efecto de andrografÓlido sobre la viabilidad de …
TRANSCRIPT
Profesor PatrocinanteDr. Dra. Angara Zambrano A.Instituto de microbiologíaFacultad de Ciencia
Profesor Co-PatrocinanteDr. Rafael BurgosInstituto de FarmacologíaFacultad de Ciencias Veterinarias
EFECTO DE ANDROGRAFÓLIDO SOBRE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS DE TIPO NEURONAL Y CULTIVO PRIMARIO DE
NEURONAS
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional deBioquímico
RODRIGO ANDRÉS LERCHUNDI MONJE
VALDIVIA – CHILE2009
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer sinceramente a Dios por darme la oportunidad de llevar
a cabo una experiencia de vida tan enriquecedora en estos años vividos en la
Universidad, la cual me permitió conocer gente buena y sincera con la que espero
compartir durante mucho tiempo más. A mis padres, abuelos, tíos y hermanos por
apoyarme en las buenas y en las malas durante toda mi vida. A la Dra. Ángara
Zambrano por acogernos a mis compañeros y a mí en su laboratorio, por
entregarnos sus conocimientos y brindarnos su apoyo y confianza en los
momentos más difíciles que vivimos en esta etapa de tesista, animándonos a
seguir adelante pese a las adversidades. A mis amigos del laboratorio que
trabajaron junto a mí: Patricia, Camila, Verónica, Loreto, Clara, Mariana, Carlos y
Sergio, con los cuales los días de trabajo fueron mucho más placenteros. A las
personas que trabajan en el Instituto de farmacología, especialmente al Dr. Rafael
Burgos y la Dra. María Angélica Hidalgo por su ayuda y apoyo al momento de
realizar la tesis. Finalmente quisiera agradecer a mis grandes amigos Sharin,
Marco, Natalia y Nicolás quienes me entregaron su amistad incondicional durante
todos estos años de Universidad. Dios los bendiga a todos.
Esta Tesis fue financiada por los proyectos FONDEF DO4I1240 y DO3I1002,
FONDECYT 11060180. DID UACh.
ÍNDICE DE CONTENIDOS
1. RESUMEN 1
1.2 SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.1. ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS 3
2.2. MECANISMOS DE MUERTE CELULAR EN
LAS ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS 6
2.3. GATILLANTES DE LA MUERTE CELULAR
EN LA NEURODEGENERACIÓN 11
2.3.1 ESTRÉS OXIDATIVO 11
2.3.2 INFLAMACIÓN 13
2.3.3 PLEGAMIENTO INCORRECTO Y AGREGACIÓN
PROTEICA 14
2.4. DIANAS FARMACOLÓGICAS EN LAS
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS 15
2.5. ANDROGRAFOLIDO 18
2.6 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 24
3. MATERIALES Y MÉTODOS 27
3.1. MATERIALES 27
3.1.1. REACTIVOS QUÍMICOS 27
3.1.2. EQUIPOS E IMPLEMENTOS 28
3.1.3 ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 29
3.2. METODOLOGÍA 29
3.2.1. PREPARACIÓN DE ANDROGRAFÓLIDO (AP) 29
3.2.2. PREPARACIÓN DE PERÓXIDO
DE HIDRÓGENO (H2O2) 29
3.2.3. CULTIVOS CELULARES 30
3.2.4. DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR
MEDIANTE MTT 31
3.2.5. DETECCIÓN DE MUERTE CELULAR
POR FRAGMENTACIÓN DEL DNA 32
3.2.6. INMUNOFLUORESCENCIA 32
3.2.7. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES 33
3.2.8. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 33
3.2.9. ANÁLISIS DE WESTERN BLOT 34
3.2.10 TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS N2a CON FUGENE6 34
3.2.11. ENSAYO DE LUCIFERASA 35
4. RESULTADOS 36
4.1. EFECTO DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
EN LA VIABILIDAD DE CÉLULAS N2A Y NEURONAS
CORTICALES 37
4.2. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO EN LA VIABILIDAD
DE CÉLULAS DE TIPO NEURONAL SOMETIDAS A ESTRÉS
OXIDATIVO INDUCIDO POR H2O2 38
4.2.1. EFECTO DE BAJAS CONCENTRACIONES
DE ANDROGRAFÓLIDO SOBRE LA VIABILIDAD
DE CÉLULAS DE TIPO NEURONAL SOMETIDAS
A ESTRÉS OXIDATIVO 43
4.3. EFECTO DIRECTO DE ANDROGRAFOLIDO EN LA
VIABILIDAD DE CÉLULAS DE TIPO NEURONAL 45
4.4. EVALUACIÓN DEL MECANISMO DE MUERTE
CELULAR INDUCIDA POR ANDROGRAFOLIDO EN
CÉLULAS DE TIPO NEURONAL 47
4.5. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LA
VIABILIDAD DE NEURONAS Y ASTROCITOS 60
4.5.1. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE
LA VIABILIDAD DE ASTROCITOS 60
4.5.2. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LA
VIABILIDAD DE CULTIVOS MIXTOS DE NEURONAS
Y ASTROCITOS 61
4.5.3. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE
LA VIABILIDAD DE NEURONAS INCUBADAS CON
MEDIO CONDICIONADO DE ASTROCITOS 63
4.6. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE
LA ACTIVACIÓN DE NF-kB EN CÉLULAS DE
NEUROBLASTOMA 67
5. DISCUSIÓN 71
6. BIBLIOGRAFÍA 81
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1: Morfología de Andrographis paniculata. 20
Figura 2: Estructura química de andrografólido. 21
Figura 3: Efecto de andrografólido en cultivo primario
de neuronas sometidas a toxicidad por Aβ in vitro. 26
Figura 4: Efecto del peróxido sobre viabilidad de
células de neuroblastoma de ratón (N2a). 39
Figura 5: Efecto de peróxido sobre viabilidad de neuronas
corticales de cerebro de ratón. 40
Figura 6: Efecto de andrografólido sobre la viabilidad en
células N2a sometidas a estrés oxidativo. 41
Figura 7: Efecto de andrografólido sobre la viabilidad
en neuronas corticales de ratón sometidas a
estrés oxidativo. 42
Figura 8: Efecto de bajas concentraciones de andrografólido
sobre la viabilidad de las células N2a y neuronas
corticales sometidas a estrés oxidativo. 44
Figura 9: Efecto de bajas concentraciones de andrografólido
sobre la viabilidad de neuronas corticales de ratón
sometidas a estrés oxidativo. 46
Figura 10: Efecto de distintas concentraciones de
andrografólido sobre la viabilidad de las células N2a. 48
Figura 11: Efecto de distintas concentraciones de andrografólido
sobre la viabilidad de las neuronas sometidas a estrés
oxidativo. 49
Figura 12: Determinación de caspasa-3 activa en células
N2a incubadas con AP. 51
Figura 13: Estudio de la muerte celular inducida por AP
en células N2a. 52
Figura 14: Determinación de caspasa-3 activa en neuronas
corticales incubadas con AP. 53
Figura 15: Estudio de la muerte celular inducida por AP
en neuronas corticales de ratón. 54
Figura 16: Determinación de caspasa-3 activa en células
N2a sometidas a distintas concentraciones de AP. 56
Figura 17: Determinación de caspasa-3 activa en neuronas
corticales sometidas a distintas concentraciones de AP. 57
Figura 18: Determinación de caspasa-3 activa inducida por
AP en células N2a. 58
Figura 19: Determinación de caspasa-3 activa inducido por
andrografólido en neuronas corticales. 59
Figura 20: Efecto de andrografólido sobre la viabilidad de
astrocitos. 62
Figura 21: Efecto de distintas concentraciones de andrografólido
sobre la viabilidad de cultivos mixtos de neuronas y
astrocitos. 64
Figura 22: Efecto de distintas concentraciones de andrografólido
sobre la viabilidad de neuronas corticales acondicionadas
con medio de astrocitos. 65
Figura 23: Efecto de andrografólido sobre la actividad luciferasa
de NF-kB en células N2a. 68
Figura 24: Efecto de andrografólido sobre la degradación
de IkB-α. 69
LISTA DE ABREVIATURAS
A30P Mutación de α-sinucleina. Cambio en el residuo 30
de alanina por prolina.
A53T Mutación de α-sinucleina. Cambio en el residuo 53
de alanina por treonina.
A β Péptido β amiloide.
AD Enfermedad de Alzheimer (Alzheimer disease).
AINES Antiinflamatorios no esteroidales.
ALS Esclerosis lateral amiotrófica.
AP Andrografolido.
Apaf-1 Factor activador-1 de la proteasa apoptótica
(Apoptosis protease-activating factor-1).
APP Proteína precursora amiloide.
ATP Adenosina trifosfato.
BHC Hexaclorociclohexano.
BSA Albúmina de suero bovino.
COX-1 Ciclooxigenasa-1.
COX-2 Ciclooxigenasa-2.
DMEM Medio Dulbelcco´s Eagle modificado
DMSO Dimetilsulfóxido.
EROs Especies reactivas de oxígeno.
Fas Receptor CD95.
fMLP N-formil-metionil-leucil-fenilalanina.
GSH Glutatión reducido.
HL-60 Línea celular promielocítica humana.
HBSS Solución salina balanceada de Hank's.
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular 1 (Inter-Cellular Adhesion
Molecule 1).
IgG Inmunoglobulina G.
IkB-α Inhibidor alfa del Factor Nuclear kappa B
(NF-kappa-B inhibitor alpha).
IKK IkB Kinasa.
LPS Lipopolisacáridos.
MAP-2 Proteína asociada a microtúbulos 2
(microtubule-associated protein 2).
MTT Dimetil-tiazolil-tretrazolio.
N2a Neuroblastoma de ratón.
NF-kB Factor Nuclear kappa B.
PBS Tampón fosfato salino.
PD Enfermedad de Parkinson (Parkinson disease).
pRL-TK Vector pRL codificante para renilla luciferasa.
PMSF Fenilmetilsulfonil fluoruro.
SDS Dodecil sulfato de sodio.
SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturantes.
SNC Sistema nervioso central.
SOD Superóxido dismutasa.
TEMED N, N, N´, N´- tetrametilendiamina.
TNFR Receptor del factor de necrosis tumoral.
Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano.
Tritón X-100 Octil fenoxi polietoxietanol.
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa.
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP
nick end labeling.
1
1. RESUMEN
Andrografólido (AP) es el constituyente más abundante de Andrographis
paniculata, planta de origen asiático tradicionalmente utilizada en Oriente para
aliviar desórdenes inflamatorios. Estudios realizados en cultivos de células
neuronales sugieren que AP tendría un rol neuroprotector frente a enfermedades
neurodegenerativas tales como Alzheimer y Parkinson. En esta tesis de
investigación se propuso evaluar el efecto de distintas concentraciones de AP en
líneas celulares de tipo neuronal (neuroblastoma de ratón) y neuronas corticales
de ratón bajo condiciones normales y de estrés oxidativo inducido por H2O2. Las
células fueron incubadas con distintas concentraciones de H2O2, AP o ambos;
observándose por medio de ensayos de viabilidad por reducción de MTT que
andrografólido no induce protección en estos modelos celulares frente al daño por
estrés oxidativo. Además, se pudo observar que concentraciones de 50µM y
100µM de AP poseen un efecto citotóxico en ambos modelos celulares. Cultivos
mixtos de neuronas y astrocitos incubados con los estímulos mencionados
atenuaron el efecto citotóxico causado por altas concentraciones del fármaco.
Estos resultados nos indican que AP no posee un efecto protector directo en
células de tipo neuronal frente al daño originado por estrés oxidativo, descartando
esta vía como mecanismo del fármaco para inducir neuroprotección frente a
enfermedades neurodegenerativas.
2
1.2 SUMMARY
Andrographolide (AP) is the major component of Andrographis paniculata, a
traditional asiatic herb that has been used for the treatment of inflammatory
diseases. Studies in Neuronal cells culture suggest that AP has a neuroprotector
role in neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. In this study
we evaluated the effect of several AP concentrations in neuronal cell line and in
neuronal primary cell cultures under normal conditions and induced oxidative
stress by H2O2. Cells were treated with different H2O2 concentrations, AP or both,
and by MTT reduction viability assay, we found that AP does not induce protection
against oxidative stress in these cells. Furthermore, we also found that AP
concentrations of 50uM and 100uM had a cytotoxic effect in both kinds of cells.
Neurons and astrocytes mixed culture under above mentioned conditions,
attenuated the cytotoxic stress from AP high concentrations. These results
indicated that AP did not exert a direct protection in neuronal cells from oxidative
stress, discarding this path as AP target to induce neuroprotection against
neurodegenerative diseases.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
Las enfermedades neurodegenerativas constituyen hoy en día uno de los
problemas de salud pública más serios en la sociedad, tanto en países
desarrollados como en vías de desarrollo. Hace 30 años, no se sabía mucho sobre
las causas de estas enfermedades, que permitieran una acción más eficaz sobre
las mismas o, por lo menos, un mayor conocimiento de su etiología. Los avances
logrados en los últimos años han sido positivos, de tal modo que se están
abriendo nuevas vías de investigación que representan un gran desafío frente a
graves problemas médicos, asistenciales, sociales y económicos a los que se
enfrentan los principales países desarrollados (Evers, 2002).
La mayoría de las enfermedades neurodegenerativas tiene un comienzo
engañoso y un curso progresivo que puede durar por muchos años. Las
manifestaciones generalmente son bilaterales y simétricas, afectando a menudo a
sistemas de neuronas anatómica y fisiológicamente relacionadas. Su clasificación
se establece de acuerdo a las manifestaciones clínicas que éstas presentan,
destacándose aquellas que cursan con un síndrome demencial, siendo el mejor
exponente la enfermedad de Alzheimer (AD); las que presentan trastornos del
movimiento y la postura, como en la enfermedad de Parkinson (PD); las que
exhiben ataxia progresiva, en donde destaca la atrofia olivopontocerebelosa; las
que manifiestan debilidad y atrofia muscular, como ocurre en la esclerosis lateral
4
amiotrófica; y muchas otras enfermedades con diversas presentaciones (Sáenz de
Pipaón, 2005).
Entre los desórdenes neurodegenerativos existentes destaca la
Enfermedad de Alzheimer (AD) debido a su alta incidencia dentro de la población
de mayor edad. La AD es la enfermedad neurodegenerativa más común en
personas ancianas, afectando actualmente a alrededor del 2% de la población en
los países industrializados (Mattson, 2004). Esta enfermedad fue descrita por
primera vez en 1907 por el médico alemán Alois Alzheimer, de quien tomó su
nombre. Desde el punto de vista neuropatológico, se caracteriza por la pérdida
progresiva de poblaciones neuronales y conexiones sinápticas, especialmente a
nivel de la corteza cerebral e hipocampo. A nivel macroscópico, se aprecian
cambios como atrofia cerebral, especialmente cortical, observándose un
adelgazamiento de las circunvoluciones y del espesor cortical, aumento del
tamaño de los surcos, pérdida de sustancia en las estructuras grises profundas,
sobre todo en la amígdala y el hipocampo, pérdida de la sustancia blanca y
mielina, y aumento del tamaño de los cuernos frontal y temporal de los ventrículos
laterales (Miller, 1989). A su vez, a nivel microscópico destaca la presencia de
placas seniles y ovillos neurofibrilares en las regiones afectadas (Cotman, 1994).
Las placas seniles consisten principalmente en agregados extracelulares de
péptido β amiloide mientras que los ovillos neurofibrilares están mayoritariamente
compuestos por la proteína intracelular Tau (Selkoe, 2001). La producción de la
proteína β amiloide es el resultado de la ruptura de la proteína precursora amiloide
5
(APP), la cual se encuentra sobreexpresada en la AD. APP posee un rol
importante en la diferenciación celular y posiblemente en el desarrollo de las
sinapsis neuronal (Loffler, 1992). Su función en los cerebros adultos es menos
clara. Sin embargo, se cree que podría tener un efecto trófico en las neuronas
(Neve et al., 2000; Qiu et al., 1995). La proteína Tau, en las neuronas sanas, es un
componente integral de los microtúbulos, que son estructuras de soporte interno
que transportan nutrientes y vesículas desde el cuerpo celular al extremo de los
axones y viceversa (Lu, 1993). Sin embargo, en la AD, la proteína Tau se
encuentra hiperfosforilada, promoviendo la unión entre ellas formando los ovillos
neurofibrilares (Braak, 1994).
Se han postulado diversas teorías acerca del origen de la enfermedad. La
primera involucra la cascada amiloide, la cual postula la aparición de mutaciones
en los genes responsables de la expresión de APP y la consecuente formación del
péptido β-amiloide, TAU y las presenilinas-1 y 2, éstas últimas responsables del
procesamiento normal de APP, tendrían un efecto sobre la generación del péptido
β-amiloide, el cual sería el principal agente de neurodegeneración (Selkoe, 2001).
Una segunda hipótesis indica a la proteína TAU como causante del fenómeno de
degeneración (Kosik et al., 1986). Otras hipótesis establecen la participación del
calcio, la acetilcolina e incluso la inflamación como agentes gatillantes (MacManus
et al., 2000; Townsend and Pratico, 2005).
La segunda enfermedad neurodegenerativa más frecuente, después de AD,
es la Enfermedad de Parkinson (PD), la cual presenta una prevalencia cercana al
6
2% en individuos mayores de 65 años. Los síntomas característicos de rigidez,
bradiquinesia y temblor se encuentran asociados con la pérdida de neuronas
dopaminérgicas en la pars compacta de la sustancia nigra, que resultan en una
disminución dramática de los niveles de dopamina en el cerebro, y la aparición de
inclusiones citoplasmáticas denominadas cuerpos de Lewy (Kedar, 1999). El
principal componente proteico de estos depósitos es la α-sinucleina, el cual se
encuentra uniformemente distribuido en el cerebro. Mutaciones de la α-sinucleina,
tales como A30P y A53T contribuyen a la forma familiar de la enfermedad
(Barnham, 2004).
2.2. MECANISMOS DE MUERTE CELULAR EN LAS ENFERMEDAD ES
NEURODEGENERATIVAS
Como se ha mencionado anteriormente, las enfermedades
neurodegenerativas se caracterizan por la pérdida progresiva de neuronas en
determinadas áreas del sistema nervioso. Esta pérdida neuronal se lleva a cabo
mediante procesos de muerte celular que pueden ser de dos tipos: necrosis y
apoptosis. Estos dos mecanismos poseen distintas características histológicas y
bioquímicas. En la necrosis los estímulos de muerte (como la isquemia) por si
mismo son a menudo la causa directa de la destrucción celular. Por otra parte en
la apoptosis, el estímulo de muerte activa una cascada de eventos que finalizan en
la destrucción de la célula afectada (Martin, 2001).
7
La necrosis engloba aquellos procesos donde, en estadíos tempranos la
integridad de la membrana celular se ve comprometida resultando en una caída
brusca de los niveles energéticos. La muerte de las células necróticas en el
sistema nervioso central puede ser producida por una isquemia aguda, exposición
a toxinas o un daño traumático en el cerebro o médula espinal. Los rasgos
histológicos de la muerte de células necróticas son la dilatación nuclear y
mitocondrial, la disolución de los organelos y la condensación de la cromatina
alrededor del núcleo. Estos eventos son seguidos por la ruptura de las membranas
nuclear y citoplasmática lo que causa que se libere el contenido intracelular al
medio externo (Robert, 2003). Este fenómeno conduce a las células vecinas
también hacia la muerte, atrayendo, al mismo tiempo, a las células inflamatorias,
lo que hace que las áreas en donde se encuentran células necróticas sea
frecuente encontrar nuevas células que presentan este tipo de muerte, además de
generar un proceso inflamatorio en el tejido afectado (Jordán, 2003).
La muerte celular por apoptosis, también conocida como muerte celular
programada produce que la células se autodestruyan sin desencadenar
reacciones de inflamación ni dejar cicatrices en los tejidos (Yuan, 2000). Los
rasgos histológicos y morfológicos presentes en este tipo de muerte celular son la
ausencia de inflamación, la condensación de la cromatina, la fragmentación
nuclear, el encogimiento citoplasmático y la formación de pequeños fragmentos
celulares rodeados de membrana plasmática llamados cuerpos apoptóticos, que
impiden que la célula libere su contenido al medio extracelular (Kermer, 2004).
8
Los cambios morfológicos y bioquímicos ocurridos durante la muerte celular
por apoptosis están mediadas por una familia de cisteína proteasas intracelulares
denominadas caspasas. En las células vivas, las caspasas existen como
proenzimas inactivas, las cuales deben ser activadas por ruptura proteolítica para
poder ejercer su función (Nijhawan, 2000). Hasta el momento se han identificado
al menos 14 caspasas diferentes, de las cuales, 11 se pueden hallar en humanos
(Reed, 2000). Estas proteínas se dividen en dos tipos: las caspasas iniciadoras,
capaces de actuar río arriba en la cascada de la apoptosis, y caspasas efectoras
o de acción río abajo, las cuales desencadenan la ejecución de la muerte celular
(Kermer, 2004). La activación de las caspasas implica dos vías que han sido
relativamente bien estudiadas. La primera, denominada vía extrínseca, involucra
receptores de muerte localizados preferentemente en la membrana citoplasmática,
como Fas, y el receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), que activan de
manera intracelular a la proteína caspasa-8 (Nijhawan, 2000). La caspasa-8
activada es capaz de cortar y a su vez activar otras caspasas de acción río abajo
tales como caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, las que en definitiva median la
muerte celular (Kermer, 2004). La segunda vía, denominada intrínseca o
mitocondríal se ejecuta en respuesta a estrés u otras señales que provocan la
liberación de citocromo C al citosol, lo cual se acompaña de pérdida del potencial
de membrana mitocondrial y desestabilización de la membrana externa de la
mitocondria. En el citosol el citocromo C se une a Apaf-1 en presencia de ATP y
forma el complejo conocido como apoptosoma, el cual activa a la pro-caspasa 9,
la cual puede activar a las caspasas 3, 6 y 7, desencadenando los cambios
morfológicos y bioquimicos que ocurren el la célula apoptótica.
9
Dentro de un contexto fisiológico, la apoptosis contribuye a mantener un
número constante de células proliferativas como es el caso de las células de la
piel, la mucosa intestinal y las células del sistema inmune. Además juega un rol
importante en el desarrollo del sistema nervioso central y periférico (Mattson,
2000). La apoptosis es por lo tanto, considerada como una muerte natural
fisiológica que funciona como un mecanismo de eliminación de células no
deseadas, dañadas o desconocidas, desempeñando un papel protector frente a
diversas enfermedades.
Sin embargo, dependiendo de la etiología, la desregulación de los procesos
apoptóticos pueden resultar perjudiciales, siendo responsables de diversas
afecciones resultando en situaciones patológicas comprometedoras,
especialmente a nivel del SNC (Kermer K, 2004). Recientes investigaciones sobre
las enfermedades neurodegenerativas se han enfocado en el estudio de la
apoptosis neuronal como posible objetivo para desarrollar estrategias terapéuticas
destinadas a prevenir o retardar la progresión de la enfermedad (Nijhawan, 2000).
Se ha reportado que la exposición de cultivos neuronales con el péptido AB
induce degeneración y muerte celular por medio de la vía apoptótica, sugiriendo
que la apoptosis juega un rol en la degeneración neuronal asociada a la AD (Doo,
1993). Similar efecto ha sido reportado en estudios in vivo con ratones
transgénicos que sobreexpresan el péptido AB (LaFerla, 1995). También existen
evidencias de que las caspasas estarían involucradas en el desarrollo de la AD.
10
Gervais y col. (1999) demostraron que la cola citoplasmática de APP podría ser
cortada por caspasa-3. También se ha descrito la participación de caspasa-3 en el
corte proteolítico de TAU, generando una proteína truncada que tiende a la
agregación, lo que puede desencadenar la neurodegeneración (Gamblin et al.,
2003).
Algunos estudios realizados en cerebros postmortem de pacientes de PD
han revelado la presencia de células apoptóticas, además de la fragmentación del
DNA nuclear en la sustancia nigra (Mochizuki, 1996). Sin embargo, otros reportes
refutan estos resultados, al no observar células apoptóticas en muestras de
pacientes en etapas avanzadas de la enfermedad (Banati, 1998). A pesar de
estos resultados, existen estudios en los que se demuestra que la caspasa-3
participa como un factor crítico en la muerte de las neuronas dopaminérgicas de la
sustancia nigra de pacientes con PD (Hartmann, 2000).
11
2.3. GATILLANTES DE LA MUERTE CELULAR EN LA
NEURODEGENERACIÓN
2.3.1 ESTRÉS OXIDATIVO
Entre las posibles causas que pueden dar origen a la muerte celular en las
enfermedades neurodegenerativas, se sabe que el estrés oxidativo juega un rol
muy importante. En condiciones fisiológicas, las células presentan un equilibrio
entre la generación de radicales libres y los sistemas antioxidantes de defensa.
(Barnham, 2004). Se le denomina estrés oxidativo a la pérdida del equilibrio entre
la formación o acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs) y/o de
radicales libres, y de la incapacidad que poseen las células de eliminarlos. Las
EROs son moléculas químicamente reactivas derivadas del oxígeno y este término
incluye metabolitos que pueden ser o no radicales libres. Dentro de las EROs se
pueden destacar el anión superóxido (O2·-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el
radical hidroxilo (OH·). La generación de estos productos induce posteriormente un
daño de ciertos componentes celulares, en especial en neuronas debido a su
mayor susceptibilidad con respecto a otras células del organismo, al alto consumo
de oxígeno y a los niveles relativamente bajos de antioxidantes en el cerebro con
respecto a otros tejidos u órganos (Christen, 2000).
El proceso de estrés oxidativo ha sido relacionado con enfermedades como
el AD, PD y la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). En este aspecto muchos
estudios han establecido evidencias del efecto degenerativo producto del estrés
12
oxidativo en ciertas células en AD (Barnham, 2004). La oxidación, tanto del DNA
nuclear como del mitocondrial, ha sido observada en el córtex parietal de
pacientes con AD (Christen, 2000). De igual forma, la oxidación de proteínas
también ha sido reportada en los cerebros de individuos de avanzada edad, tanto
en pacientes con AD como en pacientes ancianos que no manifiestan la
enfermedad. Sin embargo, este rasgo se presenta mucho más marcado en los
cerebros de individuos enfermos, especialmente en aquellas regiones que
presentan daño característico de la patología. (Hensey, 1995).
Se sabe que los metales juegan un rol muy importante en la producción de
agentes oxidantes, entre los que se encuentran los radicales libres. Muchas
observaciones indican que el metabolismo del hierro se encuentra involucrado en
AD; debido a las elevadas concentraciones de hierro en cerebros de pacientes con
AD, además de la presencia de hierro, transferrina y ferritina en las placas seniles
(Loeffler, 1995). Por otra parte, el hierro también está involucrado en la formación
de radicales hidroxilos, como ocurre en la reacción de Fenton (Henle, 1999).
Estudios relacionados con la distribución del hierro en cerebros de pacientes con
AD, utilizando diversas técnicas histoquímicas revelaron que la localización de
este metal concuerda con la distribución tanto de las placas seniles como de los
ovillos neurofibrilares, dos agregados proteicos claves de la enfermedad (Smith,
1997). En este aspecto, se ha sugerido que otros metales tales como el cobre
también podrían participar. Se sabe que el cobre actúa como catalizador en la
formación de EROs y además, se ha reportado que la molécula APP posee un
sitio de unión al cobre (Multhaup, 1997). La unión del cobre, más específicamente
13
del Cu+2, a la molécula APP permite su transformación. Este proceso se produce
por la oxidación de las cisteínas 144 y 158, en 2 electrones, el primero es utilizado
en la reducción del Cu+2 en Cu+1, y el otro queda como electrón remanente
disponible para la producción de radicales hidroxilos (Multhaup, 1996). Bajos
niveles de cobre también podrían estar relacionados con la neurodegeneración.
Esta posibilidad se ha sugerido, debido a que este metal es necesario para
actividades enzimáticas tales como la de citocromo-c oxidasa y Cu/Zn superóxido
dismutasa y su presencia es muy baja en zonas del cerebro de pacientes
afectados con AD (Deibel, 1997).
2.3.2 INFLAMACIÓN
La inflamación es una característica patológica de diversas enfermedades
neurodegenerativas. Los astrocitos y microglias activadas son encontradas de
manera abundante alrededor de las neuronas y las placas seniles en AD. Estas
dos células son muy sensibles a cambios producidos en su microambiente,
activándose fácilmente en respuesta a una infección o daño por injuria (Liu, 2003).
Existen evidencias relacionadas con la activación microglial en la patogénesis de
muchas enfermedades neurodegenerativas, basados en el análisis postmortem de
cerebros de pacientes con AD y PD; los cuales muestran que las microglias
reactivas se encuentran co-localizadas con las placas neuríticas en la región
cortical de cerebros dañados por AD (Rogers et al., 1988). Igualmente, en la PD
se han encontrado microglias reactivas en la sustancia nigra, una región en donde
la neurodegeneración dopaminérgica es muy alta (McGeer et al., 1988).
14
Bioquímicamente, el nivel de inflamación determinado por el aumento en la
concentración y el grado de las microglias reactivas es justificado por un espectro
de mediadores inflamatorios (Klegeris, 2005).
2.3.3 PLEGAMIENTO INCORRECTO Y AGREGACIÓN PROTEICA
Las características más distintivas presentes en lesiones cerebrales de
pacientes con desordenes neurodegenerativos, son la acumulación de agregados
proteicos filamentosos insolubles en el sistema nervioso central (Skovronsky,
2006). El plegamiento de las proteínas para la adquisición de una correcta
estructura terciaria es esencial para una función proteica normal. Un plegamiento
incorrecto de las mismas resulta muchas veces en proteínas disfuncionales que
además de generar alteraciones producto de la disminución de su actividad,
pueden ser capaces de generar daños adicionales, debido a su condición
aberrante. Muchas patologías neurodegenerativas son claros ejemplos de la
agregación proteica, como ocurre con el péptido Aβ derivado de APP y los
filamentos helicoidales pareados compuestos por agregados de la proteína
asociada a microtúbulos TAU en AD (Christen, 2000). Otros ejemplos de
agregados proteicos anormales son la proteína huntingtina en la enfermedad de
Huntington, la α-sinucleína en PD y los priones en la enfermedad de Creutzfeld-
Jacob (Ross, 2004).
El primer mecanismo de defensa contra el plegamiento incorrecto de
proteínas a nivel celular son un grupo de proteínas conocidas como chaperonas
15
moleculares, las cuales se asocian con la formación de polipéptidos. Sin embargo,
una considerable fracción de polipéptidos falla en el plegamiento normal
generando proteínas aberrantes (Taylor, 2002). Estas proteínas pueden ser
degradadas posteriormente por el sistema Ubiquitina-Proteosoma, el cual es un
sistema múltiple capaz de identificar y degradar proteínas no deseadas. Este
sistema además de eliminar las proteínas anormales cumple otras funciones, tales
como la degradación de muchas proteínas normales de corta vida; regulando de
esta manera numerosos procesos celulares. Así, una falla en el mecanismo de
detección y eliminación de proteínas mal plegadas contribuye a la patogenia de
las enfermedades neurodegenerativas (Skovronsky, 2006).
Cuando las proteínas mal plegadas se acumulan en una gran cantidad, son
propensas a la agregación, formando agregados proteicos generalmente
citotóxicos. Estos agregados conformados por las proteínas mal plegadas poseen
una disposición de hoja-β, causada por la configuración espacial de las proteínas
aberrantes, lo que les permite interaccionar entre sí mediante puentes de
hidrógeno (Ross, 2004).
2.4. DIANAS FARMACOLÓGICAS EN LAS ENFERMEDADES
NEURODEGENERATIVAS
La mayoría de los fármacos utilizados actualmente o en fase de desarrollo
para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como la AD tienen como
principal objetivo retrasar la progresión de éstas; pero hasta el momento no existe
16
un tratamiento que sea curativo y permita a la persona el restablecimiento de su
calidad de vida. A menudo las mejoras producidas en el estado de los pacientes
son tan sutiles que ni siquiera las personas que lo rodean son capaces de
percibirlas. Sin embargo, incluso en estos casos, los fármacos utilizados sirven al
menos para retrasar el momento en que se hace necesaria la internación del
paciente en alguna institución debido a la imposibilidad de desenvolverse por si
mismo.
En la AD, los fármacos de elección son aquellos capaces de proteger el
sistema colinérgico. Los inhibidores de la colinesterasa, tales como Tacrina
(COGNEX™), Donepezilo (ARICEPT™), Rivastigmina (EXELÓN™) y
Galantamina, actúan sobre la enzima encargada de degradar la acetilcolina,
elevando así los niveles de acetilcolina en el cerebro (Flores, 1997). Su utilidad
radica en el hecho de que los enfermos de Alzheimer presentan una disminución
en el número de neuronas colinéricas subcorticales de la parte basal del cerebro
anterior (Goodman & Gilman, 2001) donde investigaciones indican que la
acumulación de péptido AB gatilla o contribuye en el proceso de degeneración de
estas células (Satyabrata Kar, 2004).
En la PD, el tratamiento se basa en el uso de fármacos que ayudan a
combatir la deficiencia de dopamina; provocada por la degeneración de las
neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra. Una de las estrategias es el uso
de Levodopa (L-dopa) exógeno, el cual es convertido a dopamina en el cerebro,
reemplazando el déficit del neurotransmisor endógeno (Münchau, 2000). Otro tipo
17
de fármaco utilizado en el tratamiento de PD son los agonistas de la dopamina.
Éstos actúan directamente sobre los receptores del neurotransmisor, imitando la
función del ligando (Goetz, 1985).
En la actualidad, se están desarrollando diversas líneas de investigación en
el control de enfermedades neurodegenerativas. Una de éstas, la fisiopatológica,
busca prevenir o paliar la aparición de la sintomatología propia en la alteración a
nivel de neurotransmisores, manteniendo el nivel de éstos. Otra línea, la
etiopatogénica, tiene como propósito detener la muerte celular y fomentar la
recuperación de las poblaciones celulares que se encuentran afectadas mediante
la búsqueda de fármacos que sean capaces de modular las rutas bioquímicas
implicadas en estos procesos (Segura, 2003).
El mantenimiento y mejoramiento de los mecanismos de defensa
antioxidante en el cerebro constituye una importante estrategia para lograr
disminuir e incluso prevenir la progresión de la neurodegeneración (Prasad, 1999).
El potencial de los antioxidantes consumidos en la dieta, entre ellos el β-caroteno
y las vitaminas C y E, como agentes protectores contra la pérdida cognitiva y los
trastornos neurodegenerativos, ha sido explorado en diversos estudios clínicos y
epidemiológicos, mostrando una correlación significativa entre los niveles de
vitamina presentes en el suero y la memoria en una población de adulto mayor
(Segura, 2003). Altas dosis de vitamina E han sido utilizadas en estudios de doble
ciego en los cuales, pese a que no hubo una disminución en la pérdida de
funciones cognitivas, mostró un retardo en el tiempo de internación del paciente,
18
así como en la pérdida de la capacidad de desarrollar sus actividades básicas y en
la aparición de la demencia (Sano, 1997).
Los antiinflamatorios no esteroidales (AINES o NSAID, por sus siglas en
inglés) han generado en el último tiempo, un gran interés debido a su potencial en
el desarrollo de tratamientos efectivos contra la neurotoxicidad producida en las
enfermedades neurodegenerativas. El término AINES abarca un grupo de
sustancias químicas que poseen acción analgésica, antiinflamatoria y antipirética,
por lo que reducen los síntomas de la inflamación, dolor y fiebre (Clive, 1998). Su
mecanismo de acción incluye esencialmente la inhibición de las enzimas
ciclooxigenasas, específicamente, de las isoenzimas COX1 y COX2 (Antman et
al., 2007). Estudios epidemiológicos han revelado una disminución en el riesgo de
desarrollar enfermedades como AD o PD en pacientes con una historial de uso
crónico de AINES (Lleo, 2007).
2.5. ANDROGRAFOLIDO
Andrographis paniculata, una planta herbácea de origen asiático
perteneciente a la familia Acanthaceae, también conocida como “Reina de los
amargos”, ha sido utilizada durante muchos años en la medicina asiática para el
tratamiento de desórdenes gástricos, trastornos inflamatorios (artritis
reumatoidea), infecciones virales y bacterianas. En Escandinavia ha sido utilizado
para la prevención y el tratamiento del resfrío común. Varias investigaciones han
revelado que Andrographis paniculata posee un amplio rango de efectos
19
farmacológicos beneficiosos, en especial el antiinflamatorio. En un contexto
morfológico, corresponde a una hierba anual muy amarga al gusto, tanto sus hojas
como sus tallos. Su crecimiento es recto, alcanzando una altura que va desde los
30cm a los 110cm y un diámetro de 2-6mm (Figura 1). Posee pequeñas flores
blancas con manchas rosas y púrpuras en sus pétalos. Sus hojas son de un color
verde oscuro, distribuidas de forma homogénea en los tallos.
El principal componente bioactivo de Andrographis paniculata es
Andrografólido (AP), un diperteno lactona bicíclico cuyo peso molecular es de
350.45gr/mol (Figura 2). Se presenta de manera ubícua en la planta,
concentrándose más del 2% del total del compuesto en las hojas (Kanokwan,
2008). Las propiedades de AP han sido estudiadas en extenso, especialmente por
su rol antiinflamatorio. Yi-Feng Xia y colaboradores (2004) identificaron algunos
mecanismos involucrados en la acción antiinflamatoria de AP. De acuerdo a sus
resultados, AP actúa como un antagonista para la activación de NF-kB, un factor
20
Figura 1: Morfología de Andrographis paniculata. Es una planta de
crecimiento erecto que alcanza una altura de 30-110cm. Posee hojas de 8,0cm de
largo y 2,5cm de ancho de color verde oscuro carentes de pilosidad, y flores
blancas con manchas rosas y púrpuras en los pétalos. La parte aérea de las
planta (hojas y tallo) son utilizadas para la extracción de las moléculas
fotoquímicas activas como el andrografolido. (Kanokwan, 2000).
21
Figura 2: Estructura química de andrigrafolido. C20H30O5; (3 - [2- {decahidro-6-
hidroxi-5(hidroximetil)-5,8α-dimetil-2-metilen-1-naptalenil}etilideno]dihidro-4-
hidroxi-2(3H)-furanona. Es un diperteno lactona que posee un peso molecular de
350.44gr/mol. (Kanokwan, 2000).
22
de transcripción y regulador pleiotrópico de muchos genes involucrados en las
respuestas inmunológicas, por medio de la modificación covalente de la cisteína
62 reducida de P50, un miembro de la familia de NF-kB. Este efecto
antiinflamatorio ha sido evaluado en presencia de inductores de la activación de
NF-kB, tales como el factor de activación plaquetaria (PAF) y N-formil-metionil-
leucil-fenilalanina (fMLP) en células HL-60 diferenciadas a neutrófilos,
demostrándose que AP reduce la unión de NF-kB al DNA, lo cual conlleva a la
disminución en la expresión de proteínas inflamatorias tales como COX2 (Hidalgo,
2005). Se ha visto que AP es capaz de disminuir la fiebre causada por agentes
tales como: endotoxinas bacterianas, streptococcus hemolítico, neumococcus,
tifoide y 2,4-dinitrofenol (Deng, 1978). También se ha demostrado que AP atenúa
la expresión de ICAM-1 e inhibe la adhesión de monocitos al endotelio inducida
por TNF; etapas claves en el desarrollo de la inflamación (Habtemariam, 1998).
El potencial de andrografólido como fármaco se ha incrementado por la
diversidad de efectos terapéuticos frente a distintas afecciones (Kanokwan, 2008).
Diversos estudios han evaluado la prevención del resfriado común y los beneficios
en el sistema respiratorio por parte de andrographis paniculata. Por medio de
análisis de doble ciego se ha observado una disminución significativa en la
intensidad de los síntomas del resfriado común comparado con el efecto placebo
luego del tratamiento con andrographis paniculata (Cáceres, 1997). Esto puede
ser atribuido a las propiedades antiinflamatorias, la actividad antipirética y el efecto
inmunomodulatorio de AP (Puri, 1993). Su efecto hepatoprotector contra el daño
oxidativo también ha sido reportado. Ratones tratados con hexaclorociclohexano
23
(BHC), un agente carcinogénico capaz de inducir estrés oxidativo hepático, y AP
mostraron un incremento significativo en la actividad antioxidante de enzimas
tales como GSH, SOD y catalasa con respecto a los ratones tratados sólo con
BHC, indicando un efecto protector de AP frente al daño oxidativo en el hígado
debido a la habilidad de aumentar la actividad de enzimas antioxidantes (Trivedi,
2007).
Los resultados encontrados en distintos tipos celulares indican que AP
puede ser un putativo agente protector frente al daño causado por degeneración
del sistema nervioso central. Se ha comprobado que es capaz de reducir la
neurodegeneración dopaminérgica mediada por la inflamación en cultivos de
neuronas-glias por medio de la inhibición de la actividad de microglias (Wang,
2003). Recientemente se evaluó el efecto de AP en la agregación y desagregación
del péptido β-amiloide (Aβ), el cual, como se ha mencionado anteriormente, tiene
un potencial efecto neurotóxico y neurodegenerativo. Por medio de ensayos de
turbidimetría in vitro, se realizó un seguimiento del proceso de agregación del
péptido, en presencia y ausencia de AP. Los resultados obtenidos muestran que
AP interfiere con los procesos de polimerización previniendo la formación de las
fibras amiloides al interactuar directamente con el péptido. Posteriormente, al
evaluar el efecto de AP en la desagregación de las fibras amiloides mediante
microscopía de fluorescencia utilizando tioflavina T, un compuesto que presenta
alta afinidad con los agregados amiloidogénicos (Le vine, 1993), se observó la
ausencia casi completa de agregados Aβ1-40 de gran tamaño en presencia de
50µM de AP, sugiriendo un efecto considerable en la desagregación del péptido
24
Aβ por parte del fármaco. Finalmente para evaluar un posible efecto
neuroprotector de AP frente al daño causado por el péptido Aβ, se realizó un
análisis cuantitativo del largo de los procesos neuronales. Para ello se realizó un
cultivo primario de neuronas corticales de embriones de ratón, el cual fue tratado
con agregados del péptido Aβ en presencia y ausencia de andrografólido 50µM.
Luego los cultivos fueron analizados por inmunofluorescencia utilizando
anticuerpos contra tubulina tirosinada y MAP-2, proteína localizada de forma
selectiva en el soma y dendritas de las neuronas (Desagher, 1996). Estos
resultados (Figura 3) son interesantes debido a que los cultivos incubados con los
agregados del péptido Aβ en presencia de AP mantuvieron la longitud, y por ende,
la integridad de los procesos neuronales, indicando el potencial efecto
neuroprotector del fármaco frente al daño causado por los agregados amiloides
(Barrientos, 2007).
2.6 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los antecedentes descritos revelan una amplia gama de propiedades
farmacológicas por parte de andrografolido, los cuales van desde propiedades
antiinflamatorias hasta antitumorales en varios modelos celulares. Además la
existencia de estudios realizados en cultivos de células neuronales sugieren que
AP tendría un rol neuroprotector frente a enfermedades neurodegenerativas tales
como Alzheimer y Parkinson. Sin embargo, no existen estudios concluyentes que
permitan establecer si andrografolido es capaz de ejercer neuroprotección frente a
estímulos inductores de muerte presentes en varias enfermedades
25
neurodegenerativas, entre el que destaca el estrés oxidativo. Es por este motivo
que en esta tesis de investigación se propone la siguiente hipótesis de trabajo:
“Andrografólido posee un rol protector en células d e origen neuronal
sometidos a estímulos neurodegenerativos, tales com o el estrés oxidativo”.
Por lo tanto los objetivos específicos de la presente tesis son:
• Determinar el efecto de andrografólido sobre la viabilidad celular, en cultivos
primarios de neuronas corticales y la línea celular de neuroblastoma de
ratón N2a frente a estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno.
• Determinar si andrografólido posee un efecto antiapoptótico sobre células
de tipo neuronal sometidas a estrés.
• Determinar la participación de andrografólido en la activación de factores
de transcripción tales como NF- kB.
26
Figura 3: Efecto de andrografolido en cultivo prima rio de neuronas
sometidas a toxicidad por agregados de péptido A β in vitro. Las neuronas
fueron incubadas con productos de ensayos de agregación del péptido Aβ 10µM,
así como en presencia del péptido y AP 50µM. Por medio de análisis de
inmunofluorescencia se determinó el largo de las prolongaciones de las neuronas.
A) anticuerpos contra tubulina tirosinada. B) Anticuerpos contra MAP-2, un
marcador específico de neuronas. (Barrientos, 2007).
27
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. REACTIVOS QUÍMICOS
Los reactivos químicos usados en la elaboración de la presente tesis fueron los
siguientes:
• Andrografólido (98%) PM 350,46gr/mol.
• Dimetilsulfóxido PM 78,13gr/mol de Sigma.
• Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2.
• Marcador preteñido de proteínas (20-120kDa) para geles de poliacrilamida-
SDS se obtuvo de BioAxis.
• Medio de montaje acuoso de Laboratorios DAKO.
• Thiazol Blue Terazolium Bromide (MTT), Ioduro de propidio, anticuerpo
Caspasa 3- Activa (Rabbit) y poli-L-lisina fueron obtenidos de SIGMA.
• kit TUNEL fue adquirido de laboratorio Roche.
• Tripsina 0,25%, medio Dulbelcco´s Eagle modificado (DMEM), medio Eagle
Mínimo (MEM), Neurobasal, suplemento B27 y suero bovino fetal (SBF)
fueron obtenidos de Invitrogen.
• Reactivo quimioluminiscente ECL Western blotting analysis system se
obtuvo de Amersham Pharmacia Biotech.
28
• Agarosa, Reactivo de Bradford, Temed y glicina fueron obtenidos de
BioRad.
• Tween 20, Persulfato de amonio, glicerol, Tritón X100, dodecilo sulfato de
sodio (SDS), azul de bromofenol, NaCl, 2-Mercaptoetanol, Peróxido de
hidrógeno (30%), acrilamida y bisacrilamida fueron adquiridos de Merck.
3.1.2. EQUIPOS E IMPLEMENTOS
• Balanza analítica.
• Baño termorregulable,
• Cámara de electroforesis Mini Protean III, Biorad.
• Cámara de transferencia Biorad
• Cámara de flujo laminar
• Centrífuga para tubos Falcon
• Espectrofotómetro
• Materiales de disección
• Microcentrífuga
• Micropipetas gilson y Eppendorf
• Microscopio confocal Olimpus
29
3.1.3. ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Las ratonas hembras preñadas fueron obtenidas del bioterio del Instituto de
Inmunología de la Universidad Austral de Chile . A partir de éstas se obtuvieron los
embriones de 16 días de gestación para la extracción de cerebros.
3.2. METODOLOGÍA
3.2.1. PREPARACIÓN DE ANDROGRAFÓLIDO (AP)
Para realizar los experimentos se preparó un stock de Andrografólido con
una concentración de 50mM. Para ello se disolvió 17,52mg de AP en 1ml de
DMSO en un tubo Eppendorf de 1,6ml y se almacenó a -20oC.
3.2.2. PREPARACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO (H 2O2)
Se preparó un stock de peróxido de hidrógeno 10mM. Para lo cual se
diluyó, bajo campana; 11,3ul de un stock comercial al 30% en 9,9ml de PBS
estéril. A partir del stock 10mM se prepararon las diluciones correspondientes para
cada experimento.
30
3.2.3. CULTIVOS CELULARES
El trabajo de investigación contempló el uso de dos modelos celulares. El
primero correspondiente a una línea tumoral de tipo neuronal y la segunda a un
cultivo primario neuronal.
Las células de neuroblastoma de ratón (N2a) fueron mantenidas en medio
Dulbelcco´s Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino
fetal (SBF), penicilina 50U/ml, estreptomicina 50mg/ml en un ambiente húmedo
con CO2 al 5% y a 37ºC.
El cultivo primario de neuronas de corteza cortical fue obtenido a partir de
embriones de ratón de 16-18 días de gestación. Las cortezas fueron disectadas y
colocadas en una solución salina balanceada HBSS suplementada con Hepes 10
mM (pH7.4), penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 mg/ml y 0,5 % glucosa (HBSS).
El tejido lavado en HBSS se incubó por 10min en tripsina 0.25 % a 37ºC.
Posteriormente el tejido se lavó con medio esencial mínimo suplementado con
10% (MEM10) de SBF y fue disociado por trituración por pipeteo. Las células
fueron sembradas en placas cubiertas con poli-lisina, en medio MEM10 y L-
glutamina 2mM. Pasado una hora se cambió el medio a neurobasal suplementado
con B27, L-glutamina 2mM y penicilina/estreptomicina. Finalmente las células se
mantuvieron durante 4 días en un ambiente húmedo con CO2 al 5% y a 37ºC
hasta la realización de los experimentos.
31
El cultivo primario de astrocitos se obtuvo a partir de ratones neonatos de 1-
3 días de nacidos. Las cortezas fueron disectadas y colocadas en una solución
salina balanceada HBSS suplementada con Hepes 10 mM (pH7.4), penicilina 50
U/ml, estreptomicina 50 mg/ml y 0,5 % glucosa (HBSS). El tejido lavado en HBSS
se incubó por 10min en tripsina 0.25 % a 37ºC. Posteriormente el tejido se lavó
con medio esencial mínimo suplementado con 10% (MEM10) de SBF y fue
disociado por trituración por pipeteo. Posteriormente las células fueron sembradas
en placas cubiertas con poli-lisina, en medio MEM10 y L-glutamina 2mM. Pasado
una hora se cambió el medio a DMEM-F12 suplementado con 10% de SBF y se
mantuvieron en un ambiente húmedo con CO2 al 5% y a 37ºC durante 15 días. Las
células fueron agitadas en un Shaker a 37ºC durante 4 horas aproximadamente
para eliminar las neuronas remanentes. Finalmente las células fueron
tripzinisadas, sembradas y cultivadas en las respectivas placas de cultivo hasta la
realización de los experimentos.
3.2.4. DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR MEDIA NTE MTT
Las células N2a y las neuronas corticales fueron cultivadas en placas de 96
pocillos, siendo expuestas a peróxido de hidrógeno, AP o ambos a distintos
tiempos y concentraciones. Luego de ser sometidas a los diferentes tratamientos
se le agregó 10µl de MTT a una concentración de 5mg/ml y se incubó por 2-4
horas a 37ºC. Posteriormente las células fueron lisadas con 50%
dimetilformamida, 20% SDS e incubadas durante toda la noche a 37ºC.
32
Finalmente se registró la absorbancia en un lector de ELISA utilizando un filtro de
540nm.
3.2.5. DETECCIÓN DE MUERTE CELULAR POR FRAGMENTACIÓ N DEL DNA
Las células N2a y las neuronas corticales fueron cultivadas sobre
cubreobjetos en placas de cultivo, siendo expuestas a peróxido de hidrógeno, AP
o ambos a distintos tiempos y concentraciones. Para detectar fragmentación del
DNA se utilizó un kit TUNEL de laboratorio Roche según las indicaciones del
fabricante. La visualización de los núcleos con el DNA fragmentado se realizó
mediante microscopia de fluorescencia.
3.2.6. INMUNOFLUORESCENCIA
Las células fueron sembradas en cubreobjetos en placas de cultivo durante
24horas. Para el cultivo primario de neuronas, los cubreobjetos fueron cubiertos
previamente con poli-L-lisina y cultivadas durante 4 días. Luego de ser sometidas
a los estímulos, las células fueron fijadas con paraformaldehido al 4% durante 15
minutos. Posteriormente las células fueron permeabilizadas y se bloquearon los
coverclips con solución de bloqueo (5% leche descremada, 1% BSA y 3%
TRITON-X100 en PBS [pH 7.4]) e incubadas con los anticuerpos de interés con
una dilución 1:100 según las indicaciones del fabricante, en solución de bloqueo.
Posteriormente fueron incubados con anticuerpos anti-IgG acopladas a Alexa
33
fluoros y con ioduro de propidio por 3 horas. La visualización se realizó por medio
de microscopia confocal y de fluorescencia.
3.2.7. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES
Las células N2a y las neuronas corticales fueron cultivadas en placas de
35mm, siendo expuestas a peróxido de hidrógeno, AP o ambos a distintos tiempos
y concentraciones. Para la extracción de las proteínas totales, luego de realizar los
estímulos, se eliminó el medio a las placas con células. El cultivo se lavó 3 veces
con PBS. Posteriormente se agregó buffer de lisis y se dejó en hielo por 15
minutos. Pasado el tiempo la placa fue raspada con un stripper. La suspensión fue
recuperada en un tubo Eppendorf de 1.6ml y centrifugada a 14000rpm a 4oC por
20 minutos. Finalmente se tomó el sobrenadante y se guardó en alícuotas a -20oC.
3.2.8. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Para la cuantificación utilizó el método de Bradford (Bradford et al, 1976).
Se realizó una curva de calibración entre 0,36 a 1,44µg de proteínas por ul de
reactivo, utilizando BSA de concentración 1,44gr/ml en agua destilada como
estándar. La lectura de los estándares se realizó 10 minutos después en un
espectrofotómetro utilizando una longitud de onda de 595nm.
34
Para determinar la concentración de las muestras, se tomó una alícuota de
cada una, y se le agregó el reactivo de Bradford. Después de 10 minutos. Se
realizó la lectura correspondiente a la misma longitud de onda que al estándar. Se
utilizó agua destilada, más el reactivo como blanco.
3.2.9. ANÁLISIS DE WESTERN BLOT
Las proteínas totales fueron separadas por electroforesis en condiciones
denaturantes en geles de poliacrilamida-SDS, utilizando un estándar de peso
molecular pre-teñido con un rango de 20-120 kDa. Posteriormente fueron
electrotransferidas a membranas de nitrocelulosa por un mínimo de 2 horas a 400
mili-amperes.
Las membranas ya transferidas fueron bloqueadas durante una hora e
incubadas con los anticuerpos de interés diluidos según las indicaciones del
fabricante en solución de bloqueo. Posteriormente las membranas fueron
incubadas con los correspondientes anticuerpos anti-IgG marcados con
peroxidasa y visualizados mediante quimioluminiscencia.
3.2.10 TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS N2a CON FUGENE6
Las células N2a fueron cultivadas en placas de 35mm2 en medio DMEM
10% libre de antibiótico hasta conseguir entre 100000- 300000 células por placa
35
(50-80% de confluencia). Posteriormente, las células fueron transfectadas 1,5µg
del plasmidio pGL3-NF-κB, proporcionado por el Dr. Rafael Burgos del Instituto de
Farmacología de la Universidad Austral de Chile (Hidalgo et al., 2005), y 0,5 µg de
plasmidio control pRL-TK, en reactivo Fugene6 por 24 horas, de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Los estudios fueron realizados 24 horas después de
realizada la transfección.
3.2.11. ENSAYO DE LUCIFERASA
Una vez finalizada la transfección, las células N2a fueron incubadas con
distintas concentraciones de AP durante 24 horas. Posteriormente las células
fueron lisadas con un Buffer de lisis pasivo Promega, de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. Finalmente se determinó la actividad luciferasa en los
extractos celulares con el kit Dual-Luciferase Reporter Assay System en un
luminómetro. La actividad luciferasa será determinada como la razón de pGL3-NF-
κB/ pRL-TK.
36
4. RESULTADOS
Antecedentes previos sugieren un potencial rol neuroprotector de AP frente
a la degeneración celular ocurrida en la AD, al interferir con los procesos de
polimerización de fibras amiloides (Barrientos, 2007). Sin embargo, su efecto en la
viabilidad de células neuronales frente a otros estímulos de muerte característicos
de las enfermedades neurodegenerativas, como es el caso del estrés oxidativo,
aún no ha sido evaluado. En este sentido, se hace razonable estudiar el efecto de
distintas concentraciones de andrografólido en células de tipo neuronal sometidas
a estrés oxidativo por H2O2, para poder determinar si existe un efecto protector
directo en las células neuronales.
Para llevar a cabo este estudio se utilizaron dos modelos celulares, ambos
in vitro. El primero de estos modelos lo constituye la línea celular de
neuroblastoma de ratón (N2a), las cuales derivan de tumores presentes en el
sistema nervioso. El segundo modelo corresponde al cultivo primario de neuronas
corticales de ratón, los cuales han sido obtenidos de embriones de ratón de 16-18
días de gestación. El empleo de la línea celular N2a es muy beneficioso como
apoyo de los resultados obtenidos en cultivo primario, debido principalmente a su
gran capacidad proliferativa y al alto grado de conservación de las características
propias de las neuronas, lo que permite representar de manera aproximada los
eventos ocurridos en las neuronas cuando son sometidos a estrés oxidativo
inducido por H2O2.
37
4.1. EFECTO DEL PERÓXIDO DE HIDRÓGENO EN LA VIABILIDAD D E
CÉLULAS N2A Y NEURONAS CORTICALES:
En diversos estudios se ha establecido la relevancia del estrés oxidativo en
enfermedades neurodegenerativas como la AD y PD entre otras. Un potente
agente oxidante es el H2O2. En condiciones normales, el H2O2 es inactivado por el
glutatión (GSH) en una reacción catalizada por la enzima glutatión peroxidasa.
Pero cuando el sistema antioxidantes/ agentes oxidantes pierde su equilibrio, el
H2O2 puede transformarse en el radical OH·, desencadenándose así el estrés
oxidativo, la cual conlleva, entre otras cosas, a la oxidación del DNA y de
proteínas, peroxidación lipídica de la membrana y por ende muerte celular. Es por
eso que el uso de de H2O2 como agente inductor de muerte celular resulta una
muy buena opción para los ensayos realizados en esta investigación.
Para establecer las concentraciones del H2O2 que se utilizarán en las
células N2a y en cultivos primarios de neuronas, se realizaron ensayos de
viabilidad celular por reducción del MTT, el cual determina el grado de
funcionalidad metabólica de la célula. Este ensayo se basa en la reducción
metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT)
realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto
coloreado de color violeta (formazán). La cantidad de células vivas es proporcional
a la cantidad de formazán producido. Los cultivos fueron tratados con diferentes
concentraciones de H2O2, en un rango que comprende entre 100µM a 1mM por un
tiempo de 24hrs, determinando el porcentaje de muerte celular a través del ensayo
38
de reducción de MTT según lo descrito en materiales y métodos. Los resultados
presentados en las figura 4 y 5, indican que las neuronas corticales presentan una
sensibilidad mucho mayor frente al estrés producido por peróxido, reduciendo el
porcentaje de viabilidad celular a menos de 50% a partir de 200µM. A partir de
estos resultados se estableció como concentraciones de trabajo para los ensayos
posteriores 200µM, 300µM y 500µM de peróxido para inducir muerte celular por
estrés oxidativo, debido a que bajo estas concentraciones se puede obtener una
muerte celular significativa.
4.2. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO EN LA VIABILIDAD DE CÉLULAS DE
TIPO NEURONAL SOMETIDAS A ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR H2O2
Para determinar que efecto podría tener el AP frente al H2O2, los cultivos de
células N2a fueron preincubados con 50µM y 100µM de AP por 30 minutos, para
luego ser incubados con H2O2 por 24hrs como agente inductor de muerte celular.
Estas concentraciones de AP han sido utilizadas en investigaciones previas, en las
cuales 50µM parece tener el mejor efecto en la desagregación del péptido Aβ en
condiciones in vitro (Barrientos, 2007). Para la realización del ensayo se utilizaron
inicialmente concentraciones de 200µM, 300µM y 500µM de H2O2. Los resultados
obtenidos indican una disminución de la viabilidad en ambos tipos celulares,
dependiente de la concentración de H2O2 agregado (figuras 6 y 7). En la figura 6
se observa claramente una significativa disminución de la viabilidad cuando los
cultivos son incubados con las distintas concentraciones de H2O2 en presencia de
39
0 200 400 600 800 10000
20
40
60
80
100
[H2O2] µµµµM
% v
iabi
lidad
Figura 4: Efecto del peróxido sobre viabilidad de células de neuroblastoma
de ratón (N2a). Las células fueron tratadas con distintas concentraciones de
peróxido de hidrógeno por 24h y analizadas por medio del ensayo de reducción
del MTT.
40
0 200 400 600 800 10000
20
40
60
80
100
[H2O2] µµµµM
% v
iabi
lidad
Figura 5: Efecto de peróxido sobre viabilidad de ne uronas corticales de
cerebro de ratón. Las células fueron tratadas con distintas concentraciones de
peróxido de hidrógeno por 24h y analizadas por medio del ensayo de reducción
del MTT.
41
Figura 6: Efecto de andrografólido sobre la viabili dad en células N2a
sometidas a estrés oxidativo. Las células fueron pre-tratadas con distintas
concentraciones de AP por 30 minutos. Posteriormente fueron incubadas con
peróxido de hidrógeno por 24 horas y analizadas por medio del ensayo de
reducción del MTT. Las barras representan el promedio ± SD. * P< 0,05; ***
P<0,01 comparado con cada control. n=4.
0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 1000
20
40
60
80
100
- 200 300 500 [H2O2] µµµµM
[AP] µµµµM
******
***
** ******
******
% v
iabi
lidad
42
Figura 7: Efecto de andrografólido sobre la viabili dad en neuronas corticales
de ratón sometidas a estrés oxidativo . Las células fueron pre-tratadas con
distintas concentraciones de AP por 30 minutos. Posteriormente fueron incubadas
con peróxido de hidrógeno por 24 horas y analizadas por medio del ensayo de
reducción del MTT. Las barras representan el promedio ± SD. * P< 0,05; ***
P<0,01 comparado con cada control. n=4.
0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 1000
20
40
60
80
100
- 200 300 500 [H2O2] µµµµM
[AP] µµµµM
***
****** *** *** ***
*** ***
% v
iabi
lidad
43
AP, lo cual sugiere un efecto inductor de muerte entre el H2O2 y el AP. Sin
embargo, este efecto se aprecia también cuando las células son tratadas
exclusivamente con AP 50µM y 100µM. Como se puede apreciar, estas
concentraciones no poseen un efecto protector frente al estrés inducido por el
peróxido en ninguno de los tipos celulares con los que se trabajó. Además, el
tratamiento con AP también dio como resultado una disminución de la viabilidad,
en la cual la muerte celular fue incluso mayor que con el tratamiento con peróxido.
4.2.1. EFECTO DE BAJAS CONCENTRACIONES DE ANDROGRAF ÓLIDO
SOBRE LA VIABILIDAD DE CÉLULAS DE TIPO NEURONAL SOM ETIDAS A
ESTRÉS OXIDATIVO
Debido a que el uso de 50µM y 100µM de AP parece poseer un efecto
tóxico de tipo dosis dependiente, fue necesario evaluar si el tratamiento con
concentraciones menores de AP es capaz de ejercer un efecto neuroprotector sin
afectar por si mismo la viabilidad celular. En estudios previos se ha evaluado el
efecto de AP sobre cultivos mixtos de neuronas-glias sometidas a neurotoxicidad
inducida por LPS, exhibiendo una protección evidente frente a este agente al ser
utilizado a una concentración de 5µM (Wang, 2004). Estos datos sugieren que
bajas concentraciones de AP pueden ejercer efectos neuroprotectores sin afectar
por si mismo la integridad neuronal. Para determinar el efecto de concentraciones
menores de AP frente a los estímulos de muerte inducidos por H2O2 se realizaron
ensayos de viabilidad celular incubando las células N2a con 1µM, 5µM y 10µM de
44
Figura 8: Efecto de bajas concentraciones de androg rafólido sobre la
viabilidad de las células N2a sometidas a estrés ox idativo. Las células fueron
pre-tratadas con distintas concentraciones de AP por 30 minutos. Posteriormente
fueron sometidas a tratamiento con peróxido de hidrógeno por 24 horas y
analizadas por medio del ensayo de reducción del MTT. Las barras representan el
promedio ± SD. comparado con el control sometido a peroxido. n=4.
- - 1 5 100
20
40
60
80
100
- + + + + 500 µµµµM H2O2
[AP] µµµµM
% v
iabi
lidad
45
AP 30 minutos antes de ser estimulados con 500µM de H2O2 por 24hrs. Como
indica la figura 8, estas concentraciones de AP no son capaces de disminuir
significativamente la muerte celular inducida por H2O2. Sin embargo, es
interesante destacar que, a diferencia del tratamiento con concentraciones de
50µM y 100µM de AP, no se produce un efecto tóxico mayor al producido por el
peróxido.
Para tener una aproximación más cercana a lo que ocurriría a nivel
cerebral, es necesario realizar los mismos ensayos en los cultivos primarios de
neuronas corticales. En cultivos neuronales se aprecia el mismo efecto que el
producido en las células N2a (figura 9). El pre-tratamiento con 1µM, 5µM y 10µM
no parece indicar un aumento o descenso significativo respecto a las células
tratadas exclusivamente con peróxido. Estos datos indican que a pesar de no
ejercer una protección directa frente al daño producido por el H2O2, no existe una
disminución mayor de la viabilidad cuando las células son pre-tratadas con estas
concentraciones de AP antes de ser estimuladas con H2O2.
4.3. EFECTO DIRECTO DE ANDROGRAFOLIDO EN LA VIABILI DAD DE
CÉLULAS DE TIPO NEURONAL
Debido a que no existen estudios concluyentes sobre el efecto de AP en
células neuronales y a los resultados previos obtenidos en esta investigación,
resulta necesario evaluar el efecto directo de AP sobre los cultivos celulares de
46
Figura 9: Efecto de bajas concentraciones de androg rafólido sobre la
viabilidad de neuronas corticales de ratón sometida s a estrés oxidativo. Las
células fueron pre-tratadas con distintas concentraciones de AP por 30 minutos.
Posteriormente fueron sometidas a tratamiento con peróxido de hidrógeno por 24
horas y analizadas por medio del ensayo de reducción del MTT. Las barras
representan el promedio ± SD, comparado con el control sometido a peroxido.
n=4.
- - 1 5 100
20
40
60
80
100
- + + + + 500µµµµM H2O2
[AP] µµµµM
% v
iabi
lidad
47
tipo neuronal. Si bien se aprecia en los tratamientos con 50µM y 100µM de AP una
disminución significativa en el porcentaje de viabilidad celular respecto al control
(figuras 4 y 5), esto no resulta evidente en el tratamiento con bajas
concentraciones de AP (figuras 8 y 9). Para evaluar el efecto directo de AP sobre
los cultivos de tipo neuronal, éstos fueron tratados exclusivamente con las
concentraciones de AP anteriormente utilizadas, es decir 1µM, 5µM, 10µM 50uM y
100µM, por 24hrs para luego determinar el porcentaje de viabilidad a través de
ensayos de MTT. Se pudo observar que concentraciones de 1µM, 5µM y 10µM no
ejercen un efecto inductor de muerte en los cultivos celulares, tanto en células N2a
(figura 10), como en cultivo primario de neuronas corticales (figura 11). El
tratamiento con altas concentraciones de AP en cambio disminuye de manera
significativa el porcentaje de viabilidad en ambos modelos celulares (figuras 10 y
11), siendo la muerte celular más marcada con 100µM de AP. Es interesante
destacar que el efecto inductor de muerte celular fue mucho mayor en neuronas,
indicando una mayor sensibilidad al fármaco por parte de estas células.
4.4. EVALUACIÓN DEL MECANISMO DE MUERTE CELULAR IND UCIDA POR
ANDROGRAFOLIDO EN CÉLULAS DE TIPO NEURONAL
Los resultados previos han establecido que altas concentraciones de AP
son capaces de inducir muerte celular en los modelos de cultivos celulares de tipo
neuronal. Este efecto resulta ser mucho mayor en los cultivos primarios de
neuronas corticales que en la línea celular N2a. Debido a esto resulta necesario
48
Figura 10: Efecto de distintas concentraciones de andrografóli do sobre la
viabilidad de las células N2a. Las células fueron tratadas con distintas
concentraciones de AP por 24 horas y analizadas por medio del ensayo de
reducción del MTT. Las barras representan el promedio ± SD. * P< 0,05; ***
P<0,01 comparado con el control. n=4.
- 1 5 10 50 1000
20
40
60
80
100
[AP] µµµµM
*
***
% v
iabi
lidad
49
Figura 11: Efecto de distintas concentraciones de andrografóli do sobre la
viabilidad de las neuronas sometidas a estrés oxida tivo. Las células fueron
pre-tratadas con distintas concentraciones de AP por 30 minutos. Posteriormente
fueron sometidas a tratamiento con peróxido por 24 horas y analizadas por medio
del ensayo de reducción del MTT. Las barras representan el promedio ± SD. * P<
0,05; *** P<0,01 comparado con el control. n=4.
- 1 5 10 50 1000
50
100
[AP] µµµµM
**
***
% v
iabi
lidad
50
evaluar el tipo de muerte que sufren las neuronas. Hay que recordar que existen
dos tipos de muerte a las que pueden verse enfrentadas las células: la necrosis y
la muerte por apoptosis, siendo la primera causada directamente por el estímulo
de muerte, mientras que la segunda es causada por una cascada de eventos
inducida por el estímulo de muerte (Martin, 2001).
Para determinar el mecanismo de muerte inducido por altas
concentraciones de AP, las células fueron tratadas con 50µM de AP en intervalos
de tiempo de 1hora, 3 horas y 6 horas. Posteriormente las células fueron fijadas
con paraformaldehido 4% para poder realizar ensayos de inmunocitoquímica
contra caspasa-3 activa, según se establece en materiales y métodos. Los análisis
de inmunofluorescencia indican la presencia de caspasa-3 activa a las 6 horas de
haber sido estimuladas las células N2a (figura 12). Estos resultados han sido
confirmados a través de la técnica de TUNEL, la cual permite identificar la
presencia de fragmentación de DNA en el núcleo de las células. Para ello las
células fueron tratadas con AP 50µM en tiempos de 3 horas, 6 horas y 24 horas.
En la figura 13 se puede apreciar una señal positiva en células N2a a partir de las
6 horas, la cual se ve aumentada a las 24 horas, indicando claramente una
inducción de muerte en este modelo celular, el cual sería mediado principalmente
por apoptosis. En neuronas se aprecia un efecto similar en la activación de
caspasa-3, sin embargo este efecto puede apreciarse con claridad a partir de las 3
horas (figura 14), indicando una mayor sensibilidad al fármaco en este modelo
celular. Ensayos de fragmentación de DNA en neuronas apoyan este resultado
(figura 15).
51
Figura 12: Determinación de caspasa-3 activa en cél ulas N2a incubadas con
AP. Las células fueron tratadas con 50µM de AP durante 6 horas. Posteriormente
se evaluó la activación de caspasa 3 inducida por AP por inmunofluorescencia
utilizando anticuerpo anti-caspasa 3 activa. En verde, caspasa-3 activa. En rojo,
núcleos teñidos con ioduro de propidio. La barra de magnificación corresponde a
10µm.
caspasa-3 superposición superposición
IP
IP
caspasa-3 caspasa-3
caspasa-3
superposición superposición
IP
IP
3 horas 6 horas
Control 1 hora
52
Figura 13: Estudio de la muerte celular inducida po r AP en células N2a. Las
células fueron tratadas con AP 50µM durante 24 horas. La inducción de apoptosis
se evaluó por ensayos de fragmentación del DNA celular (TUNEL). En verde,
TUNEL positivo. En rojo, núcleos teñidos con ioduro de propidio. La barra de
magnificación corresponde a 20µm.
TUNEL superposición
IP
TUNEL superposición
IP
TUNEL superposición
IP
TUNEL superposición
IP
Control 3 horas
6 horas 24 horas
53
Figura 14: Determinación de caspasa-3 activa en neu ronas corticales
incubadas con AP. Las células fueron tratadas con 50µM de AP durante 6 horas.
Posteriormente se evaluó la activación de caspasa 3 inducida por AP por
inmunofluorescencia utilizando anticuerpo anti-caspasa 3 activa. En verde,
Caspasa-3 activa. En rojo, núcleos teñidos con ioduro de propidio. La barra de
magnificación corresponde a 20µm.
Caspasa-3 superposición superposición
IP
IP
Caspasa-3 Caspasa-3
Caspasa-3
superposición superposición
IP
IP
control 1 hora
3 horas 6 horas
54
Figura 15: Estudio de la muerte celular inducida po r AP en neuronas
corticales de ratón. Las células fueron tratadas con AP 50µM durante 24 horas.
La inducción de apoptosis se evaluó por ensayos de fragmentación del DNA
celular (TUNEL). En verde, TUNEL positivo. En rojo, núcleos teñidos con ioduro de
propidio. La barra de magnificación corresponde a 10µm.
TUNEL
IP IP
TUNEL TUNEL
IP
Control 3 horas
6 horas 24 horas
TUNEL
superposición
superposición superposición
superposición
IP
55
Posteriormente se evaluó el efecto de altas y bajas concentraciones de AP
en la activación de caspasa-3 activa. Para llevar a cabo este objetivo, las células
fueron tratadas con 1µM, 5µM, 10µM, 50µM y 100µM de AP. Los resultados
mostrados en la figura 16 indican una señal positiva de caspasa-3 en las células
N2a cuando son tratadas con altas concentraciones de AP (50µM y 100µM). Este
mismo efecto puede verse en los cultivos primarios de neuronas tratados con
estas concentraciones del fármaco (figura 17). Sin embargo, este efecto no se
aprecia de forma evidente en los cultivos de ambos tipos celulares tratados con
bajas concentraciones de AP. Los resultados obtenidos en las
inmunoflurescencias se confirman a través de los ensayos de Western blot, tanto
en la línea celular N2a como en neuronas corticales, en los cuales las proteínas
totales obtenidas luego de los estímulos con distintas concentraciones de AP
fueron separadas electroforéticamente en condiciones desnaturantes e incubadas
con anticuerpos contra caspasa-3 activa (figuras 18 y 19). Estos datos se
correlacionan además con los obtenidos en los ensayos de viabilidad (figuras 10 y
11), los cuales sugieren que altas concentraciones de AP poseen efecto citotóxico
en estos modelos celulares.
56
Figura 16: Determinación de caspasa-3 activa en cél ulas N2a sometidas a
distintas concentraciones de AP. Las células fueron tratadas con diferentes
concentraciones de AP durante 6 horas. Posteriormente se evaluó la activación de
caspasa 3 inducida por AP por inmunofluorescencia utilizando anticuerpo anti-
caspasa 3 activa. En verde, Caspasa-3 activa. En rojo, núcleos teñidos con ioduro
de propidio. La barra de magnificación corresponde a 20µm.
caspasa-3
IP
superposición
IP IP
caspasa-3 superposición
IP
caspasa-3 superposición superposición
caspasa-3 caspasa-3
caspasa-3
Control 10µM AP
1µM AP 50µM AP
5µM AP 100µM AP
superposición
superposición
IP
IP
57
Figura 17: Determinación de caspasa-3 activa en neu ronas corticales
sometidas a distintas concentraciones de AP. Las células fueron tratadas con
diferentes concentraciones de AP durante 6 horas. Posteriormente se evaluó la
activación de caspasa-3 inducida por AP por inmunofluorescencia utilizando
anticuerpo anti-caspasa-3 activa. En verde, caspasa-3 activa. En rojo, núcleos
teñidos con ioduro de propidio. La barra de magnificación corresponde a 10µm.
IP
IP
Caspasa-3 superposición
IP
Caspasa-3
Caspasa-3 Caspasa-3
Caspasa-3
Caspasa-3 superposición superposición
superposición superposición
superposición
IP
IP
IP
1µM AP 50µM AP
5µM AP 100µM AP
Control 10µM AP
58
c 1 5 10 50 100 staur.0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
AP (µµµµM)
Cas
pasa
-3/T
otal
Figura 18: Determinación de caspasa-3 activa inducida por AP e n células
N2a. Las células fueron tratadas con distintas concentraciones de AP 50µM por 6
horas y posteriormente se analizó la activación de caspasa-3 activa a través del
análisis de westernblot. B) Análisis densitométrico. Las abreviaturas c y staur,
corresponden al controles negativos y positivo (estaurosporina) respectivamente.
C 1 5 10 50 100 Staur.
Caspasa -3 activa
Total
AP (µM) A)
B)
59
c 1 5 10 50 100 staur.0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
AP (µµµµM)
Cas
pasa
-3/T
otal
Figura 19: Determinación de Caspasa-3 activa inducido por andr ografolido
en neuronas corticales. Las neuronas fueron tratadas con distintas
concentraciones de AP 50µM por 6 horas y posteriormente se analizó la activación
de caspasa-3 activa a través de western blot. B) Análisis densitométrico. Las
abreviaturas c y staur, corresponden al controles negativos y positivo
(estaurosporina) respectivamente.
C 1 5 10 50 100 Staur.
Caspasa -3 activa
Total
AP (µM)
A)
B)
60
4.5. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LA VIABILIDAD D E NEURONAS
Y ASTROCITOS
Escasos son los estudios sobre el efecto de AP en modelos celulares de
tipo neuronal. Sin embargo un estudio reporta que AP es capaz de reducir la
neurodegeneración dopaminérgica inducida por LPS en cultivos mixtos de glías y
neuronas (Wang, 2003). Estos datos nos sugieren la necesidad de evaluar el
efecto de AP en la viabilidad de cultivos mixtos de neuronas y astrocitos, con el fin
de determinar si la presencia y/o los factores liberados por estas células son
capaces de inducir protección en las neuronas corticales frente al tratamiento con
AP, tanto en condiciones de estrés oxidativo inducido por H2O2, como en
condiciones normales.
4.5.1. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LA VIABILIDAD DE
ASTROCITOS
Como primer paso, se procedió a evaluar el efecto de AP en cultivos
primarios de astrocitos, con el fin de determinar si AP posee un efecto citotóxico
en este tipo celular. Para ello, las células fueron tratadas con concentraciones AP
de 1µM, 5µM, 10µM, 50µM y 100µM durante 24 horas, para determinar
posteriormente el porcentaje de muerte celular a través del ensayo de reducción
de MTT. Los resultados obtenidos muestran una mayor resistencia de los
astrocitos contra las concentraciones altas de AP (figura 20 A), apreciándose una
mayor disminución en el porcentaje de viabilidad al ser tratadas con 100µM. Sin
61
embargo, este efecto citotóxico no alcanza a ser significativo en este tipo celular.
También se puede apreciar una ligera disminución de la viabilidad producida por el
vehículo utilizado para disolver el AP, sin embargo este efecto no es significativo
en la viabilidad celular.
Posteriormente se evaluó el efecto de AP en los cultivos primarios de
astrocitos sometidos a estrés oxidativo inducido por H2O2. En este caso, las
células fueron preincubadas 30 minutos antes con 1µM, 5µM, 10µM, 50µM y
100µM de AP, seguido de una incubación durante 24 horas con 500µM de H2O2
determinando el porcentaje de viabilidad celular a través de ensayos de reducción
del MTT. Los resultados mostrados en la figura 20 B, indican que ninguno de los
dos estímulos posee un efecto significativo en la viabilidad celular.
4.5.2. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LA VIABILIDAD DE
CULTIVOS MIXTOS DE NEURONAS Y ASTROCITOS
El siguiente paso consistió en evaluar el efecto de AP en cultivos mixtos de
astrocitos y neuronas con el fin de determinar si la presencia de los astrocitos es
capaz de inducir un efecto protector en las neuronas frente a la citotoxicidad
inducida por altas concentraciones de AP. Para llevar a cabo este ensayo se
realizó un cultivo primario a partir de cerebros de embriones de ratón, en el cual
las células corticales obtenidas fueron incubadas con DMEM F-12 como se
describe en materiales y métodos, logrando obtener al cabo de 4 días una mayor
62
Figura 20: Efecto de andrografólido sobre la viabilidad de ast rocitos. Las
células fueron tratadas con distintas concentraciones de H2O2 y/o AP por 24 horas
y analizadas por medio del ensayo de reducción del MTT. Las barras representan
el promedio ± SD. n=4. A) Astrocitos tratados con AP. B) Astrocitos preincubados
con AP por 30min y luego con H2O2 por 24horas.
- - - 1 5 10 50 1000
50
100
AP (µµµµM)
- + - + + + + + DMSO 1%- - + + + + + + H2O2 (500µµµµM)
% v
iabi
lidad
B)
- - 1 5 10 50 1000
50
100
AP (µµµµM)
- + + + + + + DMSO 1%
% v
iabi
lidad
A)
63
cantidad de astrocitos con respecto a neuronas en el cultivo. A continuación los
cultivos fueron incubados con 1, 5 10, 50 y 100µM de AP, determinando el
porcentaje de viabilidad celular por medio del ensayo de reducción del MTT. A
pesar de que se aprecia una ligera una disminución del porcentaje de viabilidad en
los cultivos tratados con altas concentraciones de AP (figura 21), este efecto no es
significativo, a diferencia de las neuronas incubadas con AP en cultivos puros,
Indicando que la presencia de los astrocitos ejerce protección en las neuronas
frente a la citotoxicidad del fármaco en altas concentraciones.
4.5.3. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LA VIABILIDAD DE
NEURONAS INCUBADAS CON MEDIO CONDICIONADO DE ASTROC ITOS
Los resultados mencionados anteriormente indican una protección frente al
efecto citotóxico de AP en cultivos mixtos de neuronas y astrocitos. Sin embargo,
estos resultados no permiten establecer el mecanismo involucrado en la
protección. Por lo tanto, resulta necesario determinar si los astrocitos son capaces
de generar una protección indirecta en las neuronas cuando éstas últimas son
incubadas en presencia de AP, H2O2 o ambos estímulos. En este caso se extrajo
el medio desde un cultivo de astrocitos incubado durante 3 días. Este medio fue
añadido a un cultivo de neuronas corticales durante 24horas y posteriormente se
incubaron con distintas concentraciones de AP, H2O2 y ambos. Por último se
analizó la viabilidad celular a través de ensayos de MTT. Se puede observar a
partir de los resultados obtenidos una disminución del efecto citotóxico de AP en
64
C 1 5 10 50 1000
50
100
[AP] µµµµM
% v
iabi
lidad
- - 1 5 10 50 1000
50
100
[AP] µµµµM
H2O2 200µµµµM
% v
iabi
lidad
Figura 21: Efecto de distintas concentraciones de andrografoli do sobre la
viabilidad de cultivos mixtos de neuronas y astroci tos. Las células fueron
tratadas con distintas concentraciones de AP (1µL) por 24 horas y analizadas por
medio del ensayo de reducción del MTT. Las barras representan el promedio ±
SD. n=4. A) cultivo mixto tratado con distintas concentraciones de AP. B) Cultivo
mixto preincubado con AP por 30 minutos e incubados con H2O2.
A)
B)
65
- - - 1 5 10 50 1000
50
100
[AP] µµµµM- - + + + + + + M. Cond.- + - - - - - - M. Nuevo
****
% v
iabi
lidad
- - - - - 1 5 10 50 1000
50
100
[AP] µµµµM- - + - + + + + + + H2O2 200µµµµM
- - - + + + + + + + M.Cond.- + + - - - - - - - M.Nuevo
* ***
% v
iabi
lidad
A)
B)
66
Figura 22: Efecto de distintas concentraciones de andrografoli do sobre la
viabilidad de neuronas corticales acondicionadas co n medio de astrocitos.
Las células fueron preincubadas con medio de astrocitos y posteriormente
tratadas con distintas concentraciones de AP, H2O2 o ambas por 24 horas y
analizadas por medio del ensayo de reducción del MTT. Las barras representan el
promedio ± SD. * P< 0,05; *** P<0,01 comparado con el control incubado con
medio neurobasal. n=4. A) Neuronas condicionadas tratadas con distintas
concentraciones de AP. B) Neuronas preincubadas con AP por 30 minutos e
incubadas con 200µM de H2O2. Las siglas M. Cond. Y M. Nuevo corresponden a
Medio condicionado por astrocitos y Medio nuevo sin condicionar,
respectivamente.
67
los cultivos neuronales, que sin embargo continúa siendo significativo. Estos
resultados indican que el medio condicionado de los astrocitos no es capaz de
inducir una efectiva protección en las neuronas frente a la citotoxicidad de AP
cuando éste es aplicado a concentraciones de 50µM y 100µM (figura 22a). Al
comparar los porcentajes de viabilidad entre el ensayo realizado con cultivo mixto
y el ensayo con medio condicionado vemos que el primero alcanza un 88% y 87%
de supervivencia cuando son incubados con AP 50µM y 100µM, respectivamente,
mientras que en cultivo de neuronas con medio condicionado sólo logran un 73% y
66%. Un efecto similar se aprecia cuando las células son tratadas con AP y
peróxido en presencia del medio condicionado (figura 22b), indicando que la
presencia de factores liberados por los astrocitos no son capaces de evitar del
todo la citotoxicidad inducida por altas concentraciones de AP, ni tampoco inducir
neuroprotección frente a estrés oxidativo en presencia del fármaco.
4.6. EFECTO DE ANDROGRAFOLIDO SOBRE LA ACTIVACIÓN D E NF-kB EN
CÉLULAS DE NEUROBLASTOMA
Para finalizar, se decidió analizar el efecto que posee AP en altas
concentraciones sobre la activación de NF-kB en células de tipo neuronal. Se ha
descrito que AP actúa como un potente inhibidor de la activación de NF-kB, tanto
en neutrófilos como en células dendríticas (Carreta, 2008). Para lograr determinar
el efecto de AP sobre la actividad de NF-kB en células neuronales, se realizaron
ensayos de actividad luciferasa utilizando el vector reportero NF-kB luciferasa y el
vector renilla como normalizador de transfección. Este ensayo permite determinar
68
- - - 5 50 1000
50
100
150
***
***
***
- + - - - - TNF-αααα 10nM- - + - - - H2O2 200µµµµM
[AP] µµµµM
pGL3
-NF
- κκ κκB
/ pR
L-T
K
Figura 23: Efecto de andrografólido sobre la activi dad luciferasa de NF-kB en
células N2a. Las células fueron transfectadas con un vector reportero regulado
por NF-kB. Posteriormente fueron estimuladas con distintas concentraciones de
AP, 200µM de H2O2 y TNF-α 10nM como control positivo. La actividad luciferasa
fue medida en un luminómetro y expresada como la razón de pGL3-NF-κB/ pRL-
TK. Las barras representan el promedio ± SD. *** P<0,01 comparado con el
control.
69
c 10 30 60 90
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
tiempo (min.)
IkB
- αα αα/T
otal
Figura 24: Efecto de andrografólido sobre la niveles de IkB- α. A). Las células
fueron tratadas con AP 50uM por distintos tiempos y analizadas por medio de
Western Blot utilizando anticuerpos contra IkB-α. B) Análisis densitométrico.
C 10 30 60 90 Tiempo (min)
IKB-α
Total
70
la cantidad de luminiscencia emitida por luciferasa que es expresada por los
plasmidios transfectados que poseen el vector reportero NF-KB luciferasa, como
se describe en materiales y métodos. En este caso, células N2a fueron co-
transfectadas con ambos vectores. Posteriormente las células fueron incubadas
con 50µM de AP, 200µM de H2O2 y TNF-α como control positivo. Los resultados
obtenidos indican un aumento significativo de la actividad de NF-kB a
concentraciones de 50µM y 100µM, mientras que el tratamiento con AP 5µM no
induce cambios en la actividad luciferasa (figura 23). Estos datos se correlacionan
con ensayos de Western Blot en los cuales se utilizaron anticuerpos contra IkB, en
el cual se aprecia una disminución a tiempos cortos (figura 24) cuando las células
son incubadas con AP 50µM, lo cual indica que el inhibidor de NF-kB se está
degradando permitiendo así la translocación del factor al núcleo. Estos resultados
indicarían un efecto inductor de la actividad de NF-kB en éste tipo celular.
71
5. DISCUSIÓN
Las enfermedades neurodegenerativas constituyen en la actualidad uno de
los campos de estudio e investigación de mayor interés en la farmacología. Sin
embargo, los diversos intentos por desarrollar tratamientos efectivos capaces de
detener la progresión de estas patologías no han sido del todo exitosos, debido
principalmente a que solo han logrado retrasar el desarrollo de las mismas en la
mayoría de los casos, en particular aquellos involucrados en el control de la
Enfermedad de Alzheimer. Es por este hecho que el desarrollo de nuevos
fármacos capaces de prevenir la degeneración neuronal se ha vuelto de vital
importancia.
Andrografolido (AP), un diperteno lactona que constituye el principal agente
fitoactivo de la planta medicinal de orígen asiático Andrographis paniculata, ha
adquirido un gran interés debido a su amplio potencial farmacológico. Se le han
atribuido propiedades antiinflamatorias, inmunoestimulatorias, hepatoprotectoras,
antidiarreícas, y ha sido utilizado en la prevención y tratamiento del resfrío común
(Kanokwan, 2008). Sin embargo, son pocos los antecedentes encontrados
respecto a sus efectos a nivel del SNC, lo que abre una gran interrogante acerca
de sus aplicaciones en el tratamiento de enfermedades que afectan al SNC,
especialmente las enfermedades neurodegenerativas. En este trabajo se evaluó el
efecto de AP en cultivos celulares de tipo neuronal frente a la muerte celular
inducida por peróxido, el cual se ha reportado que participa en las enfermedades
neurodegenerativas (Markesbery, 1997; Zhang, 1997). Investigaciones anteriores
72
han descrito el efecto protector de AP frente al estrés oxidativo en otros tipos
celulares. Se ha demostrado que AP es capaz de prevenir la producción de EROS
inducido por fMLP (Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine) en neutrófilos aislados
de rata (Shen, 2002). Sin embargo, el efecto de AP en modelos celulares de tipo
neuronal resulta ser diferente. Los resultados obtenidos en este trabajo revelan
que AP es incapaz de ejercer una protección directa frente a este tipo de daño
celular, tanto en cultivos de líneas celulares de tipo neuronal, correspondiente a la
línea de neuroblastoma de ratón (N2a), así como en cultivos puros de neuronas
corticales de ratón (figuras 6 y 7). Se sabe que el H2O2 es tóxico para muchos
tipos celulares debido a su capacidad de atravesar la barrera plasmática
(Desagher, 1996), y las neuronas son particularmente susceptibles a este agente
oxidante al poseer niveles bajos de glutatión, un importante antioxidante natural, al
alto consumo de oxígeno necesario para el metabolismo en el cerebro y a la alta
proporción de ácidos grasos en su membrana celular (Christen, 2000). Estudios de
la caracterización de la toxicidad del H2O2 en neuronas obtenidas de proencéfalo
de ratón, han revelado que las neuronas tratadas con este agente oxidante
muestran una morfología nuclear apoptótica, reducción de glutatión, liberación de
Ca+2 y cambios en el potencial de membrana (Hoyt, 1997). Los datos sugieren
que AP no es capaz de ejercer efecto neuroprotector por medio de una vía
antioxidante en células neuronales sometidas a estrés oxidativo. Esto puede
deberse al hecho de que las neuronas son células altamente especializadas,
cuyos bajos niveles de antioxidantes endógenos no le permiten desarrollar un
sistema de protección propio lo suficientemente eficiente para ser estimuladas de
manera positiva por AP. Sin embargo, para poder entender las razones por las
73
que AP no es capaz de ejercer neuroprotección frente a la citotoxicidad del H2O2,
es necesario realizar estudios de las vías de señalización involucradas en daño
por estrés oxidativo inducido por H2O2 en este tipo celular cuando son pretratadas
con AP.
La razón por la cual se consideró utilizar altas concentraciones de AP en
este estudio radica principalmente en el hecho de que es un potencial agente
inhibidor de la agregación del péptido Aβ. Investigaciones previas realizadas sobre
el efecto de AP en la agregación y desagregación del péptido Aβ en condiciones in
vitro (Barrientos, 2007), señalan que éste interfiere con los procesos de
agregación, previniendo la formación de fibras amiloides al interactuar
directamente con el péptido Aβ. Ensayos de fluorimetría con Tioflavina T, un
compuesto que se une a las fibras amiloides de manera específica y cuya
fluorescencia es proporcional a la agregación del péptido amiloide indican que el
uso de AP a concentraciones de 10µM y 50µM en agregados del péptido induce
una disminución de la agregación, la cual es mucho más significativa y rápida con
50µM. Sin embargo, los resultados obtenidos en esta investigación demuestran
que el uso de concentraciones elevadas en los cultivos neuronales poseen un
efecto negativo en estos tipos celulares.
Los resultados obtenidos demostraron que AP no posee un efecto protector
frente al estrés oxidativo inducido por peróxido en modelos de células de tipo
neuronal; independiente de las concentraciones utilizadas. Sin embargo, estos
mismos revelan un efecto inesperado de AP en ambos modelos celulares con los
74
cuales se trabajó. Los ensayos de viabilidad realizados en el transcurso de la
investigación revelan un efecto negativo de AP en este tipo de células cuando es
aplicado en altas concentraciones. El tratamiento con AP 50µM y 100µM por 24hrs
generó una disminución significativa en el porcentaje de viabilidad de las células
N2a con respecto al control en los ensayos de reducción del MTT, la cual se
redujo aun más cuando se estimularon con una concentración de 100µM (Figuras
6 y 10). Este efecto puede ser explicado por la naturaleza tumoral de esta línea
celular. En estudios anteriores se ha descrito que diversos antinflamatorios no
esteroidales (AINES) son capaces de inhibir la proliferación e inducir apoptosis en
células cancerígenas (Khwaja, 2004). A modo de ejemplo, observaciones in vitro
sugieren que el AINES ibuprofeno es capaz de reducir viabilidad de cultivos de
células cancerígenas de próstata humana a través de la regulación positiva del
supresor tumoral p75NTR (Khwaja, 2004). Se ha reportado también un efecto
antitumoral por parte de AP en distintos tipos celulares cancerígenos. Se ha
descrito que es capaz de inhibir la adhesión de células de cáncer gástrico a las
células endoteliales (Jiang, 2007). Otras investigaciones han ratificado este efecto,
indicando una inducción de la muerte de las células tumorales mediado por
apoptosis a través de la regulación positiva de bax, proteína de carácter pro-
apoptótico, y una regulación negativa de bcl-2, implicada en el bloqueo de la
muerte celular (Zhao, 2008). Sin embargo, estos antecedentes no son capaces de
explicar el efecto observado en los cultivos primarios de neuronas corticales. Al
ser estimuladas con AP 50µM y 100µM por 24hrs, se aprecia una marcada
disminución de la viabilidad celular en los cultivos primarios, mayor a la observada
en la línea celular N2a al ser comparados con su respectivos controles, lo que
75
indicaría una mayor sensibilidad frente al efecto tóxico de AP a esas
concentraciones en los cultivos puros de células de tipo neuronal.
Además de que AP no es capaz de ejercer neuroprotección frente al estrés
oxidativo inducido por H2O2, posee además un efecto citotóxico al ser utilizado en
altas concentraciones en los cultivos primarios de neuronas corticales. Esto podría
deberse al hecho de que se encuentran en estado puro, libre de células glíales.
Los astrocitos o astroglías, pertenecientes al subtipo glial más abundante en el
sistema nervioso central, presentan una sensibilidad a la citotoxicidad inducida por
H2O2 mucho más atenuada con respecto a las neuronas debido a la mayor
concentración de enzimas antioxidantes presentes en ellas. Se sabe además que
las neuronas dependen en gran medida de los astrocitos para protegerse del
estrés oxidativo inducido por H2O2 mediante dos mecanismos: El primero estaría
relacionado con la capacidad de estos, de captar compuestos citotóxicos presente
en el medio extracelular, o bien mediante la liberación de factores
neuroprotectores. (Desagher, 1996). Se ha descrito que en cultivos mixtos de glías
y neuronas del mesencéfalo, AP disminuye la neurodegeneración dopaminérgica
inducida por LPS (Wang, 2003). Por esta razón se evaluó el efecto de
concentraciones bajas y altas de AP utilizadas en los ensayos anteriores en
distintas condiciones, tanto en cultivo primario de astrocitos, cultivo mixto de
astrocitos y neuronas, y cultivo primario de neuronas condicionadas con medio de
astrocitos, con el fin de determinar si la presencia de los astrocitos, o participación
indirecta de éstos es capaz de influenciar la sensibilidad de las neuronas al
fármaco. Los resultados obtenidos indican una menor sensibilidad al fármaco por
76
parte de los astrocitos. Sin embargo, una concentración de 100µM de AP
igualmente reduce el porcentaje de viabilidad celular, aunque esta disminución no
es estadísticamente significativa. Cuando el cultivo es incubado además con H2O2
500µM tampoco se aprecian cambios significativos en el porcentaje de viabilidad
celular. Sin embargo, a pesar de que los cultivos no sufren un aumento sinérgico
de la muerte celular, este efecto puede deberse al mecanismo de defensa
antioxidante innato de los astrocitos frente al estrés oxidativo. Un efecto similar se
observa en cultivos mixtos de neuronas y astrocitos. Los cultivos presentan una
disminución de la viabilidad cuando son tratadas con altas concentraciones de AP,
tanto en 50µM como en 100µM. Sin embargo, este efecto es más atenuado con
respecto a los cultivos neuronales puros, por lo que la disminución no es
significativa. No ocurre lo mismo al tratar los cultivos con AP y H2O2, ya que en
este caso no se aprecia una disminución de la viabilidad como sucede al ser
tratadas sólo con AP, lo cual se debería a una mayor densidad de células
astrocíticas en éste ensayo con respecto a los otros al momento de realizar los
cultivos. Estos resultados confirmarían la hipótesis planteada de que la presencia
de astrocitos protege a las neuronas del efecto citotóxico ejercido por altas
concentraciones de AP. Sin embargo no queda del todo claro de que forma los
astrocitos ejercen dicha protección, por tanto se determinó analizar el efecto del
medio condicionado por astrocitos sobre las neuronas, esto en base a la posible
liberación de factores que inducen neuroprotección frente a compuestos
citotóxicos como H2O2, según lo descrito por Desagher. Cuando las neuronas
corticales fueron preincubadas con medio de astrocitos y luego tratadas con AP
50µM y 100µM se indujo una disminución de la viabilidad celular, menor que en
77
los ensayos de reducción de MTT mostrados en la figura 7, pero igualmente
significativo con respecto al control. Estos resultados indican que la liberación de
factores al medio extracelular corresponde sólo a una parte del mecanismo de
protección frente a AP ejercido por los astrocitos.
Como último paso se decidió evaluar el efecto de AP en la activación de
NF-kB, el cuál está implicado en varias vías de señalización en distintos modelos
celulares. NF-kB es un heterodímero compuesto por las subunidades p65 y p50 en
la mayoría de los casos. Este factor es activado por una gran variedad de
estímulos incluyendo citoquinas como TNF-alfa y oncoproteínas. En células no
estimuladas NF-kB se encuentra principalmente a nivel citoplasmático, asociado
con una familia de moléculas inhibitorias llamadas IkBs (Mathews, 1995). El
mecanismo de activación de NF-kB consiste en la fosforilación de IkB en dos
residuos de serinas a través de IKK, lo que conlleva a que IkB sea blanco de
ubiquitinacion y su posterior degradación a causa del proteosoma 26 S, el cual
permite que la forma libre de NF-kB pueda translocarse al núcleo y activar la
transcripción de diversos genes (Mathews, 1995). Entre las respuestas celulares
inducidas por la activación de NF-kB destacan la activación de células del sistema
inmune por medio de la inducción de citoquinas, la migración celular y reparación
de tejidos a través de la inducción de moléculas de adhesión, inflamación a través
de la inducción de proteínas de fase aguda, inhibición de la apoptosis y
tumorigénesis a través de la regulación de protooncogenes (Cop, 1995). A partir
de los resultados obtenidos se puede observar que al tratar las células de
neuroblastoma con AP 50 µM y 100 µM indujeron un aumento en la actividad del
78
factor, concentraciones que además inducen muerte por apoptosis en células de
tipo neuronal. Estos resultados parecen ser opuestos a los observados en otros
modelos celulares por acción de AP. Se ha descrito que, en células endoteliales
estimuladas, AP inhibe la activación de NF-kB a través de una modificación
covalente de la cisteína 62 reducida de p50, lo cual reduce además la expresión
de E-selectina, ejerciendo a su vez un efecto protector antiinflamatorio en este tipo
celular (Xia, 2004). Estudios realizados en el laboratorio del Instituto de
Farmacología de la Universidad Austral de Chile por la Dra. María Angélica
Hidalgo (Hidalgo, 2005), en los cuales células HL-60 diferenciadas a neutrófilos
fueron tratadas con PAF y fMLP, activadores de NF-kB, demostraron que el
tratamiento con AP 5 y 50µM inhiben la activación del factor. Muchas de las
investigaciones enfocadas en los efectos de la activación del factor se sustentan
además en el hecho de que NF-kB posee un rol antiapoptótico al inducir un
aumento en su actividad. Sin embargo, diversos estudios han revelado que, en
células neuronales, el rol de este factor es dependiente del estímulo. Un estudio
realizado en neuronas indica que la toxicidad inducida por glutamato en estas
células se encuentra acompañada por una inducción de NF-kB (Grilli, 1996). Se ha
descrito además que varias neurotoxinas, así como el estrés oxidativo estimulan la
actividad de NF-kB al regular de manera positiva la expresión de genes pro-
apoptóticos (Baichwal, 1997). Este efecto también se aprecia en investigaciones
con líneas celulares de tipo neuronal. El tratamiento con dopamina (0,1-0,5mM) en
células PC-12, el cual indujo su muerte por apoptosis, incrementó la fosforilación
del inhibidor de NF-kB (ikB-α). Además se observó por medio de inmunoblot, la
presencia de la proteína NF-kB-p65 en la fracción nuclear y la desaparición de la
79
misma en la fracción citosólica de las células apoptóticas (Panet, 2001). Nuestros
resultados sugieren que en células de tipo neuronal, altas concentraciones de AP
inducirían la activación de NF-kB, lo cual a su vez podría influenciar la expresión
de genes proapoptóticos que inducirían la muerte celular.
Si bien los antecedentes entregados en esta investigación no son muy
alentadores para la aplicación de AP como agente neuroprotector frente al daño
generado en las enfermedades neurodegenerativas, especialmente a la cito-
toxicidad causada por estrés oxidativo, su uso en bajas concentraciones no es
descartable para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, ya sea de forma
complementaria a los tratamientos usados en la actualidad o para su aplicación en
etapas iniciales de la enfermedad. Las investigaciones sobre agregación y
desagregación del Péptido Aβ demostraron que 10µM de AP es capaz de inducir
desagregación del péptido, aunque de forma gradual, siendo significativa al tercer
día de su aplicación (Barrientos, 2007). Considerando los antecedentes previos y
los obtenidos en este trabajo, esta concentración parece ser una alternativa
segura y factible para combatir la neurodegeneración inducida por la formación de
agregados de péptido Aβ, conservando la integridad de las neuronas frente a la
accción de AP. Además, es necesario tener en cuenta las concentraciones reales
en el plasma que alcanza el fármaco cuando es aplicado. Estudios
farmacocinéticos, en los cuales se cuantificaron las cantidades de AP en el plasma
de sangre de ratones y humanos voluntarios a los cuales se les administró el
fármaco de manera oral (Panossian, 2000) demostraron que una dosis terapéutica
de 20mg de AP alcanza niveles plasmáticos de aproximadamente 1,12µM
80
(393ng/ml). Esta misma investigación entrega importantes antecedentes
referentes al uso de altas dosis de AP como tratamiento de diversas
enfermedades. Los autores indican que el incremento de 10 veces en la dosis
(200mg/kg) no produce un aumento proporcional de la concentración de AP en la
sangre. Por esta razón resulta necesaria la investigación in vivo del efecto de
distintas concentraciones de andrografólido a nivel del SNC.
Como conclusión podemos mencionar que si bien la hipótesis planteada no
se cumple, descartando un efecto neuroprotector de andrografólido a través de
una vía antioxidante frente al daño generado por estrés oxidativo, su potencial
como fármaco neuroprotector capaz de interferir con la agregación e inducir la
desagregación del péptido Aβ en pacientes de AD no debe dejar de ser
considerado. El uso de AP en dosis correctas puede resultar beneficioso para el
tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la AD, sin
comprometer la integridad de las neuronas por un efecto citotóxico del fármaco.
81
6. BIBLIOGRAFÍA
Ames B., Shingenaga M. and Park E. M. Oxidation damage and repair: chemical,
biological and medical aspects (1991). Elmsford, United Kingdom: Pergamon
Press.
Baichwal V. and Baeuerle P. Apoptosis: Activate NF-kB or die? (1997). Curr Biol;
7(2): R94-6.
Banati R. B., Daniel S. E. and Blunt S. B. Glial pathology but absence of apoptotic
nigral neurons in long-standing Parkinson’s disease (1998). Mov Disord; 13: 221–
227.
Barnham K., Masters C. and Bush A. Neurodegenerative diseases and oxidative
stress (2004). Nat Rev. Drug Discovery; 3: 205-214.
Braak H., Braak E. and Strothjohann M. Abnormally phosphorylated tau protein
related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the
cerebral cortex of sheep and goat (1994). Neurosci Lett; 171: 1– 4.
Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein pye binding (1976). Anal.
Biochem; 72: 248-254.
82
Cáceres D. D., Hancke J.L., Burgos R. A. and Wikman G. K. Prevention of
common colds with Andrographis paniculata dried extract: A pilot double-blind
trial(1997). Phytomedicine; 4: 101–104.
Clive P. Page, Michael J. Curtis, Morley Sutter, Michael Walker, Brian Hoffman.
Farmacologia integrada (1998). Elsevier España.
Cotman C. W. and Pike C. J. Beta-amyloid and its contributions to
neurodegeneration in Alzheimer’s disease. In: Alzheimer’s disease. Terry R. D,
Katzman R., Bick K. L., eds. New York: Raven Press 1994: 305-15.
Christen Y. Oxidative stress and Alzheimer disease (2000). Am J Clin Nutr; 71(2):
621S-629S.
Deibel M. A., Ehmann W. D. and Markesbery W. R. Copper, iron, and zinc
imbalances in severely degenerated brain regions in Alzheimer’s disease: possible
relation to oxidative stress (1997). J Neurol Sci; 143: 137–42.
Deng W. L. Preliminary studies on the pharmacology of the Andrographis product
dihydroandrographolide sodium succinate (1978). Newsletter Chinese Herbal
Medicine; 8: 26–28.
Desagher S., Glowinski J. and Premont J. Astrocytes protect neurons from
hydrogen peroxide toxicity (1996). J. Neurosci; 16: 2553-2562
83
Antman E. M., Bennett J. S., Daugherty A., Furberg C., Roberts H and Taubert K.
A. Use of Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs: An Update for Clinicians (2007). A
Scientific Statement From the American Heart Association Circulation; 115: 1634-
1642.
Evers M. M., Purohit D., Perl D., Khan K., Martin D. B. Palliative and aggressive
end-of-life care for patients with dementia (2002). Psychiatr Serv; 53: 609-13.
Florez, J. Farmacología humana (1997). 3ª. Ed. Masson, SA. Barcelona. pp. 595-
596.
Gamblin T., Chen F., Zambrano A., Abraha A., Lagalwar S., Guillozet A., Lu M., Fu
Y., Garcia-Sierra F., LaPointe N., Miller R., Berry R. �, Binder L. and Cryns V.
Caspase cleavage of tau: Linking amyloid and neurofibrillary tangles in Alzheimer’s
disease (2003). Proc Natl Acad Sci USA; 100: 10032- 10037.
Gervais F. G., Xu D., Robertson G. S., Vaillancourt J.P., Zhu Y., Huang J., LeBlanc
A., Smith D., Rigby M., Shearman M. S., Clarke E. E., Zheng H., Van Der Ploeg L.
H., Ruffolo S. C., Thornberry N. A., Xanthoudakis S., Zamboni R. J., Roy S. and
Nicholson D. W. Involvement of caspases in proteolytic cleavage of Alzheimer’s
amyloid-β precursor protein and amyloidogenic A β peptide formation (1999). Cell;
97: 395–406.
84
Goetz C. G., Tanner C. M. and Glantz R. H. Chronic agonist therapy for
Parkinson’s disease: a 5-year study of bromocriptine and pergolide (1985).
Neurology; 35: 749–51.
Goodman L. S., Hardman J G, Limbird L. E., Gilman, Alfred Goodman. The
pharmacological basis of therapeutics (2001). McGraw-Hill., 10th ed.
Grilli M., Pizzi M., Memo M., Spano P. F. Neuroprotection by aspirin and sodium
salicylate through blockade of NF-kB activation (1996). Science; 274:1383–1385.
Habtemariam, S. Andrographolide inhibits the tumour necrosis factor-α-induced
upregulation of ICAM-1 expression and endothelial-monocyte adhesion (1998).
Phytother. Res; 12: 37–40.
Hartmann A., Hunot S., Michel P. P., Muriel M. P., Vyas S., Faucheux B. A.,
Mouatt-Prigent A., Turmel H., Srinivasan A., Ruberg M., Evan GI., Agid Y and
Hirsch E. C. Caspase-3. A vulnerability factor and final effector in apoptotic death
of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease (2000). Proc Natl Acad Sci USA;
97: 2875–2880.
Henle E. S., Han Z., Tang N., Rai P., Luo Y., and Linn S. Sequence-specific DNA
Cleavage by Fe2+-mediated Fenton Reactions Has Possible Biological Implications
(1999). J. Biol. Chem; 274(2): 962 - 971.
85
Hensey K., Hall N., Subramaniam R., et al. Brain regional correspondence
between Alzheimer’s disease histopathology and biomarkers of protein oxidation
(1995). J Neurochem; 65:2146–56.
Hidalgo M. A., Romero A., Figueroa J., Cortés P., Concha I. I., Hancke J. L. and
Burgos R. A. Andrographolide interferes with binding of nuclear factor-κB to DNA in
HL-60-derived neutrophilic cells (2005). Br. J. Pharmacol; 144: 680–686.
Hoyt K. R., Gallagher A. J., Hastings T. G., Reynolds I. J. Characterization of
hydrogen peroxide toxicity in cultured rat forebrain neurons (1997). Neurochem
Res; 22(3):333-40.
Kar S., Slowikowski S. P.M., Westaway D. and Mount H. T. J. Interactions between
β-amyloid and central cholinergic neurons: implications for Alzheimer's disease
(2004). J Psychiatry Neurosci; 29(6): 427–441.
Kermer K. and Liman J. Neuronal Apoptosis in Neurodegenerative Diseases:
From Basic Research to Clinical Application. Neurodegenerative Dis 2004; 1:9–19
Klegeris A. and McGeer P. L. Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and
other anti-inflammatory agents in the treatment of neurodegenerative disease
(2005). Current Alzheimer research; 2(3): 355-65.
86
Kopp E. B. and Ghosh S. NF-kappa B and Rel proteins in innate immunity (1995).
Adv Immunol; 58: 1-27.
Kosik K. S., Joachim C. L. and Selkoe D. J. Microtubule-associated protein tau
(tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer
disease (1986). Proc Natl Acad Sci U S A; 83: 4044-4048.
LaFerla F., Tinkle B., Bieberich Ch., Haudenschild Ch. and Jay G. The Alzheimer's
A peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice
(1995). Nature Genetics; 9: 21 – 30.
Liu, Bin, Hong, Jau-Shyong. Role of Microglia in Inflammation-Mediated
Neurodegenerative Diseases: Mechanisms and Strategies for Therapeutic
Intervention (2003). J Pharmacol Exp Ther; 304: 1-7.
Lleo A., Galea E. And Sastre M. Molecular targets of non-steroidal anti-
inflammatory drugs in neurodegenerative diseases (2007). Cell. Mol. Life. Sci; 64:
1403-1418.
Loeffler D. A., Connor J.R., Juneau P.L., et al. Transferrin and iron in normal,
Alzheimer’s disease, and Parkinson’s disease brain regions (1995). J Neurochem;
65:710–6.
87
Loffler J. and Huber G. Beta-amyloid precursor protein isoforms in various rat brain
regions and during brain development (1992). J Neurochem ; 59: 1316–24.
Loo D. T., Copani A., Pike C. J., et al. Apoptosis is induced by b amyloid in
cultured central nervous system neurons (1993). Proc Natl Acad Sci USA; 90:
7951-7955.
Lu Q. and Wood J. G. Functional studies of Alzheimer's disease tau protein (1993).
J Neurosci; 13: 508–515.
Markesbery W. R. Oxidative stress hypothesis in Alzheimer's disease. (1997) Free
Radical Biology and Medicine; 23 (1): 134-147.
Martin L. J. Neuronal cell death in nervoussystem development, disease, and injury
(2001). Int J Mol Med; 7: 455-78.
Matthews J. R. and Hay R. T. Regulation of the DNA binding activity of NF-kappa
B (1995). Int J Biochem Cell Biol; 27: 865-79.
Mattson M. P. Apoptosis in neurodegenerative disorders (2000). Nat Rev Mol Cell
Biol.; 1:120–129.
88
McGeer P. L., Itagaki S., Boyes B. E. and McGeer E. G. Reactive microglia are
positive for HLA-DR in the substantia nigra of Parkinson’s and Alzheimer’s disease
brains (1988). Neurology; 38:1285–1291.
MacManus A., Ramsden M., Murray M., Henderson Z., Pearson H. A. and
Campbell, V.A. Enhancement of (45)Ca(2+) influx and voltage-dependent Ca(2+)
channel activity by beta-amyloid-(1-40) in rat cortical synaptosomes and cultured
cortical neurons (2000). Modulation by the proinflammatory cytokine interleukin-
1beta. J Biol Chem; 275: 4713-4718.
Mochizuki H., Goto K., Mori H. and Mizuno Y. Histochemical detection of apoptosis
in Parkinson’s disease (1996). J Neurol Sci; 137: 120–123.
Multhaup G. Amyloid precursor protein, copper and Alzheimer’s disease (1997).
Biomed Pharmacother; 51:105–11.
Multhaup G., Schlicksupp A., Hesse L., et al. The amyloid precursor protein of
Alzheimer’s disease in the reduction of copper (II) to copper (I) (1996). Science;
271:1406–9.
Nijhawan D., Honarpour N., Wang X. D. Apoptosis in neural development and
disease (2000). Annu. Rev. Neurosci; 23:73–87 .
89
Prasad K. N., Cole W. C. and Kumar B. Multiple Antioxidants in the Prevention and
Treatment of Parkinson’s Disease (1999). J Am Coll Nutr; 18(5):413-23.
Puri A. , Saxena R., et al. Immunostimulant agents from Andrographis
paniculata(1993). Journal of Natural Product; 56: 995–999.
Reed J. C. Mechanisms of apoptosis (2000). Am J Pathol; 157:1415–1430.
Robert M. and Friedlander, M. D. Apoptosis and Caspases in Neurodegenerative
Diseases (2003). N Engl J Med; 348:1365-75.
Rogers J., Luber-Narod J., Styren S. D. and Civin W. H. Expression of immune
system-associated antigens by cells of the human central nervous system:
relationship to the pathology of Alzheimer’s disease(1988). Neurobiol Aging;
9:339–349.
Ross C. A., Poirier M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease
(2004). Nat Med. ;10 Suppl:S10-7.
Sáenz de Pipaón I. and Larumbe R. Neurodegenerative diseases programme
(2005). ANALES; 24, 3.
Sano, M. et al. A controlled trial of seligiline, a-tocopherol, or both as treatment for
Alzheimer’s disease (1997). N. Engl. J. Med; 336: 1216–1222.
90
Segura T., Galindo M. F., Rallo-Gutierrez B., Ceña V. and Jordan J. Dianas
farmacológicas en las enfermedades neurodegenerativas (2003). Rev Neurol; 36
(11): 1047-1057.
Selkoe D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy (2001). Physiol
Rev; 81: 741-766.
Skovronsky D. M., Lee V. and Trojanowski J. Neurodegenerative Diseases. New
Concepts of Pathogenesis and Their Therapeutic Implications (2006). Annu. Rev.
Pathol. Mech. Dis; 1:151–70.
Smith M. A., Richey Harris P. L., Sayre L. and Perry G. Iron accumulation in
Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals (1997). Proc Natl
Acad Sci U S A; 94:9866–8.
Taylor J. P., Hardy J. and Fischbeck K. H. Toxic proteins in neurodegenerative
disease (2002). Science; 296(5575: 1991-1995.
Townsend K. P. and Pratico D. Novel therapeutic opportunities for Alzheimer's
disease: focus on nonsteroidal anti-inflammatory drugs (2005). Faseb J; 19: 1592-
1601.
91
Trivedi Neha P., Rawal Upendra M. and Patel Beena P. Hepatoprotective Effect of
Andrographolide Against Hexachlorocyclohexane-Induced Oxidative Injury (2007).
Integr Cancer Ther; 6: 271-280.
Wang T., Liu B., Zhang W., Wilson B. and Hong J. Andrographolide Reduces
Inflammation-Mediated Dopaminergic Neurodegeneration in Mesencephalic
Neuron-Glia Cultures by Inhibiting Microglial Activation (2004). J. Pharmacol; 308:
975 - 983.
Xia, Yi-Feng, Ye, Bu-Qing, Li, Yi-Dan, Wang, Jian-Guo, He, Xiang-Jiu, Lin,
Xianfeng, Yao, Xinsheng, Ma, Dawei, Slungaard, Arne, Hebbel, Robert P., Key,
Nigel S., Geng and Jian-Guo. Andrographolide Attenuates Inflammation by
Inhibition of NF-κB Activation through Covalent Modification of Reduced Cysteine
62 of p50 (2004). J Immunol; 173: 4207-4217
Yuan J. And Yankner B. A. Apoptosis in the nervous system (2000). Nature;
407:802-9.
Zhang L., Zhao B., Yew D.T., Kusiak J.W and Roth G.S. Processing of
Alzheimer's amyloid precursor protein during H2O2-induced apoptosis in human
neuronal cells (1997). Biochemical and Biophysical Research Communications;
235 (3): 845-848.