Efecto de xenoesteroides sobre la determinación y diferenciación sexual en

larvas de pejerreyAnelisa González; Lucila Elordi; Melina Barrionuevo

Disruptores/Desorganizadores endocrinos“Una sustancia exógena o mezcla de sustancias que altera una función o varias del sistema endocrino, y consecuentemente produce efectosadversos en un organismo, en su progenie o en poblaciones” OMS 2002.

Eje:

Hipotálamo

Hipofisario

Gonadal

Retroalimentación positiva y negativa

Pejerrey: Odontesthes bonariensis

(Mariano Elisio, 2013)

Junio Octubre-Enero Marzo-Mayo

De

sov

es

Etapa reproductiva

(Strussmann et, al 1996, 1997, 2002, 2003, 2005; Elisio, 2012; Fernandino et, al 2008ª, 2008b)

10 días

10 semanas

(Chalde et al, 2012)

Objetivo general

Evaluar los mecanismos de acción y la relevancia ambiental de xenoesteroides sobre la determinación y diferenciación sexual en larvas de pejerrey (Odontesthes bonairiensis)

Objetivos específicos

1.Mecanismos de Acción- Hallar el LC50 y NOEC para cada xenoesteroide.- Estudiar los efectos de la exposición a xenoesteroides en agua

sobre: a)la expresión de genes específicos, b) la diferenciación gonadal, c) la relación de sexos y d) el crecimiento de las larvas.

� durante el período de determinación y diferenciación sexual .

2.Relevancia Ambiental- Evaluar los efectos de xenoesteroides provenientes de los desagües

cloacales vertidos en la laguna de Chascomús sobre la determinación y la diferenciación sexual de larvas.

MECANISMOMECANISMO DE ACCIDE ACCIÓÓNN

• Curva de Decaimiento (E2, EE2, T, MeT): Me permite establecer cada cuánto tiempo será necesario renovar la concentración del tóxico deseada en la unidad de ensayo (pecera).

Agua + vehículo para esteroides (DMSO)/ Temp 25 ± 0,5°C/ L16:O8.

Determinación de la [xenoesteroides] cada 24 hs durante 96 hs.

• Ensayo exploratorio (Range Finding Test): 1-10-100 mg/l.

• CL50 (Concentración Letal sobre el 50% de la población): Se realizará para cada xenoesteroide con 5 concentraciones por triplicado durante 96 hs. Temp 25 ± 0,5°C. L16:O8.

Bioensayo en Laboratorio

• NOEC (Non Observed Effect Concentration): es la máxima concentración de xenobiótico para la cual la respuesta de los organismos no es significativamente diferente del control.

Bioensayo en larvas de Medaka (Oryzias latipes)

Para el caso de aquellos ensayos de toxicidad en los que se evalúan por ejemplo la inhibición de parámetros como crecimiento, reproducción, elongación de raíz, las respuestas se analizan mediante test de hipótesis. Los datos se analizan para determinar si la respuesta en cada concentración ensayada es significativamente diferente de la obtenida para el control.

XenoesteroideNOEC (reversión

sexual)CL50

E2 0,1 µg/l 3,9 mg/l

EE2 0,03 µg/l 1,5 mg/l

MeT >0,1 µg/l >10 mg/l

Hagino et al., 2001

Bioensayo en Laboratorio

Curvas dosis-respuesta

Monotónicas

No-Monotónicas

(Vanderverg et al, 2012)

Modelo de exposición para cada xenoesteroide: E2, EE2, T y MeT. 5 concentraciones, más el control. Por triplicado.

* Renovación del esteroide de acuerdo a la curva de decaimiento previamente estudiada

Fotoperiodo L16:O8 Temperatura: 25ºC ± 0.5 ºC400 c/ 200L

Bioensayo en LaboratorioExposición de larvas

Bioensayo en Laboratorio

Semanas pos-eclosión

0 2 6 10

Determinación y diferenciación sexual

2 4 610

Exposición

Se toman 10 individuos de cada tratamiento - Se miden y pesan- Se separa el tronco para extracción de RNA y subsecuentedeterminación de la expresión génica por RTqPCR.

Se toman 5 individuos de cada tratamiento para determinación del sexo y evaluación del desarrollo gonadal por histología

cyp19a1a

RERA

amh

Metodología de Muestreo

hsd11b2

RESULTADOS ESPERADOS

� Esperamos que los compuestos estrogénicos promuevan la formación de hembras, y por lo tanto durante la formación del ovario veríamos dicho comportamiento en los bioindicadores seleccionados. Y de lo contrario, para los compuestos androgénicos con la promoción de machos.

Estadística: ANOVA EN BLOQUE

� Crecimiento somático� Expresión relativa de cyp19a1a, hsd11B2, amh, RE y RA

Estadística: Binomial Test

� Proporción de sexos

RELEVANCIA AMBIENTALRELEVANCIA AMBIENTAL

Sitio de estudio: Laguna de Chascomús, Pcia. de Buenos Aires

Hipótesis: Los xenoesteroides vertidos por el efluente cloacal a la laguna de Chascomús afectan a la diferenciación y a la determinación de las larvas de

pejerreyes.

�En la semana 2-4 y 6 sacamos 10 larvas de cada UE para medir los bioindicadores

�Además, sacamos muestra de agua de cada sitio para medir: turbidez, oxígeno disuelto, conductividad y PH

� Colocamos sensores de temperatura data loggers en una bolsa del efluente y en otra del control para controlar la temperatura del agua, ya que afecta la determinación sexual de las larvas.

� En la 10ma semana sacamos las larvas para hacer histologia (N = 5).

Permite el intercambio con el medio

400 larvas cultivadas en bioterio en la 2da

semana de desarrollo

Diseño experminetal

UNIDAD EXPERIMENTAL (UE): la bolsa

RÉPLICAS: 3 bolsas por cada sitio (salida del efluente-control)

Análisis estadístico:

� Evaluar si hay diferencias en las concetraciones de xenoesteroides, temperatura, calidad del agua (turbidez, oxígeno disuelto, PH y conductividad) entre el grupo del efluente y el control y a lo largo del desarrollo de las larvas.� Diseño en bloque: Comparar la concentración de los bioindicadores entre las larvas expuestas al agua a la salida del efluente y las expuestas en la zona control.� Comparar mediante un analísis Binomial la proporción de sexos en el sitio control y a la salida del efluente.

Resultados esperados:

�Esperamos que el sitio del efluente tenga mayores concentraciones de xenoesteroides que el sitio control.

� Esperamos encontrar resultados diferentes a los hallados en el laboratorio debido a que aquí los compuestos se encuentran en una mezcla y en consecuencia podríamos hallar efectos de sinergismo y/o antagonismos, los cuales serán dirimidos a partir de los resultados anteriores.