). En el caso del cloranfenicol (5_yg/ml. y lO-yg/ml. ) , la primera de estas concentraciones provoco una mayor inhibición en el crecimiento de Aeromonas, se observo que el tamaño del halo entre esta concentración y la segunda estadísticamente no es significativa, por lo que los valores determinados se deben al azar. Por otro lado se esperaba que no existiera diferencia en el tamaño del halo con respecto al origen de la cepa, sin embargo, se obtuvó una (p=0.0029) esta diferencia se observa entre las cepas del pez 2 con las de los peces 7 y 8 , ver Tabla 2 , en la cual se observa que las cepas del pez 2 fueron las que

I

presentaron una mayor sensibilidad a todos los antibióticos, por o t r o lado l a s cepas de los peces 7 y 8 fueron los que presentaron mayor resistencia a é s t o s en comparacidn al resto de las cepas, La sensibilidad de las cepas del pez 2 se debe posiblemente a que se encontraba con mayor grado de infección, por bacterias reduciendo el efecto de los antibiótico. Tambien puede ser atribuido a que l as cepas manifientan una conducta opuesta al comportamiento de la cepa o especie a la que pertenecen (IMSS, 1968)

En las muestras de agua se observo que existo diferencias de respuesta hacia los los antibióticos con (p=0.0015). Las cepas sometidas al antibiótico 4 y 1 presentaron un patrón de respuesta similar y , el 2 y 3 de igual manera (Tabla Z ) , para los primeros dos

los segundos. Esta mayor resistencias puede ser por la diferancia de concentraciones de los antibióticos.

las cepas de las bacterias muestran una mayor resistencia que para

E l patrón de respuesta de las cepas de E. coli del líquido peritoneal de los peces es similar, en relación a la acción de los antibióticos con una (p=0.3707). Este mismo patrón de respuesta de las cepas posiblemente se deba a que los peces se encontraban bajo las mismas condiciones ambientales. P o r otro lado el porcentaje de sensibilidad de las muestras de E. coli contra cloranfenicol, estreptomicina y ampicilina fue del 100 % , diferente a lo que reporta Al-Jerbouri, (1984) para coliformes fecales entre las que se incluye a E. coli, en el que un 32.9 % es resistente a ampicilina y aproximadamente el 50 % de estos organismos fueron resistentes a estreptomicina a cloranfenicol de muestra tomadas de aguas residuales. P o r otro lado Bell ( 1 9 7 8 ) en su estudio de patrones de resistencia de coliformes fecales de agua domésticas, encontro que el 10.8 % es resistente a estreptomicina y el 1 6 . 2 % a ampicilina.

I

CONCLUSION

En 1;:~ identificación de las bacterias, s ó l o se llego a S6nero e 'n Aeronlonas S a especie en E. coli.

El porcenta.ie más alto de sensibilidad lo presenta las ijeromorms hacia la estreptomicina en las muestras obtenidas de peces Y a g u a . seguida del cloranfenicol de 10 p g / m l . , siendo l o s antibióticos a 10s que las bacterias fueron más sensibles "in vitro" y , p o r otro 1:tdo 1.a ampicilina fue el antibiótico al cual presentaron mayor resistencia en este estudio. Hay que. tomar en' cuenta que estos microor~anismos prteden dar una respuesta diferente "in v i v o " siendo otras las condiciones que para evaluarlo sería objeto de o t r o estudio. En l a s pruebas de sensibilidad y / o resistencia en Aeromonag, el tamaño del h a l o vario tanto de:L origen de la cepa (pez) como d e l antibiótico, . sin embargo para E. coli mostro un similar patrón de respuesta para ambos parámetros.

Las bacterias aisladas de l a s dos muestras de agua mostraron una respuesta extrema para la ampicilina al ser una completamente resistente y o t r a sencible, esta sensibilidad y / o resistencia es una característica propia de l a s bacterias, que puede ser una cualidad de especie o más aGn' un atributo de ciertas cepas o individuos que manifiestan una conducta opuesta a 1 comportamiento de la especie o cepa a la que pertenecen.

"

Si el tipo de antibiótico empleado es bactericida o bacteriostático, de reducido y / o amplio espectro, se verií en la respuesta de sensibilidad y /o resistencia de las bacterias pátogenas, pero más aGn el buen resultado del empleo de éstos dependerá de la dosificaci6n y del período que dure el tratamiento.

L1TERATRUR.A CITADA

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