efecto del estrÉs sobre el tejido linfoide asociado a...
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EFECTO DEL ESTRÉS SOBRE EL TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A NARIZ DE RATONES ADRENALECTOMIZADOS
RESUMEN
El sistema inmunitario de las mucosas (MALT) comprende tejidos asociados
con la superficie de las mucosas respiratoria, digestiva y genitourinaria, los cuales
defienden el organismo de antígenos externos. El tejido linfoide asociado a
nariz (NALT) representa un compartimiento inductor de la respuesta inmunitaria y
se localiza en piso de la nariz de algunos roedores; mientras que la lámina propia
de la mucosa nasal representa al compartimiento efector. El estrés, provoca un
incremento de la secreción de hormonas glucocorticoides y catecolaminas por
activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal. Estas hormonas interactúan con
receptores de las células inmunitarias ocasionando cambios en su respuesta. El
objetivo de este trabajo fue determinar los efectos del estrés sobre el número y
distribución de sus células. Se utilizaron ratones CD1 machos de 9 semanas de
edad, divididos en un grupo testigo, estrés, adrenalectomizado y
adrenalectomizado mas estrés; a los grupos problema se les aplicó 4 horas de
estrés por inmovilización. De cada animal, se obtuvo el NALT, se realizaron
tinciones inmunohistoquímicas para cuantificar linfocitos B (CD45+) y T CD4+ y
CD8+ y gamma/delta. En otros grupos de animales se cuantificó la población de
linfocitos CD45+ y T, CD4+ y CD8+ por citometría de flujo.
Los resultados mostraron que los linfocitos T (CD4 y CD8) disminuyeron
con la aplicación del estrés, por el contrario los linfocitos B de incrementaron. La
adrenalectomía provoco un incremento en todas las poblaciones celulares y el
estrés en los animales adrenalectomizados provoco disminución de las todos los
tipos celulares, excepto los linfocitos gamma/delta pero sin llegar a niveles
basales. Por lo que podemos concluir que los linfocitos son susceptibles a los
efectos del estrés agudo por inmovilización; sin embargo, el análisis de los
mecanismos involucrados requiere de mas estudios, incluyendo con animales
manipulados farmacologicamente.
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INTRODUCCIÓN
SISTEMA INMUNITARIO DE LAS MUCOSAS
En las mucosas se encuentra la primera línea de defensa contra antígenos
externos, ya que un gran número de agentes patógenos las utilizan como vía de
entrada. El conjunto de tejidos linfoides organizados y difusos en las mucosas del
organismo, se denominan “tejidos linfoides asociados a las mucosas” (MALT) los
cuales a través de la inmunidad innata y adquirida mantienen una homeostasis
inmunitaria, a lo largo de la gran superficie interior de las vísceras, la cual
comprende las mucosas oral, nasal, respiratoria, urinaria y gastrointestinal.
(Tristram GP 2001)
Características particulares del sistema inmunitario de las mucosas
El sistema inmunitario de las mucosas, además de tener cierta independencia,
presenta características únicas que lo diferencian de la inmunidad sistémica, una
de ellas es el poseer células T con propiedades reguladoras o efectoras
especificas para la mucosa, entre las que se encuentran los LIEs CD4+ y CD8+
(TCR γδ / αβ). (Cheroutre H 2005, Okuda M y Pawankar R 1992)
Adicionalmente es un sistema inmunitario polarizado hacia las mucosas, el cual
permite a los linfocitos activados migrar de manera selectiva hacia los tejidos
linfoides difusos, situados por debajo del epitelio. (Csencsits KL y cols 1999)
Tejido linfoide asociado a nariz (NALT) El tejido linfoide asociado a nariz (NALT) forma parte del sistema
inmunitario de las mucosas (MALT). Es un órgano linfoide par que se desarrolla en
algunos roedores después de la primera semana de nacimiento (Mebius R 2003,
Ying X y cols 2005, Harmsen A y cols 2002)
Debido a su localización anatómica, se considera un análogo del anillo de
Waldeyer humano (Boyaka NP y cols 2000) y funcionalmente se compara con la
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placa de Peyer por presentar características inductoras similares. (Kiyono H y
Fukuyama S 2004).
En cuanto a su estructura, el NALT está compuesto principalmente por
linfocitos T (predominando los CD4+) y linfocitos B en cantidades similares. El
órgano se encuentra regionalizado de acuerdo al patrón de distribución de cada
tipo celular; los linfocitos B se localizan preferentemente en la porción central del
órgano, conformando la zona B o folicular, mientras que los linfocitos CD3+ se
distribuyen en la periferia de la zona B, conformando la zona T o parafolicular.
Otras poblaciones presentes son células dendríticas y macrófagos (Asanuma H y
cols, 1997).
ESTRÉS
Estrés es un conjunto de eventos que se inician con un estimulo (estresor) que
inicia una reacción en el cerebro (percepción del estrés) que posteriormente activa
a los sistemas fisiológicos del cuerpo (respuesta de estrés) (Dhabhar & McEwen,
1997). También se define como un “estado de amenaza para la homeostasis,
durante el cual se activa una respuesta adaptativa compensatoria” (McEwen,
1998), y en una forma mas simple, como la respuesta general del organismo ante
cualquier estimulo estresor o situación estresante. Sin embargo, no existe en la
actualidad una definición del estrés aceptada en forma generalizada (Pacak &
Palkovits, 2001).
Los agentes estresantes o estresores se clasifican en físicos, psicológicos,
sociales, y biológicos (enfermedades infecciosas). Estos pueden variar en
intensidad y duración. De acuerdo a la frecuencia del estimulo estresante el estrés
se clasifica en estrés agudo: la respuesta persiste por un periodo de minutos u
horas, después de una sola sesión con el agente estresante, y estrés crónico: la
respuesta persiste por varias horas o días por varios días o meses, como
consecuencia de la aplicación repetida del agente estresante.
El estrés, provoca un incremento de la secreción de hormonas
glucocorticoides y catecolaminas por activación del eje hipotálamo-hipófisis-
3
adrenal. Estas hormonas interactúan con receptores de las células inmunitarias
ocasionando cambios en su respuesta.
Se piensa que las respuestas fisiológicas inducidas por el estrés involucran
al eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenales y al sistema nervioso autónomo y
dependen, en parte, de la secreción de hormonas corticosteroides y catecolaminas
(Bateman et al., 1989; Charmandari et al., 2005; Eskandari et al., 2003; Pacak &
Palkovits, 2001; Webster et al., 2002). Sin embargo, otras posibles interacciones
pueden ocurrir como las dependientes del contacto directo entre las fibras
nerviosas terminales y los linfocitos en los órganos linfoides (Bellinger DL, 2001;
Felten et al., 1984; Felten et al., 1985; Nance & Sanders, 2007).
El eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenales consiste de tres componentes: el
hipotálamo, particularmente el núcleo paraventricular (PVN), la hipófisis anterior, y
la corteza suprarrenal. El núcleo paraventricular del hipotálamo secreta la
hormona corticotropina (CRH) dentro del sistema portahipofisiario, esta hormona
subsecuentemente controla la producción de hormona adrenocorticotrofica
(ACTH) en la glándula pituitaria anterior. La hormona ACTH a su vez actúa en la
corteza de la glándula suprarrenal provocando la secreción de cortisol. Durante los
periodos de estrés se produce una sobreestimulacion hipotalamica, lo cual
conduce a una hipersecreción hormona (Chrousos, 1995; Eskandari & Sternberg,
2002; Harbuz & Lightman, 1992; McEwen et al., 1997; Webster & Sternberg,
2004).
La segunda vía por el cual el cerebro se comunica con la periferia involucra
al sistema nervioso autónomo. El sistema nervioso autónomo se divide en tres
compartimiento: el parasimpático, el simpático, y el sistema nervioso entérico. El
sistema nervioso autónomo afecta directamente las respuestas inmunitarias a
través de la inervación de los principales tejidos linfoides involucrados en la
generación y activación de los linfocitos. Prácticamente todos los órganos del
sistema inmunitario recibe inervación del sistema nervioso autónomo. Por otro
lado, los linfocitos tienen receptores para neurotransmisores y neuropéptidos
(McEwen et al., 1997). La mayor información actual se refiere al papel del sistema
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nervioso simpático, y las catecolaminas, en la modulación de las respuestas
inmunitarias. La activación del sistema nerviosos simpático involucra la liberación
de la noradrenalina, neuropeptido Y, opioides endógenos (encefalinas/endorfinas),
adenosina 5-trifosfato, los cuales afectan directamente la actividad de las células
del sistema inmune. (Elenkov et al., 2000; Kohm & Sanders, 2001; Madden et al.,
1995; Sanders, 2006). Además, bajo situaciones de estrés, la activación del
sistema nervioso simpático estimula la liberación en la sangre de catecolaminas
(adrenalina y noradrenalina) producida por células de la medula suprarrenal, a
través de fibras preganglionares simpáticas que liberan acetilcolina.
Modelos animales de estrés.
Hans Selye (Paca´k K y Palkovits M 2001) en 1936, fue el primer
investigador que utilizó el modelo de estrés por inmovilización en ratas, las cuales
manifestaron varios signos que caracterizaron un síndrome ocasionado por el
estrés. Por otro lado cuando se compararon las regiones cerebrales activadas, por
diferentes situaciones estresantes como la inmovilización, la hipoglicemia, el frío,
la hemorragia, y el dolor, se observó que el modelo de estrés por inmovilización es
uno de los más efectivos para producir activación de una mayor cantidad de
regiones cerebrales. Además se encontró que cada agente estresante, utiliza vías
neuroendocrinas específicas.
En un trabajo previo realizado por nuestro grupo de trabajo donde ratones
fueron sometidos a estrés por inmovilización, demostramos que el estrés modifica
el número y distribución de las células inmunitarias presentes en el NALT del
ratón, los principales cambios observados fueron la disminución del número de
linfocitos T CD4+ y CD8+ y la tendencia al decremento de los linfocitos B IgM+.
Estos cambios probablemente fueron debidos a la influencia de glucoroticoides y
catecolaminas, hormonas secretadas durantes el estrés. Los efectos de estas
hormonas pueden ser a diferentes niveles como en la redistribución celular o bien
en la sobrevida de las células.
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OBJETIVO GENERAL
Analizar los efectos de la aplicación del estrés agudo por inmovilización sobre las
poblaciones de linfocitos del NALT de ratones adrenalectomizados.
MATERIAL Y METODOS
Animales
Se utilizaron ratones CD1 machos entre 9 y 10 semanas de edad
proporcionados por el Bioterio de la ESM, el manejo de los animales se realizo de
acuerdo a las normas de la Comisión de Bioética de la ESM. Los ratones se
dividieron en cuatro grupos de 7 animales cada uno: 1. grupo testigo, 2..con
tratamiento de estrés de 4 horas, 3. animales adrenalectomizados (ADX) y 4.
ratones adrenalectomizados sometidos a estrés por 4 horas (ADX+E).
Reactivos necesarios para realizar las inmunohistoquimicas:
-Anticuerpos monoclonales de rata anti-ratón conjugados con biotina: anti CD3+,
anti CD4+, anti CD8+, anti CD45+ (B220+), (DB PharMingen Technical Data
Sheet).
-Estreptavidina conjugada con peroxido (Zymed Laboratories Inc).
-Diaminobencidina (Pierce)
Procedimiento quirúrgico
Los ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico (65 mg/Kg). Se realizó
una incisión media abdominal y las glándulas suprarrenales fueron expuestas y
removidas usando pinzas finas. El tejido removido fue examinado para comprobar
la completa extirpación de las glándulas.
Posterior a la cirugía, durante la primer semana los animales recibieron agua ad
limitum conteniendo 0.9% NaCl y 1% de sacarosa con 25 µg/ml corticosterona
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(Akana SF et al, 1985), Posteriormente, los 7 días restantes los ratones solo
recibieron agua conteniendo 0.9% NaCl y 1% de sacarosa.
Las adrenalectomías se realizaron 14 días antes se someter a los ratones a
estrés.
Tratamiento de estrés.
Los animales fueron sometidos a un esquema de estrés por inmovilización
fijándolos en una superficie plana con cinta adhesiva durante 4 horas. Antes y
después del periodo de estrés, los animales se mantuvieron en jaulas durante los
días de tratamiento, ingiriendo agua y comida a libre demanda. Los animales
control se mantuvieron en las mismas condiciones.
Obtención y procesamiento del material biológico.
Posterior al tratamiento, todos los animales se anestesiaron
profundamente con vapores de éter, se sangraron por punción cardiaca directa y
se sacrificaron por decapitación, se removió la piel de la cabeza, se retiró el
maxilar inferior y los tejidos blandos, como lo describen (Asanuma y cols, 1997;
Heritage y cols, 1998). Con la ayuda de microscopio estereoscópico, se realizaron
dos incisiones verticales desde el vértice del paladar por la parte interna de los
dientes incisivos, siguiendo las porciones laterales hasta la base del paladar por la
parte interna de los dientes molares. Enseguida el colgajo fue sujetado por el
vértice, con pinzas de punta fina y se realizó tracción hacia la base del paladar,
retirándolo por completo.
Obtención de linfocitos para cuantificación por citometría
Después de remover el NALT, la obtención de linfocitos se realizó de la
siguiente forma: el paladar del ratón, conteniendo el NALT se colocó en una caja
de Petri con 10 ml de medio RPMI-1640, se realizó un raspado suave con una
espátula para separar el NALT del paladar, después se disgregó el NALT con el
émbolo de plástico de una jeringa y se recuperó la suspensión celular, la cual se
filtró en tela de organza de 10 × 10 cm. con una abertura de 1mm y se colocó en
tubos cónicos de 15 ml. La suspensión celular se centrifugó a 1500 rpm/10 min. a
4° C, se desechó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 1 ml de RPMI-
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1640. Finalmente se ajustó a 1x106 células, para realizar las diferentes
inmunotinciones para citometría de flujo.
Inmunotinción de linfocitos para citometría de flujo
La tinción de los linfocitos se realizó con anticuerpos anti-ratón (Becton
Dickinson Technologies, Gaithersburg, MD) obtenidos de PharMingen (San Diego,
CA) con fluorocromos conjugados biotinilados. Para linfocitos (Lc) T CD3+
anticuerpos marcados con fluorocromos peridinin chlorophyll protein (PERCP), o
con fluorescein isothiocynate (FITC). Además se utilizó el anti-CD4+ (FITC) y anti-
CD8+ (PE) y para los Lc B el CD45 RO (B220) con (PE). Los anticuerpos se
diluyeron 1:100 con amortiguador de fosfatos con albúmina sérica bovina p.H 7.4
(PBA) (10 mg/ml) y se colocaron 10 μl de cada anticuerpo, por cada millón de
células, incubando en oscuridad a 4°C por 30 min. Al término de ese tiempo se
lavaron con PBA y se desechó el sobrenadante, al paquete celular se le agrego
400 μl de para-formaldehído al 1% y se guardo en oscuridad a 4 º C hasta su
lectura en el Citómetro de flujo FACSCAN (Becton Dickinson, San Jose, CA), cada
conteo se realizo en un mínimo de 10,000 eventos. En las muestras para lectura
de CD4+ contra CD8+ y CD3+ contra B220, se combinaron los anticuerpos
marcados con diferentes fluorocromos, además de utilizar un control. El análisis
de resultados, se llevó a cabo mediante el software (winMDI 2.8)
Procesamiento para inmunohistoquímica. El paladar extraído se colocó en contenedores de aluminio de 1 cm³, sobre
una base de medio de inclusión hidrosoluble (Tissue-tek), con el NALT en posición
ventral, éste fue cubierto con una segunda capa de tissue-tek y se congeló en
isopentano. Las muestras fueron almacenadas a –70° C, hasta su corte en
criostato.
De las muestras del NALT congeladas se obtuvieron cortes de 7 μm de espesor,
se colocaron en series de portaobjetos previamente tratados con gelatina la 1% y
se fijaron en acetona durante 20 minutos.
Tinciones
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En los cortes fijados en acetona se realizaron las tinciones
inmunohistoquímicas para identificar las siguientes poblaciones celulares: por
inmunohistoquímica indirecta se detectaron linfocitos T CD3+, CD8+, CD4+, y γδ
utilizando los respectivos anticuerpos monoclonales de ratón, conjugados con
biotina (Pharmingen). Posteriormente se aplicó estreptavidina conjugada con
peroxidasa (Jackson Immuno Reserch).
Análisis microscópico y cuantificación de las células.
Los linfocitos T CD3+, CD4+, CD8+ y B CD45+ se contaron en áreas
constantes de 5000 μm2, en las zonas parafolicular y folicular del NALT; para los
linfocitos γδ se cuantificaron en todo el NALT y ajustado a un área de 0.05 mm2
utilizando el programa Image Pro Plus.
Cada uno de los conteos se realizó por duplicado.
Análisis estadístico
Los datos se presentaran como la media ± desviación estándar. La comparación
entre dos grupos se hará utilizando la prueba t de Student. Para la comparación
de mas de dos grupos se utilizara la prueba de ANOVA de una vía, y si se
encuentra un cambio significativo (P < 0.05), las medias de los grupos respectivos
se comparan con la prueba de t de Bonferroni.
RESULTADOS Y DISCUSION Cuantificación de las células por inmunohistoquímica. Linfocitos CD4. El número total de linfocitos T CD4 en el NALT de los animales estresados
presentaron una media de 30.7 +/- 1.2 la cual fue menor en relación al grupo
testigo (51.1+/-5.7) con una p= 0.0002. La reducción en la población de linfocitos T
CD4 se ha observado en diversas situaciones de estrés, tanto agudo como
crónico. Este efecto se ha atribuido a la accion de las hormonas de estrés:
glucocorticoides y catecolaminas. Para analizar el papel de estas hormonas se
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analizo el efecto del estrés en animales adrenalectomizados (ADX). En los
animales adrenalectomizados (ADX) (54.0 +/- 3.5) y adrenalectomizados+estrés
(ADX+E) (47.2 +/- 1.6) el numero de linfocitos CD4+ fue similar al encontrado en el
grupo testigo. Comparando a los animales estresados con los ADX y ADX+E
observamos un aumento de las células en ambos grupos con p= 0.002 y p=
0.0001 respectivamente. (Figura 1). La cuantificación de las células por regiones
folicular y parafolicular mostró resultados semejantes. (Figuras 2 y 3). Los
resultados sugieren por un lado que la producción basal de glucocorticoides y
catecolaminas por las glándulas suprarrenales reduce el numero de linfocitos
CD4+ que se localizan en las regiones folicular y parafolicular del NALT. Por el
otro lado, el bloqueo de los efectos del estrés sobre el NALT por la adrenalectomia
sugiere que glucocorticoides y catecolaminas son los mediadores del estrés.
Linfocitos CD 4
Grupos
No.
de
célu
las/
0.0
05 m
m2
0
10
20
30
40
50
60
TestigoEstrésADXADX + E
Figura 1. Linfocitos CD4 totales en el NALT. Se observa disminución significativa el grupo de estrés en relación al control con una de p= 0.0002 y los grupos ADX y ADX+E muetran incrementos significativos en relación al grupo de estrés con p= 0.002 y p= 0.0001 respectivamente.
10
Linfocitos CD4 Región Folicular
Grupos
No.
de
célu
las/
0.00
5 m
m2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
TestigoEstrésADXADX + E
Figura 2. Linfocitos CD4 en la región folicular del NALT. La disminución de células en el grupo de estrés en relación al control fue significativa con p= 0.002 y el incremento del grupo ADX + E en relación con el grupo de estrés con una p= 0.04.
Linfocitos CD4Región Parafolicular
Grupos
No.
de
célu
las/
0.00
5 m
m2
0
10
20
30
40
50
TestigoEstrésADXADX + E
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Figura 3. Linfocitos CD4 en la región parafolicular del NALT. La disminución de células en el grupo de estrés en relación al control fue significativa con p= 0.0026 y el incremento de los grupos ADX y ADX+E en relación con el grupo de estrés con p= 0.01 en ambos analisis. Linfocitos CD8 El número total de linfocitos T CD8 en el NALT de los animales estresados
presentaron una media de 11.1 +/- 2.3 la cual fue menor en relación al grupo
testigo (16.3 +/- 4.0) aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa.
Esto sugiere que los linfocitos CD8+ son mas resistentes a los efectos del estrés
que la población CD4+.
En los grupos ADX y ADX+E la cantidad de células se incremento con medias de
25.3 +/- 4.9 y 21.0 +/- 2.4 respectivamente, y nuevamente las diferencias no
fueron significativas. Comparando al grupo estresado con los grupos ADX y
ADX+E en incremento de las células es significativo con p= 0.01 y p=0.007
respectivamente.(Figuras 4).
Linfocitos CD 8
Grupos
No.
de
célu
las/
0.0
05 m
m2
0
5
10
15
20
25
30
35
TestigosEstrésADXADX +E
Figura 4. Linfocitos CD8 totales en el NALT. Comparando al grupo estresado con los grupos ADX y ADX+E en incremento de las células es significativo con p= 0.01 y p=0.007 respectivamente.
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El análisis en la región parafolicular mostró diferencias significativas entre
el grupo de estrés (10.7 +/- 3.4) y el grupo ADX (20.9 +/- 3.7) con una p= 0.01 y
con el grupo ADX+E (17.7 +/- 1.9) con una p= 0.019. (Figura 5). En la región
folicular, hubo diferencias entre el grupo testigo (2.3 +/- 0.65) y el ADX+E (3.9 +/-
0.73) con p=0.04; También se observó incrementos significativos al comparar a los
animales estresados (1.7 +/- 0.34) con en los grupos ADX (4.4 +/- 1.6), p= 0.021 y
los ADX+E con una p=0.002 (Figura 6).
Linfocitos CD8Región Parafolicular
Grupos
No.
de
célu
las/
0.00
5 m
m2
0
5
10
15
20
25
30
TestigoEstrésADXADX + E
Figura 5. Linfocitos CD8 en la región parafolicular del NALT. El análisis estadístico muestra
diferencias significativas entre el grupo de estrés y los grupos ADX con p= 0.01 y con el grupo
ADX+E con una p= 0.019.
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Linfocitos CD8Región Folicular
Grupos
No.
de
célu
las/
0.00
5 m
m2
0
1
2
3
4
5
6
7
TestigoEstrésADXADX + E
Figura 6. Linfocitos CD8 en la región folicular del NALT. Se Observa un incremento
significativo en el grupo ADX + E en comparación con el testigo con p=0.04; También los incrementos son significativos al comparar a los animales estresados con en los grupos ADX, p= 0.021 y el ADX+E con una p=0.002 En conjunto los resultados sugieren, al igual que para celulas CD4+, que la
producción basal de glucocorticoides y catecolaminas por las glándulas
suprarrenales reduce el numero de linfocitos CD8+ que se localizan en las
regiones folicular y parafolicular del NALT.
Linfocitos CD45 El número total de linfocitos T CD45 en el NALT de los animales estresados
presentaron una media de 77.2 +/- 3.2 y los ADX+E de 62.5 +/- 4.5 las cuales
fueron menores en relación al grupo testigo (82.0 +/- 13.6) aunque estas
diferencias no fueron estadísticamente significativas. Pero al comparar el grupo
ADX (95.7 +/- 16.4) con los ADX+E hubo diferencia significativa con una p= 0.027;
igualmente comparando ambos grupos de animales sometidos a estrés
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observamos que los animales ADX+E tuvieron menos células que los animales
con estrés solo (p= 0.003) (Figura 7).
El análisis de la región parafolicular mostró diferencias significativas entre el grupo
testigo 22.8 +/- 2.3 y el grupo ADX que presento menos células (15.0 +/- 1.8) p=
0.01 y el grupo ADX+E (16.1 +/- 2.9), p= 0.03. Igualmente comparando el grupo
de estrés solo este presento mas células que ambos grupos de animales
adrenalectomizados; ADX p= 0.007 y ADX+E 0.05 (Figura 8).
En la región folicular se observaron diferencias entre los grupos ADX (80.6 +/-
14.5) y ADX+E (46.2 +/- 1.7) con p= 0.015. Igualmente comparando ambos
grupos de animales sometidos a estrés observamos que los animales ADX+E
tuvieron mas células que los animales con estrés solo (56.7 +/- 5.3) (p= 0.027)
(Figura 9).
Linfocitos CD 45
Grupos
0 1 2 3 4
No.
de
célu
las/
0.0
05 m
m2
50
20
40
60
80
100
120
140TestigoEstrésADXADX + E
Figura 7. Linfocitos CD45 totales en el NALT. La comparación del grupo ADX con el ADX+E muestra diferencia significativa con una p= 0.027. Comparando ambos grupos de animales sometidos a estrés se observa disminución significativa en los animales ADX+E con p= 0.003
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Linfocitos CD45Región Parafolicular
Grupos
No.
de
célu
las/
0.05
mm
2
0
5
10
15
20
25
30
TestigoEstrésADXADX + E
Figura 8. Linfocitos CD45 en la región parafolicular del NALT. El análisis mostró disminución significativa comparando los grupos ADX y ADX+E con el grupo testigo con p= 0.01 y p= 0.03 respectivamente. Comparando el grupo de estrés con ambos grupos de animales adrenalectomizados el primero presenta mayor número de células; ADX p= 0.007 y ADX+E p=0.05.
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Linfocitos CD45Región Folicular
Grupos
No.
de
célu
las/
0.00
5 m
m2
0
20
40
60
80
100
120
TestigoEstrés ADXADX + E
Figura 9. Linfocitos CD45 en la región folicular del NALT. El análisis estadístico mostró diferencias entre los grupos ADX y ADX+E con p= 0.015. Al comparando ambos grupos de animales sometidos a estrés se observa que los animales ADX+E muestran mas células que los animales con estrés p= 0.027.
Los resultados muestran que los linfocitso CD45, al igual que los linfocitos CD8+,
son mas resistentes a los efectos del estrés que la población CD4+. Por otro lado,
muestran que la adrenalectomia redujo el numero de linfocitos CD45+ en el are
parafolicular pero lo incremento en el área folicular, lo cual puede deberse a que
las catecolaminas y/o glucocrtivoides incremente normalmente el numero de
células CD45+ en el area parafolicular y la disminuyan en el area folicular.
Linfocitos γδ
Esta población se cuantificó en toda el área del corte debido la que su número es
escaso. El análisis estadístico mostró incremento celular significativo en los tres
grupos tratados en relación al control con medias de 10.5 +/- 1.1 el control, los
estresados 14.6 +/- 2.4 (p= 0.04), el ADX 38.6 +/- 4.5 (p= 0.0004) y el ADX+E
17.5 +/- 1.7 (p= 0.04). También comparando los grupos ADX y ADX+E hubo
diferencia significativa con p= 0.001 (Figura 10).
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Linfocitos Gamma/Delta
Grupos
No.
de
célu
las/
0.05
mm
2
0
10
20
30
40
50
TestigoEstrésADXADX + E
Figura 10. Linfocitos γδ en el NALT. El análisis estadístico mostró incremento significativo en los tres grupos tratados en relación al control con p= 0.04 en relación a los estresados; p= 0.0004 con el ADX y p= 0.04 con el ADX+E Comparando los grupos ADX y ADX+E se observa disminución significativa con p= 0.001
Al contrario de lo que ocurre con la población CD4+, el estrés incremento ligera
pero significativamente a la poblacion γδ+ , lo cual sugiere que las catecolaminas
o glucocorticoides promueven la migración o proliferación de esos linfocitos en el
NALT. Sin embargo, la adrenalectomia incremento en 4 veces su numero, lo cual
es contrario al aparente efecto positivo sobre migración y proliferación.
Cuantificación de las células por citometría de flujo.
La cantidad de células medida por citometría de flujo se reportan en porcentajes y
son los siguientes:
18
Como podemos observar el porcentaje de los linfocitos T disminuyó en los
animales estresados, no así los linfocitos B que se incrementaron casi a doble. En
cambio en el grupo ADX los linfocitos T mostraron incremento y los linfocitos B no
tuvieron cambios significativos en relación a los testigos. El estrés en los animales
adrenalectomizados (grupo ADX+E) ocasionó una disminución en las tres
poblaciones celulares, aunque estos fueron muy semejantes a los observados en
el grupo testigo. (Figura 11).
Testigo Estrés ADX ADX + estrés
CD4 27.3 23.1 34.4 30.2
CD8 8.5 5.79 12.4 10.1
CD45 31.3 61.0 34.0 27.2
19
CitometriaLinfocitos NALT
CD8
% d
e cé
lula
s
0
10
20
30
40
50
60
70
TestigoEstrésADXADX + E
CD4 CD45 Figura 11. Cuantificación por citometría de linfocitos del NALT. Se observa que es estrés aumenta la cantidad de linfocitos B. En cambio la adrenalectomía incrementa el número de linfocitos T, sin cambios importantes en los linfocitos B.
BIBLIOGRAFIA
Asanuma H, Hodson AT, Iwasaki T, Sato Y, Inaba Y, Aizawa C, Kurata T, Tamura S. Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue. J Immunol methods. 1997; 202: 123-131. Bateman, A., Singh, A., Kral, T. & Solomon, S. (1989). The immune-hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Endocr Rev 10, 92-112. Bellinger DL, L. D., Lubahn C, Felten DL. (2001). Innervation of Lymphoid Organs- Association of Nerves with Cells of the Immune System and Their Implications in DIsease. In Psychoneuroimmunology, pp. 55-111. Edited by F. D. Ader R, Cohen N. San Diego: Academic Press. Boyaka PN, Wright PF, Marinaro M, Kiyono H, Johnson JE, Gonzales RA, Ikizler MR, Werkhaven JA, Jackson RJ, Fujihashi K, Di Fabio S, Staats HF, and McGhee JR. Human nasopharyngeal-associated limphoreticular tissues, functional analysis of subepithelial and intraepithelial B and T cells from adenoids and tonsils. Am J Pathol. 2000; 157: 2023-2035.
20
Charmandari, E., Tsigos, C. & Chrousos, G. (2005). Endocrinology of the stress response. Annu Rev Physiol 67, 259-284. Cheroutre H. IELs: enforcing law and order in the court of the intestinal epithelium. Immunol Rev. 2005; 206: 114-131. Chrousos, G. P. (1995). The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. N Engl J Med 332, 1351-1362. Csencsits KL, Jutila MA, Pascual DW. Nasal associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addresin in naive lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site. J Immunol. 1999; 163: 1382-1389. Dhabhar FS y McEwen BS. Bidirectional effects of stress and Glucocorticoid Hormones on Immune function: Possible explanations for Paradoxical observations. Psychoneuroimmunology. 2001; 1: 301-330. Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P. & Vizi, E. S. (2000). The sympathetic nerve--an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system. Pharmacol Rev 52, 595-638. Eskandari, F. & Sternberg, E. M. (2002). Neural-immune interactions in health and disease. Ann N Y Acad Sci 966, 20-27. Felten, D. L., Felten, S. Y., Carlson, S. L., Olschowka, J. A. & Livnat, S. (1985). Noradrenergic and peptidergic innervation of lymphoid tissue. J Immunol 135, 755s-765s. Felten, D. L., Livnat, S., Felten, S. Y., Carlson, S. L., Bellinger, D. L. & Yeh, P. (1984). Sympathetic innervation of lymph nodes in mice. Brain Res Bull 13, 693-699. Harbuz, M. S. & Lightman, S. L. (1992). Stress and the hypothalamo-pituitary-adrenal axis: acute, chronic and immunological activation. J Endocrinol 134, 327-339. Harmsen A, Kusser K, Hartson L, Tighe T, Sunshine MJ, Sedwick JD, Choi Y, Littman DR, Randall TD. Cutting edge: Organogenesis of nasal-associated lympoid tissue (NALT) occurs independently of limphotoxin-α (LTα) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ, but the organization of NALT is LTα dependent. J Immunol. 2002; 168: 986-990. Kiyono H, Fukuyama S. NALT-versus peyer’s-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 2004; 4: 699-710.
21
22
Kohm, A. P. & Sanders, V. M. (2001). Norepinephrine and beta 2-adrenergic receptor stimulation regulate CD4+ T and B lymphocyte function in vitro and in vivo. Pharmacol Rev 53, 487-525. Madden, K. S., Sanders, V. M. & Felten, D. L. (1995). Catecholamine influences and sympathetic neural modulation of immune responsiveness. Annu Rev Pharmacol Toxicol 35, 417-448. McEwen BS. Protective and damaging effects of stress mediators. New England Journal Med 1998: 338; 171–179. McEwen, B. S., Biron, C. A., Brunson, K. W. & other authors (1997). The role of adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural, endocrine and immune interactions. Brain Res Brain Res Rev 23, 79-133. Mebius RE. Organogenesis of lymphoid tissues. Nat rev Immunol. 2003: 3; 292-303. Nance, D. M. & Sanders, V. M. (2007). Autonomic innervation and regulation of the immune system (1987-2007). Brain Behav Immun 21, 736-745. Okuda M, Pawankar R. Flow cytometric analysis of intraepithelial lymphocytes in the human nasal mucosa. Allergy. 1992; 47: 255-259. Paca´k K. and Palkovits M. Stressor specificity of central neuroendocrine responses: implications for stress-related disorders. Endocr Rev. 2001: 4; 502–548 Sanders, V. M. (2006). Interdisciplinary research: noradrenergic regulation of adaptive immunity. Brain Behav Immun 20, 1-8.
Tristram GP, Stites DP, Terr AI, Imboden JB. Inmunología Básica y clínica. 10a ed. México: Manual moderno; 2001 Webster, J. I. & Sternberg, E. M. (2004). Role of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, glucocorticoids and glucocorticoid receptors in toxic sequelae of exposure to bacterial and viral products. J Endocrinol 181, 207-221. Webster, J. I., Tonelli, L. & Sternberg, E. M. (2002). Neuroendocrine regulation of immunity. Annu Rev Immunol 20, 125-163.
Ying X, Chan K, Shenoy P, Hill M, Ruddle NH. Lymphotocin plays a crucial role in the development and function of nasal-associated-lymphoid tissue through regulation of chemokines and peripheral node addressin. Am J Pathol. 2005; 166: 135-146.