el presente trabajo se realizó en la unidad de...
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El presente trabajo se realizó en la Unidad de Investigación en Inmunodeficiencias
del Instituto Nacional de Pediatría, bajo la dirección de la Dra. Gabriela López
Herrera. Una parte del trabajo se llevo a cabo en el laboratorio no. 4 del
Departamento de Biomedicina Molecular del Centro de Investigación y Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Leopoldo
Santos Argumedo y en el Laboratorio de Inmunoquímica I del Departamento de
Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, bajo la dirección de la
Dra. Ethel A. García Latorre.
Durante el desarrollo de este trabajo la alumna recibió beca CONACYT, con número
de registro 176353, y el apoyo de CONACYT con el proyecto 58945.
DEDICATORIAS
Se lo dedico a mis hijos por ser lo más importante de mi vida.
A mi madre por toda la ayuda que siempre me dio.
A mi padre por sus sabios consejos.
A mis hermanos por su apoyo incondicional.
A Gaby, Claudia y Eduardo por su amistad y apoyo.
Agradecimientos
Agradezco el apoyo brindado por el M. en C. Héctor Romero Ramírez y el M.
en C. Víctor Hugo Rosales García por las diferentes etapas de este trabajo.
Agradezco la enorme colaboración en este trabajo del Dr. Francisco
Espinosa Rosales y la Dra. Sara Espinosa Padilla.
A la Dra. Ethel A. García Latorre por su apoyo y consejos.
A los miembros del Jurado, por tomarse el tiempo para revisar mi trabajo, por
sus acertadas correcciones y sugerencias:
Dra. Luis Antonio Jiménez Zamudio
Dr. Leopoldo Santos Argumedo
Dra. Maria Lilia Domínguez López
Dra. Elba Reyes Maldonado
Dra. Ethel A. García Latorre
De manera especial quiero agradecer al Dr. Leopoldo Santos Argumedo por
su invaluable apoyo y ejemplo.
A la Dra. Gabriela López Herrera por su enseñanza y confianza.
A mis compañeros de CINVESTAV por la ayuda que siempre me brindaron.
INDICE:
Página Lista de abreviaturas i Índice de figuras iv Índice de tablas v Resumen vii Abstract viii I. Introducción
Inmunodeficiencias Primarias 1
Manifestaciones clínicas 1
Clasificación de IDP 3
Prevalencia 3
Inmunodeficiencias primarias predominantemente de anticuerpo
4
Desarrollo de la células B 5
CVID 7
Síndrome de hiper-IgM 15
Justificación 20 Hipótesis 20 Objetivo general 21 Objetivos particulares 21 II. Material y métodos Tipo de investigación 22 Criterios de inclusión, exclusión y eliminación 22 Obtención de muestra 22 Análisis de poblaciones leucocitarias 23 Análisis de sub-poblaciones de células B 23 Análisis de la expresión de CD40 24 Análisis de la expresión de TACI 24 Análisis de la expresión de CD154 24 Análisis de la expresión de ICOS 24 Adquisición y análisis 25 Extracción de RNA 25 Síntesis de cDNA 25 Amplificación de CD154 por reacción en cadena de la polimerasa 26
Electroforesis de los productos de PCR en geles de agarosa 27 Clonación de productos de PCR, reacción de ligación 27 Transformación de los productos de ligación en Escherichia coli
DH5
28
Selección de colonias positivas por PCR 28 Purificación de plásmidos de colonias positivas 29 Secuenciación y análisis 29 III. Resultados 1.- Características clínicas de los 25 pacientes con Inmunodeficiencia Humoral
30
2.- Análisis de poblaciones de leucocitos. 34 3.- Análisis de poblaciones de linfocitos T, linfocitos B y células NK y sub-poblaciones de células T
39
4.- Determinación de sub-poblaciones de células B 45 5.- Clasificación de 21 pacientes con CVID de acuerdo a su porcentaje de células B de memoria
49
6.- Análisis de la expresión de CD154 50 7.- Análisis de la expresión de CD40 51 8.- Análisis de la expresión de ICOS 57 9.- Análisis de la expresión de TACI 60 10. Análisis de mutaciones en CD154 en el paciente 16, 19, 20 y 22 63 IV. Discusión 70 V. Conclusiones 77 VI. Perspectivas 78 VII. Bibliografía 79 Anexos 87
i
LISTA DE ABREVIATURAS
ALX Agammaglobulinemia ligada al X
AHA Anemia hemolítica autoinmune
AID Activador –inductor de citidina deaminasa de inglés
activation-induced cytidine de aminase
AP-1 Proteína activadora 1 del inglés adaptor-related protein
complex 1
APRIL Ligando que induce proliferación del inglés a proliferation-
inducing ligand
AR Agammaglobulinemia autosómica recesiva
ARJ Artritis reumatoide juvenil
BAFF Factor de activación de células B del inglés B cell-activating
factor
BAFFR Receptor del factor de activación de células B del inglés B
cell-activating factor receptor
BCMA Proteína de maduración de células B del inglés B cell
maturation
BCR Receptor de la célula B del inglés B cell receptor
BLNK Proteína adaptadora de la célula B del inglés B-cell linked
BTK Tirosina Cinasa de Bruton del inglés Bruton tirosin kinase
CAML Modulador de calcio del inglés modulating calcium
CRD Región conservadas de cisteínas
CVID Inmunodeficiencia común variable del inglés común variable
immunodeficiency
ii
DIgA Inmunodeficiencia de IgA del inglés immunodeficiency IgA
EDA-ID Displasia hipohidrótica ectodérmica con inmunodeficiencia
del inglés anhidrotic ectodermal displasia with
immunodeficiency
IDP’S Inmunodeficiencias primarias
ICOS Coestimulador inducible del inglés inducible costimulator
ICOSL Ligando del costimulador inducible de inglés inducible
coestimulator ligand
Ig’s Inmunoglobulinas
LES Lupus eritematoso sistémico
LXP Síndrome linfoproliferativo ligado a X
MHC II Molécula de histocompatibilidad tipo II
NEMO Modulador esencial de NF- B del inglés NF- B essential
modulator
NFAT Factor nuclear de células t activadas del ingles nuclear factor
of activated T-cells
NF B Factor nuclear de B del inglés nuclear factor - B
PI3K Fosfatidilinositol 3 –cinasa del inglés phosphatidylinositol 3-
kinase
PMBC’s Células mononucleares
PTI Púrpura trombocitopenia idiopática
TACI Activador transmembrana e interactor de CAML del inglés
transmembrane activador and calcium-modulating cyclophilin
ligand
TLR Receptores parecidos a toll del inglés toll like receptor
iii
TRAF Factores asociados a receptores TNF del inglés TNF
receptor asociated factor
TNFR Receptores de la familia de TNF del inglés TNF receptor
iv
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1 Tipos de infecciones y riesgos en enfermedades por inmunodeficiencias primarias.
2
Figura 2 Principales grupos de Inmunodeficiencias, según el registro de la Sociedad de Inmunodeficiencias.
5
Figura 3 Representación esquemática del gene de CD154 y las mutaciones identificadas en pacientes con hiper-IgM tipo 1.
17
Figura 4 Análisis de las poblaciones celulares en sangre periférica.
34
Figura 5 Valores absolutos de las poblaciones de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los testigos y los pacientes pareados por edad.
38
Figura 6 Análisis de las poblaciones de células T, B y NK. 39 Figura 7 Porcentaje de células CD8+ y CD4+ en las muestras
de los pacientes y de los testigos. 40
Figura 8 Valores absolutos de las poblaciones de células T CD3+, células B CD19+, células NK CD16+56, células T CD4+ y células T CD8+ de los testigos sanos y los pacientes pareados por edad.
43
Figura 9 Determinación de las sub-poblaciones de células B. 45 Figura 10 Porcentaje de células B CD22+, CD27+ en pacientes
y testigos. 48
Figura 11 Histogramas que muestran la expresión de CD154. 50 Figura 12 Análisis de la expresión de la proteína CD154 en
pacientes y testigos sanos. 52
Figura 13 Histogramas que muestran la expresión de CD40. 53 Figura 14 Análisis de la expresión de CD40 en células B y
monocitos de pacientes y testigos sanos. 56
Figura 15 Histogramas que muestran la expresión de ICOS. 57 Figura 16 Análisis de la expresión de ICOS en células T de
pacientes y testigos sanos. 59
Figura 17 Histogramas que muestran la expresión de TACI. 60 Figura 18 Análisis de expresión de TACI en las células B
maduras de pacientes y testigos sanos. 62
Figura 19 Resultados de la amplificación por PCR de CD154 en los pacientes 16, 20, 19 y 20.
64
Figura 20 Selección de clonas positivas para el gen CD154 en el paciente 19.
65
Figura 21 Mutaciones del gen CD154 en el paciente 16. 66 Figura 22 Mutaciones del gen CD154 en el paciente 19. 67 Figura 23 Mutaciones del gen CD154 en el paciente 22. 68 Figura 24 Mutaciones del gen CD154 en los pacientes 19 y 20. 69
v
INDICE DE TABLAS
Página Tabla 1 Clasificación de las inmunodeficiencias
predominantemente de anticuerpo.
Tabla 2 Valor absoluto de linfocitos B y concentración sérica de inmunoglobulinas en los 25 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
32
Tabla 3 Características y manifestaciones clínicas en los 25 pacientes con inmunodeficiencias humorales.
33
Tabla 4 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos sanos de 1 a 5 años de edad, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
35
Tabla 5 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos de 6 a 10 años de edad, representados por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
35
Tabla 6 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 30 testigos sanos de 11 a 17 años de edad, representados por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
36
Tabla 7 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 19 testigos sanos de edad adulta, representados por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
36
Tabla 8 Datos de los valores absolutos de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los 25 paciente
37
Tabla 9 Valores absoluto de células TCD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 1 a 5 años, representado por media, desviación estándar y los límites menor y mayor.
40
Tabla 10 Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19 + y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 6 a 10 años, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
41
Tabla 11 Valores absolutos de células T CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19* y células NK CD16+56+ en 30 testigos sanos de 11 a 17 años, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
41
Tabla 12 Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 19 testigos sanos de
41
vi
edad adulta, representado por la media, la desviación estándar y los rangos menor y mayor.
Tabla 13 Datos de los valores absolutos de células T, sub-poblaciones de células T, células B, células NK de los 25 pacientes.
42
Tabla 14 Porcentaje de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 25 pacientes.
46
Tabla 15 Porcentaje de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 15 testigos sanos.
47
Tabla 16 Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo al porcentaje de células B de memoria y sus características clínicas.
49
Tabla 17 Porcentaje de expresión de CD154 en 17pacientes con inmunodeficiencias humorales.
51
Tabla 18 Porcentaje de expresión de CD154 en 7 testigos sanos.
51
Tabla 19 Porcentaje de células B que expresan CD40 en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
54
Tabla 20 Porcentaje de células B que expresan CD40 en 8 testigos sanos.
54
Tabla 21 Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 14 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
55
Tabla 22 Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 6 testigos sanos.
55
Tabla 23 Porcentaje de células T que expresan ICOS en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
58
Tabla 24 Porcentaje de células T que expresan ICOS en 5 testigos sanos.
58
Tabla 25 Porcentaje de células B maduros que expresan TACI en 17 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
61
Tabla 26 Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 6 testigos sanos.
61
Tabla 27 Resumen de las mutaciones encontradas en el gen de CD154 de los pacientes con Síndrome de hiper-IgM (Tipo 1).
69
vii
RESUMEN
Entre los grupos de Inmunodeficiencias Primarias (IDP’s), las
inmunodeficiencias humorales son las más comúnmente reportadas en el
mundo. Una de las inmunodeficiencias humorales es la Inmunodeficiencia
Común Variable (CVID). El defecto común en los pacientes con CVID es la
disminución en la producción de anticuerpos y los defectos genéticos que la
ocasionan no se conocen completamente, aunque se han identificado diversas
anormalidades como la deficiencia de CD19, defectos en la molécula TACI,
mutaciones en ICOS y BAFFR. Otra inmunodeficiencia humoral es el síndrome
de hiper-IgM que en la mayoría de los casos se hereda de un modo ligado al
cromosoma X (HIGM tipo 1) con mutaciones en la proteína CD154, pero
también se han reportado casos de una forma adquirida que afecta ambos
sexos. En este trabajo de investigación se estudiaron 25 pacientes con
diagnostico de inmunodeficiencia humoral, se determinó el origen de esta
deficiencia inmunológica CVID ó hiper-IgM. El comportamiento de las
poblaciones de leucocitos de los 25 pacientes fue muy irregular, la mayoría de
los pacientes tuvieron disminución de células B, principalmente los pacientes
de edad adulta. Cuatro pacientes no expresaron CD154 y a estos pacientes se
les determinaron las mutaciones en el gen de CD154. Un paciente no expresó
CD40 en monocitos y dos pacientes expresaron un porcentaje muy bajo de
ICOS y son candidatos al estudio molecular. Cuatro pacientes tuvieron menos
del 1% de células B (grupo III) por lo que no se les incluyó en el análisis de
asociación entre células B de memoria y manifestaciones clínicas. De los 17
pacientes restantes, con más del 1% de células B; 47% expresaron menos del
20% de células B de memoria CD22+, CD27+ (grupo I); los demás expresaron
más del 20% de linfocitos B de memoria (grupo II). Los pacientes del grupo II
presentaron una mayor susceptibilidad a procesos infecciosos virales y
tuberculosis, por lo que su defecto pude deberse a una deficiencia combinada
de células B y T. En conclusión estos datos confirman que las manifestaciones
clínicas y el porcentaje de las poblaciones de células B de memoria es
altamente variable de paciente a paciente, indicando que pueden existir
diferentes defectos que lleven a un fenotipo de CVID.
viii
ABSTRACT
Among the different primary immunodeficiencies (PID), the antibody defects are
the most commonly reported. These disorders range from the complete absence
of all classes of antibodies to selective states of deficiency of a single class or
subclasses of antibodies. The most frequent immunodeficiency is the common
variable immunodeficiency (CVID), which is characterized by the decrease in the
production of antibodies. The genetic defects that cause it are not completely
known although various defects as CD19, TACI and ICOS deficiencies have
been identified. Other primary immunodeficiencies of antibodies are the hyper –
immmunoglobulin M (IgM) syndrome (hyper- IgM). The most common for of
hyper-IgM is thought to be x-linked and the consequence of mutations of CD40
ligand (CD154). This work reports the results of studies of leukocyte populations,
the expression of B cell subpopulations, and the expression of some proteins
(ICOS, TACI, CD40 and CD40L), which were determined by flow cytometry,
performed on 25 patients with clinical diagnosis of primary immunodeficiencies of
antibodies; these results were analyzed together with their medical records. It
was found that the behavior of these patients’ leukocyte populations was very
irregular. Most of them had a diminished number of B cells, especially adult
patients. Four patients had less than 1% of B cells (group III); of the 17 remaining
patients, 8 had less than 20% of memory B cells CD22 +, CD27 + (group I) and
the other 9 expressed more than 20% of lymphocyte memory B cells (group II).
Patients from Group II presented a higher number of viral infections or
tuberculosis. The expression of CD40, TACI, CD154 and ICOS were sought in all
the patients. Four patients express a very low percentage of CD154 and we
studied of mutations of this molecule. One patient expressed low percentage of
CD40 and two patients expressed low percentage of ICOS and therefore they
would be candidates for a search of mutations of this molecule. In conclusion,
these data confirm that this disease presents a wide variability in the spectrum of
clinical manifestations and in the number of memory B cells; this suggests that
the phenotype of CVID may be provoked by different genetic defects.
I. INTRODUCCIÓN
Las inmunodeficiencias primarias
Las inmunodeficiencias se producen cuando uno o más componentes del sistema
inmunitario están defectuosos. Estas se clasifican en primarias y secundarias. Las
inmunodeficiencias secundarias o adquiridas son debidas a factores extrínsecos,
como fármacos, radiaciones, desnutrición, infecciones, las malformaciones del
tracto urinario o del sistema respiratorio. Las inmunodeficiencias primarias (IDP’s)
son debidas a defectos intrínsecos de las células que integran el sistema
inmunitario, y en la mayoría de los casos aparecen como consecuencia de
anomalías genéticas. Aunque en muchas IDP se ha podido determinar una causa
genética, en otras la causa permanece desconocida. Las IDP’s, representan un
grupo heterogéneo que se caracteriza por la predisposición a enfermedades
infecciosas, autoinmunitarias y procesos cancerosos (Bonilla y Geha, 2003).
Manifestaciones clínicas
Las inmunodeficiencias primarias se presentan fundamentalmente en forma de
infecciones recurrentes. Según el tipo de infección puede sospecharse la
existencia de la deficiencia inmunitaria, sin embargo, las infecciones son sólo un
elemento de orientación, ya que existe un buen número de casos intermedios y de
formas de difícil definición. La edad de aparición y la gravedad de las infecciones
varían según el tipo de deficiencia, se presentan con mayor frecuencia (60%) en
lactantes o niños, pero pueden aparecer en cualquier etapa de la vida (Smith y col.
1999). El tipo de microorganismo identificado en los pacientes nos da un indicio
del tipo de defecto inmune. Las infecciones bacterianas recurrentes del sistema
respiratorio están asociadas a defectos de células B. Por otro lado, los pacientes
que presentan infecciones con Pneumocystis carinii ó microorganismos
intracelulares pueden tener deficiencias de células T. En la figura 1se muestra
con mayor detalle las complicaciones de las inmunodeficiencias primarias según
los diferentes sistemas de defensa que están involucrados en la enfermedad
(Hassner, 1991).
2
Figura 1. Tipos de infecciones y riesgos en enfermedades por inmunodeficiencias primarias
(Conley y col., 1999)
3
Clasificación de las inmunodeficiencias primarias
El concepto de IDP y su desarrollo comienza con el descubrimiento de la
agammaglobulinemia de Bruton en 1952. A partir de entonces se inicia la
investigación de estas enfermedades que enseguida se relacionan con las
anomalías de la ontogenia del sistema inmunitario. Desde 1950 a 1965 se
describen las IDP más características, sin embargo, el número de IDP ha
incrementado con el tiempo, registrándose 34 formas en 1973, 66 en 1989 y cerca
de un centenar en la actualidad (Stiehm,1992).
Los desórdenes congénitos de la inmunidad son raros. Se han reportado muchas
variedades de IDP. En la mayoría de los casos se trata de enfermedades
hereditarias cuya clasificación sufre una revisión continua a medida que se
generan progresos en la inmunología. Sin embargo llama la atención comprobar
que a pesar de un mejor conocimiento y aplicación de sondas moleculares para la
identificación de los genes involucrados en las IDP’s, la mayor parte de los déficit
inmunitarios todavía se clasifican de acuerdo a sus manifestaciones clínicas y
biológicas.
La clasificación de las inmunodeficiencias primarias más actualizada está bajo
revisión de la Organización Mundial de la salud. La última clasificación se publicó
en 2007 y divide a las inmunodeficiencias conocidas en ocho grupos (Geha y col.,
2007).
Prevalencia
Las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos ó inmunodeficiencias
humorales son las más frecuentes, ya que representan alrededor del 55% del total
de las IDP, según los datos obtenidos del registro de la Sociedad Europea de
Inmunodeficiencias Primarias (ESID), figura 2.
4
Figura 2. Principales grupos de Inmunodeficiencias, según el registro de la Sociedad de Inmunodeficiencias. Datos obtenidos de la página de Internet www.esid.org.
Las IDP’s con defectos predominantemente de anticuerpos
En este grupo de IDP, el defecto se limita a la formación de anticuerpos, ya sea
por una alteración en el desarrollo intrínseco de las células B, por un fallo en la
respuesta de las células T o defectos que afecten la activación de las células B.
Los defectos moleculares en este grupo de IDP son muy heterogéneos, pudiendo
afectar cualquier elemento de la respuesta humoral, dando lugar a una falta de
producción de todas las clases de anticuerpos o una deficiencia selectiva de una
clase o subclase de anticuerpo (Conley, 2001; Wood, 2009).
5
Tabla 1. Clasificación de las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpo (Notarangelo y col., 2004).
Desarrollo de las células B en periferia:
Para poder entender los defectos moleculares de las inmunodeficiencias
humorales, es importante conocer el desarrollo de la célula B en humanos y la
interacción que existe con las células T cooperadoras y el micro ambiente en los
órganos linfoides secundarios.
El desarrollo de las células B en el humano es poco conocido. En la médula ósea,
los diferentes estadios del desarrollo de la célula B pueden ser identificados con
base en la expresión de marcadores de superficie y en la caracterización de
rearreglos del loci de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas.
Basados en estos datos, las fases tempranas del desarrollo de la célula B son
6
similares en el ratón y el humano (Carsetti y col., 2004). En la célula B la
expresión de una cadena pesada intacta y más tarde la expresión en superficie de
una molécula de inmunoglobulina completa regula activamente la progresión de un
estadio al siguiente, que culmina en la producción de la célula B inmadura
superficie (LeBien, 2000).
Las células B inmaduras migran al bazo en donde se diferencian en linfocitos
maduros ó vírgenes. Las células B inmaduras en la periferia son conocidas como
células transicionales. Sims y col. han identificado y caracterizado a las células B
transicionales humanas, clasificaron a las células B inmaduras en médula ósea
por la expresión de marcadores como CD10 alto, CD44 bajo, CD24 alto, CD38 alto
y el 7 a 8 % expresan IgD. Las células transicionales humanas en sangre de
cordón se presentan en un 14 %, mientras que en sangre periférica en un 2 % y
se pueden identificar por marcadores como CD19 +, CD24 alto, CD38 alto, CD21
bajo, CD23 negativo o bajo, IgM alto, IgD bajo, CD62L bajo. El marcador CD27,
así como la hipermutación somática de sus cadenas pesadas y ligeras está
ausente por lo que no es posible identificarlas como células B de memoria (Sims
y col., 2005).
Las células B vírgenes inician su activación con el reconocimiento del antígeno por
parte del BCR. En estudios recientes, se concluye que éstas requieren de la
integración de tres señales para ser activadas; la primera señal es el
reconocimiento del antígeno por parte del BCR; la segunda señal está dada por la
interacción de la célula T cooperadora y la célula B por medio del contacto entre
CD154 y CD40; y la tercera señal está integrada por los productos bacterianos
que activan los receptores parecidos a Toll (TLRs) (Lanzavecchia y col., 2006).
El siguiente paso de la respuesta adaptativa es la generación de la memoria
inmunológica. La activación de las células B es indispensable para la respuesta
humoral a la infección. Las células B que unen a su antígeno específico son
atrapadas en forma selectiva y las células T cooperadoras las activan, entonces
forman el foco primario de expansión clonal que después de unos días
involuciona. Las células T y B que sobreviven migran a los folículos primarios
donde siguen proliferando y forman el centro germinal. Las células B experimentan
7
una amplia proliferación y mutación somática, expresan un receptor mutado que si
es complementario a los antígenos mostrados por las células dendríticas
foliculares van a ser rescatados temporalmente. Las células B que han captado,
interiorizado y mostrados sus antígenos en las MHCII van a recibir señales
permanentes de rescate por parte de las células T específicas. Entonces van a
entrar en el conjunto de las células B de memoria y quedar disponibles para una
futura estimulación ó bien pueden diferenciarse a células plasmáticas y secretar
inmunoglobulinas con diferentes isotipos (Anderson y col., 2006).
Inmunodeficiencia común variable (CVID):
La Inmunodeficiencia Común Variable (CVID) fue descrita en 1953 (Janeway y
col.,1953), es el síndrome más común de las inmunodeficiencias primarias de
anticuerpos. Los pacientes con CVID presentan los niveles reducidos de IgG e IgA
en suero, mientras que la IgM se encuentra reducida en la mitad de los pacientes,
a pesar de poseer células B en sangre periférica. Los pacientes con CVID
presentan infecciones bacterianas recurrentes, predominantemente en las vías
altas y bajas del tracto respiratorio y gastrointestinal. Afecta tanto a hombres
como a mujeres, con cierto predominio en hombres. Sólo en algunos casos con un
defecto monogénico se ha podido demostrar una transmisión genética de la
enfermedad (autosómica recesiva y autosómica dominante). Los primeros
síntomas pueden aparecer en la infancia, adolescencia o edad adulta. El
diagnóstico se realiza preferentemente en dos picos de edad; uno en la infancia y
otro entre los 20 y 30 años, siendo la IDP que inicia en adultos más
frecuentemente (Hammartön y col., 2000).
Manifestaciones clínicas
Las infecciones pulmonares piógenas recurrentes están presentes prácticamente
en todos los pacientes en el momento del diagnostico, siendo las manifestaciones
clínicas de origen respiratorio las más frecuentes. Estas manifestaciones pueden
ser neumonías, sinusitis, bronquitis, otitis. La bacterias encapsuladas
(Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Pseudomona aeruginosa)
8
son los gérmenes responsables de la mayoría de las infecciones respiratorias. Las
complicaciones pulmonares como bronquiectasias, enfisema, fibrosis pulmonar se
desarrollan en cerca del 20 al 30% de los pacientes (Oksenhendler y col., 2008).
Las manifestaciones gastrointestinales son la segunda causa mas frecuente,
siendo las enteritis por Salmonella y Giardia lamblia las mas comunes. Las
manifestaciones gastrointestinales son la diarrea crónica no infecciosa, síndrome
de mala absorción, intolerancia a la lactosa. La enfermedad inflamatoria intestinal
es común, cerca del 30% de los pacientes tiene algún grado de diarrea crónica
(Park y col., 2008).
Los pacientes con CVID tienen predisposición a infecciones por micoplasma
dando lugar a artritis séptica. Las alteraciones neurológicas comunes son las
meningitis bacterianas causadas por neumococos y Haemophilus que crean
complicaciones clínicas como abscesos cerebrales y enfermedad granulomatosa.
Alrededor de un 20 a 30 % de los pacientes presentan trastornos autoinmunes
como: anemia hemolítica autoinmune (AHA), púrpura trombocitopénica idiopática
(PTI), artritis reumatoide (Ar), anemia perniciosa y lupus eritematoso sistémico
(LES). Un tercio de los pacientes presentan esplenomegalia, linfadenopatías;
también las lesiones granulomatosas han sido descritas (Chapel y col., 2008).
Diagnostico diferencial
Otras inmunodeficiencias humorales presentan hipogammaglobulinemia y
síntomas de infecciones recurrentes pulmonares, estas incluyen
agamaglobulinemia ligada al X (ALX), agammaglobulinemia autosómica recesiva
(AR), síndrome linfoproliferativo ligado al X (LXP) y síndromes de hiper IgM; estás
inmunodeficiencias deben ser descartadas para el diagnostico de CVID. Los
criterios aceptados incluyen: la presencia de hipogamaglobulinemia en dos o más
isotipos de inmunoglobulinas (bajo IgG, IgA ó IgM), infecciones sinopulmonares
recurrentes y respuesta irregular de anticuerpos; esta última incluye ausencia de
isohemaglutininas, pobre respuesta a las vacunas polisacáridas (S pneumoniae) y
vacunas contra difteria y tétanos (Park y col., 2008).
9
Etiología
El defecto común en los pacientes con CVID es la formación defectuosa de
anticuerpos. Los defectos genéticos en CVID no se conocen, aunque se han
identificado diversas anormalidades. Las irregularidades incluyen alteraciones de
la proliferación y la activación de las células T, producción irregular de citocinas y
la expresión reducida de moléculas coestimulatorias como CD40L (Farrington y
col., 1994). Sin embargos los defectos más notorios se encuentran en las células
B ya que la diferenciación terminal y la hipermutación somática se encuentran
alterados, además de problemas en la señalización y en el cambio de isotipo
(Salzer y col., 2006).
En los últimos años se han identificado 4 defectos monogénicos en pacientes con
CVID. Estos son TACI, CD19, ICOS y BAFFR (Bacchelli, 2007). Estas moléculas
cobran importancia debido a que forman parte de las señales necesarias para el
desarrollo de la célula B en periferia.
TACI
La proteína TACI (transmembrane activator and calcium-modulator and cyclophilin
ligand interactor, TNFRSF-17)) es una proteína de la superfamilia de los
receptores del factor de necrosis tumoral, los cuales transducen señales
importante para la regulación, tanto de supervivencia como de apoptosis de las
células B. TACI y BCMA ( B-cell maduration protein, TNFRSF17) se unen a dos
ligandos: BAFF (B cell activating factor, TNFSF13B) y APRIL (Proliferation-
inducing ligand, TNFSF13A), mientras que la proteína BAFFR ( BAFF receptor,
TNFRSF13) se une exclusivamente a BAFF. TACI es un receptor transmembranal
tipo III y el gen TNFSF13B (TACI) está situado en el cromosoma 17p11.2 y tiene 5
exones. TACI se expresa en células B vírgenes y activadas y, transduce las
señales vía TRAF, NF B, CAML, NFAT y AP-1. Los ratones TACI -/- presentan
una expansión e hiperactividad de la células B, autoinmunidad, linfoproliferación y
una respuesta alterada timo independiente tipo II (Castigli y col., 2005; Salzer y
Grimbacher, 2006).
10
En el 2005 se describieron 6 diferentes mutaciones, homocigotas y heterocigotas,
en el gen TNFSF13B de pacientes con CVID y con inmunodeficiencia de IgA
(DIgA). En este estudio se describieron dos “hotspots” (C104R y A181E); el
primero corresponde a una cisteína muy conservada (CRD) y el segundo está en
la región transmembranal de TACI. El fenotipo de los pacientes es variable en los
casos descritos, y no se ha encontrado gran similitud con los ratones TACI-/-. Los
pacientes no presentan manifestaciones autoinmunes graves, ni linfoproliferación,
ni expansión de las células B en sangre periférica (Castigli y col., 2005).
Se han identificado mutaciones en el gen que codifica TACI en un 10-15% de los
casos pacientes con CVID, así como en una pequeña fracción de casos con
DIgA (Salzer y col., 2005). Las mutaciones en TACI se asocian a defectos en la
generación y/o mantenimiento de las células B de memoria y células plasmáticas.
Este defecto se manifiesta más plenamente en la respuesta timo independiente.
En estos pacientes el número de células B es normal o se encuentra
discretamente reducido, con reducción variable de células B de memoria CD27+
(Salzer y Grimbacher , 2006).
CD19
Se han reportado también pacientes con CVID y deficiencia de CD19 (Van Zelm
y col., 2006). El desarrollo y diferenciación depende de la transducción de señales
a través del BCR. Los co-receptores asociados al BCR pueden modular la señal
de transducción del BCR positiva o negativamente e influenciar la diferenciación
del linfocito B. CD19, junto con CD21, CD81 y CD225 forman el complejo receptor
que regula la señalización del BCR después de su entrecruzamiento con el
antígeno. CD19 tiene dos dominios extracelulares parecidos a inmunoglobulinas y
un tallo citoplasmático con motivos capaces de unir tirosinas cinasas como Lyn o
la cinasa PI3K (Bacchelli y col 2007). El CD19 juega un papel crucial en la
regulación de la respuesta de la célula B frente al antígeno y en la supervivencia
de estas células. La proteína CD19 se expresa de forma temprana durante el
proceso de diferenciación de la célula B en médula ósea, hasta su diferenciación
a célula plasmática. Los pacientes con mutación en CD19 tienen un desarrollo
11
relativamente normal de células B y la formación de centros germinales, pero el
número de las células B CD27 positivas esta reducido, tienen defectos en el flujo
de calcio seguido de estimulación con IgM y muestran poca proliferación después
de estimulación con Staphylococcus aureus Cowan 1, que resulta de la
incapacidad de montar una respuesta humoral efectiva (van Zelm y col., 2006).
ICOS
ICOS (co-estimulador inducible), es una molécula que esta relacionada estructural
y funcionalmente con CD28 y se ha reportado que es un regulador importante del
sistema inmune (Hutloff y col., 1999). Se expresa en células T activadas que se
encuentran en órganos linfoides secundarios y en la zona clara de los centros
germinales y se une solamente a ICOS-L. En 1999 se descubrió el ligando de
ICOS (ICOS-L), glicoproteína de membrana tipo I que se expresa en células B,
células dendríticas; monocitos y células no linfoides. Este co-estimulador
promueve en las células T la secreción de citocinas como IL 4, IL 5, IL 6 pero
principalmente IL 10 que estimula la diferenciación terminal de células B a células
de memoria y plasmáticas. El gen que codifica ICOS humano está localizado en
el cromosoma 2q33-34, misma región que los genes para CD28 y CTLA-4 (Beiber
y col. 2000).
La deficiencia de ICOS en humanos fue descrita por primera vez en 2003 por
Grimbacher y colaboradores, cuatro pacientes adultos de dos familias no
relacionadas se les encontró una eliminación que resultó de la completa falta de
expresión de la proteína ICOS. Dichos pacientes habían sido diagnosticados como
CVID con hipogammaglobulinemia; con reducción considerable de células B de
memoria y células B “naive”. En otros estudio con 9 pacientes, donde 2 pacientes
eran niños, se determinó que el número de células B en adultos estaba reducido,
mientras en los niños era normal. El fenotipo y función de células T CD4+ era
normal, pero la secreción de IL-10 e IL-17 era irregular (Warnatz K y col. 2006).
Con estos datos es evidente que una función de ICOS es en las células T
activadas, como un regulador de las células B, en el cambio de isotipo, en la
formación de células B de memoria y en la producción de inmunoglobulinas. Se
12
han encontrado mutaciones en ICOS en 5 % de los pacientes con CVID (Warnatz
y col. 2006).
BAFFR
BAFF, APRIL y sus receptores tienen una función inmunológica importante,
especialmente en las células B. El gen TNFSF13B (BAFF) está localizado en el
cromosoma 13q34, tiene 6 exones y existen dos isoformas, una de ellas se
expresa en membrana mientras que la otra, es una proteína soluble, es expresado
por células presentadoras de antígeno, linfocitos T, neutrófilos y células
estromales de médula ósea. Los ratones BAFF-/- presentan un defecto grave en
el desarrollo de células B, por lo que las respuestas timo independiente y
dependiente están alteradas. La expresión de APRIL se ha descrito en células
presentadoras de antígeno, células T y en líneas tumorales. Los ratones
deficientes en APRIL -/- presentan una respuesta de IgA alterada. El gen
TNFRSF13C (BAFFR) está localizado en el cromosoma 22q13.1-13.31, se
expresa en linfocitos B y en una sub-población de linfocitos activados. Las células
plasmáticas presentan una baja expresión de BAFFR en la membrana. Los
ratones BAFFR-/- presentan un fenotipo grave parecido al de los ratones BAFF-/-,
con alteraciones en la presencia de algunas sub-poblaciones de células B y una
respuesta tipo-dependiente deficiente (Bossen y Schneider, 2006). Además de su
papel como factores de supervivencia de células B, BAFF/BAFFR interaccionan en
la regulación de la expresión de CD21 y CD23 y en la diferenciación de las células
B en zonas marginales. En el 2004 se comunicó un paciente con CVID con una
eliminación en el gen TNFRSF13C, que afectaba la región transmembranal del
BAFFR, el patrón de herencia fue autosómico recesivo (Warnatz y col. 2005).
Clasificación de CVID
Desde la primera descripción de CVID se han realizado múltiples estudios con el
fin de obtener conocimientos nuevos sobre esta enfermedad. Se ha descrito esta
patología según la clasificación propuesta por Bryant (Spickett y col., 1997)
(Bryant y col., 1990). En esta clasificación se describe la capacidad de la célula B
13
de secretar IgM, IgG e IgA bajo estimulación in vitro con Staphylococcus aureus
Cowan I, adicionando IL-12, o anti IgM más IL-2. Se establecieron tres grupos:
Grupo A: involucra pacientes que presenta falla en la producción de cualquier
isotipo de Ig’s in vitro; Grupo B: pacientes con producción normal solamente de
IgM; Grupo C: pacientes con una producción similar a individuos sanos de
cualquier tipo de isotipo de Ig’s in vitro, pero niveles bajos de inmunoglobulinas in
vivo.
Los actuales conocimientos sobre maduración y diferenciación de las células B
han permitido definir otras alteraciones en sub-poblaciones de células B en
pacientes con CVID. Las células B “naive” y las células B de memoria en humanos
pueden identificarse usando una combinación de marcadores que incluyen
isotipos de inmunoglobulinas, CD27 el cual es expresado en la mayoría de las
células B de memoria, entre otros marcadores celulares que ayudan a discriminar
entre las diferentes sub-poblaciones de células B. En humanos, las mutaciones en
las regiones V de las inmunoglobulinas correlacionan con la expresión de CD27 en
las células B de memoria (Shi y col., 2003).
Utilizando como marcadores de memoria a CD27, CD21 y CD19 Warnatz y col.,
2002 establecieron una nueva clasificación:
Grupo I: incluye pacientes que poseen células B CD27+ menos de 0.5%
(77% de los pacientes estudiados). Este grupo se subdivide en dos grupos:
o Tipo 1a: con un número incrementado de las células B CD19+CD21-
(células inmaduras);
o tipo 1b: los pacientes que presentan un número normal de células B
CD19+, CD21+;
Los pacientes del tipo 1a también poseen porcentajes muy bajos de células B de
memoria con cambio de isotipo. El 100% de los pacientes del tipo 1a presentó
esplenomegalia y el 60% presentó citopenia del tipo autoinmune, mientras que los
pacientes del grupo 1b sólo el 7.7% se asoció a otros fenómenos autoinmunes
tales como vitiligo y anemia perniciosa.
14
Grupo Tipo II: Incluye pacientes con un alto porcentaje de células B, con
CD27+ mayor al 0.05% y con una producción normal de Ig’s in vitro, pero
con porcentajes bajos de Ig’s in vivo.
Grupo III: incluye pacientes con menos del 1% de células B.
En esta clasificación se concluyó que los pacientes con CVID del grupo I, pueden
tener reacciones irregulares en el centro germinal. Los pacientes con CVID del
grupo II pueden cursar con incremento en la proliferación o decremento en la
apoptosis. Y sí estos pacientes tienen número normal de células B de memoria,
pueden tener una reacción normal de centro germinal, pero fallan en la
producción de anticuerpos in vivo y la hipogammaglobulinemia entonces puede
deberse a fallas en la diferenciación hacia las células plasmáticas. Muchas
interacciones como CD27 y CD70, CD134 y CD134L e IL6 con su receptor
promueven la diferenciación de las células B a células plasmáticas (Agematsu,
2000). Asimismo, la interacción BAFF y BAFFR contribuye a la diferenciación de
las células B de memoria a plasmablastos y la supervivencia de estos, para la
formación de las células plasmáticas (Warnatz y col., 2002).
La clasificación propuesta por el grupo de París (Piqueras y col. 2003), se basa
en la cuantificación de la proporción de sub-poblaciones de células B de memoria
(BM), definidas con base en la expresión de IgD y CD27 y se dividieron a los
pacientes en 3 grupos:
Grupo BM0: pacientes sin células B de memoria (CD27-).
Grupo BM1: pacientes con células B de memoria no funcionales (sin
cambio de isotipo (CD27+ IgD+)
Grupo BM2: pacientes con células B de memoria de ambos tipos (células B
de memoria con cambio de isotipo, CD27+IgD- y células B de memoria sin
cambio de isotipo células B CD27+IgD+) en una proporción igual a la de la
población general.
Se observó una proporción mayor de manifestaciones linfoproliferativas y
granulomatosas. En los pacientes con CVID que pertenecen al grupo BM0, y de
esplenomegalia en los pacientes del Grupo BM0 y BM1 (Piqueras y col. 2003).
15
La última clasificación de los pacientes con CVID es la de EURO class trial, este
ensayo europeo fue iniciado para desarrollar un consenso de 2 esquemas de
clasificación existentes basados en el fenotipo de las células B y el curso clínico.
La evaluación clínica de 303 pacientes con CVID demostró que una reducción
severa de las células B de memoria se asoció a un riesgo alto de esplenomegalia
y enfermedad granulomatosa (Wehr y col., 2008).
Síndrome de Hiper-IgM
En 1961, se describen 2 hermanos con infecciones recurrentes, los cuales,
presentaron la IgG y la IgA en concentraciones muy bajas y elevada la IgM, a este
síndrome se le denominó “dysgammaglobulina” (Rosen y col. 1961). En 1974 la
Organización Mundial de la Salud lo nombró como Síndromes de
Inmunodeficiencias con hiper-IgM. Las observaciones de que bastantes pacientes
con hiper-IgM son susceptibles a infecciones oportunistas hicieron pensar que el
defecto se podría encontrar en las células T. En 1993, 5 grupos independientes
encontraron la mutación en el gen responsable de este síndrome, el cual se
encuentra en la proteína CD154. Recientemente, se han involucrado más genes
con diferentes presentaciones clínicas, lo que condujo a un cambio en el nombre
“Defectos en la recombinación del cambio de isotipos de la Ig’s” (Etzioni y Ochs,
2004).
La hiper-IgM LX suele originarse debido a una mutación del gen que codifica para
el ligando de CD40 (CD154) en las células T y se hereda de un modo ligado al
cromosoma X. Los pacientes que tienen esta mutación se conocen como hiper-
IgM LX ó hiper-IgM tipo1. En la clasificación más reciente de la Organización
Mundial de la Salud (OMS), a este desorden lo agrupan como una deficiencia
combinada severa, pero todavía está incluida en las deficiencias
predominantemente de anticuerpos por que tiene un fenotipo de
agamaglobulinemia (Rosen y col.1997). Las manifestaciones clínicas
predominantes en estos pacientes incluyen, infecciones recurrentes virales y
bacterianas del tracto respiratorio alto y bajo y, enfermedad intersticial del pulmón
causado por Pneumocystis carinii; neutropenia que puede ser crónica ó cíclica;
16
diarrea crónica ó recurrente. La enfermedad se presenta con infecciones piógenas
recurrentes, incluyendo otitis media, neumonía y septicemia. La neumonía
causada por Pneumocystis es una infección inicial muy frecuente. Aquellos que
logran sobrevivir a los 20 años de edad suelen desarrollar enfermedad hepática
crónica o hepatoma (Levy y col. 1997).
El ligando de CD40 (CD154) se expresa en células T cooperadoras activadas e
interactúa con CD40, el cual se encuentra constitutivamente en la superficie de
las células B, monocitos y células dendríticas. La interacción entre las moléculas
CD40 y su ligando (CD154) lleva a numerosas asociaciones que tiene lugar entre
células del sistema inmune innato y adaptativo. CD154 y CD40 pertenecen a una
gran familia de citocinas y receptores de citocinas. CD154 es miembro de la
familia de citocinas TNF y CD40 de receptores TNF (TNFR). CD154 es una
proteína transmembranal tipo II, que se expresa en la superficie celular en forma
trimérica, puede unirse simultáneamente a tres moléculas de CD40. CD154 se
expresa predominantemente en células T CD4+ activadas, se ha identificado en
algunas células T CD8+ y algunas células T (van Krooten y col., 2000). La
expresión de CD154 en células T activadas es transitoria, por 6 a 10 horas según
la estimulación y se pierde después de 24 horas.
La interacción entre células T y B se basa en contactos célula-célula y factores
solubles (citocinas) tienen una función en la maduración de la respuesta de
anticuerpos. La unión de CD40 y su ligando (CD154) es particularmente
importante para promover la supervivencia de las células B y la inducción del
cambio de isotipo. El entrecruzamiento de CD40 en la superficie de la célula B
promueve su proliferación, el rescate de la apoptosis, induce la expresión de
moléculas de adhesión, la hipermutación somática, el cambio de isotipo y la
generación de células plasmáticas de larga vida. La interacción de CD154-CD40
es requerida para la formación de los centros germinales. Diversas rutas de
señalización son activadas después de la interacción de CD154-CD40, como la
secreción de citocinas (IL-2, IL-4 y IL-10) que inducen la activación de las células
B. Como otros miembros de la superfamilia de receptores TNF, el dominio
citoplasmático de CD40 interacciona con factores asociados a receptores TNF
17
(TRAF) 2, 3 y 6. TRAF-2 y TRAF-3 se unen a sitios del tallo citoplasmático de
CD40 y son esenciales para el cambio de isotipo. Las moléculas TRAF actúan
como proteínas adaptadoras y reclutan diferentes proteínas, como la fosfolipasa
C , c-Jun, BTK, entre otras y el resultado es la activación de factores de
transcripción como AP-1 y NF- B (Notarangelo y col., 2006).
La determinación de la expresión de CD154 por citometría de flujo representa un
método importante para el diagnóstico de síndrome de hiper-IgM tipo I, sin
embargo, para la confirmación de esta enfermedad es necesario un estudio
molecular para determinar mutaciones en el gen de CD154. La estructura del
RNA mensajero de CD154, mostrado en la figura 3, se aprecian las mutaciones
identificados en este gen (Notarangelo y col., 2006).
Figura 3: Representación esquemática del gen de CD154 y las mutaciones encontradas en pacientes con hiper-IgM tipo 1 (Notarangelo y col., 2006).
Aunque la mayoría de los pacientes con hiper-IgM tienen defectos en el de gen de
CD154, se han reportado formas autosómicas recesivas y autosómicas
dominantes de esta enfermedad que indica la presencia de otros defectos
18
genéticos. Se han descrito solo 4 familias con deficiencia de CD40. En todos los
casos la enfermedad es autosómica recesiva y se ha diagnosticado con base en la
falta de expresión de CD40 en la superficie de las células B y los monocitos. Los
hallazgos clínicos de estos pacientes son idénticos a los reportados en los
pacientes con deficiencia de CD154, con infecciones recurrentes debido a
bacterias oportunistas. Esta entidad se le clasifica como hiper-IgM tipo 3 (Ferrari y
col. 2001).
El entrecruzamiento de CD40 da como resultado la activación de la ruta de
señalización de NF- B, la cual es crítica para la hipermutación somática y el
cambio de isotipo. Los pacientes afectados con displasia hipohidrótica
ectodérmica (EDA-ID), tienen la característica de niveles bajos en suero de IgG e
IgA, y concentraciones elevadas o normales de IgM y mala respuesta de
anticuerpos particularmente a los antígenos de polisacáridos (Durandy, 2002). En
muchos casos, la EDA-ID está ligada al cromosoma X y la mutación se encuentra
en el modulador esencial de NF- B (NEMO, también llamado IKK- ). Después del
entrecruzamiento de CD40, se activa IKK y da como resultado la fosforilación de
los inhibidores de NF- B (I B), con lo cual NF- B se puede trasportar al núcleo
para transcribir diversos genes involucrados en la hipermutación somática y el
cambio de isotipo (Notarangelo y col., 2006). Los pacientes con EDA-ID ligado al
X muestran defectos es células B de memoria (IgD- CD27+) y un exceso de
células B vírgenes, que expresan IgM e IgD (Döffinger y col., 2001).
Otras formas de síndromes de híper-IgM causan defectos intrínsecos en las
células B. La deficiencia AID (activation induced deaminase) en humanos fue
descrita a través del análisis de familias con síndrome de hiper-IgM con herencia
autosómica recesiva. El mecanismo de acción de AID es todavía debatido, sin
embargo, diversas líneas de investigación indican que AID es una enzima
reparadora de DNA (Durandy y col, 2005). En la mayoría de los casos la
enfermedad se presenta en niños con infecciones recurrentes en las vías altas y
bajas del tracto respiratorio, infecciones gastrointestinales y del sistema nervioso
central. Los pacientes tienen deficiencia profunda de IgG e IgA, y los niveles de
IgM están incrementados o son normales. El número de células B y T es normal,
19
la proporción de células B de memoria (CD27+) es normal, pero sin cambio de
isotipo (IgM+). La deficiencia de AID en pacientes con hiper-IgM se denomina
hiper-IgM tipo 2 (Revy y col., 2000; Imai y col., 2005).
Se han reportado 3 casos de deficiencia de uracilo N-glicosilasa (UNG) en
humanos. Las 4 mutaciones identificadas en estos pacientes están localizadas en
la región catalítica de la proteína que afecta la expresión tanto de UNG1 y UNG2.
UNG media la desglicosilación y remueve los residuos de desoxiuridina. La
deficiencia de UNG lleva a la incapacidad de remover los residuos generados por
AID con lo cual se acumulan lesiones en la replicación del DNA afectando la
recombinación del cambio de isotipo. En ratón y en humanos el gene de UNG
tiene dos isoformas: UNG 1 y UNG 2. UNG1 se expresa en mitocondrias y UNG2
es una proteína nuclear expresada en células en proliferación. UNG2 esta
asociada al complejo de proteínas de reparación de DNA, el cual es importante en
la hipermutación somática y cambio de isotipo (Schrader y col., 2005). El fenotipo
de los pacientes con deficiencia de UNG muestra defectos profundos en el
cambio de isotipo con muy bajos niveles de IgG e IgA y altas concentraciones de
IgM. La activación in vitro de las células B de pacientes con IL-4, falla en inducir
cambio de isotipo. Los pacientes tienen cantidades normales de células de
memoria (CD27+) que expresan sIgM. Los pacientes con hiper-IgM y deficiencia
de UNG se les denominan hiper-IgM tipo 5 (Imai y col., 2003; Notarangelo y col.,
2006).
20
JUSTIFICACIÓN:
En los últimos 20 años se ha tratado de entender los defectos genéticos de las
inmunodeficiencias primarias, para avanzar en las bases moleculares y celulares
de la patogenia de estas enfermedades. En México las inmunodeficiencias
primarias son de difícil diagnóstico debido principalmente a la falta de pruebas de
laboratorio que caractericen a cada tipo de inmunodeficiencia. Así, el diagnóstico
se basa primordialmente en las manifestaciones clínicas que muestra cada
paciente. Por lo tanto, es importante estudiar pacientes con posible diagnóstico de
inmunodeficiencia primaria (humoral) para determinar el origen de su enfermedad
mediante la determinación de las moléculas que estén involucradas en estas
patologías, para clasificar los grupos encontrados y así orientar el defecto
molecular; apoyar el diagnóstico clínico y para ofrecer un tratamiento mas
especifico a cada paciente; finalmente dar un consejo genético a las familias
afectadas.
HIPÓTESIS:
Los pacientes mexicanos con inmunodeficiencias humorales del tipo CVID e hiper-
IgM presentan defectos en alguna de las moléculas de coestimulación TACI,
ICOS, CD40 y CD154 ó en algunas de las enzimas como AID ó UNG.
21
OBJETIVO GENERAL:
Determinar los posibles defectos moleculares que expliquen el fenotipo de CVID ó
hiper-IgM en pacientes mexicanos.
OBJETIVOS PARTICULARES:
Determinar las poblaciones de leucocitos (CD45), linfocitos B (CD19),
linfocitos T (CD3, CD4, CD8), células NK (CD16+56) y monocitos (CD14),
por citometría de flujo en pacientes y en testigos sanos.
Determinar las sub-poblaciones de células B en sangre periférica: célula B
madura (CD22 +, CD27 -) y célula B de memoria (CD22 +, CD27 +), por
citometría de flujo en pacientes y testigos sanos.
Determinar la expresión de ICOS, TACI, CD154, CD40 por citometría de
flujo en pacientes y testigos sanos.
Determinar el tipo de mutación en el gen CD154, en los pacientes que no
expresen la proteína CD154.
Clasificar a los pacientes de acuerdo a los resultados de citometría e
historial clínico, para confirmar el diagnóstico y determinar el tipo de
mutación presente.
22
II. MATERIAL Y MÉTODOS:
Tipo de investigación
Estudio prospectivo, descriptivo, transversal, cuasi experimental de una serie de
pacientes pediátricos con diagnóstico de CVID e hiper-IgM.
Criterios de inclusión
Los pacientes que se incluyeron en este estudio, fueron individuos de
menos de 16 años previamente diagnosticados con la enfermedad de CVID
o hiper-IgM, según los criterios establecidos para Inmunodeficiencias
Primarias (Conley y col., 1999), que asisten para su evaluación al Instituto
Nacional de Pediatría, SSa; ó individuos de edad pediátrica o adultos que
asisten al Centro Médico Nacional “La Raza” del IMSS.
Los padres y/o tutores o el paciente mismo que acepten mediante la firma
de consentimiento informado participar en el estudio, conforme al comité de
ética de 1975 de Helsinki.
Criterios de exclusión
Pacientes en los que se detecten causas secundarias de
hipogammaglobulinemia (ver tabla 1 en Anexo).
Pacientes que reciban fármacos inmunosupresores
Criterios de eliminación
Pacientes en quienes no se puedan obtener las muestras necesarias para
realizar el estudio ó que, decidan retirarse del estudio.
Obtención de de muestras
Se obtuvieron muestras de 20 mL de sangre periférica de los pacientes y
controles sanos, utilizando para ello el sistema Vacutainer® con tubos
heparinizados (Becton Dickison, San José, CA) (BD). De estas muestras se utilizó
23
1mL para la determinación de las poblaciones leucocitarias. El resto de la muestra
se utilizó para la obtención de células mononucleares (PBMC’s) mediante
centrifugación en Histopaque (Sigma, Chemical Co., St Louis, MO).
Análisis de poblaciones celulares en sangre periférica
Se obtuvo una muestra de sangre total de los pacientes y testigos sanos para
realizar una tipificación por citometría de flujo. Se realizaron tinciones para
determinar las proporciones de las diferentes poblaciones celulares, para lo cual
se emplearon 30 l de sangre periférica sin activar y se incubaron durante 20
minutos con 5 µl de las siguientes mezcla de anticuerpo monoclonales (mAB):
antiCD45 FITC/antiCD14 PE(BD); antiCD3 FITC/antiCD19 PE/antiCD45
PerCP(BD); antiCD4 FITC/antiCD8 PE/antiCD3 PerCP(BD); antiCD3
FITC/antiCD16+56 PE/antiCD45 PerCP(BD); control de isotipo antiCD45 PerCP/ 1
FITC/ 1 PE (BD). Las muestras fueron incubadas 20 minutos a temperatura
ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, los eritrocitos fueron lisados
con 500 µl de solución de lisis FACS (BD), se incubaron durante 10 minutos más
y posteriormente se lavaron con PBA (PBS con 1% de albúmina sérica humana).
Las células se fijaron con PBS conteniendo 1% de formaldehído. La adquisición y
análisis se describe más adelante.
Análisis de expresión de las sub-poblaciones de células b en sangre
periférica
La expresión de sub-poblaciones de células B se determinó en PBMC’s por
citometría de flujo. Las PBMC’s fueron teñidas con una mezcla de anti-CD19 APC
(BD); anti-CD22 PE-Cy5 (BD) y CD27 PE (BD); se incubaron por 20 minutos a
temperatura ambiente y en oscuridad. Las muestras fueron lavadas con PBA y
fijadas con PBS conteniendo 1% de formalina. La adquisición y análisis se
describe más adelante.
24
Determinación de la expresión de CD40
Para determinar la expresión de CD40, las PBMC’s se incubaron con una los
siguientes anticuerpos: anti-CD40 PE (BD) y anti-CD19 APC (BD) (para analizar la
expresión en células B) y anti-CD40 PE (BD) y anti-CD14 PerCP (BD) (para
analizar la expresión en monocitos). Las células se incubaron 20 minutos a
temperatura ambiente en la oscuridad. Después, fueron lavadas con PBA y fijadas
con PBS conteniendo 1% de formalina. El análisis se describe más adelante.
Determinación de la expresión de TACI
En resumen, las PBMC’s se incubaron con la mezcla de anti-TACI PE (BD) y anti-
CD22 PE-Cy5 (BD) durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
Después, las muestras fueron lavadas con PBA y fijadas con PBS conteniendo 1%
de formalina.
Determinación de la expresión de CD154
La expresión de CD154 se evaluó en células T activadas. Para la determinación
de CD154 las PBMC’s fueron cultivadas por 5 horas a una densidad de 2 X 106
células bajo condiciones estándar (37ºC, 5% CO2) en medio RPMI 1640 (GIBCO–
BRL, Gaithersburg, MO) suplementado con 10% SFB (PAA; Australia), 1mM L-
glutamina, penicilina en 100 unidades/ml y estreptomicina a 10 g/ml (GIBCO) en
presencia de 10 ng/ml de phorbol 12-myristrato 13-acetato (PMA, GIBCO –BRL,
Gaithersburg, MO) y de 1 g/ml de ionomicina (Sigma, St Louis MO). Después,
los PBMC’s se tiñeron con una mezcla de anti-CD3 PerCP(BD), anti-CD154 PE
(BD) y anti-CD69 FITC (BD), se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente en
la oscuridad. Posteriormente, las muestras fueron lavadas con PBA y fijadas con
PBS conteniendo 1% de formalina. El análisis se describe más adelante.
Determinación de la expresión de ICOS
Para ICOS, las PBMC’s fueron incubadas toda la noche bajo las condiciones de
activación descritas en la sección anterior. Posteriormente, las PBMC’s fueron
teñidas con una mezcla de anti-CD3 PerCP (BD), anti-ICOS PE (BD) y anti-CD69
25
FITC (BD). Las células se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad. Finalmente, las muestras fueron lavadas con PBA y fijadas con PBS
conteniendo 1% de formalina. Tanto para la tinción de CD154 como de ICOS se
usaron como testigos negativos células sin activar y para evaluar la activación se
analizó la expresión de CD69. El análisis se describe más adelante.
Adquisición y análisis
Se adquirieron 10,000 eventos para el análisis de las poblaciones leucocitarias en
sangre periférica y 100,000 eventos para los análisis de las moléculas
involucradas en el fenotipo CVID en las PMBC’s. Las muestras fueron leídas en el
FACScalibur® (BD). Los datos se analizaron con el software Flow.Jo 7.2.4 (Tree
Star. Inc. 1997-2009).
TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Extracción de RNA
La extracción de RNA se realizó a partir de 3x106 células PBMC's, que se lisaron
con Trizol, se adicionaron Cloroformo- alcohol isoamílico, recuperando la fase
acuosa la cual se precipitó con isopropanol. La pastilla de RNA se lavo con etanol
al 75%. La concentración del RNA se llevo acabo determinando, por
espectrofotometría, la absorbancia a 260 y a 280 nm.
Síntesis de cDNA
La síntesis de DNA complementario se realizó utilizando 1 l RNA total en una
mezcla de reacción con un volumen final de 20 L:
Oligo (dT) 1 L
dNTPs (10mM) 1 lL
RNA 1 L
Agua inyectable c.b.p. 13 L
26
Los tubos de reacción se colocaron en el termociclador a 72º C durante 5
minutos y posteriormente se ponen en hielo para permitir el alineamiento del oligo
(dT) con el molde, posteriormente se adiciono los siguientes reactivos:
Regulador de reacción 5x 4 L
DTT 0.1M 2 L
Las muestras se introdujeron nuevamente al termociclador a 42ºC durante 2
minutos para adicionar finalmente 200 unidades de transcriptasa reversa. La
síntesis del cDNA se llevó a cabo incubando las muestras durante 50 minutos a
42ºC, y a 72ºC por 15 minutos más.
Amplificación de CD40L por reacción en cadena de la polimerasa
La amplificación de CD40L se llevo a cabo a partir de las muestras de cDNA, para
esto, empleamos la siguiente mezcla de reacción con un volumen final de 50 µL
(Invitrogen):
Regulador de reacción 10x 5 µL
MgCl2 50mM 1.5 µL
dNTPs 10mM 1 µL
Iniciador 5’ 10pmoles/µl 3 µL
Iniciador 3’ 10pmoles/µl 3 µL
Taq DNA polimerasa 5U/µl 0.4 µL
cDNA molde 2-4 µL
Agua inyectable c.b.p. 50 µL
Las condiciones de la reacción fueron las siguientes:
1 ciclo 95ºC 5 minutos
35 ciclos 95ºC 30 segundos
Tm 30 segundos
72ºC 1 minuto por cada 1000pb
1 Ciclo 72ºC 8 minutos
Iniciadores empleados para amplificar CD40L (Lee W y col. 2005).
27
Sentido Antisentido Tm (oC)
GCCAGAAGATACCATTTC CCGCTGTGCTGTATTATGA 50
Electroforesis de los productos de PCR en geles de agarosa
Los productos de PCR se prepararon con regulador de carga para DNA y se
utilizaron 5 µL de cada muestra para correr electroforesis en geles de agarosa al
1% preparados en TAE 1x (Tris-ácido acético-EDTA) y conteniendo de 0.1 a 0.5
µg/mL de bromuro de etidio. La electroforesis se realizó a 100V durante 45
minutos, para finalmente visualizar los productos amplificados en un
transiluminador de luz ultravioleta (Kodak). El tamaño de los amplificados
obtenidos se determinaron por medio del uso de un marcador de DNA
(Fermentas).
Clonación de productos de PCR
Reacción de ligación
Una vez que se determinó por medio de la electroforesis si los productos de PCR
obtenidos tuvieron una longitud anormal, se procedió a clonarlos para su posterior
secuenciación.
Para esto, los productos amplificados se ligaron con el vector pCR2.1 de acuerdo
al protocolo descrito para el kit de clonación TOPO TA® Cloning (Invitrogen,
Carlsbad CA) en las siguientes condiciones:
Producto de PCR 0.5 a 4 µg
Solución de salina (NaCl) 1 µL
Agua inyectable c.b.p. 5 µL
TOPO vector 1 µL
Las reacciones de ligación se incubaron durante 5 minutos a temperatura
ambiente.
28
Transformación de los productos de ligación en Escherichia coli DH5
La transformación se realizó utilizando 5 µL del producto de ligación con 100-200
µl de bacterias competentes, se incubó por 30 minutos a 4ºC, seguido por un
choque térmico a 42ºC por dos minutos y a 4ºC por un minuto más. Las bacterias
transformadas se cultivaron por una hora en 1 mL de medio SOC a 37ºC en
agitación, para finalmente centrifugarlas a 1000g por 5 minutos y resembrar por
espatulado el botón bacteriano resuspendido en 100 µL de medio LB en una placa
de agar LB conteniendo 150 µg/mL de ampicilina y preparada recientemente con
40 µl de IPTG 100mM y X-Gal 40 mg/mL.
Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche y posteriormente se llevo
acabo la selección de colonias positivas para el producto de PCR clonado.
Selección de colonias positivas por PCR
Se realizó una selección de colonias conteniendo el inserto de interés por PCR.
Para esto, se seleccionaron un promedio de 10 colonias blancas por placa, y se
resembraron en una placa de LB-ampicilina, al mismo tiempo, se resuspendieron
en 6 µl de agua inyectable con la cual se monto una reacción de PCR utilizando
los iniciadores M13 (ver apéndice) que reconocen una secuencia del vector
pCR2.1. La reacción de PCR se llevo acabo bajo las siguientes condiciones:
Regulador de reacción 10x 2.5 µL
MgCl2 50mM 0.75 µL
dNTPs 10mM 0.5 µL
Iniciador 5’ 10pmoles/µl 1.5 µL
Iniciador 3’ 10pmoles/µl 1.5 µL
Taq DNA polimerasa 5U/µl 0.2 µL
Suspensión bacteriana 6 µL
Agua inyectable c.b.p. 25 µL
Las condiciones del PCR fueron las siguientes:
1 ciclo 95ºC 5 minutos
35 ciclos 95ºC 30 segundos
29
50ºC 30 segundos
72ºC 1 minuto por cada 1000pb
1 Ciclo 72ºC 8 minutos
Las colonias positivas fueron aquellas que dieron un producto de PCR del tamaño
del inserto de 1000 pb de bases que corresponden a la secuencia del vector.
Purificación de plásmidos a partir de las colonias positivas
Las colonias seleccionadas se resembraron en 5 mL de medio LB + ampicilina a
37ºC durante toda la noche. La purificación del vector bacteriano se realizó
siguiendo el protocolo establecido para el kit QIAprep Miniprep (Quiagen).
Secuenciación y análisis
La secuenciación se realizó a partir de los vectores purificados y empleando tanto
los iniciadores M13 sentido y antisentido. La secuenciación se realizó en la unidad
de secuenciación del Instituto de Fisiología Celular, UNAM en un secuenciador
automatizado (ABI PRISM 310 Genetic analyzer, Perkin-Elmer Applied
Biosystems, Foster City CA). Los resultados de la secuencia se analizaron
empleando el programa Vector NTI (Invitrogen), comparando con las secuencias
reportadas en la página electrónica del GeneBank con número de acceso NM
000074. El uso de este programa nos permite predecir el tipo de cambio que se
origina tanto a nivel de DNA como a nivel de proteína.
30
III. RESULTADOS
1.- Características clínicas de los 25 pacientes con Inmunodeficiencia
Humoral
Los pacientes que se estudiaron en este trabajo fueron compatibles con un
fenotipo de CVID ó hiper-IgM. Los pacientes analizados fueron 15 masculinos y 10
femeninos. La media de edad fue de 15 años en hombres y 19 años en mujeres.
El intervalo transcurrido desde la aparición de los síntomas hasta su diagnóstico
fue tardío, el tiempo promedio entre el inicio de síntomas y el diagnóstico fue de
6.6 años (tabla 3). Todos los pacientes presentaron hipogammaglobulinemia
principalmente de IgG e IgA; la concentración de IgM fue variable, casi todos los
pacientes expresaron células B excepto los pacientes 3, 11, 21 y 23, como se
muestra en la tabla 2. Todos los pacientes presentaron infecciones recurrentes
comunes para inmunodeficiencias primarias humorales. El síntoma más común
fue la neumonía, diarrea crónica y sinusitis como se muestra en la tabla 3. Los
agentes infecciosos mas comunes en estos 25 pacientes fueron el Streptococcus
pneumoniae y el Haemophilus influenzae (datos no mostrados). Revisando los
antecedentes familiares destaca el paciente 6, quien tuvo un hermano que murió a
causa de un linfoma de Hodgkin, el paciente 8 que tiene 3 hermanos con CVID, un
hijo con déficit de IgA y patología tiroidea. Se sospecha consanguinidad en la
familia del paciente 15; los pacientes 16 y 17 son hermanos y ambos presentan
CVID. La madre del paciente 20, presenta esferocitosis; el paciente 21 tiene el
antecedente de un hermano finado por hepatitis fulminante y agamaglobulinemia;
y por último los pacientes 16, 19 y 22 fueron los que tuvieron un inicio de síntomas
a muy temprana edad (meses) con complicaciones clínicas graves y
microorganismos pocos comunes como: Pseudomona aeruginosa, Serratia
marscescens, Klebsiella pneumonie (paciente 16); Cándida albicans (paciente 19);
y Pneumocitis carinii (paciente 22). El paciente 20 a muy temprana edad se le
realizó el diagnóstico por ser hermano menor del paciente 19. Seis pacientes
reportan reacciones alérgicas, destacando la hipersensibilidad a antibióticos beta-
31
lactámicos, de uso común en infecciones secundarias a las inmunodeficiencias
humorales
Tabla 2. Valor absoluto de linfocitos B y concentración sérica de inmunoglobulinas
en los 25 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
32
Tabla 3. Características y manifestaciones clínicas en los 25 pacientes con inmunodeficiencias humorales.
33
2.- Análisis de las poblaciones de leucocitos.
Se determinó la proporción de las poblaciones celulares en sangre periférica, tanto
en los pacientes como en testigos sanos, empleando una doble tinción con anti-
CD45-FITC y anti-CD14-PE, como se muestra en la figura 4.
TESTIGO PACIENTE
Figura 4. Análisis de las poblaciones celulares en sangre periférica. La mezcla de anticuerpos empleada fue: anti-CD45-FITC/CD14-PE. Se muestra las gráficas de contorno CD45-FITC vs CD14. Tomada de la población de leucocitos, (R2): población de
polimorfonucleares (PMN); (R3): población de monocitos; y (R1): población de linfocitos.
Con base en los resultados obtenidos en las gráficas de la figura 4 y con los datos
de la cantidad de leucocitos por mm3 en sangre se pudo calcular con la cámara de
Newbauer el número absoluto de cada una de las poblaciones leucocitarias de
sangre periférica por medio de la siguiente fórmula:
34
A los valores absolutos de leucocitos, PMN, linfocitos y monocitos de los testigos
sanos de este estudio se les calculó la media y desviación estándar por rango de
edad como se muestra en las tablas 4, 5, 6 y 7:
Tabla 4. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos sanos de 1 a 5 años de edad, representado por la media, la desviación estándar
y los límites menor y mayor.
Tabla 5. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos de 6 a 10 años de edad, representados por la media, la desviación estándar y los
límites menor y mayor.
Leucocitos
Totales Neutrófilos Linfocitos Monocitos
MEDIA 6929 3561 2778 493
DS 2055 1303 951 146
LÍMITE MENOR 4874 2258 1827 348
LÍMITE MAYOR 8985 4864 3730 639
Leucocitos Totales Neutrófilos Linfocitos Monocitos
MEDIA 8171 4071 3203 524
DS 2108 1219 1077 171
LÍMITE MENOR 6063 2852 2126 353
LÍMITE MAYOR 10278 5290 4280 695
35
Tabla 6. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 30 testigos sanos de 11 a 17 años de edad, representados por la media, la desviación
estándar y los límites menor y mayor.
Tabla 7. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 19 testigos sanos de edad adulta, representados por la media, la desviación estándar y los
límites menor y mayor.
Leucocitos
Totales Neutrófilos Linfocitos Monocitos
MEDIA 7089 4231 2234 437
DS 1326 1066 539 138
LÍMITE MENOR 5763 3165 1695 299
LÍMITE MAYOR 8416 5297 2773 574
Leucocitos
Totales Neutrófilos Linfocitos Monocitos
MEDIA 6603 3431 2446 483
DS 1239 955 572 120
LÍMITE MENOR 7843 4385 3018 603
LÍMITE MAYOR 5364 2476 1874 363
36
Tabla 8. Datos de los valores absolutos de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los 25 pacientes:
37
Figura 5. Análisis, en valores absolutos de las poblaciones de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los testigos y pacientes pareados por edad. Con los datos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos en mm3 de los testigos sanos (n=76) se dividieron en intervalos de edad; 1 a 5 años (n=17), 6 a 10 años (n=17), 11 a 17 años (n=30) y adultos (n=19) y se calculó el promedio y su desviación estándar. Los valores absolutos de los pacientes, divididos por edad, comparados con X±DS de los testigos sanos en su edad correspondiente. El cuadro negro representa la media de los testigos sanos, las líneas verticales representan su desviación estándar.
38
3.- Análisis de las poblaciones de linfocitos T, linfocitos B y células NK y
sub-poblaciones de células T
Para el análisis se llevaron a cabo tinciones triples, por un lado se realizaron
tinciones con los anticuerpos anti-CD3-FITC/anti-CD19-PE/anti-CD45-PerCP y por
otro lado se emplearon los anticuerpos anti-CD3-FITC/anti-CD16+56-PE/anti-
CD45-PerCP como se muestra en la figura 6. La proporción de las poblaciones de
células B, T o NK se hizo dentro de una región de células CD45+, a partir de la
cual se calculó la proporción de células B, T y NK.
Figura 6. Análisis de las poblaciones de células T, B y NK. El análisis de cada población se realizó sobre una región de células CD45+, a partir de la cual se muestra la proporción de las células B (CD19), NK (CD16+56) y T (CD3).
PACIENTE TESTIGO
39
Para el análisis de las sub-poblaciones de células T se llevó a cabo una tinción
triple con los anticuerpos anti-CD4-FITC/anti-CD8-PE/anti-CD3-PerCP. Las
proporciones de células CD4+ y CD8+ se determinaron dentro de una región de
células CD3+, a partir de la cual se calcularon las proporciones de células TCD4+
y células T CD8+, como se muestra en la figura 7.
Figura 7. Porcentaje de células CD8+ y CD4+ en las muestras de los pacientes y de los testigos. Las gráficas que se muestran se realizaron capturando las células dentro en una región CD3+.
Los datos de los linfocitos CD3, CD19+, CD16+56, CD4+ y CD8+ se muestran en
la tabla 9, 10, 11,12 y 13:
Tabla 9. Valores absoluto de células T CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 1 a 5 años, representado por media, desviación estándar y los límites
menor y mayor.
CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56
MEDIA 2139 1161 799 466 561
DS 694 483 350 175 370
LÍMITE MENOR 1445 679 449 291 190
LÍMITE MAYOR 2833 1644 1149 640 931
PACIENTE TESTIGO
40
Tabla 10. Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19 + y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 6 a 10 años, representado por la
media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56
MEDIA 1884 1035 713 340 394
DS 510 394 235 180 209
LÍMITE MENOR 1374 641 478 159 186
LÍMITE MAYOR 2394 1429 949 520 603
Tabla 11. Valores absolutos de células T CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19* y células NK CD16+56+ en 30 testigos sanos de 11 a 17 años, representado por la
media, la desviación estándar y los límites menor y mayor. .
CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56
MEDIA 1682 879 695 294 415
DS 507 233 321 130 233
LÍMITE MENOR 1175 646 374 163 182
LÍMITE MAYOR 2190 1111 1016 424 648
Tabla 12. Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 19 testigos sanos de edad adulta, representado por la
media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.
CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56
MEDIA 1602 911 582 221 449
DS 507 319 245 108 167
LÍMITE MENOR 1095 592 337 113 282
LÍMITE MAYOR 2110 1230 827 329 615
41
Tabla 13. Datos de los valores absolutos de células T, sub-poblaciones de células T, células B, células NK de los 25 pacientes.
42
Figura 8. Valores absolutos de las poblaciones de células T CD3+, células B CD19+, células NK CD16+56, células T CD4+ y células T CD8+ de los testigos sanos y pacientes pareados por edad. Con los datos de las células T CD3+, las células B CD19+, las células NK CD16+56, las células T CD4+ y las células T CD8+ en mm3 de los testigos sanos (n=76) se dividieron en intervalos de edad; 1 a 5 años (n=20), 6 a 10 años (n=21), 11 a 17 años (n=26) y adultos (n=10) y se calculó el promedio y su desviación estándar. Los valores absolutos de los pacientes, divididos por edad, comparados con X±DS de los testigos sanos en su edad correspondiente. El cuadro negro representa la media de los testigos sanos, las líneas verticales representan sus
desviaciones estándar.
43
Los hallazgos mostraron que la población de pacientes adultos tuvo una
importante disminución de sus poblaciones leucocitarias, pero principalmente de
las células TCD4+ y de las células B (fig.5 y 8). Los pacientes que se encontraron
en el rango de edad entre 6 y 10 años y 11 a 17 años tuvieron un comportamiento
parecido, donde los hallazgos que se encontraron es que ambos mostraron una
disminución importante de células B y los pacientes menores de 5 años tuvieron
un comportamiento irregular y en la mayoría de los casos sus concentraciones
leucocitarias se encontraron por arriba de los valores de referencia para su edad.
44
4.- Determinación de las sub-poblaciones de células B
Se determinaron las sub-poblaciones de células B, en la población de células B
CD19+ se analizó la expresión de células B CD22+ y CD27+ que corresponde a
la población de memoria como se muestra en la fig. 9. Los datos del porcentaje
de expresión de los 25 pacientes y 15 testigos sanos se describen en las tablas
14 y 15 respectivamente. El 40% de los pacientes (n=25) tuvieron menos de 20%
de células B de memoria comparado con los testigos sanos (n=15), estos últimos
ese encontraron entre 30% y 60% con una media de 40%.
Figura 9. Determinación de las sub-poblaciones de células B. En la población de células B CD19+, se determinó el porcentaje de células B de memoria (CD22+, CD27+) y células B maduras (CD22+, CD27-)
47
Figura 10. Porcentaje de expresión de células B CD22+, CD27+. Los porcentajes obtenidos de células B CD22+, CD27+ tanto de pacientes (n= 25) como de testigos sanos (n=15) fueron comparados. La línea negra representa la media correspondiente.
48
5.- Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo a su porcentaje de
células B de memoria
Con los datos de la figura 10 se clasificó a los pacientes con CVID (n=21) de
acuerdo a sus células B de memoria CD27+, CD22+. Pacientes con menos de
20% de células B de memoria se le asignó como grupo 1(n=8); pacientes con
más de 20% células B de memoria se le asignó como Grupo 2 (n=9); pacientes
con menos de 1% de células B se les asignó como grupo 3 (n=4). Estos grupos se
correlacionaron con los hallazgos del expediente clínico como se muestra en la
tabla 16.
Tabla 16. Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo al porcentaje de células B de memoria y sus características cínicas.
49
6.- Análisis de la expresión de CD154
La expresión de CD154 y CD69 (control de activación) se determinó en células T
activadas CD3+, como se muestra en la figura 11. Se analizaron 17 pacientes y 7
testigos sanos. Los resultados en porcentaje de los pacientes y testigos sanos se
describen en las tablas 17 y 18 respectivamente. Los hallazgos del análisis se
muestran en la figura 12. Los pacientes 16, 19, 20 y 22 mostraron una diminución
drástica de la proteína CD154, por lo que fueron analizadas para detectar las
mutaciones en el gen de CD154.
Figura 11. Histogramas que muestran la expresión de CD154. La expresión de CD154 se determinó en células T activadas CD3+ usando CD69 como control de activación.
50
Tabla 17. Porcentaje de expresión de CD154 en 17 pacientes con inmunodeficiencias
humorales.
Tabla 18 Porcentaje de expresión de CD154 en 7 testigos sanos
51
Figura 12. Análisis de expresión de la proteína CD154 en pacientes y testigos sanos. El porcentaje de expresión de CD154 de los pacientes (n= 17) y testigos sanos (n= 7) fue comparada, la línea negra representa la media correspondiente.
52
7.- Análisis de la expresión de CD40
La expresión de CD40 se determinó en las células B (CD19+) y en los monocitos
(CD14+), como se muestra en la figura 13. Se analizó la expresión de CD40 en
células B en 18 pacientes y 8 testigos sanos; y en los monocitos en 14 pacientes
y 5 testigos sanos como se describe en las tablas 19, 20, 21 y 22. Los hallazgos
del análisis se muestran en la figura.14. El paciente 11 expresó de manera muy
disminuida CD40 en monocitos, y en las células B no se determinó ya que tuvo
una cantidad muy disminuida de estas células.
Figura 13. Histogramas que muestran la expresión de CD40. La expresión de CD40 se determinó en células B (CD19+) y en monocitos (CD14+).
53
Tabla 19. Porcentaje de células B que expresan CD40 en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
Tabla 20. Porcentaje de células B que expresan CD40 en 8 testigos sanos
54
Tabla 21. Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 14 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
Tabla 22 Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 6 testigos sanos.
55
Figura 14. Análisis de la expresión de CD40 en células B y monocitos de pacientes y testigos sanos. La expresión de CD40 se determino en células B (CD19+) y monocitos (CD14+). Se compararon las poblaciones de los pacientes CD19+ (n=18) y CD14+ (n=14) con las de los testigos sanos CD19+ (n= 8) y CD14+ (n=6). La línea negra representa la media correspondiente.
56
8.- Análisis de la expresión de ICOS
La expresión de ICOS y CD69 (control de activación) se determinó en células T
CD3+ activadas como se muestra en la figura 15. Se analizaron 17 pacientes y 7
testigos sanos. Los resultados de los pacientes y controles sanos se describen en
la tabla 23 y 24 respectivamente. Los hallazgos del análisis se muestran en la
figura 16. Los pacientes 21 y 25 expresan un porcentaje muy bajo de ICOS.
Figura 15. Histogramas que muestran la expresión de ICOS. La expresión de ICOS se determinó en células T CD3+activadas usando CD69 como control de activación.
57
Tabla 23. Porcentaje de células T que expresan ICOS en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral
Tabla 24. Porcentaje de células T que expresan ICOS en 5 testigos sanos
58
Figura 16. Análisis de la expresión de ICOS en células T de pacientes y testigos sanos. El porcentaje de expresión de ICOS de los pacientes (n= 18) y testigos sanos (n= 5) fue comparada, la línea negra representa la media correspondiente.
59
9.- Análisis de la expresión de TACI en células B maduras
En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI, como se muestra en la
figura 17. Se analizaron 17 pacientes y 6 testigos sanos. Los resultados en
porcentaje de los pacientes y controles se describen en la tabla 25 y 26
respectivamente. Los hallazgos del análisis de muestran en la figura 18. El
promedio del porcentaje de expresión en los testigos (n= 5) fue de 36% y el
promedio de los pacientes (n=17) fue de 31.
Figura 17. Histogramas que muestran la expresión de TACI. En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI.
60
Tabla 25. Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 17 pacientes con inmunodeficiencia humoral.
Tabla 26. Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 6 testigos sanos
61
Figura 18. Análisis de expresión de TACI en células B maduras de pacientes y testigos sanos. En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI, el porcentaje de expresión en los testigos sanos (n= 6) y el de los pacientes (n= 17) se comparó. La línea negra representa la media.
PACIENTES TESTIGOS
62
10. Análisis de las mutaciones en CD154 en los pacientes 16, 19, 20 y 22
La proteína CD154 es una molécula involucrada con los casos de Hiper-IgM tipo 1.
El análisis de mutaciones se realizó analizando el mRNA de CD154; para esto, se
obtuvo mRNA a partir de PBMC’s de sangre periférica y se amplificó la secuencia
correspondiente a CD154 utilizando los siguientes iniciadores:
Sentido Antisentido Tm (oC)
GCCAGAAGATACCATTTC CCGCTGTGCTGTATTATGA 50
Los productos amplificados se corrieron en geles de agarosa y se revelaron con
bromuro de etidio, de acuerdo a lo descrito en la sección de materiales y métodos.
Como se aprecia en la figura 19, en todos los pacientes se les detectaron mRNA
del tamaño esperado 1000pb. Todos estos transcritos se clonaron en el vector
TOPO TA® para su secuenciación automatizada, con el objetivo de determinar el
tipo de mutación (figura 20).
De los 15 pacientes a los cuales se les determinó la expresión de CD154 por
citometría, únicamente los pacientes 16, 19, 20 y 22 no expresaron CD154 y se
procedió a la caracterización de posibles mutaciones. El paciente 16 presentó un
codón de paro prematuro, originado por el cambio de la C730 por una T, lo cual
origina una proteína que carece de los últimos 42 aminoácidos presentes en su
dominio TNFH (Dominio de homología a TNF); además, presenta una mutación
puntual que se localiza en el dominio extracelular y que a nivel de proteína
produce el cambio de la K52 por una arginina. La mutación C370T, que da origen
al codón de paro prematuro, se encuentra reportada en la base datos para CD154
(Lee W y col. 2005), no así la mutación K52R. El paciente 19 presenta tres
mutaciones puntuales; la primera mutación se localiza en el dominio extracelular y
origina el cambio de la K106 por una metionina, las mutaciones A123E y F177C se
localizan en el dominio TNFH. Solo la mutación A123E ha sido reportada como
causal de síndrome de Hiper-IgM (Prasad M y col. 2005). El paciente 20, es
hermano del paciente 19, pero él solo presenta una mutación A123E, por lo que
ésta puede ser la causa de la inmunodeficiencia. El paciente 22 presenta una sola
63
mutación puntual en el dominio TNFH, en esta mutación se sustituye la histidina
125 por una tirosina. Esta mutación ya ha sido reportada en pacientes con Hiper-
IgM; sin embargo, es la primera vez que se describe la sustitución de la histidina
por tirosina. Los hallazgos encontrados se describen en la tabla 27.
a)
b)
c)
Figura 19. Resultados de la amplificación por PCR de CD154 en los pacientes a) P16, b) P20, 1 c) P19 y P22.
64
Figura 20. Selección de clonas positivas para el gen CD154 en el pacientes 19. El
cuadro negro muestra las clonas seleccionadas para la secuenciación.
65
a)
b)
Figura 21. Mutaciones del gen CD154 en el paciente 16. a) Análisis del cDNA y b) análisis “in silico” para determinar su efecto en la proteína. Las flechas rojas muestran los cambios que existieron con el gen de C154 que se usó como patrón.
66
a)
b)
Figura 22. Mutaciones del gen CD154 en el paciente 19. a) Análisis del cDNA y b) análisis “in silico” para determinar su efecto en la proteína. Los cuadros negros muestran los cambios que existieron con el gen de C154 que se usó como patrón.
67
a)
b)
Figura 23. Mutaciones del gen CD154 en el paciente 22. a) Análisis del cDNA y b) análisis “in silico” para determinar su efecto en la proteína. Los cuadros negros muestran los cambios que existieron con el gen de C154 que se usó como patrón.
68
a)
Figura 24. Mutaciones del gen CD154 en los pacientes 19 y 20 a) Análisis del cDNA. El cuadro negro muestra el cambio que existió con el gen de C154 que se usó como patrón. Tabla 27. Resumen de las mutaciones encontradas en el gen de CD154 de los pacientes con Síndrome de hiper-IgM (Tipo 1).
Pacientes Edad (años)
Sexo Mutación Dominio afectado
Cambio (Proteína)
Referencias
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Extracel. TNFH
K52R Q220X
NR Lee y col.. 2005
19 6 M cA317 T cC368 A cT530 G
Extracel. TNFH TNFH
K106M A123E F177C
NR Prasad y.col.,2005 NR
20 8 m M cC368 A TNFH A123E Prasad y col., 2005
22 5 M cC373 T TNFH H125Y NR
69
IV. DISCUSIÓN:
En el estudio de las IDP’s, es muy importante determinar las poblaciones
leucocitarias (CD3, CD4, CD8, CD19 y CD16+56) por que con estas pruebas se
puede estudiar la presencia y número de células implicadas en la respuesta
inmunitaria. En este trabajo se determinaron las poblaciones leucocitarias a 83
testigos sanos que se dividieron por los rangos de edad 1 a 5 años (n=17); 6 a 10
años (n=17); 11 a 17 años (n=30) y adultos (n=30). A estas determinaciones se les
calculó la media y desviación estándar para obtener intervalos de confianza con
los cuales comparamos a los pacientes con inmunodeficiencias
predominantemente de anticuerpos, como se muestran en las tablas 4 a la 13.
Después del análisis de las poblaciones leucocitarias en los 25 pacientes que se
muestran en la figura 7 y 8, llamó la atención que el grupo de edad adulta
presentó concentraciones bajas en sus leucocitos totales encontrándose la
mayoría por debajo de los valores de referencia; mientras que en los otros grupos
de edad, entraron en los valores de referencia. En cuanto a los valores absolutos
de neutrófilos, los pacientes del grupo de edad de 1 a 5 años, la mayoría se
encontraron en el límite inferior y solo un paciente por debajo de los valores de
referencia, esto se explica por que en este grupo se encuentran todos los
pacientes con hiper-IgM y esta enfermedad se caracteriza por neutropenias
crónicas (Winkelstein y col., 2003). En los otros grupos de edad los valores
absolutos de neutrófilos de los pacientes se encontraron dentro de los valores de
referencia. Los linfocitos totales se encontraron altos en los pacientes de 1 a 5
años, irregulares en los pacientes de 11 a 17 años y bajos en los pacientes de 6 a
10 años y en los adultos. En los monocitos, el comportamiento de los pacientes en
los 4 grupos de edad fue parecido. En células T, sub-poblaciones de células T y
células NK solo los pacientes del grupo de edad adulto estuvieron por debajo del
valor de referencia, esto es debido a que estos pacientes mostraron leucopenias
importantes. En las células B los pacientes de edad adulta se encontraron todos
por debajo de los valores de referencia. Todavía no se explica si la disminución
de las células T ó de las células B es la causa de la inmunodeficiencia o es una
70
causa secundaria por las infecciones repetidas en el paciente inmunodeficiente. El
comportamiento heterogéneo en cuanto a las sub-poblaciones leucocitarias ha
sido previamente reportado en CVID, donde los diferentes defectos genéticos
pueden afectar a diferentes tipos de células (Vlková y col. 2005).
La inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos son un grupo de
desordenes que se caracterizan por la ausencia absoluta de todas las clases de
anticuerpos o la ausencia selectiva de una sola clase o subclase de anticuerpos.
En este grupo se incluyen dos de las más frecuentes IDP’s, el déficit selectivo de
IgA (DIgA) y la CVID. Solo un tercio de los pacientes de DIgA presenta
infecciones, por lo que la CVID pasa a ser la IDP sintomática más frecuente. . El
diagnóstico para esta IDP es difícil y es importante excluir causas secundarias de
hipogammaglobulinemia; también excluir otros defectos primarios como la hiper-
IgM, la agamaglobulinemia ligada a X y la autosómica recesiva; y el Síndrome
linfoproliferativo ligado a X. La característica principal de CVID es la
heterogeneidad; como la edad de presentación de los primeros síntomas y las
manifestaciones clínicas (Chapel, 1994).
En este trabajo se estudiaron 21 pacientes con CVID, estos fueron diagnosticados
clínicamente de acuerdo a los criterios para las IDP’s, publicados en 1999 por el
grupo Panamericano de IDP’s (PAGI) y la sociedad europea de IDP’s (ESID)
(Conley y col. 1999). Estos criterios incluyen las concentraciones séricas de IgG e
IgA de menos de dos desviaciones estándar por debajo de la media para edad la
concentración baja o normal de IgM (tabla 2). Para la CVID es importante la
exclusión de otras causas de hipoagammaglobulinemia (ver anexo). No a todos
los pacientes se les evaluaron la ausencia de isohemaglutininas y la pobre
respuesta a vacunas, por que en el hospital donde se les atiende, no cuentan con
este tipo de pruebas. La edad de inicio de síntomas fue variable en algunos en
edad pediátrica mientras que en otros en edad adulta (tabla 3). A pesar de los
esfuerzos para lograr un mejor entendimiento de las inmunodeficiencias primarias,
el intervalo transcurrido desde la aparición de los síntomas en los pacientes con
71
CVID hasta su diagnóstico es muy prolongado. El tiempo promedio entre el inicio
de infecciones recurrentes y el diagnóstico e inicio del tratamiento en nuestra serie
de pacientes fue en promedio de más de 6 años, como se ve en la tabla 3., lo que
representa un retraso importante que se ve reflejado en muchos casos, en la
presencia de complicaciones crónicas como bronquiectasias. El cuadro clínico de
este grupo de 21 pacientes es similar a lo reportado en otras series, con
infecciones bacterianas recurrentes de vías respiratorias altas y bajas como la
infección mas frecuente. En segundo lugar de frecuencia se encuentran las
infecciones gastrointestinales (tabla 3). A estos 21 pacientes se les realizaron
estudios de expresión de otras moléculas involucradas en CVID (TACI, CD19,
ICOS); también se les analizó la expresión de CD40 y CD154 para descartar
hiper-IgM tipo 3 y hiper-IgM tipo 1 respectivamente. Por último, el análisis de la
expresión de las sub-poblaciones de células B que se les realizó a los 21
pacientes sirvió para clasificarlos y poder correlacionar con su historial clínico y
dar una orientación del posible defecto en ellos.
La determinación de las sub-poblaciones de células B se realizó a los 25
pacientes, como se ve en la tabla 14y se comparó con 15 testigos sanos como se
muestra en la tabla 15. Los porcentajes obtenidos se compararon como se
muestra en la figura 9, donde se aprecia que un porcentaje alto de pacientes
tienen disminuida la población de células B de memoria CD22+, CD27+. De estos
sólo a los 21 pacientes con CVID se les correlacionó la expresión de sus células
B de memoria con los hallazgos clínicos como se ve en la tabla 16. Los cuatro
pacientes con Hiper-IgM no entraron en esté análisis por que el objetivo era
buscar una clasificación de los pacientes con CVID, según la expresión de sus
células B de memoria. De los 17 pacientes que mostraron una expresión mayor
del 1% de células B en sangre periférica, casi la mitad (47%) tenían menos del
20% de células B de memoria (grupo 1), mientras el otro 53% de los pacientes
expresaron más del 20% de estas células (grupo 2), incluyendo un paciente que
expresó 96% de células B con fenotipo de memoria. Las diferencias más
importantes en las manifestaciones clínicas, entre estos dos grupos, fue una
72
mayor incidencia de neuroinfecciones, tuberculosis e infección por CMV en el
grupo 2. Estos datos sugieren como posibles causas: defectos en las células B
(grupo 1) ó defectos tanto en células T como en células B (grupo 2). Los pacientes
con una población disminuida de células B de memoria podrían tener un defecto
en la diferenciación de estas, mientras que en los pacientes con un porcentaje de
células B de memoria igual o mayor al de los testigos sanos, los defectos podrían
encontrarse tanto en células T como en células B. Cuatro pacientes presentaron
menos de 1% de células B (grupo 3). A estos pacientes no se les realizó el análisis
de células B de memoria, por no contar con número suficientes de estás. Estos
pacientes pueden tener un defecto en el desarrollo de la células B en la médula
ósea y, por lo tanto, se les deben realizar estudios de las moléculas involucradas
en agammaglobulinemia LX (BTK) y autosómica recesiva (BLNK, Igα, Igβ, cadena
µ) (Tsukada y col. 1994) (Grunebaum 2001).
Desde el 2003 se han descrito mutaciones genéticas a las que se ha atribuido la
responsabilidad del fenotipo clínico de CVID como son ICOS, TACI, CD19 y
BAFFR (Bacchelli y col. 2007). Los recientes descubrimientos de las mutaciones
en pacientes con CVID, refleja la variabilidad clínica e inmunológica en estos
pacientes, al encontrarse en diferentes genes que transcriben para diferentes
proteínas. Estos 4 defectos moleculares han sido identificados en pocos de los
casos de CVID; sin embargo, los hallazgos clínicos de los pacientes con defectos
ICOS, TACI, CD19 y BAFFR son iguales a los observados en los demás pacientes
en los que aún no se encuentra el defecto molecular (Kopecký y Lukesová 2007).
Sin embargo, el conocer este defecto en los pacientes puede tener implicaciones
en mejores oportunidades terapéuticas. Por ejemplo en las deficiencias de ICOS y
XLP, la hipogammaglobulinemia es causada por la baja producción de interlucina
10 (IL-10). En este contexto, el uso de IL-10 mejora lo función de las células B en
los pacientes con CVID (Zielen y col. 1993). Desde el descubrimiento de la
deficiencia de TACI en humanos, se ha tratado de estimular con BAFF para
restaurar la secreción de inmunoglobulinas y la proliferación de células B en
algunos pacientes con CVID. (Stewart y col. 2003; Nardell y col. 2002).
73
Los antecedentes clínicos de los pacientes adultos con una deficiencia de ICOS
ponen de manifiesto que la mayoría de ellos habían padecido al menos una
neumonía durante la infancia (Grimbacher, 2003). En este trabajo, dos pacientes
tuvieron disminuida drásticamente la expresión de ICOS (figura11) y ambos
presentaron neumonías de repetición, referidas desde la infancia. Los pacientes
21 y 25, que expresaron de manera disminuida ICOS, son candidatos para el
análisis de mutaciones, así como al análisis de la funcionalidad de este receptor,
para confirmar el diagnóstico. TACI se expresa en la superficie de las células B, se
ha visto que tanto las mutaciones homocigotas como heterocigotas del gen
TNFRSF13B, que codifica para TACI, están asociadas con un fenotipo de CVID
(Salzer, 2005). En este estudio todos los pacientes expresaron TACI en porcentaje
parecido al de los testigos sanos (figura 25 y 26); sin embargo, es importante
remarcar que la expresión no significa una proteína funcional, por lo que será
necesario realizar la búsqueda de mutaciones en el gen que codifica para esta
proteína (Warnatz y col. 2005). La proteína CD19 se expresa en células B y
recientemente se han descrito pacientes con una expresión considerablemente
reducida de CD19 (Van Zelm M y col.2006). Sin embargo, dichos pacientes
presentaron un número normal de linfocitos B, lo que se demostró mediante el
marcador CD20 (Van Zelm M y col.2006). En este estudio, los pacientes que no
expresaron CD19, tampoco expresaron el otro marcador de células B que fue
utilizado, el CD22 (tabla 14), lo que sugiere fuertemente que no hubo deficiencias
de CD19. A 18 pacientes se les buscó la expresión de CD40 en células B CD19+
(tabla 19 y 20) y a 14 pacientes en monocitos CD14+ (tabla 21 y 22), con el
objetivo de descartar algún paciente con Hiper-Igm tipo 3. El paciente 11 expresó
1% de CD40 en monocitos (tabla 21) cuando la media de los controles sanos fue
de 95% de expresión en monocitos (tabla 22). Al paciente 11 no se le analizó
CD40 en células B ya que tenía menos del 1% de estas células (grupo 3). En
conclusión, para este paciente es importante descartar tanto agammaglobulinemia
(LX como AR) e hiper-IgM tipo 3.
74
El aumento anormal de la concentración de IgM y, simultáneamente, una falta de
cambio de isotipo en las células B de memoria son característicos de los defectos
de recombinación de cambio de clase o hiper-IgM. En una proporción significativa
de pacientes con defectos de recombinación de cambio de clase, la IgM normal y
la ausencia de IgA e IgG pueden conducir al diagnóstico erróneo de CVID
(Glocker y col. 2007). Por esta razón, en este trabajo se determinó la expresión
de CD154 en la mayoría de los pacientes (tabla 17). El paciente 14, por su edad y
hallazgos clínicos, se orientaba hacia un fenotipo de hiper-IgM, pero luego del
análisis de CD154, donde se encontró una expresión semejante a la de los
testigos sanos (figura 50), se diagnosticó también como CVID; esto hasta que se
descarte por medio del análisis funcional y posibles mutaciones del gen de
CD154, que podría explicar que se está expresando la proteína pero esta no es
funcional. Esta es una razón para incluir a CD154 en la valoración de los pacientes
con diagnóstico de CVID. Otra razón es que existen antecedentes de pacientes
diagnosticados con CVID, cuya expresión de CD154 fue significativamente baja
comparada con los testigos. Así, la baja expresión de CD154 puede ser una
explicación del fenotipo de CVID (Farrington, 1994). A los pacientes 1, 4, 8 y 25
con CVID, que se les realizaron estudios de CD154, expresaron CD154 menor al
15% (tabla 17), contrastando con los testigos sanos que estuvieron por arriba de
15% (tabla 18 y figura 11). La interacción entre CD40 y CD154 es muy importante
para la proliferación, diferenciación y cambio de isotipo en la célula B. De esta
manera los pacientes que tuvieron una reducción en la expresión de CD154,
podrían tener una ineficiente interacción CD40-CD40L, lo que podría explicar el
fenotipo de CVID. Para poder tener una conclusión acertada serían necesarios
estudios funcionales que corroboren que la expresión reducida de CD154 tiene
algún efecto en los fenómenos de activación y diferenciación de las células B. El
paciente 3 mostró alta expresión de CD154 en las células activadas y el paciente
9 tuvo alta expresión de CD154 aún en células no activadas (tabla17); sin
embargo a ninguno de estos pacientes se les ha diagnosticado un síndrome
linfoproliferativo.
75
En este trabajo, como se había dicho anteriormente 4 pacientes expresaron de
manera disminuida CD154. A estos pacientes se les realizaron estudios
moleculares. La búsqueda de las mutaciones, en los pacientes 16, 19, 20 y 22, se
realizó amplificando CD154 por RT-PCR (figura 19). Estas alteraciones fueron
debidas: en el paciente 16 en una eliminación y en los pacientes 19, 20, 22 a
mutaciones puntuales; todas ellas en localizadas en el exón 5, donde se
encuentran la mayoría de las mutaciones reportadas en otros trabajos (figuras 21
a 24) (Notarangelo y col., 2006). Es importante mencionar que de las 4
mutaciones encontradas, la del paciente 16 está descrita (Lee y col., 2005); los
pacientes 19 y 20 al ser hermanos era de esperarse una misma mutación la cual
también está reportada (Prasad y col., 2005) y solo se encontró la mutación del
gen CD154 en el paciente 22 de novo, por lo que es importante hacer un estudio
funcional para poder corroborar la mutación con el fenotipo de hiper-IgM tipo
1(tabla 27). El conocimiento de los defectos genéticos en estos pacientes
proporciona una alternativa para poder brindar un consejo genético a los
familiares.
Para entender las causas que llevan a una patología como la CVID ó hiper-IgM es
necesario el estudio de las poblaciones leucocitarias, la determinación de la
expresión de las moléculas involucradas en el desarrollo de la célula B, así como
el porcentaje de las células B de memoria. En conjunto, estos datos se deben
correlacionar con los hallazgos clínicos. Un análisis de esta naturaleza orienta
sobre los posibles defectos involucrados, lo que permite proponer estudios
moleculares con una guía mejor definida. Los hallazgos encontrados nos permiten
iniciar la búsqueda de tratamientos alternativos y favorecen la posibilidad de
diagnosticar las enfermedades en edades tempranas para evitar las
complicaciones que pudieran poner en riesgo la integridad y vida de los pacientes.
76
V. CONCLUSIONES
Los leucocitos totales de los pacientes adultos, en particular las células B,
fueron mucho más bajos que los valores de referencia de los testigos
sanos pareados por edad.
La cuantificación de las sub-poblaciones de células B es un método útil para
distinguir entre los diferentes fenotipos clínicos de los pacientes con CVID.
Se detectaron 3 diferentes defectos en los pacientes estudiados, atribuibles
a ICOS CD40 y CD154. No se encontraron patologías asociadas a CD19 y
TACI.
Por lo tanto, para llegar a un diagnóstico preciso es necesario determinar
las alteraciones moleculares en ICOS, CD40 y CD154.
Se encontraron 3 mutaciones en el gen de CD154 ya reportadas en la
literatura y una no reportada que deberá explorarse en los casos de hiper-
IgM ligado a X para precisar el diagnóstico molecular.
El estudio molecular es útil también para detectar a posibles portadoras, por
lo que se debe implementar a familiares de los pacientes.
EL CVID puede deberse a múltiples defectos. Nuestros resultados indican
las bases moleculares de algunos de ellos pero es evidente que se
necesita investigar aún más para entender a nivel molecular las causas de
estas patologías.
77
VI. PRESPECTIVAS
Para completar el estudio de las inmunodeficiencias humorales es importante
estandarizar estudios funcionales en las células B, por medio de la activación con
mitógenos específicos para estas células y determinar la producción de
inmunoglobulinas in vitro y la diferenciación a células plasmáticas. Estos estudios
nos darán un panorama más completo de los defectos que puedan estar
implicados en los pacientes. Además se tiene que aumentar el estudio de las
moléculas que están implicadas en el desarrollo de la célula B y que están
descritas como causa del fenotipo de CVID ó hiper-IgM; como BAFFR y AID, entre
otras. Es importante continuar los estudios de biología molecular para detectar las
mutaciones de genes candidatos que puedan estar involucrados en estas
enfermedades. Estos estudios nos van a dar herramientas para poder entender el
mecanismo del desarrollo de la célula B en la diferenciación en los órganos
linfoides secundarios y encontrar los defectos que puedan estar afectando a los
pacientes con inmunodeficiencias humorales.
78
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63. Wehr C, Kivioja T, Schmitt C, Ferry B, Witte T, Eren E, Vlkova M, Hernandez
M, Detkova D, Bos PR, Poerksen G, von Bernuth H, Baumann U, Goldacker
S, Gutenberger S, Schlesier M, Bergeron-van der Cruyssen F, Le Garff M,
Debré P, Jacobs R, Jones J, Bateman E, Litzman J, van Hagen PM, Plebani
A, Schmidt RE, Thon V, Quinti I, Espanol T, Webster AD, Chapel H, Vihinen
M, Oksenhendler E, Peter HH, Warnatz K. 2008. The EUROclass trial:
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342:750-51.
86
ANEXO I:
TABLA I:
DIAGNOSTICO DEFERENCIAL DE HIPOGAMMAGLOBULINEMIA
DROGAS QUE LA INDUCEN:
agentes anti-malaria
Captopril
Carbamazepina
Glucocorticoides
Fenclofenaco
Sal de oro
Penicilina
Fenintoina
Sulfasalazina
DESORDENES GENETICOS:
Ataxia telangiectasia
Formas autosomales de SCID
Deficiencia de transcobalamina II e hipogammaglobulinemia
Agammaglobulinemia ligada al X
Desorden linfoproliferativo ligado al X ( asociado con EBV)
SCID ligado al X
Algunos desordenes metabólicos
ANOMALIAS CROMOSOMALES:
Síndrome cromosoma 18q
Monosomia 22
Trisomia 8
Trisomia 21
ENFERMEDADES INFECCIOSAS:
HIV
Rubéola congénita
Infección congénita con CMV
87
Infección congénita con Toxoplasma gondii
Virus Epstein –Barr
MALIGNIDAD:
Leucemia crónica linfocítica
Linfoma no Hodgkin
Malignidad de células B
DESORDENES SISTÉMICOS:
Inmunodeficiencia causada por hipercatabolismo de inmunoglobulinas
Inmunodeficiencia causada por excesiva perdida de inmunoglobulinas
88
ANEXO II
PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
PBS 10x
NaCl 80g
KH2PO4 2g
NA2HPO4*12H2O 29g
KCl 2g
pH 7.4
Aforar a 1 litro con agua destilada y filtrar en membranas de 0.22 m. Diluir 1:10 antes de comenzar a trabajar.
Solución fijadora.
Paraformaldehído al 1% diluido en PBS.
PBA (PBS-Azida).
Albúmina 0.5%
Azida de sodio 0.05%
Disolver en PBS 1x.
Líquido de Turk
Acido acético glacial 3.0 ml
Agua destilada c.b.p. 100 ml
Adicionar 1 ó 2 gotas de azul de metileno
Tris-ácido acético- EDTA 50X (TAE)
Disolver en 1 L de agua las siguientes sales:
-Tris.base 242 g
-Acido acético glacial 57.1 ml
-EDTA 18.6g
89
TAE 1X
Preparar 1L de una dilución 1:50 de TAE 50X
Regulador TSS 2X
En condiciones estériles, preparar una solución conteniendo los siguientes
reactivos, utilizando medio Luria-Bertani como disolvente:
Polietilen-glicol (3350 ó 8000) 20%
Dimetil-sulfóxido 10%
MgS04 ó MgCl2 70mM
Ajustar el pH a 7.5
Gel de Agarosa
Agarosa 1%
Regulador de desnaturalización (2X)
Sacarosa 20 g
Urea 15 g
Xileno cianol 0.025 g
Azul de Bromofenol 0.025 g
Agua destilada c.b.p. 50 ml
Tris- Acido Bórico- EDTA (TBE) 10X
Tris-base 108 g
Acido bórico 55 g
EDTA 9.3 g
Agua destilada c.b.p. 1L
Regulador de carga para DNA
Sacarosa 20 g
Orange G 0.1 g
Agua destilada c.b.p. 50 ml