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EFECTO DE CIERTAS PRÁCTICAS ENOLÓGICAS EN LA CALIDAD POLIFENÓLICA DE UVA Y VINO. RELACIÓN CON EL COLOR Y LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE. Financiado por Consejería de Educación y Ciencia. Nº de Proyecto: PCC-05-002-2 Coordinado con: Dr. D. Francisco Montero Riquelme Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la Universidad de Castilla-La Mancha. Duración: 2005- 2007 Investigadores: Esteban García Romero, Sergio Gómez Alonso, Isidro Hermosín Gutiérrez, Noelia Castillo Muñoz. Introducción En Castilla-La Mancha, reconocida como la primera región del mundo con respecto a extensión de viñedo y a producción de vino (según datos estadísticos de la Consejería de Agricultura de 2003: 566.587 Has y 3.610.274 Tn de uva, lo que supone un 50.44 y un 48.35% respecto de la extensión y producción nacionales respectivamente), el sector vitivinícola es uno de los pilares de la economía a lo que hay que añadir la importancia social e incluso medioambiental (en lo que atañe a la vid como elemento definitorio del paisaje castellano-manchego). El consumo de vino sin embargo decrece año a año y el mercado se transforma: disminuyen las ventas de vinos “corrientes” y aumentan las de vinos de calidad, más de los tintos que de los blancos (Lauroba y Domínguez, 1999). La mayoría de las bodegas de la región así lo tienen entendido y han invertido en medios técnicos que propicien la obtención de vinos con un mayor valor añadido, en especial tintos de crianza, reserva y gran reserva. La administración, por su parte, ha apoyado al sector mediante los planes de reconversión del viñedo con los que se ha logrado que se sustituyeran vides de variedades blancas poco apreciadas por otras, en general tintas, de mayor prestigio; fundamentalmente Cencibel (o Tempranillo) aunque también foráneas como Cabernet Sauvignon, Merlot o Syrah (o Shiraz) Estos cambios han propiciado que los enólogos se encuentran con nuevos problemas, sobre todo en lo relacionado con la extracción del color durante la vinificación y con la estructura polifenólica de los vinos tintos, que condiciona en gran medida las posibilidades de obtener vinos de crianza y envejecimiento con unas características organolépticas (en especial el color y astringencia) que no muestren una evolución muy acusada en un intervalo de tiempo corto-medio. Varias son las causas:
- Cepas jóvenes cuyas producciones presentan poco potencial polifenólico - Plantaciones en espaldera y regadío con producciones que no llegan a alcanzar
los contenidos polifenólicos que podrían esperarse de la variedad. - Variedades como la Bobal o Garnacha que históricamente sólo han sido
empleadas para la producción de vinos rosados y ahora se intentan revalorizar mediante la producción de vinos tintos.
Siendo todos los anteriores hechos constatables, un problema subyacente es que la transformación de las plantaciones y el cambio en las prácticas vitícolas no se han acompañado del correspondiente estudio del potencial fenólico y de la forma en cómo moldearlo a las necesidades de concentración y estabilidad de los vinos tintos de calidad. El simple traspaso de las técnicas vitivinícolas de las zonas de donde se han importado los nuevos conceptos no es aceptable por diferencias fundamentales como es el clima de nuestra región, diferenciado al de otras regiones españolas (Rioja, Ribera, Penedés) o extranjeras (Bourdeos, Montpellier,...). La elaboración de vinos tintos jóvenes exige que éstos tengan alta intensidad colorante y tonalidades rojo-púrpuras, pero que no sean excesivamente astringentes; en cambio, para la elaboración de vinos tintos que se vayan a someter a crianza y envejecimiento, se requiere que éstos posean una estructura polifenólica suficientemente robusta como para resistir los lentos procesos oxidativos de la crianza, así como que las transformaciones que sufre la materia colorante del vino no afecten de forma acelerada a la intensidad y a la tonalidad del color. Por esta razón, a la hora de elaborar un vino tinto, no basta con conocer el potencial fenólico de la uva empleada como materia prima, sino que además es preciso conocer los mecanismos que gobiernan la transferencia de los compuestos fenólicos, que son las sustancias responsables del color y de la aptitud para la crianza de los vinos tintos, desde la uva hasta el vino durante la vinificación. Es muy conocido por los enólogos el hecho de que las uvas con más color no dan lugar necesariamente a los vinos de mayor intensidad colorante, y son muchas las decepciones relacionadas con vinos jóvenes con una alta intensidad colorante inicial que disminuye rápida e inexorablemente en los meses siguientes. Algunos autores han sugerido (Boulton, 2001) que, para tener una visión más exacta de los procesos en que está implicada la materia colorante del vino durante su transferencia desde la uva al vino durante la vinificación, y posteriormente en el vino durante su crianza y envejecimiento, debe prestarse más atención a un fenómeno denominado copigmentación (Figura 1). �
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Figura 1. Influencia del pH (rango de 1 a 7) en el color de una disolución de monoglucósido de malvidina. Izquierda sin copigmento; Derecha con copigmento.
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Los complejos de copigmentación los forman los antocianos monómeros originales de la uva, con otras sustancias también presentes en la uva (llamadas copigmentos o cofactores, normalmente otros compuestos fenólicos incoloros). Estos complejos de copigmentación son muy estables y ayudarían a incrementar el porcentaje de transferencia de antocianos de la uva al vino. Al ser tan estables los complejos de copigmentación, los antocianos se ven protegidos en ellos de los fenómenos que pueden degradarlos (por ejemplo, su oxidación o su hidrólisis) o transformarlos en pigmentos
más o menos polimerizados. A la luz de esta nueva visión del fenómeno de transferencia de color durante la vinificación, se hace necesario evaluar el potencial fenólico de las uvas tintas no sólo desde la perspectiva de su contenido en antocianos, sino también considerar la cantidad de cofactores presentes en las uvas que podrían aumentar su porcentaje de transferencia y su estabilidad posterior en el vino. De este modo, pueden sugerirse nuevas estrategias para aumentar la intensidad y la estabilidad del color de los vinos tintos: desde el punto de vista de la viticultura, investigar qué factores culturales permiten conseguir las uvas con el mayor potencial fenólico, no sólo por contenido en antocianos, sino también en copigmentos; desde el punto de vista enológico se puede proponer que aquellas vendimias que tengan un alto contenido en antocianos pero bajo contenido en copigmentos, puedan suplementarse con más copigmentos, para favorecer la formación de complejos de copigmentación. En este último sentido, el suplemento en copigmentos podría ser suministrado mediante la cofermentación de las uvas con bajo contenido en copigmentos con otras ricas en éstos. Las uvas ricas en copigmentos podrían ser a su vez de la misma variedad o de distinta variedad. Actividades Realizadas. 1. Análisis por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) de compuestos fenólicos de bajo peso molecular de la uva y el vino, usando multidetección e inyección directa El análisis de los compuestos fenólicos de los diversos productos de la uva y del vino (pepitas, hollejos, mostos y vinos) resulta bastante complicado debido a su gran diversidad. Se trata de analizar ácidos benzoicos e hidroxicinámicos, flavan-3-oles (tanto monómeros como oligómeros y polímeros, los llamados taninos condensados), flavonoles, estilbenos (como el resveratrol), así como antocianos. Dependiendo de la naturaleza del compuesto fenólico a analizar, los requisitos generales de un método cromatográfico por HPLC pueden comprender un paso previo de separación por extracción líquido-líquido o en fase sólida (columnas o cartuchos rellenos de gel de sílice de fase inversa C-18, Toyopearl gel HW-40, o poliamida, por ejemplo). Se ha optimizado un método HPLC basado en el procedimiento descrito por Vaadia (Master of Science Thesis. University of California, Davis, 1997), que es a su vez una modificación del método de inyección directa usado por Lamuela-Raventós y Waterhouse (Am. J. Enol. Vitic. 1994, 45, 1-5). El nuevo método desarrollado combina la detección UV-Vis (DAD) junto con la detección por fluorescencia (FD), tal como proponen Viñas y col. (J. Chromatography A. 2000, 871, 85-93). Usando el detector de fluorescencia, los límites de cuantificación de los flavan-3-oles pueden bajarse, y se pueden evitar las interferencias del resto de compuestos fenólicos que normalmente se resolvía por tediosos protocolos de fraccionamiento previo. Además, para obtener una buena separación cromatográfica, se usó un sistema ternario de disolventes que combina cambios en el pH y en la polaridad. El cambio de pH de 2.6 a 1.5 es necesario para poder eluir los antocianos en forma de cationes flavilio coloreados de rojo. Con este método ha sido posible separar, identificar (en algunos casos sólo se puede proponer una estructura tentativa), y cuantificar hasta 50 compuestos fenólicos en una
única inyección: 2 ácidos benzoicos (DAD a 280 nm), 9 ácidos hidroxicinámicos (DAD a 320 nm), 6 flavan-3-oles (FD a 280/325 nm de excitación/emisión), 16 flavonoles (DAD a 360 nm), 15 antocianos (DAD a 520 nm), y 2 estilbenos (DAD a 306 nm). El método ha sido validado con los correspondientes estudios de linealidad, reproducibilidad y límites de detección.
Figura 2: Cromatograma HPLC de antocianos de un hollejo Cencibel�
Figura 3: Cromatograma HPLC de flavonoles de un hollejo Cencibel
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2. Perfil antociánico de variedades tradicionales de vid en peligro de extinción. Entre los cultivares de vid se puede observar una gran variación en el color de la uva que va desde el Amarillo-verdoso (variedades blancas) al azul oscuro. El color de la uva tinta está determinado por la acumulación de antocianos localizados en el hollejo de la uva salvo en pocas excepciones que también están presentes en la pulpa. Estos compuestos pasan al vino durante la maceración, proporcionando el color característico a los vinos tintos y rosados. Las enzimas implicadas en la biosíntesis de los antocianos son numerosas (Kobayashi et al., 2002; Kobayashi et al., 2004): phenylalanine ammonia-lyase PAL, chalcone synthase CHS, dihydroflavonol 4-reductase DFR, flavanone 3-hydroxylase F3H, leucoanthocyanidin dioxygenase LDOX y UDP-glucose:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UFGT. Además, los análisis moleculares indican que las variaciones genéticas y somáticas en el color de la uva pueden asociarse con el gen VvmybA1. Por lo tanto, el gen VvmybA1 es en gran medida determinante de la variación en el color de la baya, y su inestabilidad es la principal causa de variación somática para este rasgo (Kobayashi et al., 2004; Lijavetzky et al., 2006; Yakushiji et al., 2006). La concentración de antocianos en la uva depende de diversos factores como la temperatura durante la maduración (Kliewer, 1970; Yamane et al., 2006), la diferencia de temperaturas diurnas y nocturnas o la aplicación de ácido abscísico, que aumenta la expresión del gen VvmybA1 (Mori et al., 2005). Sin embargo, se sabe que esta composición se modifica muy poco durante las últimas etapas de la maduración (Ryan et al., 2003). Así, las uvas maduras y los vinos jóvenes de variedades tintas de vid presentan una composición antociánica cualitativa característica (Mazza, 1995) y poco variable con respecto a las condiciones climáticas o de cultivo (Fernández-López et al., 1998). Por ello el perfil antociánico se ha utilizado como criterio para la caracterización varietal de uvas y vinos tintos (Wenzel et al, 1987; Darne, 1988; Valenti et al., 1997; García-Beneytez et al., 2002; Hermosín et al., 2004; Hermosín et al., 2005). Así, por ejemplo variedades tradicionales españolas como Tempranillo (también llamada Cencibel), Garnacha Tinta y Garnacha Tintorera se caracterizan por el predominio de los derivados no acilados, predominando entre ellos los cumaratos frente a los acetatos, mientras que otras variedades de origen francés como Cabernet Sauvignon y Merlot destacan por contener niveles más altos de acetatos, Syrah contiene niveles altos tanto de acetatos como de cumaratos y Pinot Noir es característica por no contener antocianos acilados. Las causas para la aparición de estas diferencias en el perfil antociánico hay que buscarlas en la actividad de las enzimas directamente relacionadas con la ruta biosintética de estos compuestos, profusamente estudiadas desde hace años (Holton et al., 1995; Boss et al, 1996). En la Figura 4 se muestra un esquema de esta ruta. A partir del dihydrokaempferol se inician dos rutas distintas, la de los 3’,4’-hydroxylated anthocyanins y la de los 3’,4’,5’- hidroxylated anthocyanins moduladas por la actividad de las enzimas Flavonoid-3’- hidroxylase y Flavonoid-3’,5’-hidroxylase, F3’H y F3’5’H respectivamente. Seguidamente la actividad de la enzima Flavonoid methyltransferase (FMT) regula la biosíntesis de antocianos metilados.
Figura 4. Rutas metabólicas de la biosíntesis de antocianos. F3’H, Flavonoid 3’-hidroxylase; F3’5’H, Flavonoid 3’,5’-dihidroxylase; DFR, dihidroflavonol 4-reductase; LDOX, Leucoanthocianidin
dioxygenase; UFGT, UDP-glucose:flavonoid-3-O-glucosil transferase; FMT, Flavonoid methyltransferase.
Durante las últimas décadas y debido a un continuo proceso de erosión genética, potenciado por los procesos de reconversión del viñedo, se ha evidenciado una pérdida masiva de variedades autóctonas de vid que han sido cultivadas tradicionalmente en distintas regiones vitícolas. El único modo de evitar la pérdida de este patrimonio es localizarlo, estudiarlo, y conservarlo en bancos de germoplasma para poder llevar a cabo una caracterización que permita identificarlo de modo preciso. 1. Prospección Durante los años 2004 y 2005 se prospectaron una serie de poblaciones de Castilla La Mancha, donde la vid resulta actualmente un cultivo marginal frecuentemente compuesto de parcelas plurivarietales, en total se recogieron 20 accesiones de Vitis
Vinifera L. En la tabla 1 se recogen las accesiones estudiadas y la procedencia de las mismas. 2. Identificación La identificación varietal de las accesiones se realizó mediante el análisis de las 6 regiones microsatélites, recomendadas por el proyecto europeo GENRES 081: VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 y VrZAG79 (This et al., 2004), según la metodología descrita por Fernández-González, Mena, Romero & Martínez (2006).
Tabla 1. Accesiones empleadas en el estudio. Denominación local, nombre habitual de la variedad y lugar de origen del material vegetal.
Denominación local Denominación habitual Localidad (Provincia) Derechero Ariño1 Sacedón (GU) Crujidera Brujidera1 Sacedón (GU) Colgadera Brujidera1 Campillo de Altobuey (CU) Rucial Brujidera1 Casasimarro (CU) Moravia Dulce Brujidera1 Cañaveras (CU) Churriago * Villaverde y Pasaconsol (CU) Gordera Roja * Villar de Olalla (CU) Gordera Negra * Arrancacepas (CU) Moravia Agria Moravia Agria1 Madrigueras (AB) Moravia Agria Moravia Agria1 Casasimarro (CU) Moravia Agria Moravia Agria1 Villagarcia del Llano (AB) Coloraillo Gordo Rojal1 Campillo de Altobuey (CU) Coloraillo Pequeño Rojal1 Campillo de Altobuey (CU) Machina Rojal1 Casasimarro (CU) Rojal Rojal1 Madrigueras (AB) Teta de Vaca Tinta * Villar de Olalla (CU) Granadera Tinto Velasco1 Villaverde y Pasaconsol (CU) Frasco Tinto Velasco1 Madrigueras (AB) Desconocido1 * Villaverde y Pasaconsol (CU) Unkwown2 * Villar de Olalla (CU)
3. Análisis de Antocianos Para determinar la composición antociánica de los hollejos de las distintas variedades de uva emplearon alrededor de 100 uvas representativas del conjunto que se pesaron y se prensaron entre los dedos para eliminar la pulpa. Los hollejos se lavaron con agua Milli-Q, se secaron entre papel de filtro y se pesaron.Una vez secos, se tomo una porción de los hollejos y se sometió a homogenización con una mezcla de metanol/agua/ácido fórmico. Este homogenizado se centrifugo y el sobrenadante se analizo mediante HPLC. Los análisis fueron realizados en un equipo HPLC compuesto por una bomba ternaria, un automuestreador y un detector de fotodiodos array, empleando una columna C18 de 250x4,6 mm y un flujo de 1 ml/min de fase movil. Los antocianos se identificaron de acuerdo a su orden de elusión, los tiempos de rentención respecto al 3-glucosido de malvidina y su espectro característico de absorción en el UV-Vis (Hebreros et al., 1988; Cantos et al., 2002). La cuantificación se realizó a 520 nm, longitud de onda característica de los antocianos, mediante el método del patrón externo con respecto al 3-O-monoglucósido de malvidina (Extrasynthese,
Genay, France). Los resultados se han expresado en tanto por ciento molar sobre el total de compuestos identificados y cuantificados. 4. Tratamiento de Datos Los datos obtenidos se sometieron a un análisis de la varianza y la prueba de Student-Newman-Keuls para determinar la posible existencia de diferencias estadísticamente significativas entre variedades y a un análisis de componentes principales. Estos tratamientos estadísticos se realizaron empleando el softwate SPSS 12.0. 5. Resultados Los seis locis microsatélite seleccionados para este estudio discriminaron 10 genotipos diferentes entre las 20 accesiones estudiadas, 5 con genotipos identicos a variedades de vid previamente descritas geneticamente (Ariño, Brujidera, Rojal, Tinto Velasco y Moravia Agria) (Martín et al. 2003) y otros 5 con nuevos genotipos no descritos en la bibliografía consultada (Churriago, desconocido 1, desconocido 2, Teta de Vaca Tinta Tinta y Gordera Roja). En la tabla 2 se presentan los resultados del análisis de Microsatelites, expresados en formato Genres. Tempranillo y Garnacha Tinta fueron usadas como referencias para poder comparar los datos obtenidos con los de otras librerías de microsatélites existentes. Tabla 2. Perfil SSR de las 12 variedades estudiadas. Longitud de los alelos expresada en formato Genres.
Los antocianos se pueden clasificar en dos grupos según la ruta metabólica de la que provengan. En el primer grupo se incluyen los glycosilated en posición 3 de cianidina y peonidina y sus derivados acilados, estos compuestos proceden de la dihidroquercetina; el segundo grupo está formado por las formas glicosiladas de delfinidina, petunidina y malvidina y sus derivados acilados, estos compuestos provienen de la dihidromiricetina. En la tabla 3 se muestra la distribución de los antocianos y sus derivados en las distintas variedades de uva estudiadas en función de la ruta metabólica de la que proceden. En esta tabla también se puede observar el valor medio y la desviación estándar del tanto por ciento molar de cada compuesto sobre el total para los cinco antocianos no acilados y sus correspondientes acetatos y cumaratos.
Variety VVS2 VVMD5 VVMD7 VVMD27 ZAG62 ZAG79
Ariño CH2 SI1 CF1 CH1 CF1 MU2 MU1 MU2 CH1 CF2 4MA1 4MA2
Brujidera CH2 SU1 MU1 TR1 CF1 TR1 FE1 MU2 CH1 VE1 CF1 4MA1
Churriago SU1 SU1 MU1 MU2 TR1 MU2 FE1 MU2 VE1 CF1 4MA1 4MA1
Gordera Negra BA2 CH2 CH1 CH2 TR1 TR1 MU2 MU2 CH1 CH1 4MA1 4MA1
Moravia Agria SU1 SI1 MU1 MU2 CF1 SU2 MU1 MU1 CH1 CF1 TR2 TR2
Rojal CH1 SU1 MU1 CH1 CF1 TR1 PI1 MU2 CH1 CH1 CF1 4MA1
Teta de Vaca Tinta CH1 SU1 CH2 CF2 TR1 TR1 CF1 FE1 CH1 CH1 CF1 CF1
Tinto Velasco BA1 BA1 TR1 CH2 MU1 SU2 MU1 PI1 5C1 CF2 RO1 TR2
Desconocida 1 CF2 MAN2 MU1 MU2 CF1 CF1 CF1 PI1 MU1 CH1 CF1 TR2
Desconocida 2 BA2 BA2 TR1 CH2 CF1 MU2 CS2 CS2 CF1 SCH2 CF1 4MA1
Garnacha Tinta CH1 SU1 CF1 CF2 CF1 TR1 MU2 MU2 CH1 CH1 4MA1 4MA1
Tempranillo CH2 SU1 MU2 MU2 CF1 SU2 FE1 FE1 CH2 5C1 CF1 TR2
Los distintos superíndices indican las diferencias estadísticamente significativas entre variedades según el test de Student-Newman-Keuls. Los datos muestran que las variedades de uva pueden agruparse en tres grupos bien diferenciados en función del perfil antociánico. En uno de los grupos se incluyen las variedades en las que los antocianos predominantes ( > 76 %) son los procedentes de la ruta de los Antocianos sustituidos en la posiciones 3’ y 5’, este es el perfil más habitual entre las variedades de vid cultivadas a nivel mundial, y en el se incluyen las variedades Tempranillo y Garnacha Tinta junto con 7 de las variedades minoritarias estudiadas (Churriago, Desconocido 1, Desconocido 2, Ariño, Brujidera, Moravia Agria y Tinto Velasco). En el siguiente grupo, en el que se incluyen las variedades Teta de Vaca Tinta y Gordera Roja, predominan los antocianos 3’-sustituidos (procedentes de la dihidroquercetina) que suponen un porcentaje � 61, quedando reducidos los compuestos procedentes de la ruta de la dihidromiricetina a un valor inferior al 40 %. Finalmente un tercer grupo lo constituye la variedad Rojal en la que los compuestos procedentes de la ruta de la dihidroquercetina suponen un porcentaje mayor del 75 %, quedando reducidos los originados por la otra ruta a poco más del 20 %. Respecto a los porcentajes que representan cada uno de los cinco monoglucósidos de los antocianos dentro de la fracción antociánica puede observarse como dentro del grupo de variedades en las que predomina la ruta de la flavonoide 3’,5’-hidroxilasa hay dos subgrupos. Por una parte las variedades Tempranillo, Garnacha Tinta, Churriago, Desconocido 1, Desconocido 2, Ariño, Brujidera, y Moravia agria en las que el antociano mayoritario es el 3-G-malvidina, antociano terminal de esta ruta metabólica, mientras que en la variedad Tinto Velasco el antociano predominante es el 3-G-delfinidina, antociano inicial de esta ruta. Este hecho junto con el que en la variedad Tinto Velasco predomine el 3-G-cianidina frente al 3-G-peonidina indicaría una baja actividad de la enzima FMT. Entre las variedades en las que predominan los antocianos de la ruta de la flavonoide 3’-hidroxilasa el antociano mayoritario siempre es el 3-G-peonidina, compuesto terminal de esta ruta metabólica. En la figura 5 pueden observarse los cromatogramas típicos de variedades de uva representativas de los distintos perfiles antociánicos. Como se puede ver en esta figura la mayor parte de las diferencias estadísticamente significativas encontradas para el perfil antociánico de las distintas variedades son suficientemente elevadas como para que se puedan observar cualitativamente en los cromatogramas recogidos a 520 nm. Con los datos de los porcentajes molares de los 3-O-glucósidos no acilados de los cinco antocianos se realizó un Análisis de Componentes Principales obteniéndose dos componentes principales que explicaron el 43.9 y el 39.6% de la varianza respectivamente. En la figura 6 se muestra la proyección de las muestras analizadas en el espacio definido por los dos componentes principales citados, observándose que las muestras se ordenan dando lugar a cuatro grupos en función de su composición cualitativa y cuantitativa en antocianos.
Tabla 3. Distribución de los antocianos y sus derivados en las distintas variedades de uva estudiadas (% molar).
TEM CHU UN1 UN2 GAR ARI BRU MOA TVE TVT GOR ROJ
Compuesto media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de media ± de
3’,5’-Antocianos 88.1c,d±2.7 90.4d±4.1 90.9d±5.9 91.9d±0.1 78.1c,d±2.7 76.0c±2.6 78.7c,d±7.0 85.0c,d±4.5 92.3d±3.7 38.9b ±1.5 36.6b±1.6 20.5a±5.3
3’-Antocianos 11.9a,b±2.7 9.6a±4.1 9.1a±5.9 8.1a±0.1 21.9a,b±2.7 24.0b±2.6 21.3a,b±7.0 15.0a,b±4.5 7.7a±3.7 61.2c±1.5 63.3c±1.6 79.5d±5.3
3-G-Delfinidina (1) 16.6e±0.6 10.2d±1.8 6.4a,b,c,d±1 5.8a,b,c,d±2 5.5a,b,c,d±1.4 9.6c,d±2.1 8.8b,c,d±2.1 4.0a,b±1.7 29.8f±2.2 7.1a,b,c,d±1.8 4.6a,b,c±0.9 2.6a±0.9
3-G-Cianidina (2) 2.9a±0.5 1.4a±0.5 1.1a±0.6 0.9a±0.2 2.8a±0.3 4.5a±2.0 2.8a±0.9 0.9a±0.5 3.2a±1.9 14.9c±2.3 9.5b±2.3 29.5d±2.9
3-G-Petunidina (3) 12.8d±0.8 9.6c±1.2 8.0b,c±0.8 6.9b,c±2.6 6.2b,c±1.0 8.1b,c±1.2 9.2c±1.6 4.6a,b±1.6 12.3d±0.6 5.6a,b,c±1.2 4.4a,b±0.6 2.6a±0.8
3-G-Peonidina (4) 6.2a±1.3 4.8a±2.1 3.7a±2.1 5.1a±0.1 16.6b±3.3 15.7b±2.2 14.9b±5.2 9.6a,b±3.6 2.1a±1.2 40.7c.d±2.8 45.9d±4.4 37.1c±3.7
3-G-Malvidina (5) 39.4c±2.3 45.1c,d±1.5 39.6c±4.9 56.6e±3.6 57.9e±2.8 41.3c,d±0.8 46.2c,d±4.5 49.9d±4.6 19.3b±2.4 21.7b±0.3 22.8b±0.3 6.2a±2.3
Acetato-3-G-Delfinidina (6) 0.6a,b±0.0 0.3a,b±0.0 0.8b±0.2 0.2a,b±0.1 0.2a,b±0.1 0.7a,b±0.2 0.2a,b±0.1 0.1a±0.4 2.1c±0.6 0.2a,b±0.0 0.1a±0.1 0.6a,b±0.4
Acetato-3-G-Cianidina (7) 0.3a±0.1 0.2a±0.0 0.3a±0.0 0.2a±0.0 0.2a±0.1 0.3a±0.1 0.2a±0.0 0.1a±0.0 0.3a±0.0 0.4a±0.0 0.2a±0.1 2.7b±1.5
Acetato-3-G-Petunidina (8) 0.7b,c±0.1 0.5b±0.0 1.5d±0.3 0.3a,b±0.1 0.2a,b±0.1 0.9c±0.1 0.3a,b±0.1 0.2a,b±0.1 1.2d±0.4 0.2a,b±0.0 0.0a±0.0 0.5b±0.1
Acetato-3-G-Peonidina (9) 0.3a±0.1 0.3a±0.1 0.9a±0.5 0.2a±0.0 0.5a±0.1 1.1a±0.1 0.3a±0.1 0.4a±0.1 0.1a±0.1 1.0a±0.0 0.5a±0.1 2.8b±1.3
Acetato-3-G-Malvidina (10) 2.4b,c±0.2 3.1c±0.6 9.4e±1.9 2.6b,c±0.1 1.9a,b,c±0.4 5.8d±0.5 1.4a,b,c±0.4 3.0c±1.2 1.5a,b,c±0.4 0.8a,b±0.1 0.4a±0.0 0.7a,b±0.0
p-cumarato-3-G-Delfinidina (11) 2.3a±0.4 2.3a±0.1 1.9a±0.6 0.9a±0.2 0.4a±0.2 0.7a±0.5 1.1a±0.5 1.0a±0.2 13.1b±3.6 0.5a±0.2 0.5a±0.1 1.8a±1.2
p-cumarato-3-G-Cianidina (12) 0.6a±0.3 1.1a±1.4 0.6a±0.4 0.2a±0.1 0.3a±0.1 0.3a±0.2 0.5a±0.2 0.5a±0.4 1.4a±0.4 0.9a±0.2 1.2a±0.3 4.9b±0.1
p-cumarato-3-G-Petunidina (13) 2.3a,b±0.1 1.9a,b±1.3 2.9b±0.3 1.4a,b±0.2 0.5a±0.0 1.0a,b±0.4 1.4a,b±0.4 1.6a,b±0.3 5.2c±1.4 0.4a±0.2 0.5a±01 1.1a,b±1.0
p-cumarato-3-G-Peonidina (14) 1.5a±0.6 1.8a±0.5 2.4a±2.1 1.6a±0.4 1.5a±0.6 2.0a±1.6 2.6a±0.1 3.3a±0.8 0.6a±0.2 3.3a±0.9 6.1b±0.1 2.5a±3.3
p-cumarato-3-G-Malvidina (15) 11.0a,b,c±0.9 17.4b,c±3.9 20.5c±2.3 17.4b,c±8.4 5.4a±2.3 7.9a,b±4.9 10.2a,b,c±3.7 20.6c±7.0 7.6a,b±1.6 2.2a±1.3 3.3a±0.1 4.4a±4.1
Σ Antocianos no acilados 78.0b,c±2.0 71.1a,b±4.5 58.7a±0.3 75.2b,c±9.1 89.0c±3.4 79.2b,c±6.6 81.9b,c±4.1 69.0a,b±8.5 66.8a,b±6.8 90.1c±2.8 87.2c±0.1 78.0b,c±4.7
Σ Antocianos acetilados 4.3a,b±0.2 4.4b±0.5 12.9d±0.8 3.4a,b±0.1 3.0a,b±0.6 8.9c±1.0 2.3a,b±0.5 4.0a,b±1.4 5.3b±1.2 2.6a,b±0.1 1.2a±0.3 7.3c±3.3
Σ Antocianos p-cumarilados 17.7a,b,c±2.2 24.5b,c±4.1 28.4c±1.2 21.4a,b,c±9.2 8.0a±2.9 11.9a,b±7.7 15.8a,b,c±3.8 27.0c±7.1 27.9c±5.5 7.3a±2.7 11.6a,b±0.6 14.7a,b,c±1.4
Acetatos/p-cumaratos 0.24a±0.04 0.18a±0.02 0.46a±0.05 0.18a±0.08 0.40a±0.06 0.98b±0.71 0.15a±0.03 0.14a±0.02 0.19a±0.01 0.39a±0.13 0.11a±0.02 0.49a±0.18
Distintos superíndices indicant diferemcias estadisticamente siginificativas entre variedades de acuerdo a la prueba de Student-Newman-Keuls (α = 0.05).�ARI, Ariño. BRU, Brujidera. CHU, Churriago. GOR, Gordera Roja. MOA, Moravia Agria. ROJ, Rojal. TVT, Teta de Vaca Tinta. TVE, Tinto Velasco. UN1, Desconocido 1. UN2, Desconocido 2. GAR, Garnacha Tinta. TEM, Tempranillo.
En un primer conjunto de variedades se agrupan todas las tienen un perfil antociánico similar al que presentan la mayor parte de las variedades cuyo cultivo y empleo para vinificación está extendido a nivel mundial. El antociano mayoritario es el 3-O-glucósido de malvidina y por ello también lo son sus derivados acetilado y cumarilado en cada uno de sus respectivos grupos de antocianos acilados. Dentro de este grupo no obstante existen diferencias. Tempranillo, Churriago, Desconocido 1, y Desconocido 2 contienen mayores proporciones de delfinidina y petunidina mientras que Garnacha Tinta, Ariño y Brujidera presentan porcentajes más elevados de peonidina que las antes mencionadas. Las proporciones de antocianos acetilados son en general bastante bajas, aunque destacan las variedades Desconocido 1 y Ariño con un 9.4 y 5.8% de acetato de malvidina sobre todas las demás. Los porcentajes de antocianos cumarilados son superiores a los de los antocianos acetilados, observándose que aunque la forma cumarilada del 3-G-malvidina es la más abundante existen algunas diferencias. Así, en las variedades Churriago, Desconocido 1, Desconocido 2 y Moravia Agria el cumarato-3-G-Malvidina representa más del 17 % del contenido total en antocianos mientras que en el resto esta proporción es inferior al 11 %. Un segundo grupo lo forman las muestras de la variedad Rojal en las que el antociano mayoritario es la peonidina, seguido de la cianidina. Estas diferencias de porcentaje se mantienen así mismo en los antocianos acetilados y cumarilados. El grupo formado por las variedades Gordera Roja y Teta de Vaca Tinta por su parte destaca porque más del 40% de los antocianos analizados corresponde al 3-O-G de peonidina seguido en proporción por los 3-G-malvidina y 3-G-cianidina. Este perfil antociánico es similar al descrito para las variedades Muscat Hamburg (Jeong et al., 2006), Moscato Rosa (Mattivi et al., 2006), Garnacha Tintorera (también llamada Alicante-Bouschet), y Brancellao (Revilla et al., 2006). El 3-G-peonidina y el 3-G-malvidina se corresponden con los extremos de la cadena de metoxilación del 3-G-cianidina y 3-G-delfinidina respectivamente por lo que podría pensarse en una actividad elevada de las enzimas metiltransferasas en estas variedades. Sólo se ha encontrado una diferencia estadísticamente significativa entre ambas, el cumarato de 3-G-peonidina representa el 3,3% en Teta de Vaca Tinta y casi el doble, el 6,1% en Gordera Roja. Por último un grupo sólo constituido por la variedad Tinto Velasco queda muy separado del resto de muestras. Esta variedad se caracteriza por una elevada proporción de antocianos 3’5’-hidroxilados frente a los 3’-hidroxilados lo que la diferencia de las variedades Rojal, Gordera Roja y Teta de Vaca Tinta. Sin embargo, esta variedad también difiere del resto de variedades en las que predominan los antocianos 3’5’-hidroxilados, ya que en ella predominan el 3-G-delfinidina y sus derivados frente al resto de antocianos 3’5’-hidroxilados debido a una menor actividad de la enzima FMT. En todos los casos la relación acetatos/cumaratos es inferior a la unidad, característica de la mayoría de variedades españolas. No obstante en la variedad Ariño esta relación sube a 0.98 con diferencias estadísticamente significativas sobre las demás.
Figura 5. Perfiles antociánicos característicos de los cultivares de uva tinta (Vitis vinifera L.) estudiados.
La numeración de los picos corresponde con la indicada en la tabla 3.
20 25 30 35 40 45 50 55
Minutes
0
100
200
300
400
mAU
0
10
20
30
40
50
60
mAU
0
100
200
300
mAU
0
100
200
300
400
mAU
Tinto Velasco
Rojal
Gordera Roja
Tempranillo
1
2
3
4
5
6 7 8
15
14 9 10
11
12 13
1
2
3
4
5
6 7 8 15
14
9 10 11
12
13
4
1
2
3
4
5
6 7 8
15
14 9 10
11 12
13
1
2
3
5
6 7 8 15
14
9
10
11 12
13
Figura 6. Proyección de las muestras analizadas en el plano definido por los dos
primeros componentes principales. Estos resultados ponen de manifiesto que la labor de recuperación de variedades minoritarias o en peligro de extinción es muy importante desde el punto de vista ecológico, pero que también es de suma importancia desde un punto de vista enológico, en un mercado tan competitivo como el actual, ya que estas variedades darán lugar a vinos con distintos perfiles antociánicos. Por lo tanto, es necesario que en los próximos años, cuando se disponga del material vegetal suficiente, se realicen investigaciones sobre como se manifiestan estas diferencias de composición antociánica tanto en el color de vino (tonalidades y matices) como en la evolución y estabilidad del mismo. 3. Características cromáticas y composición fenólica de uvas y vinos tintos de la variedad Cencibel Se han analizado muestras de uvas Cencibel maduras, tomadas a su llegada a bodega y producidas en diversas comarcas manchegas. Así mismo, se analizaron los vinos tintos jóvenes producidos por estas bodegas en 2004-2005, junto con otros vinos jóvenes comerciales de la variedad Cencibel, elaborados durante la misma vendimia en zonas próximas. Por último, también se analizaron vinos tintos Cencibel de diferentes
-1 0 1 2
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
PC
2
PC 1
� Ariño
� Brujidera
� Rojal
� Churriago
� Unknown 1
� Tinto Velasco
� Garnacha Tinta
� Tempranillo
� Gordera Roja
� Teta Vaca Tinta
� Unknown 2
� Moravia Agria
vendimias para evaluar los cambios en las características cromáticas y composición fenólica durante el envejecimiento. Se han podido establecer los perfiles característicos de antocianos monómeros (los pigmentos rojos) y de flavonoles (los copigmentos más eficaces) tanto para las uvas como para los vinos jóvenes Cencibel. El perfil de antocianos monomeros de las uvas y los vinos de esta variedad se caracteriza por una alta contribución de derivados cumarílicos, cuya proporción disminuye sensiblemente al pasar de la uva al vino, por su menor solubilidad. El perfil de flavonoles de las uvas se caracteriza por un predominio del 3-glucósido de miricetina, aunque en el cómputo global predominan ligeramente los derivados de la aglicona quercetina sobre los de miricetina, suponiendo los flavonoles de ambos tipos de aglicona el 90% del total; el resto se lo reparten a partes casi iguales los derivados de kampferol y de isoramnetina. El perfil de flavonoles, en cuanto a las agliconas presentes, se transfiere casi en su integridad a los vinos jóvenes, pero la hidrólisis de los flavonoles glicósidos, con liberación de sus correspondientes agliconas, hace que el perfil de flavonoles (glicósidos y agliconas) muestre cierta variabilidad. Se ha constatado que la copigmentación es un fenómeno importante en los vinos jóvenes Cencibel, que aumenta la intensidad del color rojo de éstos hasta en un 50%, y desplaza el tono del color del vino del rojo hacia el púrpura (desplazamiento batocrómico de unos 4 nm). La copigmentación contribuye al color total de los vinos jóvenes Cencibel en una proporción similar a la de los pigmentos polimerizados (un tercio en ambos casos), que ya se encuentran en cantidad importante, y condiciona fuertemente las características cromáticas de los vinos jóvenes Cencibel, que suelen mostrar una intensa coloración roja (efecto hipercrómico) con marcados tonos púrpuras (efecto batocrómico). En la copigmentación mostrada por los vinos Cencibel juegan un papel importante la elevada proporción de derivados cumarílicos de los antocianos, que pueden estar implicados tanto en complejos de copigmentación intra- como intermoleculares. También puede afirmarse que la copigmentación actúa como fuerza motriz en la extracción de antocianos durante la vinificación: mientras que las concentraciones de antocianos y de flavonoles no mostraron ninguna correlación en las uvas analizadas, sí se encontró esta correlación en los vinos elaborados a partir de estas uvas y también en los otros vinos jóvenes comerciales analizados. El alto grado de copigmentación inicialmente observado en los vinos tintos jóvenes de la variedad Cencibel, fue decreciendo hasta desaparecer después de 5 años de envejecimiento. Paralelamente, el contenido en antocianos monómeros disminuyó mientras que el porcentaje de pigmentos poliméricos aumentó, por lo que tras pocos años no fue posible detectar el característico perfil de antocianos monómeros de los vinos Cencibel. En cambio, el contenido en flavonoles y el perfil de flavonoles por tipo de aglicona, sí se mantuvieron prácticamente invariables durante este periodo. Estos resultados sugieren que el perfil de flavonoles por tipo de aglicona puede usarse como criterio de autenticidad varietal para los vinos Cencibel durante un periodo extenso de tiempo, superior a los 2-3 años en que se puede utilizar el perfil de antocianos monómeros.
4. Ensayos de cofermentación de variedades de uva tinta como método para aumentar la transferencia de color durante la vinificación de vinos tintos Se fermentaron conjuntamente (cofermentación) uvas tintas con un potencial deficitario de copigmentos de tipo flavonol con una pequeña proporción de otras uvas con un potencial alto de copigmentos. El propósito de estas cofermentaciones es el de aumentar la transferencia de antocianos de la uva al vino por formación de complejos de copigmentación. Así las uvas pobres en copigmentos se beneficiarían del exceso de las uvas ricas, de las que no se extraería este exceso en caso de vinificarlas por separado. La mayor dificultad a priori para realizar este tipo de ensayos es la coincidencia temporal de uvas deficitarias y excedentarias en copigmentos. En este primer ensayo, se cofermentaron uvas de las variedades Cencibel (deficitaria) con Syrah (excedentaria), y de las variedades Bobal (deficitaria) con Cabernet Sauvignon (excedentaria), en las siguientes proporciones: 90% Cencibel - 10% Syrah 80% Cencibel - 20% Syrah 90% Bobal - 10% Cabernet Sauvignon 80% Bobal - 20% Cabernet Sauvignon Las fermentaciones y cofermentaciones se llevaron a cabo mezclando las partes proporcionales de mosto y hollejo de cada una de las variedades, con un estricto control de temperatura a 22ºC mediante siembra de levadura VN seleccionada por el IVICAM y comercializada por Lallemand. Se añadió SO2 (100 ppm) en forma de metabisulfito sódico y se tomaron muestras sucesivas del mosto en fermentación para realizar su seguimiento mediante el análisis de glucosa y fructosa. Las fermentaciones se realizan con maceración hasta agotamiento de azúcares. Terminada la fermentación alcohólica los vinos se separaron por escurrido. Tras trasegar, se siembra un cultivo de bacterias lácticas comerciales (Lactobacter SP1; Laffort) a fin de que se produjera la fermentación maloláctica. La fermentación maloláctica se monitorizó por análisis enzimático, y una vez finalizada se tomó una muestra de vino para su análisis. A continuación, y para no desvirtuar la composición fenólica de los vinos, éstos se filtraron a través de lana de vidrio y directamente se embotellaron para su envejecimiento, sin aplicar ningún tratamiento de clarificación o de estabilización. En los ensayos de cofermentación las variedades utilizadas se vinificaron también por separado para evidenciar los efectos de esta práctica. De las variedades cofermentadas aquella que muestra mayor potencial fenólico en la uva se considera la variedad mejorante (Syrah y Cabernet Sauvignon) y es añadida a la de menor potencial fenólico (Cencibel y Bobal) en distintas proporciones. Terminada la fermentación maloláctica de las variedades por separado se prepararán mezclas de vinos con las mismas proporciones utilizadas en la cofermentación, que posteriormente seguirán el mismo protocolo de almacenamiento y análisis. De esta forma, se dispone de vinos 4 monovarietales, 4 vinos cofermentados y 4 mezclas de vinos monovarietales. Todas las elaboraciones u mezclas se realizaron por duplicado.
Si bien los vinos cofermentados mejoraron sus características cromáticas y aumentaron su contenido en antocianos y en flavonoles respecto de sus homólogos varietales deficitarios en copigmentos, el resultado sólo fue ligeramente mejor que el conseguido cuando los vinos se mezclaron después de la fermentación maloláctica, al menos en las proporciones ensayadas y durante el tiempo de envejecimiento considerado, que en este caso será de 30 meses. Estos resultados preliminares deben complementarse con los obtenidos en ensayos en los que se prueben otras proporciones y otras combinaciones de variedades diferentes a las ensayadas. 5. Ensayos de cofermentación de uvas tintas con hollejos frescos de uva blanca En los años 2006 y 2007 se han continuado los análisis de los ensayos de cofermentación entre variedades tintas iniciados el año 2005, y se han ensayado nuevas cofermentaciones, esta vez entre uvas tintas y hollejos de variedades de uva blancas. En este nuevo ensayo de cofermentación se han abordado dos aspectos:
1. Efecto de la cofermenación con hollejos fresco de uva blanca en las características fenólicas y cromáticas de los vinos obtenidos y su evolución en el tiempo.
2. Estudio de la cinética de extracción de los compuestos fenólicos y el color en
vinos cofermentados durante la maceración y su evolución durante la fermentación maloláctica y las etapas de estabilización por frío.
A continuación se presentan algunos de los resultados obtenidos en el primero de los aspectos estudiados. Los posibles efectos de la cofermentación sobre la concentración de antocianos y el color del vino tinto ha atraído la atención de los enólogos en los últimos años. Se ha sugerido que cualquier acción que fomente el fenómeno de la copigmentación durante la maceración de los hollejos, que tiene lugar simultáneamente con la fermentación alcohólica, representa una vía potencial para incrementar la transferencia de antocianos de la uva al vino. No obstante, los resultados de los pocos estudios realizados hasta ahora, incluyendo nuestros ensayos de cofermentación de uvas tintas de distintas variedades del año 2005, parecen ser contradictorios dejando entrever que se necesitan abordar estudios más profundos. Los ensayos que se han llevado a cabo este año se diferencian de los del año pasado en que la fuente extra de copigmentos de tipo flavonol no son ahora uvas tintas excedentarias en ellos, sino hollejos frescos de uvas blancas que están además exentas de antocianos. Se llevaron a cabo cofermentaciones a escala de laboratorio con dos variedades de uva tinta, Cencibel y Garnacha, a las que se añadieron hollejos frescos de uvas blancas de las variedades Chardonnay, Airén y Macabeo, en tres proporciones diferentes (5, 10 y 20%). Los vinos se analizaron tras la fermentación alcohólica, tras la fermentación maloláctica, y tras un corto periodo de estabilización por frío (4 ºC). Se determinaron los contenidos en antocianos, flavonoles y ácidos hidroxicinámicos por HPLC y por técnicas analíticas clásicas. Otros parámetros directamente relacionados con la
composición fenólica y el color, como el grado de copigmentación, la actividad antioxidante y los parámetros cromáticos del espacio de color CIELAB, se determinaron espectrofotométricamente. En la figura 7 se representa el efecto de la cofermentación en el color de los vinos. Los vinos Tempranillo elaborados por coferementación poseen mayores valores de luminosidad (L*), croma (C*), y angulo (h*) que el vino control, aunque estas diferencias fueron estadísticamente significativas en la pareja Tempranillo-Macabeo. Por lo tanto, los vino obtenidos mediante cofermentación mostraró una menor intesidad colorante con un color rojo más puro y un mayor matiz amarillo. Este puede explicarse considerando que la copigmentación da lugar a un efecto batocrómico, mientras que la polimerización de los antocianos con los flavan-3-oles generalmente da lugar a un efecto hipsocrómico, lo que concuerda con los resultados obtenidos: a medida que aumenta el porcentaje de orujo de uva blanca añadido disminuye la cantidad de color debida a la copigmentación y aumenta el contenido en antocianos polímeros.
Figura 7. Representación del color de los vinos Garnacha y Tempranillo en el espacio CIELAB. En los vinos Garnacha cofermentados, al igual que ocurre en los de Tempranillo, se observan mayores valores de L* y por lo tanto menor intensidad colorante. Sin embargo, el valor de C* disminuye, lo que significa que estos vinos muestran un mayor componente azul. Este último hecho puede explicarse por un incremento en la copigmentación, que en algunos de los vino se multiplica por 4 frente al vino control, y una disminución en los antocianos polímeros. Respecto al efecto de la variedad de uva blanca de la que proceden los orujos, en los vinos Garnacha se ha observado que la adición de orujos Airén produce una pequeña disminución en el valor de h*, mientras
L*
25
35
30
50 45 40
b*
20
30
40
50
Te
Te Ch10
Te Ch20
Te Ma20
Te Ma10
Ga
Ga Air10
Ga Air 20
Ga Ma10
Ga Ma20
a*
que los orujos Macabeo, al igual que se ha observado en los vinos Tempranillo, producen un incremento en parámetro h* de los vinos Garnacha. La concentración en antocianos (Tabla 4) de los vinos Tempranillo disminuye gradualmente a medida que aumenta el porcentaje de hollejo blanco cofermentado; este resultado probablemente se deba a la adsorción de los antocianos por los orujos. Sin enbargo en los vinos Garnacha la concentración de antocianos permanecio constante e incluso aumento ligeramente. Tabla 4. Efecto de la adición de cofermentos en el color de los vinos Garnacha y Cencibel. Orujo Te-Ch Te-Ma Ga-Air Ga-Ma blanco (%) Media DE Media DE Media DE Media DE Antocianos no 0 206.7 2.2 206.7 2.2 36.7 1.3 36.7 1.3 aciladios 10 173.5 7.1 178.5 2.1 34.0 0.2 34.7 2.5 (mg/L) 20 156.4 3.5 147.8 3.7 36.5 1.4 37.7 0.1 Antocianos 0 21.0 0.1 21.0 0.1 1.9 0.2 1.9 0.2 Acetilados 10 18.2 0.9 17.7 0.2 1.7 0.1 1.9 0.2 (mg/L) 20 16.4 0.1 14.8 0.4 1.9 0.1 2.1 0.0 Antocianos 0 42.8 0.0 42.8 0.0 2.5 0.1 2.5 0.1 cumarilados 10 36.2 2.3 34.9 1.3 2.3 0.0 2.4 0.3 (mg/L) 20 32.2 0.4 28.0 0.6 2.8 0.1 2.8 0.0 Ácidos 0 46.0 0.2 46.0 0.2 44.0 2.2 44.0 2.2 Hidroxicinámicos 10 50.1 1.1 45.4 0.6 49.6 0.8 40.0 2.1 (mg/L) 20 51.8 2.6 42.4 1.0 60.5 2.7 46.4 0.5 Flavan-3-oles 0 388.0 18.7 388.0 18.7 197.6ª 7.4 197.6 7.4 Totales 10 435.8 78.9 410.0 28.3 220.6b 1.4 195.6 9.6 (mg/L) 20 405.4 55.7 447.6 69.0 264.8c 4.5 220.2 0.3 Los vinos Tempranillo cofermentados mostrarón una disminución gradual de los contenidos en derivados de miricetina e isorhamnetina (Figura 8), mientras que en los vinos Garnacha aumento la concentración de derivados de miricetina y se mantuvo o ligeramente disminuyo la de los de isorhamnetina. Sin embargo, las concentraciones de quercetina y kaempferol, generalemente los principales flavonoles de las uvas blancas, se incrementaron en todos los vinos cofermentados (Figura 8).
Figura 8. Contenido del vino en Flavonoles: (a) Tempranillo, (b) Garnacha. En el caso de los ácidos hidroxicinámicos los resultados parecen estar más influidos por la variedad de uva de la que proceden los orujos blancos que por la uva tinta (Tabla 4). Las cofermentaciones Tempranillo-Chardonnay y Garnacha-Airén mantuvieron e
0
1
2
3
4
20
25
30
35
40Garnacha
Isorhamnetin+ Glycosides
Kaempferol+ Glycosides
Quercetin+ Glycosides
Myricetin+ Glycosides
Ga Ga-Ma 10 % Ga-Ma 20 % Ga-Air 10 % Ga-Air 20 %
Win
e C
onte
nt (m
g/L)
Flavonols
0.0
2.5
5.0
30
35
40
45
Isorhamnetin+ Glycosides
Kaempferol+ Glycosides
Quercetin+ Glycosides
Win
e C
onte
nt (m
g/l)
Flavonols
Te Te-Ch 10 % Te-Ch 20 % Te-Ma 10 % Te-Ma 20 %
Myricetin+ Glycosides
Tempranillo
incrementaron considerablemente su contenido en ácidos hidroxiciámicos respectivamente. Por el contrariolas cofermentaciones de ambas variedades tintas con Macabeo mantuvieron o disminuyeron su concentración en estos compuestos. Un efecto común a todos los ensayo de cofermentación, pero especialmente importante en el caso Garnacha-Airén, fue el incremento en la concentración de flavan-3-oles. Este incremento se explica por el aporte de estas sustancias que incluyen las pepitas que acompañan a los hollejos blancos. Los resultados sugieren una clara dependencia varietal que determina el curso y la magnitud de los efectos de la cofermentación en la composición fenólica del vino y su color. Por lo tanto, se hace necesaria una evaluación cualitativa y cuantitativa previa de los compuestos fenólicos de las variedades de uva a cofermentar, tanto tinta como blanca. Además, este estudio necesita ser complementado con la evaluación de las consecuencias de la cofermentación a medio y largo plazo, incluyendo la estabilidad del color, para ello se está realizando el estudio de la evolución de todos estos parámetros durante la conservación del vino. 6. Diferencias de composición fenólica y de color entre vinos tintos Garnacha elaborados tradicionalmente y en depósitos “Ganimede” La variedad de uva Garnacha, cuando se cultiva en clima cálido como el manchego, se caracteriza por un escaso contenido fenólico, que se traduce en los vinos de esta variedad de forma especial en un color rojo poco intenso. Se ha considerado importante estudiar el efecto que algunas prácticas enológicas pueden introducir en el grado de extracción de compuestos fenólicos desde la uva al vino, sobre todo cuando se elaboran vinos a partir de uvas de variedades con un escaso potencial fenólico, como es el caso de la variedad Garnacha. Una de las tecnologías de vinificación más novedosas consiste en el empleo de fermentadores tipo “Ganimede”, que utilizan el CO2 generado por la propia fermentación alcohólica para mantener de forma continuada la maceración de los hollejos, sin necesidad de recurrir a bazuqueos o remontados periódicos. Los fermentadores tipo “Ganimede” están separados en dos secciones mediante un gran embudo interior. Este embudo va almacenando el CO2 en la sección inferior del depósito, limitado por el embudo y la pared del depósito, hasta que este espacio se llena de gas; entonces éste escapa en grandes burbujas por la parte abierta del embudo, en dirección hacia la sección superior del depósito, generando un removido de los hollejos que impide que se forme el llamado “sombrero” de orujos secos y elevados sobre el mosto en fermentación. El efecto es parecido a una especie de suave “délestage”. La elaboración de esta uva Garnacha en depósitos tipo “Ganimede” permite una mejora en el color y un aumento del contenido en polifenoles. Los vinos elaborados en depósitos “Ganimede” mostraron un 30% más de polifenoles totales en comparación con vinos elaborados con uva similar pero de forma tradicional. Este aumento no afectó a los compuestos fenólicos mayoritarios, los taninos, pero sí a los compuestos fenólicos directamente relacionados con el color rojo del vino tinto (antocianos), así como a otros relacionados indirectamente con el color a través del fenómeno de copigmentación (flavonoles y derivados hidroxicinámicos). Las diferencias encontradas fueron tanto de naturaleza cuantitativa como cualitativa, afectando a los perfiles molares de estos tipos
de compuestos fenólicos. A causa de las diferencias encontradas en la composición fenólica, el color de los vinos “Ganimede” también se vio afectado de forma favorable. 7. Evolución del contenido en compuestos fenólicos y extension de la copigmentación durante la vinificación tradicional en tinto. Se han realizado fermentaciones a escala de laboratorio por triplicado con dos variedades tintas, Cencibel y Cabernet Sauvignon, empleando 10 kg de uvas despalilladas en cada una. Los vinos se han analizado diariamente durante la fermentación alcohólica y después de las diferentes etapas del proceso: prensado, desfangado, fermentación maloláctica, estabilización a 4ºC durante seis días y estabilización a -4ºC durante otros seis días. Las muestras tomadas se han estabilizado por adición de azida sódica y se han analizado inmediatamente. Los antocianos, flavan-3-oles, flavonoles y ácidos hidroxicinámicos se han determinado mediante HPLC-DAD. Otros parámetros como el grado de polimerización, grado de copigmentación y el Color Total del Vino (TWC) se han determinado espectrofotométricamente. Resultados y Discusión. La evolución de la concentración de antocianos durante la fermentación ha sido ya estudiada. La extracción de antocianos del hollejo de la uva es muy rápida. El máximo contenido de antocianos se alcanza antes del fin de la maceración, al tercer y cuarto día en las variedades Cencibel y Cabernet Sauvignon respectivamente. Después de este momento su contenido decrece especialmente después de la fermentación maloláctica y de la estabilización a 4ºC. Este descenso puede ser debido a la coprecipitación de los antocianos con las paredes celulares de levaduras y bacterias con más probabilidad que a la formación de antocianos polimerizados, dado que el TWC decrece de una forma similar. De hecho la evolución del TWC en el tiempo es muy similar a la evolución de la concentración de antocianos, y se ha obtenido un coeficiente de correlación altamente significativo entre ambos parámetros (r2 > 0.949). El contenido de antocianos en el vino final es ligeramente más alto que el del vino después de un día de maceración en ambas variedades.
Figura 9. Evolución de los compuestos fenólicos y del Total Wine Colour.
a) Cencibel; b) Cabernet Sauvignon Por otra parte, el contenido en flavan-3-oles, calculada como la suma de catequiza, epicatequina y procianidinas B1 y B2, aumenta continuamente hasta el fin de la maceración en ambas variedades. Sin embargo el incremento de flavan-3-oles en el vino Cencibel es muy pequeño
D1 AF D2 AF D3 AF D4 AF Press EAF/Settle MLF Stb 4 ºC Stb -4 ºC
8
10
12
14
Anthocyanins Flavonols Flavan-3-ols0
100
200
300
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
[µM
]
D1 AF D2 AF D3 AF D4 AF Press EAF/Settle FML Stb 4 ºC Stb -4 ºC
Total Wine Colour
Total Wine C
olour
D1 AF D2 AF D3 AF D4 AF D5 AF Press EAF/Settle MLF Stb 4 ºC Stb -4 ºC
0
2
4
6
8
10
Anthocyanins Flavonols Flavan-3-ols0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
[µM
]
D1 AF D2 AF D3 AF D4 AF D5 AF Press EAF/Settle MLF Stb 4 ºC Stb -4 ºC
Total Wine Colour
Total Wine C
olour
debido al bajo contenido de estos compuestos en las uvas Cencibel, especialmente en sus semillas (datos no mostrados). Además los vinos Cencibel sufren una mayor pérdida porcentual de flavan-3-oles durante la fase de estabilización. Este menor contenido en flavan-3-oles tiene como consecuencia un menor porcentaje de TWC debido a la polimerización en los vinos Cencibel que en los Cabernet Sauvignon, 23 % y 30 % en los vinos finales respectivamente, y también puede explicar la menor pérdida de color en Cabernet Sauvignon después del prensado. En lo que respecta a los flavonoles, a pesar de que su evolución es muy similar en ambas variedades, se observan ligeras diferencias en su extracción dependiendo del cultivar. En los vinos Cencibel siguen la misma pauta que la extracción de antocianos, alcanzando su máximo valor antes del fin de la maceración. Por el contrario en los vinos Cabernet Sauvignon el contenido máximo de flavonoles se ha encontrado al final del proceso de maceración. El efecto de la fermentación maloláctica y de las dos fases de estabilización en la pérdida de flavonoles es pocentualmente menor que la de antocianos y flavan-3-oles. El contenido final de flavonoles en ambos vinos es muy similar pero algo menor en los Cencibel. No obstante los vinos Cencibel muestran un mayor porcentaje de color debido a la copigmentación, 28 % (23 % para Cabernet Sauvingnon), que podría explicarse por su mayor contenido en ácidos hidroxicinámicos, considerados unos compuestos muy efectivos sobre la copigmentación de antocianos, y también por su mayor contenido en antocianos libres que puede favorecer el fenómeno de auto-asociación o copigmentación intramolecular. El color debido a la copigmentación y a la polimerización de los antocianos muestra resultados opuestos: la copigmentación se mantiene más o menos constante durante la maceración y decrece en las operaciones posteriores, mientras que la polimerización aumenta constantemente desde el principio.