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INDICE GENERAL.
RESUMEN ....................................................................................................................... 9
ABSTRACT .................................................................................................................... 10
1. INTRODUCCIN .................................................................................................. 11
1.1. Biofrmacos y protenas de uso teraputico. ......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... .......... 11
1.2.1. Sistemas de expresin para la produccin de protenas recombinantes teraputicas............... 11
1.2.2. Produccin de protenas recombinantes teraputicas enEscherichia coli............................. 13
1.2.3. Sobreexpresin de protenas recombinantes en forma de cuerpos de inclusin....................... 15
1.3. Factor de Crecimiento Epidrmico. .......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... ...... 18
1.3.1. Sealizacin molecular y estimulacin de la reparacin de tejido........................................ 19
1.3.2. Cicatrizacin y alteraciones en el proceso de reparacin de tejidos....................................... 21
1.3.3. Utilizacin teraputica de Factor de Crecimiento Epidrmico.............................................. 22
2.
HIPTESIS ............................................................................................................. 24
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 24
4. MATERIALES Y MTODOS .............................................................................. 25
4.1. Materiales. ................................................................................................................................. 25
4.1.1. Medios de cultivo de bacterias y antibiticos. ......................................................................... 25
4.1.2. Cepas bacterianas. .................................................................................................................... 25
4.1.2. Plsmidos. ................................................................................................................................ 25
4.1.3. Lneas celulares. ....................................................................................................................... 25
4.1.4. Soluciones de cultivo celular. .................................................................................................. 26
4.1.5. Enzimas. ................................................................................................................................... 26
4.1.6. Reactivos y soluciones. ............................................................................................................ 26
4.1.7. Kit comerciales. ....................................................................................................................... 28
4.2. Metodologa. .................................................................................................................................. 29
4.2.1. Sntesis de ADN. ...................................................................................................................... 29
4.2.2. Mtodos generales para la manipulacin de ADN. .................................................................. 29
4.2.2.1. Transformacin de bacterias E. coli DH5 mediante electroporacin.............................. 29
4.2.2.2. Purificacin de plsmidos. ................................................................................................ 29
4.2.2.3. Purificacin a escala mini preparativa. ............................................................................. 30
4.2.3.4. Purificacin a escala preparativa. ..................................................................................... 30
4.2.2.5. Extraccin de protenas con fenol/cloroformo y precipitacin de ADN plasmdico......... 31
4.2.2.6. Extraccin de ADN plasmidial a partir de gel de agarosa................................................. 31
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4.2.2.8. Reaccin de ligacin. ........................................................................................................ 32
4.2.3. Transformacin de bacterias E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL quimiocompetentes por shocktrmico. ............................................................................................................................................... 32
4.2.4. Cuantificacin de protenas mediante cido bicinconnico..................................................... 34
4.2.5. Precipitacin de protenas. ...................................................................................................... 34
4.2.6. Electroforesis de protenas en condiciones reductoras y anlisis de geles.............................. 35
4.2.7.1. Determinacin de la concentracin de IPTG ptima para la sobreexpresin de hEGF..... 38
4.2.7.2. Determinacin del tiempo de induccin ptimo para la sobreexpresin de hEGF.......... 38
4.2.8. Extraccin y purificacin de cuerpos de inclusin. ................................................................ 39
4.2.9. Solubilizacin y renaturacin de hEGF mediante Cromatografa de Lecho Expandido......... 39
4.2.9.1. Determinacin de la concentracin de Urea..................................................................... 39
4.2.9.2. Determinacin de la variacin del pH y concentracin de sales sobre la capacidad deunin de la matriz. .......................................................................................................................... 40
4.2.9.3. Determinacin del efecto de la cantidad de protena soluble cargada sobre la capacidad
de unin de la matriz. ...................................................................................................................... 40
4.2.9.4. Purificacin de hEGF solubilizado a escala preparativa.................................................. 41
4.2.10. Escisin de pptido 6xArg terminal y purificacin mediante cromatografa de intercambioinico. ................................................................................................................................................. 41
5.
RESULTADOS ........................................................................................................ 45
5.1. Generacin de la secuencia gnica codificante para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano.
................................................................................................................................................................ 45
5.2. Optimizacin de la expresin del Factor de Crecimiento Epidrmico humano. .......... ........... ........ 47
5.3. Ruptura celular y extraccin de cuerpos de inclusin. .......... .......... ........... .......... ........... .......... ..... 49
5.4. Solubilizacin de cuerpos de inclusin. ......... ........... .......... ........... .......... ........... .......... ........... ...... 49
5.5. Renaturacin y purificacin de hEGF-6xArg mediante Cromatografa de Lecho Expandido. ....... 51
5.5.1. Determinacin de pH y concentracin de NaCl. .................................................................... 51
5.5.2. Determinacin de capacidad de carga de matriz de lecho expandido..................................... 54
5.5.3. Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg a escala preparativa...................................... 54
5.6. Escisin de pptido 6xArg C-terminal. .......... .......... ........... .......... .......... ........... .......... ........... ........ 57
5.7. Purificacin final de hEGF mediante cromatografa de intercambio catinico y
ultracentrifugacin. ................................................................................................................................. 59
5.8. Determinacin de la actividad mitognica de hEGF en una lnea celular de fibroblastos de ratn. 62
6. DISCUSIN ............................................................................................................ 67
6.1. Sobreexpresin de hEGF-6xArg en forma de cuerpos de inclusin en Escherichia coli. ................ 70
6.2. Solubilizacin de cuerpos de inclusin y renatuacin de hEGF-6xArg mediante adsorcin en
matriz de lecho expandido. ..................................................................................................................... 72
6.3. Escisin de pptido 6xArg y purificacin final de hEGF. .................... .......... ........... .......... .......... 75
6.4. Caracterizacin biolgica de hEGF purificado. .......... .......... ........... .......... .......... ........... .......... ..... 77
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6.5. Proyecciones. ................................................................................................................................. 79
7.
CONCLUSIONES ................................................................................................... 81
8. AGRADECIMIENTOS .......................................................................................... 82
9. BIBLIOGRAFA ..................................................................................................... 83
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INDICE DE FIGURAS
Figura N 1. Expresin de protenas heterlogas enE. colimediante el sistema de
vectores pET.................................................................................................................... 14
Figura N 2.Esquema que representa las principales vas de sealizacin activadas por
el Receptor del Factor de Crecimiento Epidrmico......................................................... 20
Figura N 3.Metodologa de replegamiento de protenas en matriz de lecho expandido..
......................................................................................................................................... 42
Figura N 4.Generacin de una secuencia codificante para el Factor de Crecimiento
Epidrmico humano......................................................................................................... 46
Figura N 5. Optimizacin de las condiciones de induccin para la expresin de hEGF-
6xArg............................................................................................................................... 48
Figura N 6.Optimizacin de la eficiencia de la ruptura celular................................... 50
Figura N 7.Optimizacin de la eficiencia de solubilizacin de cuerpos de inclusin..52
Figura N 8.Determinacin del efecto de la variacin de pH en tampn de equilibriosobre la capacidad de unin de la matriz......................................................................... 53
Figura N 9.Determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de NaCl en
tampn de equilibrio sobre la capacidad de unin de la matriz....................................... 55
Figura N 10.Determinacin del efecto de la variacin en la cantidad de protenas
solubles cargadas sobre la capacidad de unin de la matriz............................................ 56
Figura N 11.Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg mediante cromatografa de
lecho expandido en matriz Streamline SP....................................................................... 58
Figura N 12.Escisin de pptido 6xArg ubicado en el extremo C-terminal de hEGF..
......................................................................................................................................... 60
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Figura N 13.Purificacinfinal de hEGF...................................................................... 61
Figura N 14. Ensayo de actividad proliferativa in vitro en lnea celular de fibroblastos
de ratn 3T3..................................................................................................................... 63
Figura N 15.Sitios de corte reconocidos por la enzima tripsina en la estructura del
Factor de Crecimiento Epidrmico humano.................................................................... 76
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INDICE DE TABLAS
Tabla N 1. Protocolo para la preparacin de la reaccin de ligacin.. .......................... 33
Tabla N 2.Protocolo para la preparacin de gel de poliacrilamida al 15 %. ................ 36
Tabla N 3.Protocolo para la preparacin de gel discontinuo de Tris-Tricina-
poliacrilamida al 16 %/4%. .............................................................................................. 37
Tabla N 4.Resumen del nivel de pureza y rendimiento de recuperacin de hEGF en
cada paso del proceso de produccin. .............................................................................. 65
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ABREVIATURAS
C
6xArg
6xHis
ADN
Arg
ARN
BCA
DMEM
DTT
EBAE. coli
ED50
EDTA
EGFR/ErbB1
h
hEGF
HPLC
IEC
IPTG
kb
kDa
L
Lis
LB
M
mEGF
mg
mL
Grados Celcius
Cola de poli-arginina
Cola de poli-histidina
cido desoxirribonucleico
Arginina
cido ribonucleico
cido bicinconnico
Medio Mnimo Esencial Dulbecco
Diotriotreitol
Cromatografa de adsorcin en lecho expandidoEscherichia coli
Dosis Efectiva 50
cido etilendiaminotetraactico
Receptor de Factor de Crecimiento Epidrmico
Horas
Factor de Crecimiento Epidrmico humano
Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia
Cromatografa de Intercambio Inico
Isopropil--D-1-tiogalactopiransido
Kilo bases
Kilo Dalton
Litros
Lisina
Luria-Bertani
Molar
Factor de Crecimiento Epidrmico murino
Mili gramos
Mili litros
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mM
ng
PCR
PDGFpI
PPB
PSA
rpm
SDS
SDS-PAGE
TCA
TAE
TEMED
Tris
UFC/mL
V
VEGF
g
L
Mili molar
Nano gramos
Reaccin en cadena de la polimerasa
Factor de Crecimiento derivado de PlaquetasPunto Isoelctrico
Tampn Fosfato de Potasio
Persulfato de amonio
Revoluciones por minuto
Dodecil sulfato de sodio
Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
denaturantes
cido tricloroactico
Tris/Acetato/EDTA
Tetrametiletilendiamina
Tris(hidroximetil)aminometano
Unidades formadoras de colonias / mili litro
Volts
Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular
Micro gramos
Micro litros
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RESUMEN
El Factor de Crecimiento Epidrmico humano (hEGF) es una citoquina que
estimula la proliferacin de clulas epiteliales, endoteliales y fibroblastos. Gracias a este
potencial mitognico, el hEGF ha sido empleado como agente cicatrizante para el
tratamiento de heridas agudas y ulcerosas presentes en la piel, el tracto gastrointestinal y
renal. Debido a su importancia teraputica, el hEGF se ha producido por va
recombinantes a travs de procesos de elevado costo, basados principalmente en la
utilizacin de HPLC como paso purificativo. Debido a esto se ha despertado un gran
inters en el desarrollo de mtodos eficientes y ms econmicos para producir hEGF.
Considerando estos antecedentes, nos propusimos desarrollar un proceso de produccin
eficiente y de bajo costo, que se basa en la adicin de un pptido de 6 residuos de
arginina (6xArg) en el extremo C-terminal de hEGF. Empleamos el organismo
Escherichia coli con el fin de sobreexpresar hEGF en forma de cuerpos de inclusin, que
nos permiti alcanzar un nivel de expresin de hEGF de 100 mg/L cultivo.
Estandarizamos un procedimiento de solubilizacin y replegamiento en matriz de lecho
expandido, que permiti disolver los agregados insolubles y posteriormente renaturar el
hEGF a su estado nativo, con un rendimiento del 72%. Se escindi el pptido 6xArg
mediante tratamiento con tripsina, y establecimos las condiciones para separar el hEGFde esta enzima y de las trazas de protena no digerida, mediante cromatografa de
intercambio catinico y ultrafiltracin, obtenindose hEGF a un nivel de 42 mg/L de
cultivo, y pureza del 99%. Finalmente, comprobamos la bioactividad de hEGF
estimulando la proliferacin en la lnea celular 3T3, y que la adicin del pptido 6xArg
no afecta significativamente la actividad de la molcula. Con esto demostramos que el
procedimiento diseado fue eficiente y permiti obtener hEGF biolgicamente activo,
con un nivel de pureza adecuado para su aplicacin tpica e inyectable.
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ABSTRACT
The human Epidermal Growth Factor (hEGF) is a cytokine that stimulate
proliferation of epithelial cells and fibroblasts. Due to this mitogenic potential, hEGF
has been used as a healing agent in treatment to acute and chronic wounds in skin,
gastrointestinal tract and renal tissue. Because of its therapeutic rol, hEGF has been
produced as a recombinant protein through expensive processes, mainly based in a
HLPC purification step. Due to this, has aroused a great interest in developing cheaper
and more efficient methods to produce hEGF. However, most existing strategies are
based on the use of high-cost methods such as HPLC. Considering this background, we
decided to develop a hEGF production process, based on the addition of a six arginine
tag (6xArg) at the C-terminal domain of the protein. We used the prokaryotic organism
Escherichia coli, in order to overexpress hEGF as inclusion bodies, which allowed us to
achieve a hEGF expression level of 100 mg/L of culture. We standardized solubilization
and refolding methods by using expanded-bed adsorption chromatography, allowing us
to dissolve insoluble aggregates of hEGF, and then returning them to their native state
with a yield of 72%. The 6xArg tag was cleaved by trypsin treatment, and we
established the conditions for separating the hEGF of this enzyme and traced undigested
protein by cation-exchange chromatography and ultrafiltration, obtaining hEGF at alevel of 42 mg/L of culture, with a purity of 99%. Finally, we checked the bioactivity of
hEGF stimulating the proliferation of a 3T3 cell line, and that the addition of 6xArg tag
did not significantly affect the molecule activity. This demonstrates that the designed
production process was efficient and allowed us to obtain biologically active hEGF with
a level of purity suitable for topic and intralesional application.
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1. INTRODUCCIN
1.1. Biofrmacos y protenas de uso teraputico.
El concepto de biofrmaco hace referencia a sustancias farmacuticas basadas en
protenas o cidos nucleicos usadas con fines teraputicos o de diagnstico, producidas a
partir de organismos vivos modificados genticamente, distintos a la fuente original
(Walsh, 2004). Los biofrmacos se presentan como una alternativa para el tratamiento
de aquellas patologas donde los medicamentos existentes slo funcionan como
paliativos de algunos sntomas, controlando la enfermedad de forma ineficaz (Gamboa y
Trujillo, 2009). De esta forma, las protenas de uso teraputico poseen varias ventajas
sobre los medicamentos tradicionales de sntesis qumica, entre ellas cabe destacar (i)su
ventaja funcional, debido a la incapacidad de los compuestos qumicos de imitar
adecuadamente las funciones proteicas; (ii) su especificidad, que disminuye la
posibilidad de interferir en los procesos biolgicos y causar efectos adversos; (iii) su
mejor tolerancia al ser suministrados, reduciendo la probabilidad de generar una
respuesta inmune, y (iv)su potencialidad de ser utilizados en terapias de reemplazo en
vez de terapia gnica para el tratamiento de enfermedades genticas (Leader y col.,
2008).
1.2. Produccin de protenas teraputicas.
Debido a la elevada demanda que han alcanzado los biofrmacos derivados de
protenas recombinantes en el mercado farmacutico, en los ltimos aos se gener un
incremento significativo en la produccin de estas molculas teraputicas, lo que
conduce a la necesidad de desarrollar nuevas estrategias que permitan elevar los
rendimientos de produccin (Walsh, 2010).
1.2.1. Sistemas de expresin para la produccin de protenas recombinantes
teraputicas.
Las protenas de uso teraputico pueden obtenerse por dos vas distintas:
mediante la extraccin directa desde una fuente animal o humana, o a travs de la
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tecnologa de ADN recombinante utilizando una amplia variedad de organismos vivos
como sistemas hospedantes para la expresin artificial (Leader y col., 2008).
Actualmente la generalidad de las protenas teraputicas de aplicacin en humanos se
producen mediante la tecnologa de ADN recombinante. Esto se debe a que estasmolculas son extradas en muy bajas cantidades desde una fuente natural, y las
metodologas empleadas en su purificacin son demasiado engorrosas a diferencia de las
opciones recombinantes, donde las biomolculas de inters se producen mediante
procesos de purificacin robustos y en concentraciones elevadas (Walsh, 2004).
Dentro de los sistemas de produccin de protenas se encuentran las bacterias,
levaduras, cultivos de clulas superiores (insectos o mamferos) y organismos
transgnicos (animales o plantas) (Ferrer-Miralles y col., 2009). La seleccin de un
sistema u otro para la expresin de protenas teraputicas se basa en los rendimientos y
costos de produccin, as como en el requerimiento de eventos post-traduccionales (ej.
glicosilaciones) necesarios para asegurar la actividad biolgica y farmacocintica de la
molcula (Demain y Vaishnav, 2009).
Los sistemas de expresin basados en levaduras, como Pichia pastoris y
Saccharomyces cerevisiae, se utilizan para expresar protenas que no pueden producirse
en sistemas bacterianos debido a problemas de plegamiento o falta de glicosilaciones
(Demain y Vaishnav, 2009). Aun as, los patrones de glicosilacin generados en las
levaduras son distintos producidos por la maquinaria de las clulas de mamferos, lo que
implica importantes alteraciones en la farmacocintica e inmunogenicidad de la protena
recombinante cuando esta se administra de forma inyectables (Gerngross, 2004).
Para obtener protenas correctamente plegadas y con patrones de glicosilacin
adecuados, se requiere la utilizacin de cultivos artificiales de clulas de mamferos
(Demain y Vaishnav, 2009). Estos sistemas pueden generar patrones de glicosilacin
muy similares a los producidos por las clulas del organismo humano (Dingermann,2008), y tienen la capacidad de exportar las protenas al medio de cultivo, lo que facilita
el proceso de purificacin (Montesino y Toledo, 2006). No obstante, los elevados costos
de mantencin de los medios de cultivo, as como la posibilidad de contaminacin del
producto con agentes virales, son algunas de sus principales desventajas (Wurm, 2004).
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1.2.2. Produccin de protenas recombinantes teraputicas en Escherichia coli.
Los sistemas de produccin basados en organismos procariontes como
Escherichia colison los ms empleados para la produccin de protenas recombinantes
de bajo peso molecular y carentes de glicosilaciones. Esto se debe a su rpidocrecimiento y acumulacin de biomasa mediante procesos fermentativos de alta
densidad celular que utilizan fuentes de carbono de bajo costo, a los altos rendimientos
productivos, al fcil escalamiento desde matraces de cultivo hasta fermentadores, y a su
capacidad de sobreexpresar protenas exgenas de forma controlada, que puede alcanzar
entre un 10% a 50% de las protenas totales (Sahdev y col., 2008). Entre las principales
desventajas de Escherichia coli como sistema de expresin, se destaca la carencia de
enzimas encargadas de glicosilar protenas, limitando el espectro de biofrmacos que
pueden generarse mediante dicho sistema, y la inexistencia de ptimos sistemas de
secrecin (Wacker y col.,2002).
Un paso crtico dentro de la primera etapa del proceso productivo de protenas
recombinantes es la eleccin del promotor y la metodologa que se emplear para regular
la expresin del gen que codifica para la protena teraputica. Estos promotores deben
estar finamente regulados, generalmente por sustratos que funcionan como inductores de
la transcripcin. Idealmente, estos sistemas inducibles deben estar basados en
procedimientos simples y de bajo costo (Demain y Vaishnav, 2009). Uno de los sistemas
de vectores ms utilizados a escala de laboratorio para la produccin de biofrmacos en
bacterias est basado en los plsmidospET (Novagen, EE.UU.). En estos vectores el gen
de inters se encuentra bajo el control transcripcional del promotor de la ARN
polimerasa del bacterifago T7. Por esta razn, estos vectores deben emplearse en cepas
bacterianas que posean el gen que codifica esta ARN polimerasa, cuya expresin este
regulada por algn promotor derivado del promotor lac, inducible por isopropil--D-1-
tiogalactopiransido (IPTG) (Fig. 1) (Srensen y Mortensen, 2005).
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Figura N 1. Expresin de protenas heterlogas en E. coli mediante el sistema devectores pET. Dentro del genoma de la bacteria se encuentra una copia del gen que
codifica a la ARN polimerasa del fago T7, cuya expresin est controlada por el
promotor lacUV5, y una copia del gen que codifica al represor lac I. Cuando se adiciona
IPTG al medio de cultivo, este se une al represor lac I y altera su estructura de tal forma
que este pierde afinidad por el operador lac, activndose la expresin de la ARN
polimerasa del fago T7. Finalmente la T7 ARN polimerasa activa la expresin del gen de
inters presente en el vector plasmdico (Quiroga, 2010).
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El siguiente paso conlleva la aplicacin de una serie de metodologas de
purificacin, cuya finalidad es eliminar las molculas endgenas producidas por el
organismo husped, como endotoxinas o agentes pirognicos, para as alcanzar niveles
de pureza cercanos al 99%. De esta forma en el primer paso se realiza la remocin de lasclulas desde el caldo de fermentacin, y su posterior ruptura mediante procedimientos
enzimticos o mecnicos. A continuacin, dependiendo de las caractersticas
fisicoqumicas de la molcula, se aplican tcnicas de separacin cromatogrfica como
cromatografa de intercambio inico, de exclusin molecular o de afinidad. Para esta
ltima suelen emplearse pptidosde afinidad como el eptope FLAG, terminaciones o
colas de poli-histidina o poli-arginina unidas a la protena de inters, los cuales poseen
alta afinidad por determinadas molculas que son ancladas a un soporte slido o matriz,
permitiendo de esta forma la captacin y purificacin especfica de la molcula marcada
(Jonasson y col.,2002).
Un ejemplo de esto es el sistema de purificacin basado en el pptido terminal
de poli-arginina (6xArg), diseado para la purificacin de protenas expresadas en
sistemas bacterianos mediante la utilizacin de resinas de intercambio catinico. Este
sistema permite eluir la protena marcada con 6xArg mediante la aplicacin de un
gradiente de NaCl a pH alcalino en un primer paso cromatogrfico, seguido por la
remocin de los residuos de arginina empleando las enzimas tripsina o carboxipeptidasa
B, y un segundo paso de purificacin en un resina de intercambio catinico (Sassenfeld
y Brewer, 1984).
1.2.3. Sobreexpresin de protenas recombinantes en forma de cuerpos de
inclusin.
Una de las principales ventajas de los sistemas procariontes es su capacidad de
sobreexpresar protenas recombinantes, sin embargo esto lleva generalmente a laacumulacin de las protenas en forma de agregados insolubles, denominados cuerpos de
inclusin. Si bien este evento de agregacin es una caracterstica predominante de los
sistemas de alta expresin, tambin es promovido bajo condiciones de elevada
concentracin de inductor y alta temperatura de crecimiento celular (Li y col., 2004).
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Estos agregados intracelulares se encuentran principalmente conformados por la protena
sobreexpresada en una conformacin no nativa carente de actividad biolgica, y en
menor porcentaje por otras protenas celulares, ADN y ARN ribosomal (Panda, 2003). A
pesar de generar la protena en forma inactiva, la expresin en forma de cuerpos deinclusin presenta importantes ventajas, como la proteccin ante la degradacin
proteoltica, fcil separacin de estos agregados de las protenas solubles mediante
procedimientos de centrifugacin, filtracin o cromatografa de exclusin molecular, y
la posibilidad de expresar protenas txicas para la bacteria (Li y col., 2004). Por tanto,
el mayor desafo de expresar protenas en forma de cuerpos de inclusin es convertir la
protena insoluble e inactiva en un producto soluble, correctamente plegado y
biolgicamente activo (Clark, 1998).
La recuperacin de la protena activa desde los cuerpos de inclusin se realiza
inicialmente a travs del aislamiento de estos desde el lisado bacteriano. Los cuerpos de
inclusin se caracterizan por poseer una densidad especfica elevada, por lo que se
pueden separar de la fraccin de protenas solubles mediante pasos de centrifugacin a
alta velocidad (8.000 a 10.000 g) (Panda, 2003). Posteriormente se realiza la
solubilizacin de los agregados usando agentes reductores como DTT y -
mercaptoetanol, y altas concentraciones de agentes caotrpicos (6-8 M) como urea o
cloruro de guanidinio, los que generan la perdida de la estructura secundaria, llevando a
la protena a la formacin de una estructura al azar (random coil). Finalmente se lleva a
cabo el replegamiento de la protena denaturada mediante la remocin del agente
caotrpico y reductor (Fahnert y col., 2004).
De estas etapas, el replegamiento es la etapa principal que determinar los
rendimientos de recuperacin. Existen tres modelos que pueden ser empleados para
realizar la renaturacin de las protenas solubilizadas (Singh y Panda, 2005):
(1)
Dilucin. En este modelo la protena solubilizada se diluye directamente enun tampn de renaturacin que favorezca el replegamiento de la protena,
disminuyendo la concentracin del agente denaturante. Este procedimiento
normalmente es empleado a nivel de laboratorio debido a que requiere de
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grandes cantidades de tampn, y es necesario realizar procedimientos de
concentracin de la muestra, lo que aumenta el costo de produccin.
(2) Intercambio de solvente. Se realiza mediante procedimientos de dilisis,
diafiltracin o cromatografa de exclusin molecular. En este procedimiento,los agentes denaturante y reductor son removidos completamente del medio,
e intercambiados por un tampn de renaturacin. Los procedimientos de
dilisis y diafiltracin que emplean membranas de ultra-filtracin, se
emplean en menor grado debido su lentitud, a la perdida de polipptidos no
plegados que pueden atravesar la membrana, y a la obstruccin de estas
debido a la acumulacin de las protenas denaturadas sobre la membrana.
(3) Adsorcin reversible de protenas denaturadas a un soporte slido. Las
protenas denaturadas unidas a un soporte slido, como matriz de
intercambio inico o afinidad a iones metlicos, se encuentran espacialmente
separadas e inmovilizadas durante el proceso de replegamiento, previniendo
su difusin e interaccin, y por lo tanto su re-agregacin.
Dentro del tercer modelo de replegamiento cabe destacar la utilizacin de la
cromatografa de adsorcin en lecho expandido, la cual se ha empleado para realizar el
replegamiento y la purificacin parcial de protenas recombinantes expresadas como
cuerpos de inclusin, en un solo paso (Cho y col, 2002; Jin y col., 2005; Alibolandi y
col., 2011). Esta tcnica se basa en la utilizacin de matrices de afinidad o intercambio
inico, las cuales al ser sometidas a un flujo ascendente expanden su volumen hasta
alcanzar el equilibrio entre la velocidad de sedimentacin de las partculas y el flujo
ascendente, lo que permite formar un lecho estable y uniforme (Anspach y col., 1999).
De esta forma, al expandir el lecho cromatogrfico las interacciones intermoleculares
entre las protenas denaturadas se minimizan debido a la separacin espacial existente
entre ellas, de tal forma que al realizar la remocin del agente caotrpico desde el lechocromatogrfico expandido, se disminuyen los eventos de re-agregacin (Jin y col.,
2005).
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1.3. Factor de Crecimiento Epidrmico.
El Factor de Crecimiento Epidrmico pertenece al grupo de los factores de
crecimiento, molculas biolgicas de carcter proteico u hormonal capaces de estimular
el crecimiento celular, la proliferacin y la diferenciacin celular. Su hallazgo seremonta a la dcada de los aos 60 del siglo XX, en el marco de los estudios dirigidos
por Stanley Cohen para caracterizar el Factor de Crecimiento Nervioso presente en la
glndula submaxilar de ratones. Al inyectar diariamente un extracto puro de la glndula
en ratones recin nacidos, se generaban cambios fisiolgicos inesperados como apertura
precoz de parpados y prematura erupcin de dientes (Cohen, 1962). Dichos efectos
morfolgicos fueron atribuidos posteriormente a la estimulacin del crecimiento
epidrmico y queratinizacin inducida por el Factor de Crecimiento Epidrmico murino
(mEGF). Este corresponde a una cadena polipeptdica de 53 residuos de aminocidos,
producida en la glndula submaxilar, interconectada por tres enlaces disulfuro
responsables de su alta estabilidad trmica, y cruciales para su actividad biolgica
(Savage y col.,1973).
Posteriormente, se determin que el mEGF estimulaba el crecimiento epitelial y
la sntesis de ADN y ARN en cultivos celulares de fibroblastos humanos, lo que llev a
pensar en la posibilidad de que este factor se encontrara presente adems en humanos
(Starkey y col., 1975). De esta forma se logr purificar por primera vez el Factor de
Crecimiento Epidrmico humano a partir de orina, bajo el nombre de Urogastrona,
debido a su capacidad de inhibir la secrecin de cido gstrico (Starkey y Cohen, 1975).
Posteriormente, se comprob que este factor estimula la proliferacin y diferenciacin
de clulas epiteliales de la piel, cornea, tejido pulmonar y del tracto gastrointestinal,
promueve el crecimiento y migracin de queratinocitos, y aumenta la proliferacin de
fibroblastos y clulas endoteliales. Por lo tanto, se postul que el EGF podra jugar un
rol crucial dentro del proceso de reparacin de tejido y organognesis (Carpenter yCohen 1979).
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1.3.1. Sealizacin molecular y estimulacin de la reparacin de tejido.
El efecto mitognico del EGF es mediado por un receptor transmembrana
especfico denominado EGFR/ErbB1, presente en la membrana plasmtica de las clulas
blanco. Este se organiza formando 3 dominios: un dominio extracelular donde seencuentra el sitio de unin al ligando, un dominio transmembrana, y una porcin
intracelular rico en residuos de serina, treonina y tirosina. Al unirse el EGF al dominio
extracelular del receptor se desencadena la dimerizacin de este, estimulndose la
actividad quinasa del receptor, que finalmente resulta en la autosforilacin de residuos
de tirosina en el dominio intracelular y en la transduccin de la seal proliferativa
(Carpenter y Cohen, 1990).
Posteriormente se genera la activacin de vas de sealizacin intracelular,
como la va RAS-RAF-MEK-MAPK que controla la progresin del ciclo celular desde
la fase G1 a S, la va de Fosfoinositol 3-quinasas/Proteina quinasa B
(Phosphatidylinositide 3-kinases/Protein Kinase B, PI3K-Akt) que activa una cascada de
seales anti-apoptticas y citoprotectivas que inducen la recuperacin de las clulas
daadas, y la activacin de Fosfolipasa C1 y la va de Protenas Quinasas Activadas
por Mitgenos (Mitogen-Activated Protein Kinases, ERK/MAP) que estimulan la
migracin celular (Fig. 2) (Citri y Yarden, 2006).
Estas vas finalmente inducen la expresin de una amplia variedad de genes que
estimularn tres importantes procesos biolgicos implicados en la reparacin de tejidos:
proliferacin celular, citoproteccin y locomocin en clulas epiteliales y fibroblastos
(Berlanga-Acosta y col., 2009).
Una vez que el EGF se une a su receptor, se genera la internalizacin del
complejo, y su posterior degradacin enzimtica dentro del lisosoma (Carpenter y Cohen
1979). De esta forma la clula realiza un proceso de recambio del receptor ErbB1 en la
superficie celular, lo cual conduce posteriormente a un incremento compensatorio en laexpresin y sntesis del receptor (Earp y col., 1986).
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Figura N 2. Esquema que representa las principales vas de sealizacin
activadas por el Receptor del Factor de Crecimiento Epidrmico luego de
la unin con su ligando.
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1.3.2. Cicatrizacin y alteraciones en el proceso de reparacin de tejidos.
La reparacin de tejidos es un proceso biolgico complejo que implica la
accin de un amplio nmero de factores de crecimiento y citoquinas. Este puede
resumirse en cuatro etapas: (i)estimulacin de la migracin de clulas productoras haciala zona daada, (ii) estimulacin del crecimiento del tejido granular, incluyendo
acumulacin de matriz extracelular y angiognesis, (iii)estimulacin de la contraccin
de la herida mediante estimulacin de la proliferacin de miofibroblastos, y (iv)
estimulacin del recubrimiento del rea daada mediante migracin y proliferacin de
las clulas epiteliales (Pastore y col., 2008).
La alteracin del proceso de cicatrizacin es un problema significativo tanto a
nivel medico como econmico, principalmente para aquellos pacientes diabticos que
desarrollan heridas ulcerosas en sus extremidades inferiores (lceras de Pe Diabtico)
(Berlanga-Acosta y col., 2009). Estos se caracterizan por padecer severos trastornos
endoteliales sistmicos, fallas en las defensas anti-bacterianas, irrigacin sangunea
anmala, y una deficiencia en el proceso de reparacin de tejidos. Finalmente todos
estos factores habitualmente llevan a la amputacin de las extremidades inferiores
(Tiaka y col., 2012). A nivel mundial, ms de 370 millones de personas sufren de
diabetes, de los cuales se estima que aproximadamente un 20% desarrolla una lcera
crnica en algn pe. En Chile, la prevalencia de diabetes mellitus asciende a un 9.4%.
Del total de los pacientes diabticos, aproximadamente el 12,5% desarrolla una lcera de
pie diabtico, de los cuales el 12% son sometidos a amputacin de sus miembros
inferiores (aprox. 18.750 personas) (Encuesta Nacional de Salud, 2009-2010).
El mecanismo molecular por el cual se origina una disminucin en el proceso
de reparacin del tejido an no ha sido dilucidado, sin embargo existe evidencia que
sugiere que esta deficiencia podra deberse a una expresin anormal o reducida de
algunos factores de crecimiento, o a una alteracin en su actividad proliferativa debido aun proceso de glicosilacin no enzimtico (glicacin) de estas molculas inducida por la
condicin hiperglicmica (Papanas y Maltezos, 2010).
Finalmente este dficit desencadena una serie de efectos fisiolgicos a nivel
epidrmico: (i) un dao en la funcin de los fibroblastos, limitando la formacin,
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maduracin y remodelacin de la matriz extracelular, (ii) una disminucin en la
poblacin de miofibroblastos, reduciendo la contraccin de la herida, y (iii)una limitada
o nula respuesta angiognica (Berlanga-Acosta y col., 2009).
Bajo este contexto, con la finalidad de contrarrestar el dficit de factores decrecimiento, y disminuir los sntomas generados, se desarroll un nuevo tratamiento
denominado Terapia de Reemplazo de Factores de Crecimiento, cuyo objetivo es
estimular y restaurar el proceso de cicatrizacin. Este se basa en la administracin
exgena de factores de crecimiento como el PDGF (factor de crecimiento derivado de
plaquetas), VEGF (factor de crecimiento vascular endotelial) o EGF, obtenidos a partir
de su fuente natural, o mediante tcnicas de ADN recombinantes (Kwon y col., 2006).
1.3.3. Utilizacin teraputica de Factor de Crecimiento Epidrmico.
Varios ensayos in vivo se realizaron con la finalidad de probar el efecto de EGF
sobre el proceso de cicatrizacin. Para esto se emplearon distintos modelos de heridas
(heridas parciales o profundas, quemaduras trmicas o qumicas) inducidas en diversos
modelos de animales como ratones, cerdos y perros (Nanney, 1990; Tanaka y col .,2005;
Alemdaroglu y col., 2006; Kwon y col., 2006). Dichos experimentos permitieron llegar a
la conclusin de que la aplicacin tpica de EGF sobre el rea daada estimula la
cicatrizacin debido a una aceleracin en la proliferacin de las clulas epiteliales
nuevas y un aumento en la contraccin de la herida, condicionado por un incremento en
la proliferacin de miofibroblastos y la deposicin de colgeno. Finalmente, estos
eventos generan un aumento significativo en la velocidad de la cicatrizacin y una
disminucin del tiempo de cierre de la herida (Kwon y col., 2006). Por otro lado, se
realizaron ensayos clnicos en humanos con la finalidad de probar el efecto de la
aplicacin tpica en heridas crnicas, obtenindose resultados similares en cuanto a la
estimulacin del proceso de cicatrizacin (Brown y col., 1991; Borges y col.,1994). Sinembargo, la mayora de los ensayos clnicos que implican la utilizacin de EGF como
agente cicatrizante, estn destinados a estudiar su efecto sobre las lceras de pie
diabtico. Se realizaron estudios en lceras de pie diabtico de diversa severidad (ulceras
de grado I a IV segn el sistema de clasificacin de Wagner), aplicando de forma tpica
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el EGF sobre la zona daada, generndose una cicatrizacin parcial (Tsang y col., 2003)
o completa de la herida (Hong y col., 2006), lo cual finalmente llev a una reduccin en
el riesgo de amputacin. Sin embargo, la aplicacin tpica puede generar efectos
variados que dependen de la disponibilidad del agente en las capas profundas de laherida, mayoritariamente debido a la presencia de proteasas en la zona de dao (Tiaka y
col., 2012). De esta forma, a diferencia de la aplicacin tpica, la inyeccin intralesional
permite liberar el agente activo directamente en la regin deseada, generndose un
efecto directo que permite mejorar el proceso de cicatrizacin (Fernndez-Montequin y
col., 2009).
Segn lo expuesto anteriormente, el Factor de Crecimiento Epidrmico posee
una funcin esencial en el proceso de regeneracin de tejido, y la ausencia de esta
molcula condiciona el desarrollo de lceras de pe diabtico. Esta afeccin tiene una
elevada incidencia tanto a nivel mundial como nacional, por lo cual se hace necesaria la
generacin de una plataforma para la produccin de esta molcula. Debido al costo de
operacin implicado en la utilizacin de sistemas de expresin de protenas
recombinantes basados en clulas de mamferos, y a las caractersticas fisicoqumicas
del EGF, nos preguntamos en este trabajo si mediante la adicin de un pptido rico en
residuos de arginina en el extremo C-terminal del EGF, y la utilizacin de Escherichia
coli como sistema de expresin, es posible establecer un proceso de produccin de alto
rendimiento, escalable y de bajo costo de operacin, para la expresin del Factor de
Crecimiento Epidrmico humano recombinante.
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2. HIPTESIS
La adicin de un pptido compuesto por 6 residuos de aminocido Arginina al
extremo C-terminal de la molcula del Factor de Crecimiento Epidrmico humano
permite establecer un proceso productivo para obtener esta protena recombinante
biolgicamente activa y con un nivel de pureza superior o igual al 99%, partiendo de su
expresin enEscherichia coli.
3. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL.
Establecer un proceso productivo para la generacin de Factor de CrecimientoEpidrmico humano recombinante en una forma biolgicamente activa, basado en la
adicin de un pptido de 6 residuos de arginina al extremo C-terminal de la protena.
OBJETIVOS ESPECFICOS.
I. Clonar y expresar en Escherichia coli la molcula de Factor de Crecimiento
Epidrmico humano unida a una cola de 6 residuos de Arginina.
II.
Establecer un procedimiento de purificacin de la molcula basado en tcnicas
cromatogrficas de intercambio inico y adsorcin en una matriz de lecho
expandido, garantizando un nivel de pureza superior o igual al 99%.
III. Determinar los rendimientos en cada paso del procedimiento de purificacin.
IV. Evaluar la actividad biolgica in vitro del Ingrediente Farmacutico Activo
purificado.
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4. MATERIALES Y MTODOS
4.1. Materiales.
4.1.1. Medios de cultivo de bacterias y antibiticos.
Medio LB (MoBio, EE.UU), Agar LB (MoBio, EE.UU), Ampicilina (SIGMA, EE.UU.),
Cloranfenicol (SIGMA, EE.UU.), IPTG (Promega, EE.UU.).
4.1.2. Cepas bacterianas.
DH5: F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15
(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK
+), .
Cepa de E. coli empleada para el clonamiento y replicacin de vectores bacterianosdebido a su alta eficiencia de transformacin.
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL: E. coli B FompT hsdS(rBmB
) dcm+Tetrgal(DE3)
endAHte [argU ileY leuWCamr] (Stratagene, EE.UU).
Cepa de E. coli empleada para la expresin de protenas heterlogas. Contiene copias
extra de los genes que codifican para los ARNt argU, ileY e leuW. Adems posee dentro
de su genoma el gen codificante para la ARN polimerasa del bacterifago T7, cuyo
expresin se encuentra controlada por el promotor lac inducible por IPTG.
4.1.2. Plsmidos.
pET-22b(+): vector plasmdico desarrollado para la expresin de protenas
recombinantes en Escherichia coli. El gen heterlogo es clonado bajo el control el
promotor de ARN polimerasa del bacterifago T7. Este vector debe ser introducido en
una cepa bacteriana que contenga una copia de ARN polimerasa del bacterifago T7
dentro de su cromosoma, la cual se encuentre bajo el control de un promotor inducible
como lacUV5, cuya expresin es inducida mediante la adicin de IPTG (Novagen,
EE.UU.).
4.1.3. Lneas celulares.
3T3: Lnea celular de fibroblastos de ratn (ATCC CRL-1658).
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4.1.4. Soluciones de cultivo celular.
Medio DMEM: 4,5 g/L de D-glucosa; 3,7 g/L NaHCO3 (HyClone, EE.UU.)
suplementado con 0.3 mg/mL L-glutaminutosa, 1 mM piruvato sdico y solucin
antibitico-antimictico 1X (Gibco-BRL, EE.UU.).
Medio de crecimiento: DMEM suplementado con suero de bovino fetal al 10%
(HyClone, EE.UU.).
Tampn fosfato salino: 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.09 g/l Na2HPO4, pH 7.2.
Tripsina-EDTA 0,25% (HyClone, EE.UU.): Usada para quitar las clulas de la placa
de cultivo.
4.1.5. Enzimas.NdeI, XhoI, T4 DNA Ligasa (New England BioLabs, Inglaterra), Tripsina de pncreas
de bovino (Calbiochem, Inglaterra).
4.1.6. Reactivos y soluciones.
Soluciones para extraccin y purificacin de ADN plasmidial y ARN:
Solucin I: 50 mM Glucosa (Merck, Alemania), 25 mM Tris-Cl pH 8.0 (SIGMA,
EE.UU.), 10 mM EDTA pH 8.0 (Calbiochem, Inglaterra), 10 mg/ml ARNasa (US
Biologicals, EE.UU.).
Solucin II: 0.2 M NaOH (Merck, Alemania), 1% (p/v) SDS (Merck, Alemania).
Solucin III: 5 M Acetato de potasio (Merck, Alemania), Acido actico glacial
(Merck, Alemania).
Cloroformo (Winkler, Chile), Isopropanol (Merck, Alemania), Etanol absoluto (Merck,
Alemania).
Soluciones para electroforesis de ADN:
Agarosa (Calbiochem, Inglaterra), Tampn de carga ADN 6x (New England Biolabs),
Tampn TAE 5x (Merck, Alemania), Bromuro de etdio (Merck, Alemania Millipore),
Marcador de peso molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas).
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Soluciones para extraccin y purificacin de protenas:
Tampn fosfato de potasio: KH2PO4y K2HPO4, (Fisherbiotech, EE.UU.).
Tampn de lisis: 10 mM EDTA (Calbiochem, Inglaterra), 25 mM PPB, pH 8.0.
Solucin de denaturacin: 8 M Urea (Fisherbiotech, EE.UU.), 5 mM DTT
(Calbiochem, Inglaterra).
Tampn renaturacin I: 200 mM NaCl (Merck, Alemania), 2 M Urea (Fisherbiotech,
EE.UU), 25 mM PPB, pH 8.0.
Tampn de renaturacin II: 200 mM NaCl (Merck, Alemania), 25 mM PPB, pH 8.0.
Tampn de elucin: 25 mM PPB, 500 mM NaCl pH 8.0.
Tampn de diafiltracin: 50 mM NaCl (Merck, Alemania), 25 mM PPB, pH 7.4.
Solucin de tripsina: 2.5 g/l Tripsina de pncreas de bovino (SIGMA, EE.UU.), 0.2g/l EDTA (Calbiochem, Inglaterra), 50 mM NaCl, 25 mM PPB, pH 7.4.
Tampn equilibrio IEC: 25 mM PPB, pH 6.0.
Tampn de elucin IEC: 25 mM PPB, 1 mM NaCl, pH 6.0.
Soluciones para electroforesis de protenas en condiciones reductoras:
Acrilamida/bisacrilamida 30%/1%, Acrilamida/bisacrilamida 16% T/3% C (Sigma,
EE.UU.), 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 (Calbiochem, Inglaterra), 0.5 M Tris-HCl pH 6.8(Calbiochem, Inglaterra), 3.0 M Tris-HCl/0.3% SDS, 10 % (p/v) PSA (Calbiochem,
Inglaterra), 20 % (p/v) SDS (Calbiochem, Inglaterra), Patrn de peso molecular
AccuRuler RGB Prestained Protein Ladder 10-180 kDa (MaestroGen, EE.UU.) y
Precision Plus ProteinDual Xtra Standards 2-250 kDa (Bio-Rad, EE.UU.)
Tampn de corrida: 25 mM Tris (Calbiochem, Inglaterra), 192 mM Glicina
(Calbiochem, Inglaterra), 1% SDS (Calbiochem, Inglaterra).
Tampn Ctodo Tris-Tricina: 0.1 M Tris (Calbiochem, Inglaterra), 0.1 M Tricina
(Sigma, EE.UU.), 0.1% SDS (Calbiochem, Inglaterra).
Tampn Anodo Tris-Tricina: 0.1 M Tris-HCl (Calbiochem, Inglaterra), pH 8.9.
http://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/SKU/161-0377/Precision-Plus-Protein-Dual-Xtra-Standardshttp://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/SKU/161-0377/Precision-Plus-Protein-Dual-Xtra-Standardshttp://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/SKU/161-0377/Precision-Plus-Protein-Dual-Xtra-Standards -
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Tampn de carga 4x: 0.25 M Tris-HCl (Calbiochem, Inglaterra) pH 6.8, 4% SDS
(Calbiochem, Inglaterra), 40% Glicerol (ISN Scientific Corporation), 0.4% Azul de
bromofenol (Merck, Alemania), 1.2 M -mercaptoetanol (Sigma, EE.UU.).
Tampn de carga Tris-Tricina: 12% SDS (Calbiochem, Inglaterra), 6% -
mercaptoetanol (Sigma, EE.UU.), 30% glicerol (ISN Scientific Corporation), 0.05%
Azul de Coomassie R-250 (Merck, Alemania), 150 mM Tris/HCl pH 7.0 (Calbiochem,
Inglaterra).
Solucin de tincin: Azul de Coomassie 0.5 g/l (Merck, Alemania), Metanol 10 %,
(TCL, Chile),
Solucin de destincin: 7 % Metanol (TCL, Chile), 5 % cido actico (Merck,
Alemania).
Matrices y columnas para purificacin de protenas:
Matriz de lecho expandido STREAMLINE SP (GE Healthcare Life Science, Inglaterra),
matriz de intercambio inico GigaCap S-650 (Tosoh Bioscience, Japn), Columna XK
16/20, Columna C 16/40, Columna C 10/10 (GE Healthcare Life Science, Inglaterra).
4.1.7. Kit comerciales.
Gel Extraction Kit EZNA (Omega Bio-Tek, EE.UU.): Kit utilizado para la
purificacin de ADN plasmidial desde geles de agarosa, basado en el uso de una matriz
de de afinidad que retiene el ADN contenido en agarosa fundida.
Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, EE.UU.): Kit que combina la
reduccin de Cu2+ a Cu1+, y la deteccin altamente selectiva de Cu1+ por el cido
bicinconnico para la cuantificacin de protenas totales.
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4.2. Metodologa.
4.2.1. Sntesis de ADN.
Se envi a sintetizar a la compaa GENEART (Toronto, Canad) el gen que
codifica para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano, seguido de un pptido de 6
residuos de arginina en su extremo C-terminal, flanqueado por los sitios de
reconocimiento para las enzimas de restriccinXhoI yNdeI.
4.2.2. Mtodos generales para la manipulacin de ADN.
Los procedimientos generales requeridos para el manejo y evaluacin del ADN
se realizaron de acuerdo a lo descrito en el Manual de Protocolos Molecular Cloning: A
Laboratory Manual(Sambrook y col. 2012). Las digestiones de ADN con las enzimas
de restriccin se realizaron de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes
(Promega, EE.UU.). Las electroforesis de ADN se efectuaron en geles de agarosa al 0.8,
y 2% peso/volumen en tampn TAE a 5 V/cm.
4.2.2.1. Transformacin de bacterias E. coli DH5mediante electroporacin.
Se adicionaron 40 L de clulas electrocompetentes DH5 descongeladas en
hielo por cada muestra de ADN plasmidial, despus de 5 minutos de incubacin en hielose introdujo la mezcla en cubetas de electroporacin de 0.1 cm de ancho (Bio-Rad,
EE.UU.), previamente enfriadas en hielo. Los parmetros de electroporacin fueron:
resistencia 200 , capacitancia 25 f y voltaje de 1.8 mV, ajustados previamente en el
electroporador (Bio-Rad, EE.UU.). Se activ el pulso elctrico con un tiempo promedio
de 8 mS, y se adicionaron lentamente 600 L de medio LB lquido a la muestra, las
clulas se incubaron a 37 C durante 1 hora. Las clulas se sembraron en placas con
medio selectivo y se incubaron a 37 C durante 16 horas.
4.2.2.2. Purificacin de plsmidos.
La purificacin del ADN plasmidial de E. colise realiz a travs del mtodo
de lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979).
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4.2.2.3. Purificacin a escala mini preparativa.
Se inocularon colonias individuales en cultivo de 5 mL de medio LB lquido
suplementado con el antibitico de seleccin ampicilina en una concentracin de 50
g/ml. Se incubaron a 37 C con agitacin durante 16 horas. Se tomaron 1.5 mL delcultivo y se centrifugaron durante 5 minutos a 6.000 rpm. El precipitado celular se
resuspendi en 100 L de solucin I y se incub a 25 C durante 5 minutos. A
continuacin se le aadieron 100 L de solucin II, se agit suavemente por inversin y
se incub en hielo durante 5 minutos. Posteriormente se aadieron 100 L de solucin
III, se agit suavemente por inversin, se incub 5 minutos en hielo y se centrifug 5
minutos a 12.000 rpm. Se extrajo el sobrenadante, se le aadi un volumen equivalente
de isopropanol y se centrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos. El precipitado se lav
con etanol al 70 % para eliminar las sales y se sec al vaco. Las muestras se
resuspendieron en 30 L de agua destilada estril y se analizaron mediante electroforesis
en gel de agarosa al 0.8%.
4.2.3.4. Purificacin a escala preparativa.
Se inocul una colonia en 300 mL de medio LB suplementado con el
antibitico de seleccin correspondiente, y se incub a 37 C con agitacin durante 16
horas. El cultivo se centrifug a 6.000 rpm durante 15 minutos a 4 C, se desech el
sobrenadante y se resuspendi el precipitado en 10 mL de solucin I. A la suspensin
celular se le adicionaron 10 mL de solucin II, se mezcl por inversin y se dej reposar
a 25 oC durante 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 10 mL de solucin III, se
mezcl por inversin, se incub en hielo durante 20 minutos y se centrifug a 12.000
rpm durante 30 minutos a 4C. Se elimin el sobrenadante, se adicionaron 0.8
volmenes equivalentes de isopropanol, y se incub a 25 oC durante 10 minutos.
Posteriormente se centrifug la mezcla a 12.000 rpm durante 30 minutos a 4 C, sedesech el sobrenadante y el precipitado se resuspendi en 600 L de agua estril. La
suspensin de ADN se incub a 37 C con 20 g/mL de ARNasa durante 2 horas. Las
protenas contaminantes se extrajeron con fenol/cloroformo, el precipitado final se
resuspendi en 300L de agua estril y la pureza del ADN se determin mediante
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espectrofotometra (espectrofotmetro SPECTROstar NANO BMG LABTECH,
Alemania).
4.2.2.5. Extraccin de protenas con fenol/cloroformo y precipitacin de ADN
plasmdico.
Por cada muestra de ADN se adicionaron 0.5 volmenes de fenol saturado y
0.5 volmenes de cloroformo. Se agitaron vigorosamente y se centrifugaron a 12.000
rpm durante 5 minutos. Se colect la fase superior y se adicionaron 2.5 volmenes de
etanol absoluto y 0.1 volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5.2. El ADN se precipit a -
20 C durante 1 hora. Las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 minutos y
se elimin la fase superior. El precipitado de ADN se lav con etanol al 70 % y
posteriormente se centrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos y se resuspendi en el
volumen deseado de agua estril.
4.2.2.6. Extraccin de ADN plasmidial a partir de gel de agarosa.
Se utiliz el kit comercial Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek, EE.UU.). Se
cort la porcin de agarosa que contena la banda de inters. El fragmento se coloc en
un tubo de centrfuga de 1.5 mL y se pes. Se adicionaron 100 L de solucin de unin
(XP2) por cada 100 mg de agarosa. Los tubos se incubaron a 50C durante 10 minutos
agitando a intervalos para favorecer la disolucin de la agarosa. Se aplicaron 700 L de
muestra en la columna comercial y se centrifug a 12.000 rpm durante 1 minutos. Se
lav la columna con 700 L de solucin de lavado (SPW), seguida de dos
centrifugaciones a 12.000 rpm durante 1 minutos. Para eluir el ADN se adicionaron
50 L de agua estril y se centrifug a 12.000 rpm durante 1 minutos. La concentracin
de ADN se determin mediante espectrofotometra (espectrofotmetro SPECTROstar
NANO BMG LABTECH, Alemania).
4.2.2.7. Digestin enzimtica de ADN plasmdico.
Para la digestin enzimtica se utiliz como material de partida ADN
plasmdico a una concentracin final entre 50 y 100 ng/L, y se emplearon enzimas de
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restriccin a razn de 1 UI por g de ADN. Las soluciones tampn, el BSA, la
temperatura de reaccin, as como otros requerimientos adicionales fueron especficos
para cada tipo de enzima segn las recomendaciones del fabricante (Catlogo New
England BioLabs, Inglaterra). Para cada reaccin se aadi de forma secuencial el ADN,la solucin tampn especfica y BSA, se adicion agua estril hasta completar el
volumen final de la reaccin y finalmente se aadi la enzima respectiva. Luego de 2
horas de incubacin a 37 C, la digestin se comprob por electroforesis en gel de
agarosa al 0.8 o 2 %.
4.2.2.8. Reaccin de ligacin.
Las ligaciones de fragmentos de ADN se realizaron con soluciones tampn y
enzimas de la firma New England BioLabs. En todas las reacciones de ligacin se
emplearon 100 ng de vector y se probaron varias proporciones banda/vector. La cantidad
de banda en cada reaccin se calcul de acuerdo a las recomendaciones de los
fabricantes (Promega, EE.UU.).
Se prepararon 4 mezclas de reaccin de ligacin. Las cantidades de reactivos para cada
reaccin se presentan en la Tabla N1.
Las ligazones con extremos cohesivos se realizaron a 25 oC durante 3 h, mientras que las
reacciones que involucraban extremos romos se realizaron a 16 C toda la noche. De
forma paralela se mont una reaccin de ligazn carente de banda para estimar en qu
medida la presencia de banda favoreca la circularizacin del plsmido.
4.2.3. Transformacin de bacterias E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL
quimiocompetentes por shock trmico.
Se tomaron 100 l de la cepa quimiocompetente, se mezclaron con el plsmido
a transformar (5 - 20 ng) y se incub en hielo durante 10 minutos.
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Reactivo VectorVector + T4
ligasa
Vector +
banda
Vector +
banda 2
Vector (l) 1 1 1 1
Tampn deenzima (l)
1 1 1 1
Banda (l) --- --- 3 6
H2O (l) 8 8 4 1
Enzima (l) --- 1 1 1
Tabla N 1. Protocolo para la preparacin de la reaccin de ligacin. Las reacciones
correspondientes a Vector y Vector + T4 ligasa corresponden a controles para la
reaccin de ligacin.
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Se dio un shock trmico a 42 C durante 2 minutos, y se volvi a incubar en
hielo durante 10 minutos. Posteriormente se adicionaron lentamente 600 l de medio LB
sin antibitico, y se incub a 37 C durante 50 minutos. Se plaquearon 150 l del
cultivo de bacterias transformadas en placas de agar LB suplementado con ampicilina50 g/ml. Las placas se incubaron a 37C durante 16 horas.
Finalmente se inocularon colonias aisladas en medio LB suplementado con
ampicilina 50 g/ml, y se crecieron hasta alcanzar una densidad ptica de 0.6. En este
punto las bacterias se mezclaron con glicerol hasta una concentracin final del 15 %.
Los gliceroles se guardaron a -80 C.
4.2.4. Cuantificacin de protenas mediante cido bicinconnico.Para cuantificar la concentracin de protenas totales se emple el kit Pierce
BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific, EE.UU.) de acuerdo a las indicaciones del
fabricante. Se prepar una curva de calibracin de BSA con concentraciones desde 0 a
1000 g/mL. Se aplicaron 25 l de cada calibrador o muestra en una placa de 96
pocillos, se adicionaron 200 l de mezcla BCA (reactivo A y B mezclados en
proporcin 50:1) y se ley la placa a 562 nm en espectrofotmetro SPECTROstar
NANO (BMG LABTECH, Alemania). La concentracin de las muestras se determin a
travs del software de anlisis de datos MARS Data Analysis Software (BMG
LABTECH, Alemania).
4.2.5. Precipitacin de protenas.
Para cada muestra de protena, se adicion 0.1 volumen de deoxicolato de sodio
15 mg/ml, se dio vrtex a la mezcla y se incub a temperatura ambiente durante 10
minutos. Se adicion 0.1 volumen de TCA 72 % y se centrifug a 10.000 rpm durante
15 minutos. Se elimin el sobrenadante, se adicion 1 volumen de acetona fra, y secentrifug a 10.000 rpm durante 5 minutos. Se elimin el sobrenadante y el precipitado
se sec al aire durante 30 segundos. Finalmente el precipitado resultante se resuspendi
en agua de biologa molecular (Brown y col, 1989).
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4.2.6. Electroforesis de protenas en condiciones reductoras y anlisis de geles.
La electroforesis se realiz en una cmara vertical MiniProtean II (Bio-Rad,
EE.UU.) y el gel se prepar segn se indica en la Tabla N2. La muestra se mezclaron
en una proporcin 4:1 con tampn de carga 4x, se calentaron a 100 C por 5 minutos y
posteriormente se cargaron en gel de poliacrilamida al 15%. La electroforesis se realiz
en tampn de corrida, a 130 V dentro del gel concentrador, y 150 V una vez que el
frente de corrida entr en el gel separador (fuente de poder para electroforesis Consort
EV202) (Laemmli, 1970).
La preparacin de los geles de Tris-Tricina/SDS-PAGE se realiz de acuerdo al
protocolo que se indica en la Tabla N3. Las muestras se mezclaron en una proporcin
2:1 con tampn de carga Tris-Tricina, se calentaron a 37C durante 15 minutos, y se
cargaron 10 ul de muestra en los carriles del gel concentrador. La electroforesis se
realiz en tampn de corrida, a 30 V dentro del gel concentrador, y 200 V una vez que el
frente de corrida entrar en el gel separador (Schgger, 2006).
El revelado del gel se realiz con solucin de tincin durante 30 minutos en
agitacin lenta. Posteriormente los geles se destieron en solucin de destincin,
durante toda la noche en agitacin constante.
El nivel de pureza de las muestras se determin mediante densitometra ptica
empleado un escner de imgenes MFC-7460DN (Brother, EE.UU.) y el programa
ImageJ v1.46. Se emple el mismo programa para determinar el peso molecular
aproximado del hEGF.
4.2.7. Crecimiento bacteriano y optimizacin de expresin de Factor de
Crecimiento Epidrmico humano.
Se establecieron las condiciones ptimas que maximizan la expresin de Factor
de Crecimiento Epidrmico humano.
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Reactivo Gel separador 6%Gel Concentrador
15%
H2O 2.6 ml 1.4 ml
Acrilamida 30% /
Bisacrilamida 1%1 ml 3 ml
*
1.5 M Tris-HCl pH 8.8 /0.5 M Tris-HCl pH 6.8
1.25 ml 1.5 ml
SDS 10% 50 l 60 l
PSA 10 % 50 l 60 l
Temed 10 l 12 l
Tabla N 2. Protocolo para la preparacin de gel de poliacrilamida al 15 %.
* Se utiliz 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 para la preparacin del gel separador, y
0.5 M Tris-HCl pH 6.8 para el gel concentrador.
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Reactivo Gel separador 4%Gel Concentrador
16%
Acrilamida/Bisacrilamida
(49.5% T/3% C)
1 ml 10 ml
Tampn Gel 3 ml 10 ml
Glicerol --- 3 g
Agua (Volumen Final) 12 ml 30 ml
PSA 10 % 90 l 100 l
Temed 9 l 10 l
Tabla N 3. Protocolo para la preparacin de gel discontinuo de Tris-
Tricina-poliacrilamida al 16 %/4%.
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4.2.7.1. Determinacin de la concentracin de IPTG ptima para la sobreexpresin
de hEGF.
Se inocularon 50 l de glicerol de bacterias transformadas con el plsmido
pET-22b(+)-hEGF-6xArg en un precultivo de 5 mL de medio LB lquido suplementadocon ampicilina 50 g/ml, y se incub en agitacin a 37 C durante 12 h. Se inocularon
15 l en 5 ml de medio LB lquido suplementado con ampicilina 50 g/ml, y es incub a
37 C hasta alcanzar una densidad ptica de 0.4 0.6. Se adicion IPTG a
concentraciones finales de 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 y 5 mM, y los cultivos se crecieron durante
2 horas. Estos se centrifugaron a 6.000 rpm durante 10 minutos, se pesaron los
precipitado hmedos, y se resuspendieron en H2O. La expresin de hEGF se analiz en
un gel de poliacrilamida al 15 % aplicando en cada pocillo 30 g de clulas de cada
condicin de crecimiento. El gel se analiz mediante densitometra, se determin la
intensidad de la banda correspondiente a hEGF-6xArg en cada condicin de
crecimiento, y se dividi por la intensidad de la banda de hEGF-6xArg en el control sin
inducir.
4.2.7.2. Determinacin del tiempo de induccin ptimo para la sobreexpresin de
hEGF.
Se inocularon 50 l de glicerol de bacterias transformadas con el plsmido
pET-22b(+)-hEGF-6xArg en un precultivo de 5 mL de medio LB lquido suplementado
con ampicilina 50 g/ml, y se incub a 37 C durante 12 h. Se inocularon 15 l en 5 ml
de medio LB lquido suplementado con ampicilina 50 g/ml, y es incub a 37 C hasta
alcanzar una densidad ptica de 0.40.6. Se adicion IPTG hasta la concentracin final
determinada en el paso anterior. Los cultivos se crecieron durante 1, 2, 4 y 6 horas. Se
centrifugaron los cultivos a 6.000 rpm durante 10 minutos, se pesaron los precipitado
celulares, y se resuspendieron en H2O. La expresin de hEGF se analiz en un gel depoliacrilamida al 15 % aplicando en cada pocillo 30 g de clulas de cada condicin de
crecimiento. El gel se analiz mediante densitometra, se determin la intensidad de la
banda correspondiente a hEGF-6xArg en cada condicin de crecimiento, y se dividi por
la intensidad de la banda de hEGF-6xArg en el control sin inducir.
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4.2.8. Extraccin y purificacin de cuerpos de inclusin.
El cultivo celular inducido se centrifug a 8.000 rpm durante 10 minutos. El
precipitado celular obtenido fue resuspendido en tampn de ruptura en una relacin de
10 ml por 1 litro de cultivo, e incubado en hielo durante 1 hora. Se lisaron las clulasmediante pulsos de sonicacin de 1 minuto a 100 % de amplitud, empleando un
sonicador Q700 SONICATOR (Qsonica, EE.UU.). La eficiencia de la ruptura celular se
optimiz empleando diferentes cantidades de pulsos de sonicacin, y se cuantific
mediante conteo de colonias en diluciones seriadas.
Posteriormente, el lisado celular se centrifug a 11.000 rpm durante 15
minutos, el precipitado obtenido se resuspendi en H2O, y se cuantificaron las protenas
totales mediante BCA. La suspensin se centrifug a 11.000 rpm durante 15 minutos, se
lav el precipitado en tampn de ruptura, y finalmente se centrifug a 11.000 rpm
durante 15 minutos.
4.2.9. Solubilizacin y renaturacin de hEGF mediante Cromatografa de Lecho
Expandido.
4.2.9.1. Determinacin de la concentracin de Urea.
Se solubilizaron 0.01 g de cuerpos de inclusin en solucin de solubilizacincon concentraciones crecientes de urea (1 - 8 M), a modo de alcanzar una concentracin
final de 1.26 mg/ml. Las suspensiones se agitaron a 160 rpm a temperatura ambiente
durante 6 horas. Posteriormente se centrifug a 12.000 rpm durante 20 minutos. Las
fracciones solubles obtenidas en cada condicin se analizaron en geles SDS-PAGE al 15
%, y se determin el porcentaje de hEGF solubilizado mediante densitometra.
La renaturacin de los cuerpos de inclusin se realiz mediante un
procedimiento de replegamiento acoplado a una matriz de lecho expandido de
intercambio inico Streamline sp. Para realizar este procedimiento se determinaron las
condiciones ptimas que maximicen la interaccin de hEGF con la matriz.
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4.2.9.2. Determinacin de la variacin del pH y concentracin de sales sobre la
capacidad de unin de la matriz.
Se tomaron 500 l de matriz Streamline sp y se mezclaron con 500 l de
tampn de equilibrio preparado a distintos pH (6.5, 7.0, 7.5, 8.0). Se adicionaron 500 gde protenas solubilizadas, y la suspensin se mezcl durante 1 hora en un rotador
Revolver Lab Rotator Tube Mixer (Labnet, EE.UU.). Se extrajo el sobrenadante que
contiene las protenas no unidas a la matriz, y esta se lav en tampn de equilibrio
durante 15 minutos. La matriz se mezcl con 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25
mM PPB) a distintos pH (6.5, 7.0, 7.5, 8.0), y se agit durante 30 minutos. Finalmente se
extrajo el sobrenadante que contiene las protenas eluidas. Las muestras de protenas no
unidas y eluidas fueron precipitadas y analizadas en un gel SDS-PAGE al 15 % por
triplicado. Mediante densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y
recuperacin de hEGF en cada condicin.
Paralelamente se mezclaron 500 l de matriz Streamline sp y tampn de
equilibrio suplementado con concentraciones crecientes de NaCl (50, 100, 150 y 200
mM). Se adicionaron 500 g de protenas solubilizadas, y la mezcla se agit durante 1
hora. Posteriormente se extrajo el sobrenadante, y la matriz se lav en tampn de
equilibrio durante 15 minutos. Se adicion 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25
mM PPB), se agit durante 30 minutos, y se extrajo el sobrenadante. Las muestras de
protenas no unidas y eluidas se precipitaron y analizaron en un gel SDS-PAGE al 15 %
por triplicado. Mediante densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y
recuperacin de hEGF en cada condicin.
4.2.9.3. Determinacin del efecto de la cantidad de protena soluble cargada sobre
la capacidad de unin de la matriz.
Se tomaron cantidades crecientes de matriz Streamline sp (0.0438, 0.0675,0.0988, 0.148, 0.222, 0.333 y 0.5 ml) y se mezclaron con 0.5 mg de hEGF solubilizado
y 285 lde buffer de equilibrio preparado a pH y concentracin de NaCl determinados
anteriormente. La suspensin se mezcl durante 1 hora en un rotador Revolver Lab
Rotator Tube Mixer (Labnet. EE.UU.). A continuacin se extrajo el sobrenadante que
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contiene las protenas no unidas a la matriz, y la matriz se lav en tampn de equilibrio
durante 15 minutos. La matriz se mezcl con 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25
mM PPB), y se agit durante 30 minutos. Finalmente se extrajo el sobrenadante que
contiene las protenas eluidas. Las muestras de protenas no unidas y eluidas seprecipitaron y analizaron en un gel SDS-PAGE al 15 % por triplicado. Mediante
densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y recuperacin de hEGF en
cada condicin.
4.2.9.4. Purificacin de hEGF solubilizado a escala preparativa.
Para la purificacin de hEGF se emplearon 30 ml de matriz Streamline sp
cargados dentro de una columna cromatogrfica C16/40. Esta se conect a un detector
de luz ultravioleta Econo UV Monitor (Bio-Rad, EE.UU.), que permite detectar la
presencia de protenas en el efluente de la columna cromatogrfica, mediante medicin a
absorbancia a 280 nm. Las etapas de equilibrio y carga de la matriz se realizaron
mediante un flujo ascendente que permitiera expandir la matriz al doble de su volumen
original. A su vez, las protenas no unidas se eliminaron de la matriz mediante un lavado
de flujo ascendente. Finalmente las protenas unidas a la matriz se eluyeron a travs de
un gradiente de NaCl en flujo descendente. En la Figura N3 se presenta un esquema del
procedimiento de replegamiento en matriz de lecho expandido. Las fracciones que
contienen las protenas no unidas y eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE al 15%.
4.2.10. Escisin de pptido 6xArg terminal y purificacin mediante cromatografa
de intercambio inico.
El hEGF renaturado se concentr y dializ contra tampn de diafiltracin,
para lo cual se emple un Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device compuesto por una
membrana de 3 kDa (Merck, Alemania). Se dializ la muestra tres veces en tampn dediafiltracin, y se llev a un concentracin final de 150 ug/ml.
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Figura N 3.Metodologa de replegamiento de protenas en matriz de lecho expandido.
Las tres primeras etapas del procedimiento cromatogrfico, equilibrio, aplicacin de la
muestra, lavado y renaturacin se realizan mediante un flujo ascendente. La velocidad
de este flujo debe ser tal que permita expandir la matriz hasta el volumen deseado. La
expansin de la matriz favorece la separacin espacial de las molculas denaturadas, con
el fin de impedir la generacin de los eventos de re-agregacin. Una vez renaturada la
molcula, esta es eluida mediante un flujo descendente.
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Se elimin el pptido 6xArg ubicado en el extremo C-terminal mediante
tratamiento con tripsina. Se determin la cantidad de solucin de tripsina necesaria para
eliminar completamente el pptido C-terminal, para lo que se realizaron digestiones
analticas de hEGF-6xArg mezclado con cantidades decrecientes de solucin de tripsina(12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8 y 0.4 g de tripsina). La mezcla se incub a 30C durante 15
minutos, y la digestin se detuvo por medio de precipitacin de las muestras. Estas se
analizaron en un gel SDS-PAGE al 15%, y mediante densitometra se determin el
rendimiento de recuperacin final de hEGF luego del paso de tratamiento con tripsina.
Finalmente, la muestra de hEGF digerida fue purificada empleando la matriz
de intercambio catinico GigaCap S-650. Para realizar esto primero se determinaron las
condiciones que favorecieran la purificacin de hEGF, y a continuacin se realiz un
purificacin a escala preparativa. La matriz GigaCap S-650 se empaquet dentro de una
columna XK 16/20 conectada a un detector de luz ultravioleta Econo UV Monitor (Bio-
Rad, EE.UU.). Se colectaron los efluentes que contenan las fracciones de protenas no
unidas a la matriz y eludas, y estas se analizaron en un gel Tricina-SDS-PAGE al 16.5%
T/4% C. Mediante densitometra se determin el rendimiento de recuperacin y la
pureza final de hEGF purificado.
4.2.11. Determinacin de la capacidad de hEGF para estimular la proliferacin
celular.
Se evalu la actividad biolgica del hEGF generado mediante el proceso
establecido, determinando su capacidad de estimular la proliferacin de la lnea celular
de fibroblastos de ratn 3T3 (Choi y col, 2012).
Las clulas 3T3 se mantuvieron a 37C en 5% de CO 2, en medio DMEM
suplementado con 10% de SFB y estreptomicina/penicilina/anfotericina.
Para determinar la capacidad proliferativa de hEGF, las clulas 3T3 sesembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5.000 clulas/pocillo en 400 l de
medio DMEM suplementado con 10% SFB. Luego de que las clulas se adhirieron a la
placa (10 horas), se estimul la proliferacin celular adicionado varias concentraciones
de hEGF y hEGF-6xArg (0 a 500 ng/ml) en medio DMEM sin SFB. Luego de 48 horas,
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las clulas se tripsinizaron y se cont el nmero de clulas viables mediante un ensayo
de exclusin con Azul de tripan (Strober, 2001). Los pocillos se contaron tres veces, y
cada condicin experimental se evalu en cuadruplicado (n = 4). La significancia de los
datos se evalu mediante una prueba t-student.Adicionalmente, se midi la estimulacin de la proliferacin en el tiempo.
Para esto, las clulas 3T3 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de
20.000 clulas/pocillo, y se incubaron a 37C durante 12 horas en 1 ml de medio
DMEM suplementado con 10% SFB. Luego de este periodo, las clulas se cultivaron en
presencia de hEGF a una concentracin final de 10 ng/ml, o en ausencia de este (control
negativo), en medio DMEM suplementado con 0.5% SFB. A los 1, 3, 5 y 7 das post-
tratamiento se cont el nmero de clulas viables mediante un ensayo de exclusin con
Azul de tripan (Strober, 2001). Las condiciones se evaluaron en triplicado (n = 3), y
cada pocillos se cont tres veces. La significancia de los datos se evalu mediante una
prueba t-student.
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5. RESULTADOS
En este trabajo de tesis se realiz la estandarizacin de un proceso de produccin
para la generacin de Factor de Crecimiento Epidrmico humano. Para esto se dise
una variante del Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a un pptido de 6
residuos de arginina en su extremo C-terminal, con el fin de facilitar el proceso de
replegamiento y purificacin de la molcula. Se emple el organismo procarionte
Escherichia coli como sistema de expresin, y se construy un vector plasmdico que
contena la secuencia gnica codificante para la protena en cuestin. A su vez, se
establecieron las condiciones ptimas de crecimiento y expresin del hEGF, junto con
los procedimientos cromatogrficos empleados para realizar el replegamiento y
purificacin del hEGF. Finalmente se comprob la actividad biolgica del hEGF
generado a travs del proceso establecido, mediante un estudio de actividad
proliferativa.
5.1. Generacin de la secuencia gnica codificante para el Factor de Crecimiento
Epidrmico humano.
Con el fin de sobreexpresar el hEGF fusionado a un pptido de 6 residuos de
arginina en su extremo C-terminal en el organismo procarionte Escherichia coli, seconstruy un vector de expresin donde la traduccin de hEGF estuviera controlada por
el promotor de la ARN polimerasa del fago T7. Para realizar esto, el segmento de ADN
que codifica para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano con la secuencia de 6
residuos de arginina se extrajo del vector comercial mediante digestin con las enzimas
de restriccin XhoI y NdeI. La banda resultante se insert en el vector de expresin
bacteriano pET-22b(+) linealizado con las mismas enzimas de restriccin, generndose
el plsmido pET-22b(+)-hEGF-6xArg. Los clones positivos derivados de este paso de
clonacin se detectaron mediante anlisis de restriccin con las endonucleasas XhoI y
NdeI. En la Fig.4 se representan de los pasos de clonacin y el anlisis de restriccin del
plsmido resultante pET-22b(+)-hEGF-6xArg.
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Figura N 4. Generacin de una secuencia codificante para el Factor de CrecimientoEpidrmico humano. (A) Representacin de los pasos seguidos para la construccin de
una secuencia codificante para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a
6 residuos de arginina en su extremo C-terminal. hEGF-6xArg, secuencia codificante
para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a 6 residuos de arginina;
Prom T7, promotor de ARN polimerasa de fago T7; Term T7, terminador de ARN
polimerasa de fago T7; f1, origen de replicacin; AmpR, gen de -lactamasa; ori, origen
de replicacin en bacteria del plsmido pBR322; lacI, represor lac. (B) Chequeo de
restriccin del vector plasmdico pET-22b(+)-hEGF-6xArg. Carril 1: vector pET-22b(+)
digerido conXho I/Nde I (banda esperada: 5206 pb); Carril 2: patrn de peso molecular
1 kb; Carril 3: vector pET-22b(+)-hEGF-6xArg digerido con Xho I/Nde I (bandas
esperadas: 5206 y 239 pb).
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La correcta insercin del segmento de ADN correspondiente al gen de hEGF se
evidenci en el anlisis de restriccin al obtenerse la banda insertada de 239 pb y el
segmento de aproximadamente 5206 pb correspondiente al vector inicial linealizado
(Fig. 4B, carril 3).
5.2. Optimizacin de la expresin del Factor de Crecimiento Epidrmico humano.
Luego de transformar el vector pET-22b(+)-hEGF-6xArg en bacterias E. coli
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, se indujo la sobreexpresin de hEGF-6xArg mediante la
adicin del inductor IPTG al medio de cultivo. Esto indujo la produccin de una protena
con una movilidad electrofortica de aproximadamente 8.6 kDa en un gel SDS-PAGE al
15%, correspondiente a hEGF-6xArg (Fig. 5A, carril 3). El tamao de la protena
generada concord con el peso molecular terico de 8.8 kDa determinado empleando la
herramienta online Compute pI/Mw presente en el servidor Expasy
(http://web.expasy.org/compute_pi/). Por el contrario, las clulas no inducidas con IPTG
no expresaron la protena de inters (Fig. 5A, carril 2).
Con el objetivo de optimizar los niveles de expresin de hEGF-6xArg sin alterar el
crecimiento celular, se determin la concentracin de IPTG y el tiempo de induccin
mnimo necesario para obtener la mayor expresin de la protena. El anlisis de la
expresin de hEGF-6xArg a diferentes concentraciones de IPTG (desde 0.1 hasta 5
mM), durante un tiempo de induccin constante de una 1 hora, revel que el efecto de la
concentracin de inductor sobre de la sobreexpresin de hEGF-6xArg fue mnimo (Fig.
5B). De esta forma, se escogi 0.5 mM de IPTG como concentracin para la induccin
de hEGF-6xArg. A continuacin, para determinar el tiempo de induccin ptimo se
analiz la expresin de hEGF-6xArg en bacterias inducidas a una concentracin final de
0.5 mM de IPTG durante 1, 2, 4 y 6 horas. En este caso, el tiempo de induccin tuvo una
influencia significativa en la expresin de hEGF-6xArg durante las 4 primeras horas. Laexpresin de la protena se increment progresivamente junto con el tiempo de
induccin, alcanzando su meseta a las 4 horas.
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Figura N 5. Optimizacin de las condiciones de induccin para la expresin de hEGF-
6xArg. (A) Anlisis de la expresin de hEGF-6xArg mediante SDS-PAGE al 15%,
Carril1: Patrn de peso molecular, Carril 2: Bacterias E. coli no inducidas con IPTG,Carril 3: BacteriasE. coliinducidas con IPTG. (B) Efecto de la concentracin de inductor
sobre la expresin de hEGF-6xArg. Cultivo inducidos a concentraciones finales de 0.1,
0.2, 0.5, 1, 2 y 5 mM de IPTG, durante 1 hora a 37C. Los valores representan el cociente
entre la intensidad de banda de hEGF-6xArg en cada tratamiento, y la intensidad de
banda de hEGF-6xArg en control negativo, la desviacin estndar. El anlisis
estadstico se realiz acorde a una prueba de Mann-Whitney; n = 3, * p 0.05. (C) Efecto
del tiempo de induccin sobre la expresin de hEGF-6xArg. Las bacterias inducidas a 0.5
mM de IPTG durante 1, 2, 4 y 6 horas a 37C. Los valores representan el cociente entre la
intensidad de banda de hEGF-6xArg en cada tratamiento, y la intensidad de banda de
hEGF-6xArg en control negativo, la desviacin estndar. El anlisis estadstico se
realiz acorde a una prueba de Mann-Whitney; n = 3, *p 0.05.
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En este tiempo se alcanz la mxima expresin de hEGF-6xARg, que result ser
2.1 veces mayor que la alcanzada a 1 hora de induccin (Fig. 5C). De esta forma, las
condiciones que maximizaron la expresin de hEGF-6xArg fueron 0.5 mM de IPTG y 4
horas de induccin. Posteriormente estas condiciones