Efectos de la temperatura de fermentacin y Saccharomyces especies en la composicin de cidos grasos de la clula y la presencia de compuestos voltiles en vinoMara Jess Torija, Gemma Beltran, Maite Novo, Montse Poblet, Jos Manuel Guillamn, Albert Mas, Nicolas Rozs

Resumen

Baja temperatura las fermentaciones alcohlicas son cada vez ms frecuentes debido a la voluntad de producir vinos con ms pronunciado perfiles aromticos. Sin embargo, su mayor inconveniente es el alto riesgo de fermentaciones paradas y lentas. Cambios en la composicin de la membrana plasmtica pueden ser una respuesta adaptativa a las fermentaciones de baja temperatura. La produccin de compuestos voltiles y los cambios en los cidos grasos de membrana se determinaron por cromatografa de gases para mostrar el grado de adaptacin de la clula y el rendimiento a bajas temperaturas (13C) tomando 25 C como referencia. Las pruebas se realizaron en dos cepas de Saccharomyces cerevisiae y una cepa de Saccharomyces bayanus. Bajas temperaturas restriccin el crecimiento de la levadura y alargado las fermentaciones. El anlisis de cidos grasos de membrana plasmtica mostr que las levaduras secas tenan niveles similares de insaturacin, entre 70% y 80%, sin cidos grasos de cadena media (MCFA). Cadena larga saturados cidos grasos (SFA) fueron los ms frecuentes los cidos grasos de membrana a lo largo de las fermentaciones. Composicin lipdica cambia con la temperatura de crecimiento. La ptima fluidez de la membrana a bajas temperaturas fue modulada por los cambios en el grado de insaturacin en cepas de S. cerevisiae. En S. bayanus, sin embargo, este cambio en el porcentaje de cidos grasos insaturados (UFA) no se observ en las temperaturas de crecimiento diferentes pero la concentracin de MCFA en las temperaturas de fermentacin baja fue mayor. Concentraciones de compuestos voltiles fueron mayores en los vinos producidos en temperaturas ms bajas y dependa de la cepa.1. IntroduccinTemperatura es uno de los parmetros ms importantes para el desarrollo de la fermentacin alcohlica, ya que puede afectar tanto la cintica del proceso en trminos de duracin y tasa de fermentacin y la calidad final del vino, es decir, la produccin de metabolitos secundarios (Lafon-Lafourcade, 1983; Fleet and Heard, 1993). Es de Inters para los vinicultores la fermentacin a baja temperatura, 10-15 C, actualmente est aumentando desde la mejora de la produccin y retencin de voltiles de sabor puede mejorar el perfil aromtico vino. Estas bajas temperaturas, sin embargo, fcilmente pueden causar lentitud o paradas de fermentacin.Aunque no se sabe exactamente qu causa paradas de fermentacin, algunos factores importantes que se deben composicin determinada por variedad de uva, clima, etc. , y prcticas tecnolgicas como debe aclarar y temperatura de fermentacin (ingleses Ingledew y Kunkee, 1985; Ayestaran et al., 1995). Por otra parte, algunos de los metabolitos como el etanol, cido actico, el acetaldehdo y medio de los cidos grasos de cadena (ABMC) puede tener un efecto txico en Saccharomyces cerevisiae, la principal levadura en fermentacin alcohlica (Bisson, 1999). Aunque el mecanismo por el cual estos metabolitos afectan a levadura es an desconocido, composicin de la membrana es uno de los objetivos ms probables, como se ha comentado para el etanol (Ingram y Buttke, 1984; Casey y ingleses Ingledew, 1986). Membrana plasmtica levadura puede jugar un papel importante en el transporte y la tolerancia de estos compuestos, y, por lo tanto, pequeos cambios en membrana plasmtica puede modificar el metabolismo de las clulas (Keenan et al., 1982; Hazel y Williams, 1990; Valero et al., 1998).De hecho, la composicin de cidos grasos de la membrana es altamente variable y claramente influenciado por factores ambientales como la temperatura, oxgeno, limitacin de nutrientes y la tasa de crecimiento (cazador y Rose, 1972; Ratledge y Evans, 1989). La composicin grasa-acyl de la membrana de levaduras, as de muchos otros microorganismos, cambia con la temperatura: cuanto ms baja la temperatura, ms insaturada la composicin de la acil-graso de membrana (Watson, 1987). Variacin en la composicin de cidos grasos tambin puede ser especfica de algunos grupos microbianos, perfiles de cidos grasos pueden ser un criterio taxonmico til (de Roze et al., 1992; Thompson et al., 1993). Sin embargo, la composicin de cidos grasos de una clula puede tambin ser influenciada por composicin lipdica de medio ambiente ya que puede incluir los cidos grasos del medio en sus propio fosfolpidos (Benchekroun y Bonaly, 1992; Rosi y Bertuccioli, 1992).Adems, la composicin de cidos grasos del medio tambin depende de las condiciones de fermentacin, i. e., la disponibilidad de oxgeno, como resultado del metabolismo de la levadura. As que, cuando la fermentacin se lleva a cabo en condiciones anaerbicas, cidos grasos de cadena media son siempre producidos (Hammond, 1993; Ravaglia yDelfini, 1993). En contraste, cuando la fermentacin se realiza en condiciones aerobias o semi-aerobic, menos cidos grasos de cadena media y ms los cidos grasos insaturados son producidos (Suomalainen y Lehtonen, 1979). Los cidos grasos y sus steres tienen un papel esencial en la fermentacin alcohlica (Larue et al., 1984). De hecho, se ha demostrado que hexanoico, octanoico, decanoico y dodecanoico cidos y sus steres, junto con etanol, pueden inhibir el crecimiento de la levadura (Geneix et al., 1984; Ravaglia y Delfini, 1993). Los cidos grasos de cadena larga, por el contrario, parecen tener una accin positiva (Soufleros y Bertrand, 1988).El objetivo del presente estudio fue analizar los cambios en el desempeo de la levadura durante las fermentaciones de baja temperatura. Porque los cidos grasos de membrana cambia para adaptarse a las bajas temperaturas, se analiz la composicin de los cidos grasos de la membrana de la clula en tres diferentes cepas pertenecientes a las dos especies ms probables de Saccharomyces presentes en la fermentacin alcohlica. Como el resultado ms importante de la fermentacin a baja temperatura es el aroma del vino, tambin se determin la presencia de compuestos voltiles.2. Materiales y Mtodos2.1 Cepas de levaduraSe utilizaron tres cepas de levaduras comerciales: dos cepas de S. cerevisiae (llamada A y B) yuno de Saccharomyces bayanus. Fueron identificados por mtodos moleculares (Guillamon et al., 1998). La S. bayanus comercialmente fue etiquetado como Saccharomyces uvarum. A la cepa de S. cerevisiae fue una levadura de floculacin.2.2 FermentacinEl medio fue hecho de mosto blanco concentrado (Concentrados Palleja, Riudoms, Espaa), que se diluy con agua para obtener una concentracin final de azcar de 240 g/L. Esto producira 14% etanol (v/v). El pH inicial y la concentracin de SO2 fueron 3.70 y 55 mg/L, respectivamente. Las fermentaciones se realizaron en botellas de 2 l lleno de 1,8 L de medio y provistos de cierres que permiti el dixido de carbono a escapar y las muestras a ser eliminado, pero que excluye el oxgeno atmosfrico. La poblacin inoculada en cada matraz era 2106 clulas ml 1 de levadura seca rehidratada en agua a 37 .Las fermentaciones se realizaron por triplicado en dos diferentes temperaturas, 13 y 25 OC, sin agitacin. Cada da la densidad se mide en funcin de pesaje 5 ml de mosto y azcares reductores se determinaron por un mtodo enzimtico (Boehringer Mannheim, Alemania).El crecimiento de la levadura se calcul mediante el recuento de levaduras viables en placas de agar YPD glucosa (20 g/L; peptona bacteriolgica (Cultimed, Panreac, Barcelona, Espaa) 20 g/L; extracto de levadura (Cultimed) 10 g/L; agar bacteriolgico tipo americano (Cultimed) 20 g/L) en una dilucin adecuada para 2 das a 28 C. S. cerevisiae Awas diluido en la presencia de 5 mM EDTA para inhibir agregacin celular. Levadura seca determinacin se realiz como se describi anteriormente por Sierkstra et al. (1992). La mxima tasa fermentacin se obtiene la mxima pendiente de la parcela de consumo de azcar y fermentacin da y se expres en la concentracin de azcar que se consume (en g l 1) por da. Contenido de etanol Final se determin por ebulliometry (Garc'a Barcel", 1990).2.3 Determinacin de la composicin de cidos grasos de la clulaLas clulas se saponificaron y cidos grasos se obtuvieron segn el mtodo utilizado por el Roze et al. (1992). Anlisis GC se llev a cabo en un Hewlett-Packard 5890 conectado a un ordenador HP Vectra conLa ChemStation software (Agilent Technologies, Wilmington, DE, EE.UU.). El extracto (2 ul) fue inyectado (splitless (sin dividir), 1 min) en una columna de Poster-HP de 30 m x 0,25 mm y 0,25 micrometros fase grueso (Agilent) con un inyector automtico HP 7673 (Agilent). El programa de temperatura fue 1404 c min 1 a 240 c (13 min). Inyector y detector de temperatura fueron 250 y 280 c, respectivamente.El gas portador fue helio a 1,2 ml min 1. cidos heptanoico y heptadecanoico (1 y 4 mg ml-1, respectivamente) fueron agregados como estndares internos. Cantidades relativas de dada los cidos grasos se calcularon sus reas respectivas pico cromatogrfico. Estos montos fueron relacionados con el peso seco y posteriormente transformados en porcentajes de los cidos grasos totales obtenidos. Longitud de cadena media de cidos grasos (CL) se calcul como:

Donde: P es el porcentaje de cidos grasos y C es el nmero de carbonos.2.4 Determinacin de compuestos voltiles.Para determinar los cidos grasos voltiles, los steres etlicos de cidos grasos, acetatos de alcohol ms altos y otros compuestos voltiles, usamos el protocolo propuesto por Lema et al., (1996). 1-Nonanol (0,92 mg l 1) y cidos heptanoico y heptadecanoico (3.22 y 2,90 mg/L, respectivamente) fueron agregados como estndares internos. GC analtico fue llevado afuera en una Hewlett-Packard 4890A conectado a un integrador de Hewlett-Packard 3393A equipado con un detector de ionizacin de llama (Agilent). El extracto (2 ul) fue inyectado (splitless, 1 min) en una columna de Poster-HP de m0.25 mm y 3.0 Am 25 fase grueso de 30 (Agilent). El programa de temperatura fue 504 c min 1 a 240 c (15 min). Inyector y detector de temperatura fueron 240 c. El gas portador fue helio a 1 ml/min. Los compuestos voltiles fueron identificados y cuantificados en comparacin con los estndares.2.5 Tratamiento estadstico de los datos.Los datos estadsticos fueron procesados con el programa Statview 4.02 (conceptos de Abacus, Berkeley, CA, USA). Anlisis de varianza (ANOVA) se utiliz para determinar las diferencias de presin y temperatura en la composicin de cidos grasos (nivel de significacin estadstica se fij en PV0.05).3. ResultadosTodas las fermentaciones terminaron (concentracin de azcar final