v = c/ E = hv
Ene
rgía
S0
S1
S2
Ab
sorc
ión
(1
0-15 s
)
Flu
ore
sce
ncia
(1
0-9 s
-10-8
s)
Nr
Conversión interna
(10-12 s)
Corrimiento de Stokes : emisión > absorción
Diagrama de Jablonski
Ene
rgía
S0
S1
S2 Relajación del
solvente
(10-10 s)A
bso
rció
n
(10-1
5 s
)
Conversión interna
(10-12 s)
Corrimiento de Stokes : emisión > absorción
Diagrama de Jablonski
G
Absorción
Fluorescencia
relajación térmicarelajación térmica
Propiedades fundamentales de la fluorescencia (a) Principio de Frack-Condon: las transiciones son verticales (los núcleos no cambian de posición en 10-15 s). (c) La excitación es desde el nivel vibracional más bajo del estado basal hacia cualquier nivel vibracional del estado excitado. La emisión es desde el menor nivel vibracional del estado excitado hasta cualquier nivel vibracional del estado basal. La excitación revela los estados vibracionales del estado excitado; la emisión los del estado basal. (b) Si una transición es la más probable para la excitación, la recíproca lo será para la emisión. Ej.: 0–2 (excitación), 0–2 (emisión). El espectro de emisión es una imagen especular del de eexcitación. (d) El espectro de emisión está corrido a menores energías respecto al de excitación (corrimiento de Stokes).
Tiempos típicos de las interacciones entre la materia y la luz visible-UV Absorción de fotones, 10-15 s Vibración interatómica, 10-12 s Conversión interna, relajación del solvente, 10-12–10-10 s Emisión de fluorescencia 10-10–10-9 s Fosforescencia 10-3 s
Quantum yield
Tiempo de vida
Quenching the fluorescencia
Puede ser estático o dinámico
Resonance Energy Transfer
FLUORÓFOROS INTRÍNSECOS
Trp puede ser excitado selectivamente a 295 nm. (para evitar la excitación de la Tyr).
Triptofano es el fluoróforo intrínseco dominante.
Trp es muy sensible al entorno. Es posible ver cambios en los espectros de emisión en respuesta a cambios conformacionales, asociación de subunidades, unión de sustratos, desnaturalización y cualquier cosa que afecte el entorno local del anillo indol.
Trp es muy sensible a la atenuación colisional, tanto por grupos externos como por grupos vecinos, en la proteína.
Azurina 4AZU max= 308nm
Proteína G max= 342.5 nm
Glucagon 1GCN max 350.8 nm
Trp 48
Trp 48
Trp 25
25
75
125
175
225
275
325
375
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
[parinaric acid]/[YLSCP2]
Flu
resc
ence
(ar
bitr
ary
units
)
25
50
75
100
125
150
175
200
225
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
[parinaric acid]/[IFABP]
Flu
resc
ence
(ar
bitr
ary
units
)
A
B
S1
(no polar)
*
fluorescencia (no polar)
absorción
_
+
et
Transferencia electrónica
S1 ct
S0 np
(estable en ambiente polar)
fluorescencia (ambiente
polar)
Fluoróforos extrínsecos
Variación en el rendimiento cuántico del ANS
Esquema de la estructura de la ‑lactamasa. Se muestran las hélices C y N terminales.
N-terminal
C-terminal
U ESβL9 (5 M GdmCl) IP ESβL9 N ESβL9 (0.05 M GdmCl)
Longitud de onda
Flu
ore
sce
nci
a