Scian, Romina
Mecanismos inmunológicos implicados en lapatología osteoarticular por Brucella spp
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Cita recomendada:Scian, R. (2013). Mecanismos inmunológicos implicados en la patología osteoarticular por Brucella spp (Tesisde Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina. Disponible en RIDAA-UNQ RepositorioInstitucional Digital de Acceso Abierto de la Universidad Nacional de Quilmes http://ridaa.unq.edu.ar/handle/20.500.11807/137
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Scian, Romina, Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto,
diciembre de 2012, 195 pp. , http://ridaa.unq.edu.ar,
Universidad Nacional de Quilmes, Secretaría de Posgrado, Doctorado en Ciencias Básicas y Aplicadas
Mecanismos inmunológicos implicados en la patología osteoarticular por BRUCELLA SPP
TESIS DOCTORAL
Romina Scian
Resumen La brucelosis osteoarticular es la localización más común de la enfermedad activa en el hombre. Sin
embargo, hasta el momento no habían sido investigados los mecanismos inmunológicos implicados en
esta patología. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue dilucidar cuáles eran los
mediadores responsables del daño osteoarticular por Brucella abortus. La hipótesis central que fue
analizada es que B. abortus puede inducir inflamación y esta respuesta puede ocasionar la destrucción
ósea mediante diversos mecanismos: 1) la producción de metaloproteasas de matriz (MMPs), 2) la
inducción de la formación de osteoclastos (células que degradan matriz ósea) y 3) la alteración en el
número y función de los osteoblastos (células encargadas de producir la matriz ósea).
Nuestros resultados demuestran que B. abortus es capaz de infectar y replicarse intracelularmente en
osteoblastos y fibroblastos sinoviales humanos. Estas células responden a la infección produciendo MMP-
2, y las quemoquinas MCP-1 e IL-8, las cuales inducen la migración de monocitos y neutrófilos,
respectivamente. Los monocitos y neutrófilos atraídos al sitio de infección osteoarticular responden a la
infección con B. abortus y sus lipoproteínas, produciendo MMP-9. Como resultado de las interacciones de
los osteoblastos y los fibroblastos sinoviales con las células inmunes a través de citoquinas y factores de
crecimiento producidos por estos tipos celulares frente a la infección por B. abortus, pudimos demostrar
que TNF-α sería una de las principales citoquinas implicadas en la producción de MMPs.
Nuestros estudios sobre la implicancia de la osteoclastogénesis patológica en el daño óseo mediado por
Brucella, revelaron que la infección por B. abortus, mediante un mecanismo que involucra a sus
lipoproteínas vía TLR-2 y la molécula adaptadora MyD88, induce la diferenciación de osteoclastos a partir
de precursores de médula ósea en presencia de M-CSF. Mediante la utilización de precursores de
osteoclastos deficientes en el receptor de TNFR1 y anticuerpos neutralizantes demostramos que la
inducción de la formación de osteoclastos también está mediada por TNF-α.
La infección por B. abortus es capaz de inducir la apoptosis de los osteoblastos, así como también de
inhibir la diferenciación y función de los mismos como células implicadas en la deposición de matriz
orgánica y mineral. Además, demostramos que los macrófagos infectados contribuyen tanto en la
inducción de la apoptosis, como en la inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos
mediante la producción de TNF-α en respuesta a la infección.
Por otro lado, tanto la infección directa de los osteoblastos como el estímulo con los sobrenadantes de los
macrófagos infectados también inducen un incremento en la expresión de RANKL en la superficie de los
osteoblastos. Esta molécula podría interactuar con RANK presente en la superficie de los precursores de
osteoclastos y de ese modo contribuir a la inducción de osteoclastogénesis patológica.
Nuestros resultados aportan evidencias de que B. abortus y sus lipoproteínas interaccionan con los
osteoblastos y fibroblastos sinoviales atrayendo monocitos y neutrófilos al sitio de infección, los cuales
contribuyen al establecimiento de una respuesta inflamatoria que produce daño osteoarticular, mediante
un mecanismo en el que TNF-α sería la principal citoquina involucrada. Lugar de trabajo: Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral (IDEHU) e Instituto de Inmunología,
Genética y Metabolismo (INIGEM)
Agradecimientos
A mi directora Vic; por haberme guiado durante toda la tesis, por su asesoramiento
científico contínuo, por haberme permitido realizar este trabajo en un marco de confianza y
estímulo constante, y por su humor.
Al Dr. Alberto Fossati; por haberme permitido ingresar al grupo mediante una beca de la
ANPCyT, por sus valiosas y acertadas sugerencias y por contribuir enormemente en las
correcciones de esta tesis.
Al Dr. Pablo Baldi; por estar siempre bien dispuesto a compartir y transmitir sus
conocimientos sobre inmunidad y biología de Brucella.
Al Dr. Guillermo Giambartolomei; por sus valiosas críticas y sugerencias, por fomentar la
discusión científica en forma constante y por las correcciones de la tesis.
A Pau; por su permanente disposición, ayuda y paciencia, especialmente con el citómetro
de flujo.
Al Dr. Gilson Costa Macedo y el Dr. Sergio Costa Oliveira; por aportar los ratones TLR KO
y contribuir con los experimentos.
Al Dr. Diego Comerci; quien nos proporcionó las mutantes virB10.
A la Dra. Silvia Di Genaro; quien nos cedió los ratones TNFRp55 KO.
A mis compañeros y amigos del IDEHU; Cori, Mark, Marian, Sole, Vir, Melu, Pool, Santi,
Eli, Andre y Marilin, por haber compartido éxitos y fracasos, por tantas charlas y after-labs,
y sobre todo por haber hecho el día a día tan divertido.
A mis compañeros del Satz; por haberme recibido con los brazos abiertos, por compartir
inquietudes, por la compañía y diversión en la última parte de mi trabajo.
A mis amigas del alma; que siempre estan en todo lo que hago.
A Carli; por estar, compartir su tiempo y acompañarme en la última etapa.
A mi familia; por acompañarme y apoyarme incondicionalmente.
Parte de los resultados de este trabajo han sido publicados en:
- Prepatellar bursitis due to Brucella abortus: case report and analysis of the local
immune response. Wallach JC, Delpino MV, Scian R, Deodato B, Fossati CA, Baldi
PC. J Med Microbiol. 2010 Dec; 59 (Pt 12):1514-8.
- Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor- and tumor necrosis factor
alpha-mediated matrix metalloproteinase production by human osteoblasts and
monocytes after infection with Brucella abortus. Scian R, Barrionuevo P,
Giambartolomei GH, Fossati CA, Baldi PC, Delpino MV. Infect Immun. 2011 Jan;
79(1):192-202.
- Potential role of fibroblast-like synoviocytes in joint damage induced by Brucella
abortus infection through production and induction of matrix metalloproteinases.
Scian R, Barrionuevo P, Giambartolomei GH, De Simone EA, Vanzulli SI, Fossati
CA, Baldi PC, Delpino MV. Infect Immun. 2011 Sep; 79(9):3619-32.
- Macrophage-elicited osteoclastogenesis in response to Brucella abortus infection
requires TLR2/MyD88-dependent TNF-α production. Delpino MV, Barrionuevo P,
Macedo GC, Oliveira SC, Genaro SD, Scian R, Miraglia MC, Fossati CA, Baldi PC,
Giambartolomei GH. J Leukoc Biol. 2012 Feb; 91(2):285-98.
- Brucella abortus invasion of osteoblasts inhibits bone formation. Scian R,
Barrionuevo P, Fossati CA, Giambartolomei GH, Delpino MV. Infect Immun. 2012
Jul; 80 (7):2333-45.
Índice
ABREVIATURAS
INTRODUCCIÓN GENERAL
BRUCELOSIS Generalidades Historia Etiología
Brucella spp. Composición de la membrana y estructura antigénica Biología de Brucella spp.
Epidemiología Fuentes y vías de infección
Diagnóstico, tratamiento y control Respuesta inmune contra Brucella spp.
Inmunidad innata Componentes celulares de la inmunidad innata Receptores implicados en el reconocimiento de Brucella spp.
Inmunidad adaptativa Células T αβ CD4+ y CD8+ Células T γδ Respuesta humoral
Citoquinas Patogenia
Factores de virulencia Respuesta inflamatoria y patogenia Activadores bacterianos de la respuesta inflamatoria
EL HUESO Composición y dinámica normal del hueso
Los osteoclastos Los osteoblastos Los osteocitos
El hueso en condiciones inflamatorias
BRUCELOSIS OSTEOARTICULAR
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
CAPÍTULO I “Rol de las metaloproteasas de matriz en la patogénesis de la brucelosis osteoarticular”
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cultivo de bacterias 2. Cultivo celular 3. Infección celular 4. Zimografía 5. Medición de los niveles de MMP-9 y MMP-2 6. Ensayo de migración
7. Estimulación con medio condicionado 8. Medición de la concentración de citoquinas 9. Neutralización de las citoquinas y bloqueo de sus receptores 10. Actividad gelatinolítica en condiciones nativas. 11. Clonado, expresión y purificación de la proteína recombinante Omp19 de B. abortus 12. Lipoproteínas y LPS 13. Estimulación con los antígenos de B. abortus y los agonistas de los TLRs 14. Bloqueo de los receptores de tipo Toll (TLRs) 15. Evaluación de la reacción inflamatoria articular en el modelo murino 16. Determinación de marcadores inflamatorios en las muestras de líquido sinovial 17. Análisis estadístico
RESULTADOS 1. Osteoblastos
1.1. B. abortus invade y se replica intracelularmente en la línea celular de osteoblastos humanos hFOB 1.2. La infección con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α o IL-1β, en osteoblastos 1.3. B. abortus induce la producción de MMP-2 en osteoblastos a través de la secreción de GM-CSF 1.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos
2. Osteoblastos y su interacción con monocitos 2.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos 2.2. Los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos debido principalmente a TNF-α 2.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, y este efecto está mediado principalmente por GM-CSF 2.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de MMP-9 en los monocitos indirectamente a través de la inducción de TNF- α
3. Osteoblastos y su interacción con neutrófilos 3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de neutrófilos 3.2. Los sobrenadantes de neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de osteoblastos 3.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos
4. Interacción entre B. abortus, los osteoblastos, los monocitos y los neutrófilos como determinantes de patología ósea 5. Fibroblastos sinoviales
5.1. B. abortus invade y se replica en la línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982 5.2. La infección de los fibroblastos sinoviales con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α e IL-1β 5.3. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales
5.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos
6. Fibroblastos sinoviales y su interacción con monocitos y neutrófilos 6.1. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α 6.2. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-9 por parte de los monocitos a través de GM-CSF. 6.3. Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α 6.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos a través de IL-6
7. Interacción entre B. abortus, los sinoviocitos, los monocitos y los neutrófilos 8. B. abortus produce un incremento neto en la actividad de las metaloproteasas secretadas por los osteoblastos, monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales 9. Componentes estructurales de B. abortus están implicados en la inducción de MMPs por sinoviocitos, monocitos y neutrófilos
9.1. Monocitos 9.1.1. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, pero no de MMP-2 por parte de los osteoblastos 9.1.2. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos vía TLR2 9.1.3. L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos a través de la inducción de TNF- α
9.2. Neutrófilos 6.2.1. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos
9.3. Fibroblastos sinoviales 9.3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas en fibroblastos sinoviales humanos, y este efecto está mediado por L-Omp19 a través del reconocimiento de TLR2
10. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c 11. Bursitis prepatelar causada por la infección con B. abortus: producción local de citoquinas proinflamatorias y gelatinasas
DISCUSIÓN Osteoblastos Fibroblastos sinoviales Las lipoproteínas de Brucella en la inducción de MMPs Modelo murino Paciente con bursitis brucelar
CAPÍTULO II “Inducción de la osteoclastogéneis por la infección con B. abortus”
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS 1. Animales 2. Cultivo de bacterias 3. Lipoproteínas y LPS
4. Cultivo celular 5. Infección celular 6. Ensayos de infección o estimulación de los macrófagos/monocitos con B. abortus 7. Ensayo de formación de osteoclastos 8. Análisis de la expresión del receptor de vitronectina 9. Análisis por RT-PCR 10. Medición de citoquinas y RANKL 11. Ensayo de degradación de dentina 12. Evaluación de la formación de osteoclastos en un modelo in vivo 13. Análisis estadístico
RESULTADOS 1. Los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos 2. Los macrófagos murinos infectados con B. abortus producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero no RANKL o TGF-β 3. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos murinos estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos 4. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp 19 y la concomitante osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2 5. La formación de osteoclastos inducida por los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 está mediada por TNF-α. 6. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la infección con B. abortus a través de la secreción de TNF-α 7. L-Omp19 y B. abortus inducen osteoclastos diferenciados capaces de degradar matriz mineral 8. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos en la tibia de ratones mediante un mecanismo dependiente de TLR2 9. Esquema con los resultados mostrados en este capítulo
DISCUSIÓN
CAPÍTULO III “Inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos por la infección con B. abortus”
INTRODUCCIÓN
MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cultivo de bacterias 2. Cultivo celular 3. Infección celular 4. Estimulación con medio condicionado 5. Zimografía 6. Medición de la concentración de citoquinas 7. Bloqueo de TNF-α 8. Expresión de RANKL 9. Evaluación de la apoptosis 10.Diferenciación de osteoblastos 11.Determinación de la deposición de colágeno mediante tinción con Rojo Sirio
12.Determinación del depósito de osteocalcina 13.Determinación de la deposición de calcio mediante Alizarina Roja 14.Determinación de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL) 15.Análisis estadístico
RESULTADOS 1. B. abortus invade y se multiplica en osteoblastos provenientes de cultivo primario de calvaria murina 2. La infección con B. abortus induce la expresión de KC, MCP-1 y MMPs por parte de los osteoblastos de calvaria 3. La infección con B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos 4. La infección con B. abortus induce la expresión de RANKL en los osteoblastos de calvaria 5. La infección con B. abortus inhibe la diferenciación de los osteoblastos de calvaria 6. B. abortus inhibe la deposición de minerales por parte de los osteoblastos de calvaria 7. B. abortus inhibe la deposición de matriz orgánica 8. TNF-α presente en los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos de calvaria 9. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de apoptosis de los osteoblastos de calvaria 10. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus inhiben y la deposición de matriz orgánica y mineral por parte de los osteoblastos de calvaria, principalmente a través de TNF-α 11.Esquema con los resultados obtenidos en este capítulo
DISCUSIÓN
DISCUSIÓN GENERAL
CONCLUSIÓN GENERAL
BIBLIOGRAFÍA
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Abreviaturas
ATCC American Type Culture Collection
BCIP-NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato)-(azul de nitro-tetrazolio)
BMP Proteínas morfogenéticas del hueso
BSA Albúmina sérica bovina
cDNA Ácido desoxiribonucleico complementario
Ckb Creatina quinasa b
DC Células dendríticas
DMEM Dulbeco´s Modified Eagle´s Medium
DNA Ácido desoxiribonucleico
ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
FAL Fosfatasa alcalina
FITC Isotiocianato de fluoresceína
fMLP N-formil-L-metionil-L-Leucil-L-fenilalanina
GM-CSF Factor estimulante de colonias granulocítico-macrofágicas
h/s Hora/s
HKBA Brucella abortus muerta por calor
IFN Interferón
Ig Inmunoglobulina
IGF Factor de crecimiento insulínico
IL Interleuquina
IL-1Ra Antagonista del receptor de IL-1
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosido
KC Quemoquina derivada de queratinocitos
LPS Lipopolisacárido
MCP-1 Quemoquina quimioatractante de monocitos
M-CSF Factor estimulante de colonias de macrófagos
MHC Complejo mayor de histocompatibilidad
min. Minutos
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MMP/s Metaloproteasa/s de matriz
MOI/s Multiplicidad/es de infección
NFκB Nuclear factor kappa B
NK Células citotóxicas naturales
Omp Proteína de la membrana externa
OPG Osteoprotegerina
PAMPs Patrones moleculares asociados a patógenos
PBMCs Células mononucleares derivadas de sangre periférica
PBS Buffer fosfato salino
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PE Ficoeritrina
PFA Paraformaldehído
PrPC Proteína priónica celular
RANKL Ligando del receptor activador de NFκB
RNA Ácido ribonucleico
RPMI Roswell Park Memorial Institute
SDS Dodecil sulfato de sodio
SFB Suero fetal bovino
SP-1 Esfingosina 1-fosfato
TGF Factor de crecimiento transformante
Th1 T “helper” 1
TIMPs Inhibidores titulares de metaloproteasas
TLR/s Receptor/es tipo TOLL
TNF Factor de necrosis tumoral
TNFRI Receptor de TNF tipo I
TRAP Fosfatasa ácida resistente a tartrato
TSA Agar tripteína de soya
UFC Unidades formadoras de colonias
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Introducción general
BRUCELOSIS
Generalidades
La brucelosis es una zoonosis endémica de distribución mundial causada por
bacterias Gram negativas del género Brucella que se comportan como patógenos
intracelulares facultativos. La enfermedad afecta al hombre y a distintas especies animales
tanto domésticas (bovinos, caprinos, porcinos, caninos, ovinos) como salvajes (camellos,
delfines, roedores, etc.). Algunas de estas especies se encuentran muy relacionadas con
la alimentación y la actividad laboral ganadera [1]. La disminución de la capacidad
reproductora y abortos en el ganado, el nacimiento de crías débiles y la contaminación de
lácteos y carne generan un gran impacto económico-social ya que ocasionan pérdidas
tanto en la industria agropecuaria como en la salud pública. En nuestro país se considera
que las pérdidas económicas relacionadas con la enfermedad superan los 300 millones de
pesos anuales [2].
Historia
El primer aislamiento de bacterias del genero Brucella fue realizado en 1887 por el
médico del Ejército británico David Bruce, de los bazos de soldados que morían en la isla
de Malta. La bacteria fue denominada inicialmente Micrococcus melitensis. Recién en 1904
se determinó que la cabra era el reservorio del agente causal, luego de aislarse el
microorganismo de la orina y de la leche. El segundo aislamiento se produjo en 1895 por el
veterinario danés Bang quien describió un organismo causante de abortos en el ganado
vacuno denominándolo Bacillus abortus; el tercero fue cultivado en Estados Unidos en
1914 a partir del feto de un cerdo abortado (Bacillus suis). Alice Evans fue la primera en
sugerir un parentesco entre los tres microorganismos y en 1920 los incluyó en un género
aparte, denominado Brucella [3], en honor a su descubridor.
Etiología Brucella spp.
Las especies del género Brucella pertenecen a la clase α-proteobacteria, orden
Rhizobiales, familia Brucellaceae [4]. Este género está constituido por cocobacilos Gram
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negativos pequeños, inmóviles y aerobios estrictos, de crecimiento lento que no poseen
cápsulas ni forman esporas y son muy resistentes a la desecación. Esto contribuye a que
puedan permanecer viables durante largo tiempo en la paja y el polvo de los establos, o en
los alimentos, como leche, manteca y queso. A diferencia de muchas otras bacterias, su
genoma está constituido por dos cromosomas circulares y carece de plásmidos [5]. El
género Brucella es un género en expansión. Hasta el año 2008 constaba de 8 especies
clasificadas de acuerdo a variaciones antigénicas y al hospedador preferencial. Estas eran:
B. melitensis, B. suis, B. abortus, B. pinnipedialis, B. cetaceae, B. neotomae, B. canis y B.
ovis [6]. De estas 8 especies sólo 5 son patógenas para el hombre: B. melitensis, B.
abortus, B. suis, B. canis y B. pinnipedialis. De ellas, las 3 primeras son responsables de la
mayoría de los casos de brucelosis humana [7-9] (Tabla 1). En el 2008 se reportaron 2
nuevas especies: B. microti [10] (aislada a partir de ratones salvajes) cuya secuencia es
muy similar a la de B. suis y B. inopinata [11], aislada en un implante mamario de una
mujer de 71 años con síntomas de brucelosis. B. melitensis, B. abortus y B. suis se
encuentran además subdivididas en distintas biovariedades en base a diferencias en
propiedades serológicas y de cultivo [8]. Recientemente se secuenciaron los genomas de
muchas de las especies de Brucella los cuales proveerán abundante información para
dilucidar los mecanismos de patogenicidad de la bacteria [12].
Tabla 1
Especies Hospedador Patogenicidad en humanos
B. melitensis Caprinos, ovinos, camélidos Elevada
B. suis Porcinos, roedores salvajes Moderada
B. abortus Bovinos, camélidos, búfalos, bisontes Moderada
B. pinnipedae Focas, lobos marinos ModeradaB. cetaceae Cetáceos Desconocida
B. neotomae Roedores DesconocidaB. ovis Ovinos No posee
B. canis Caninos ModeradaEspecies rugosas
Especies lisas
Composición de la membrana y estructura antigénica
La envoltura celular de las bacterias del género Brucella está formada por una
membrana interna, una membrana externa y un espacio periplasmático intermedio. Desde
un punto de vista antigénico, en la membrana externa de Brucella existen dos
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componentes fundamentales: el lipopolisacárido (LPS) y las proteínas. El LPS es una
molécula anfipática que consta de una parte exclusivamente polisacarídica dirigida hacia el
exterior, y otra parte glucolipídica (lípido A) inserta en la membrana externa, y por tanto no
expuesta en la superficie (Ilustración 1).
La parte polisacarídica del LPS se divide en dos secciones: un oligosacárido
intermedio, llamado núcleo; y el polisacárido O, también conocido como cadena O que es
la estructura antigénica más expuesta de la bacteria. (Ilustración 1). La longitud de la
cadena O es variable, pudiendo presentar desde 30 a 100 residuos de glucosa [13]. El
lípido A contiene glucosamina y diaminoglucosa. En sus grupos amino e hidroxilos
presenta sustituciones por ácidos grasos de variada longitud de cadena. El lípido A del
LPS de Brucella, a diferencia del lípido A de la mayoría de las enterobacterias, posee una
estructura atípica caracterizada por su alta hidrofobicidad, su bajo grado de sustitución y
por poseer cadenas alifáticas más largas [14]. El núcleo contiene glucosa, manosa y ácido
3, deoxi-D-mano-2 octulosónico y no contiene ni heptosas ni fosfatos. El polisacárido O es
un homopolímero lineal compuesto por n-residuos de N-formil perosamina.
Ilustración 1
Peptidoglicano
Omp10 Omp16Omp 31 Braun Omp19 Omp2b Omp25
Lípido A
Núcleo
Cadena O
LPS (cepas lisas)
LPS (cepas rugosas)
Membrana externa
Espacio periplásmico
Membrana interna
Peptidoglicano
Omp10 Omp16Omp 31 Braun Omp19 Omp2b Omp25
Lípido A
Núcleo
Cadena O
LPS (cepas lisas)
LPS (cepas rugosas)
Membrana externa
Espacio periplásmico
Membrana interna
Las proteínas de la membrana externa (Omps) se asocian estrechamente con el LPS
y muchas de las mismas han sido caracterizadas desde el punto de vista genético,
inmunológico, estructural y funcional [15]. Estas proteínas se clasifican en tres grupos de
acuerdo a sus pesos moleculares, Grupo 1: se relacionan con la biosíntesis de la propia
envoltura celular (89-94 kDa), Grupo 2: equivalentes a las porinas de otras bacterias Gram
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negativas (35- 40 kDa) [16-19] y Grupo 3: interaccionan fuertemente con el LPS (25-30
kDa) [15, 20]. Las proteínas de los grupos 2 y 3 se encuentran en mayor cantidad y son
conocidas como Omps “mayores”. Las proteínas del grupo 1 junto con otras con pesos
moleculares entre 10 y 20 kDa, son denominadas Omps “menores”. Estos tres grupos de
proteínas se encuentran expuestos en la membrana externa, y son reconocidos por el
sistema inmune en el curso de la infección [21]. A través de diversos estudios se ha
confirmado la inmunogenicidad de las Omps y su posible utilidad como vacunas [22-26].
En base al aspecto de las colonias obtenidas en medio sólido, las diferentes especies
de Brucella se clasifican habitualmente como lisas o rugosas (Tabla 1). El aspecto que
adquieren las colonias se debe a la composición química del LPS en la superficie
bacteriana, en las cepas rugosas el polisacárido O está ausente (Ilustración 1). Las cepas
de Brucella en fase lisa son las más virulentas para el hombre [27].
Biología de Brucella spp.
Las bacterias de este género son microorganismos intracelulares facultativos
capaces de sobrevivir y multiplicarse dentro de las células del sistema reticuloendotelial y
los tejidos asociados. Son capaces de infectar fagocitos profesionales (macrófagos,
linfocitos B y células dendríticas) y no profesionales , así como también células no
fagocíticas [7, 28-34].
Los mecanismos de ingreso de la bacteria a estas células no han sido
completamente dilucidados, aunque se presume que el LPS y las proteínas de la
membrana externa podrían participar en los mismos, mediante receptores tipo manosa o
integrinas, respectivamente [35, 36]. En fagocitos no profesionales, la internalización
requiere un gasto de energía, y los inhibidores del metabolismo energético y de la
endocitosis mediada por receptor pueden suprimir este proceso. Brucella posee un
sistema de dos componentes llamado BvrS/BvrR, el cual codifica para un sensor de
histidina quinasa y controla la expresión de los determinantes moleculares necesarios para
la invasión celular [37].
Las cepas lisas de Brucella entran a las células macrofágicas a través de sitios en la
membrana celular ricos en colesterol conocidos como “lipid rafts” o macrodominios
lipídicos. Esto no ocurre en el caso de las cepas rugosas. Como las cepas lisas y rugosas
difieren en la composición de su LPS, particularmente de la cadena O polisacarídica, esta
cadena podría ser la responsable de dirigir la entrada a través de los “lipid rafts”. Este
mecanismo de entrada pareciera ser clave para la supervivencia de la bacteria en los
macrófagos infectados, ya que la disrupción farmacológica de los “lipid rafts” lleva a una
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fagocitosis independiente de los mismos y a la posterior eliminación de todas las bacterias
fagocitadas [38].
Watarai y col. propusieron que Brucella interactuaría con una proteína priónica
celular (PrPC) de los macrófagos; esta proteína está anclada por una unión
glicosilfosfatidilinositol en los “lipid rafts”. Esta interacción estaría mediada por la presencia
en membrana de la proteína de choque térmico 60 (HSP60) de Brucella. La proteína PrPC
podría ser necesaria para la fagocitosis mediada por “lipid-rafts” y consecuentemente para
permitir la supervivencia intracelular de Brucella [39, 40].
Dentro de las células macrofágicas, estos microorganismos son capaces de inhibir la
fusión del fagosoma al lisosoma [28]. De esta manera, si bien los macrófagos son capaces
de lisar a la mayoría de las bacterias fagocitadas, un bajo porcentaje logra sobrevivir y
replicarse intracelularmente. Experimentos realizados con macrófagos murinos infectados
con B. abortus demostraron que hay una disminución inicial del número de organismos
luego de la fagocitosis. Durante esta etapa hasta un 90-99% de los organismos son
eliminados, mientras que las bacterias que logran sobrevivir se replican posteriormente
[41, 42]. Así, el macrófago se transforma en el nicho replicativo de bacterias viables en las
formas crónicas de la enfermedad. Las cepas rugosas de Brucella también son capaces de
bloquear la fusión fagolisosomal, aunque con menor eficiencia que las cepas lisas [43].
La supervivencia de Brucella dentro de las células se ha asociado con la síntesis de
enzimas antioxidantes [44] y a la producción de guanosina 5´monofosfato y adenina, que
inhiben la fusión fagosoma-lisosoma, la degranulación, la activación del sistema
mieloperoxidasa-haluro y la producción del factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) [45]
Para formar la vacuola replicativa (o brucelosoma) en macrófagos es necesario que
la vacuola interactúe con el retículo endoplasmático. El comienzo de la replicación coincide
con el momento en que se detectan proteínas del retículo endoplasmático en la vacuola
que contiene Brucella. El brucelosoma madura en una vía endocítica por fusión continua
con compartimentos endocíticos tempranos o tardíos. La disminución del pH del
compartimento facilita la expresión de genes que se activan con la acidez del medio y que
son necesarios para la supervivencia y división intracelular de Brucella. El operón más
importante de respuesta a la acidez, es el VirB, que codifica para el sistema de secreción
tipo IV [46]. La replicación de la bacteria tiene lugar dentro del retículo endoplasmático sin
afectar la integridad celular. Recientemente se ha demostrado que luego de la replicación
en el retículo, la vacuola que contiene a Brucella adquiere características de vacuola
autofágica [47].
No se han encontrado dentro del genoma de Brucella los sistemas de secreción tipo
I, II y III ni islas de patogenicidad, tampoco se identificaron factores de virulencia clásicos
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como toxinas, fimbrias o cápsula, por lo que estos microorganismos parecieran utilizar
mecanismos únicos para evadir al sistema inmune, penetrar a las células, alterar el tráfico
intracelular, impidiendo su degradación y muerte en los lisosomas, y modular el ambiente
intracelular para permitir su replicación y larga sobrevida en dicho nicho [48, 49].
Epidemiología
La incidencia y prevalencia de la brucelosis varían según el área geográfica. Las
zonas con mayor prevalencia son el Mediterráneo, el oeste de Asia y algunas zonas de
África y Latinoamérica, especialmente países con bajos recursos económicos [50, 51]. A
nivel mundial, la infección en animales con B. abortus es la más frecuente a pesar de la
vacunación masiva; excepto en Europa y en Australia donde ha sido prácticamente
erradicada. En América del Norte, la brucelosis afecta preferencialmente zonas agrícolas
del norte y centro de México [52], aunque en Canadá y Estados Unidos ha disminuido en
los últimos años. Sin embargo, no ha sido completamente erradicada debido
fundamentalmente a la transmisión entre el ganado y animales salvajes que servirían de
reservorio [53, 54]. En América Central todos los países son afectados por B. abortus,
siendo la prevalencia de hasta un 8% [51]. En Sudamérica se encuentra en varios países,
en la mayoría es endémica y representa un problema sanitario importante [50, 55]. En
Chile, sobre todo en las zonas ganaderas y productoras de leche, se encuentra la mayor
concentración de ganado infectado [56].
La incidencia de la brucelosis es más alta en nuestro país, si bien la enfermedad se
encuentra subdiagnosticada y subreportada [57]. El número de personas que adquiere la
infección anualmente oscila entre 10.000 y 20.000 [58]. Datos aportados por el SENASA
en el año 2005 muestran que la prevalencia de la brucelosis en los bovinos fue del 5%
[59]. Sin embargo, una encuesta realizada el mismo año por el INTA Bariloche, la
Dirección de Ganadería de la provincia de Río Negro y el laboratorio de brucelosis de la
Fundación Barrera Patagónica, reveló que la prevalencia de la enfermedad era de 21,4 %
de establecimientos positivos con B. abortus -con un rango de 10% al 40%- y una tasa de
reaccionantes del 3,7% [60]. Las áreas más afectadas son el nordeste, la pre-cordillera de
los Andes, la Mesopotamia y la pampa húmeda, ubicando a la brucelosis en el cuarto lugar
entre las enfermedades transmisibles crónicas de la Argentina, después de la enfermedad
de Chagas, la tuberculosis y la sífilis.
La distribución geográfica de la brucelosis humana está en estrecha relación con la
distribución de la brucelosis animal. La incidencia puede variar desde valores inferiores a
0,01/100.000 habitantes en los países desarrollados hasta cifras superiores a 200/100.000
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habitantes en los países menos desarrollados. En la Argentina, donde no sólo hay un
importante consumo de lácteos y carnes, sino que además la producción y elaboración de
estos productos es una de las principales actividades económicas, la incidencia es muy
alta siendo una de las enfermedades laborales más importantes [58, 61].
Fuentes y vías de infección
Si bien en condiciones propicias Brucella puede sobrevivir en el medio ambiente por
períodos relativamente largos, no hay evidencias de que este microorganismo se replique
en un grado significativo en dichas circunstancias. La fuente de infección la constituyen los
animales infectados que excretan gran cantidad de bacterias junto con los tejidos y
productos de abortos, en la leche, y en menor medida en las secreciones genitales. Estos
animales también manifiestan la enfermedad, solo que con diferente sintomatología
dependiendo del hospedador y la especie de Brucella de la que se trate. La entrada de las bacterias en el hombre se puede producir por contacto directo con
material infectado, por aerosoles o alimentos contaminados a través de las vías
conjuntival, inhalatoria, gástrica o dérmica en la piel lesionada. La vía de ingreso más
importante es a través de la mucosa oronasal [62]. La brucelosis presenta dos patrones
epidemiológicos: un patrón urbano-alimentario, por consumo de leche cruda y quesos
contaminados; y un patrón rural-laboral, por exposición profesional al ganado infectado o
sus productos ya sea por contacto o inhalación. Además, la entrada por inoculación
accidental con cepas vacunales es frecuente en peones y veterinarios [63, 64]. Las
infecciones asociadas al trabajo de laboratorio representan el 2% de los casos [65]. Debido
a su potencial epidémico, la ausencia de una vacuna humana, y la eficiencia de la
infección por aerosoles, Brucella es clasificada como un patógeno de nivel de bioseguridad
3 y es considerado un potencial agente bioterrorista [66].
La mínima dosis infectiva capaz de inducir brucelosis activa depende de la especie
de Brucella y de la vía de entrada (Tabla 2) [67]. En países en los que la infección por
Brucella es endémica en la población animal, la infección por Brucella en humanos es
frecuente [68]. Sin embargo, la transmisión persona a persona es extremadamente
inusual.
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Tabla 2 [67]
Oral InhalaciónB. melitensis 5000 1300B. abortus 106 <100
B. suis 107 <100
Número de organismosEspecie
Diagnóstico, tratamiento y control
En general el diagnóstico de la enfermedad es difícil debido a que los síntomas que
caracterizan a la enfermedad en la primera etapa no son patognomónicos [37]. Además de
considerar la historia clínica, es recomendable realizar un estudio bacteriológico
complementado con el análisis de los anticuerpos séricos. Si la enfermedad es
diagnosticada tempranamente y se trata en forma adecuada tiene, en general, una
evolución favorable.
Para corroborar el diagnóstico se realizan estudios de laboratorio como detección de
anticuerpos específicos contra Brucella en sangre por seroaglutinación. También se puede
utilizar el diagnóstico por PCR (Polymerase Chain Reaction) el cual es altamente
específico e incluso sirve para distinguir entre las diferentes especies de Brucella, pero su
costo hace que la seroaglutinación siga siendo la técnica más utilizada. Aunque el
diagnóstico de certeza se establece aislando al microorganismo a partir de cultivos de
sangre, médula ósea u otros tejidos; esto solo se logra en un 50% de los casos donde los
métodos serológicos dieron positivos [69].
En las formas agudas de la enfermedad, la administración precoz y prolongada de
una apropiada combinación de antibióticos durante períodos de varias semanas (en
promedio de 6 a 8) provoca la remisión del cuadro clínico en al menos el 90% de los
pacientes. La asociación de doxiciclina y estreptomicina constituye el tratamiento de
elección ya que en estas condiciones se presenta un menor porcentaje de pacientes con
recaídas [70]. La administración de doxiciclina y rifampicina es empleada como tratamiento
alternativo.
En cuanto al control de la enfermedad, dado que no existen hasta el momento
vacunas para humanos, la forma más efectiva de tratar esta zoonosis es evitar que se
infecten los animales. Las vacunas para animales más utilizadas se obtienen a partir de
cepas vivas atenuadas. Actualmente se utilizan dos cepas vacunales lisas: B. abortus cepa
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19 (S19) para el ganado vacuno y B. melitensis REV-1 para pequeños rumiantes, y una
cepa atenuada rugosa: B. abortus RB51 para el ganado vacuno [50].
En Argentina la brucelosis humana es una enfermedad que persiste en las regiones
donde la infección animal no está controlada. Algunas medidas de prevención a tener en
cuenta son: programas de saneamiento del ganado, educación para la salud en áreas
endémicas, medidas de higiene y seguridad en el trabajo y control sanitario en las
fronteras.
Respuesta inmune contra Brucella spp.
Inmunidad innata Componentes celulares de la inmunidad innata.
En estadíos tempranos de la infección por Brucella, el rol de la respuesta innata es
reducir el número inicial de bacterias promoviendo un ambiente adecuado para generar
una respuesta Th1 en el hospedador [8]. Los macrófagos, los neutrófilos y el complemento
juegan un rol clave en esta fase temprana de la respuesta a la invasión frente a este
microorganismo [71].
Muchos autores [45, 72, 73] han demostrado que los macrófagos y los neutrófilos
poseen la capacidad de destruir a un alto porcentaje de las bacterias fagocitadas. Se pudo
determinar que la fagocitosis y el estallido respiratorio en macrófagos son dependientes de
la opsonización de las bacterias por Acs y complemento, y también de la activación celular
por el interferón gama (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) que puedan
producir otras células [45, 73]. Todas las especies del género Brucella son sensibles a los
metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, sin embargo son capaces de inhibir la
degranulación de los gránulos primarios y secundarios aumentando su supervivencia
intracelular [45, 74].
Se ha demostrado que Brucella puede sobrevivir dentro de las células dendríticas
(DC) tal como lo hace en otros tipos celulares [75]. Además de las DC “clásicas” (B220-
LY-6C- NK1.1-), en modelos murinos, se han definido recientemente varios subtipos de DC
especializados. Las DC plasmocitoides, que expresan los marcadores B220+ CD11b- LY-
6C+ NK1.1-, se especializan en la producción de IFN-α y respuestas antivirales [76]. Las
NK DC, expresan CD11b- DX5+ NK1.1+ y poseen funciones tanto citotóxicas como de
presentación antigénica [76]. Un estudio reciente ha implicado a las DC B220- CD11b+ LY-
6C+ NK1.1- iNOS+ en la infección con Brucella sugiriendo que las mismas serían los
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principales efectores de la respuesta Th1 murina contra bacterias intracelulares y que las
mismas podrían también tener un rol importante en el desarrollo de la respuesta Th1 en
humanos. El mismo trabajo también ha demostrado que la activación de las DC
inflamatorias durante la infección de ratones con Brucella es dependiente de la
señalización a través de Myd88, y que las DC B220- CD11b+ LY-6C+ son reclutadas y
activadas durante la infección y constituyen las principales células productoras de iNOS
[76]. Resultados obtenidos en nuestro laboratorio indican que B. abortus es capaz de
inducir la maduración de DC e inducir una respuesta Th1 en DC humanas [77]. Por otro
lado, utilizando un modelo de infección en ratón, recientemente se ha demostrado que las
DC, contribuyen no solo como células efectoras sino como reservorios en la patogénesis
de la brucelosis [78]. Sin embargo, cuando el ingreso se produce por vía intranasal
contribuyen a la eliminación de la bacteria en el pulmón [79].
El rol de las células NK en la infección con Brucella no está del todo claro. Estas
células no parecieran prestar una función fundamental en la erradicación de Brucella
durante la infección aguda. Los ratones susceptibles BALB/c y los resistentes C57BL/10
controlan la infección por B. abortus 2308 en ausencia de células NK [80]. En pacientes
con brucelosis, la actividad de las células NK se encuentra aparentemente suprimida [43].
Sin embargo, el co-cultivo de células NK humanas con macrófagos infectados con B. suis,
activa a las NK para producir IFN-γ y TNF-α y destruir a los macrófagos infectados. Los
niveles de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) son
normales en éstas células, de modo similar a lo que ocurre en macrófagos murinos
infectados con B. abortus [81], por lo que la inducción de muerte por las células NK no
ocurriría por este mecanismo. Tampoco está claro, cómo la infección suprime a las células
NK, un mecanismo que parece ser exclusivo de la infección en humanos no
evidenciándose en la infección murina [80].
Receptores implicados en el reconocimiento de Brucella spp.
Los TLRs (Receptores de tipo Toll) juegan un rol importante en el inicio de la
respuesta inmune innata. Estos receptores presentes en células fagocíticas profesionales
reconocen los distintos patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) uniéndose
directamente a ellos, reclutando un grupo de adaptadores intracelulares con dominios TIR
e iniciando así una cascada de activación que va a culminar con la activación de MAP
quinasas y factores de transcripción (como NF-kB) que modulan la producción de
citoquinas, quemoquinas y expresión de moléculas co-estimulatorias. Estos receptores
pueden ser activados por diversos productos microbianos; TLR2 (formando heterodímeros
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con TLR1 o TLR6) reconoce productos de la pared celular de bacterias Gram positivas y
lipoproteínas bacterianas; TLR3: dsRNA, TLR4: LPS, TLR5: flagelina, TLR9: motivos CpG
no metilados y TLR7/8: ssRNA [82].
Estudios recientes han revelado las cascadas de señalización intracelulares que
participan en el inicio de la respuesta inmune mediada por TLR en la infección por Brucella
[83]. Los receptores TLR2, TLR4 y TLR9 han sido implicados en las interacciones del
hospedador con Brucella. Las vías de señalizaciones dependientes de MyD88 e
independientes de TRIF participan en la activación de la respuesta innata por parte de
Brucella. Además, se ha demostrado el rol crítico de la molécula MyD88 en la maduración
de las células dendríticas y la producción de Interleuquina (IL)-12 durante la infección por
B. abortus [84]. También hay que destacar la contribución de NOD y los receptores IFN
tipo-I durante la infección por Brucella [85].
Inmunidad adaptativa
Se han identificado 3 mecanismos de la respuesta inmune adaptativa que parecen
tener un rol en el control de la infección por Brucella. Primero, el IFN-γ producido por
células T CD4+, CD8+ y γδ activa las funciones bactericidas del macrófago inhibiendo la
supervivencia intracelular de la bacteria. Segundo, la citotoxicidad T CD8+ y γδ puede
destruir al macrófago infectado. Tercero, los isotipos de anticuerpos de tipo Th1 como
Inmunoglobulina (Ig)G2a e IgG3 opsonizan al patógeno y facilitan la fagocitosis [86, 87].
Células T αβ CD4+ y CD8+
Se ha caracterizado la importancia tanto de las células T CD4+ como CD8+ en la
inmunidad contra Brucella [24, 88] . Estudios de transferencia adoptiva de Winter y col. [87]
han demostrado que la inmunidad protectora contra B. abortus S19 en ratón se debe a un
efecto combinado de células CD4+ (L3t4) y CD8+ (Lyt2). Sin embargo, experimentos en
ratones deficientes en los genes que codifican para moléculas MHC-I o MHC-II
demuestran que los ratones que no tienen células T CD8+ controlan la infección más
lentamente que los ratones de la cepa salvaje. Los ratones deficientes en células T CD4+
controlan la infección en forma similar a los ratones de la cepa salvaje [89]. Por otro lado,
otros autores utilizando B. abortus 2308 sugieren que los ratones deficientes en β2
microglobulina controlan eficazmente la infección y que las células T CD8+ no son
importantes hasta después de la primera semana de infección [81, 90]. Esto último está
demostrado ya que ratones BALB/c con una deleción en el gen de IFN-γ, pueden prevenir
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el incremento de unidades formadoras de colonias (UFC) después de la primera semana
posterior a la infección. En este mismo trabajo se demuestra que tanto la neutralización del
TNF-α como la depleción de células T CD8+ producen el aumento de las UFC a las 3
semanas postinfección. Se ha descripto que linfocitos T CD8+ son activados durante la
infección con Brucella [89, 91] y se han caracterizado algunos antígenos que están
involucrados en la inducción de esta respuesta citotóxica [88, 92].
Células T γδ
Se ha descripto que las células T con el receptor T Vγ9Vδ2 está aumentado a nivel
periférico en pacientes agudos infectados con B. melitensis [93]. Estas células activadas
por antígenos no peptídicos controlan el número de bacterias intracelulares porque
secretan TNF-α e IFN-γ activando las funciones bactericidas del macrófago. Estudios in
vitro sugieren que las células T Vγ9Vδ2 también podrían lisar directamente a las células
infectadas [94].
Respuesta humoral
Tempranamente en la infección aparecen anticuerpos que suelen permanecer
detectables en el suero durante años. Estos anticuerpos están dirigidos contra varios
componentes del microorganismo, pero especialmente contra los antígenos superficiales,
particularmente el LPS [95]. Los anticuerpos producidos colaboran en la lucha del
hospedador contra el patógeno pero no son suficientes para evitar la enfermedad,
seguramente debido al estilo de vida intracelular de Brucella spp. Sin embargo, la
detección de anticuerpos dirigidos contra el LPS es útil para el diagnóstico, y seguimiento
de la infección [95].
Citoquinas
Hay varias citoquinas que juegan un rol importante en el control de la infección por
Brucella spp.: IL-12, IFN- y TNF- α .[96, 97].
La IL-12 es la responsable de dirigir la respuesta inmune hacia un perfil de tipo Th1
tanto in vitro como in vivo [98, 99] con producción de IFN-, y es producida por células B,
macrófagos y DC. Si bien se conoce la importancia de esta citoquina en brucelosis [100,
101]; los mecanismos de inducción de IL-12 en estas células no se han esclarecido.
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El IFN- permite a la inmunidad enfrentarse a Brucella mediante la activación de las
funciones bactericidas del macrófago, induciendo la apoptosis, aumentando la
diferenciación celular y la producción de citoquinas, induciendo el “switch” de IgG a IgG2a
y aumentando la expresión de moléculas involucradas en la presentación antigénica [37,
45].
La relevancia del IFN- en la resolución de la infección por Brucella se evidencia en
estudios con ratones deficientes en el gen de esta citoquina ya que éstos mueren luego de
6 semanas de la infección con B. abortus [90]. Sin embargo a pesar de ser Brucella un
potente inductor de IFN-, esta bacteria es capaz de sobrevivir y reproducirse durante un
largo período en el bazo de ratones infectados [102]. Otros estudios han sugerido que la
activación con IFN- impide que Brucella establezca su nicho replicativo, y por tanto si ya
se estableció el brucelosoma, el IFN- no tiene efecto alguno [41]. La producción temprana
durante la infección de una citoquina inmunomoduladora como IL-10 podría explicar en
parte este fenómeno [103].
Recientemente, se ha demostrado en el modelo murino que IFN- producido en la
infección por B. melitensis cumple un rol fundamental en el control de la infección. En
contraste, IL-17 parecería no desempeñar una función crucial ni favoreciendo ni
controlando la infección[104].
Estudios conducidos hasta la fecha han revelado que B. abortus puede inducir en
diversos tipos celulares la producción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1β, IL-6, IL-
12 y TNF-α [13, 32, 77, 96, 101, 105-109].
El IFN- es el componente crucial de la inmunidad que permite la sobrevida del
hospedador, y así el estado crónico de infección. A pesar que las células T CD4+ y CD8+
están claramente involucradas en la producción de interferón, y que las células T CD8
pueden ser citotóxicas, el rol para las células NK y la citotoxicidad no se ha sustentado
experimentalmente [67].
Patogenia
El cuadro clínico y la evolución de la infección varían en función de la especie animal
afectada. La especial afinidad de las bacterias por el endometrio grávido y la placenta fetal
condiciona que la principal manifestación clínica de la infección aguda en los bovinos sea
el aborto durante el último tercio de la gestación, o el nacimiento de animales prematuros
poco viables [110]. Se estima que el 40 al 50% de las vacas afectadas tienen
obstaculizadas su capacidad reproductora, como resultado de la enfermedad [111]. La
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enfermedad es generalmente asintomática en las hembras no preñadas. En bovinos
machos provoca alteraciones testiculares y una disminución de la fertilidad, acompañadas
algunas veces por abscesos en testículos y epidídimo [112].
En el hombre presenta una gran tendencia a la cronicidad y se caracteriza por fiebre
y localización de las bacterias en distintos tejidos (articulaciones, hueso, endocardio,
sistema nervioso). La supervivencia intracelular de Brucella condiciona el curso ondulante
de la enfermedad y la tendencia a la recaída y evolución crónica.
Si bien constituye una enfermedad de baja mortalidad, puede dejar secuelas
discapacitantes de magnitud variable. Por otra parte, la brucelosis humana no presenta un
cuadro clínico característico que permita una detección precoz del infectado, lo que
favorece la evolución a la cronicidad, complicando las alternativas terapéuticas y la
curación definitiva. Muchos pacientes padecen infecciones asintomáticas. El período de
incubación varía entre 10 y 20 días, aunque la sintomatología puede aparecer varios
meses después.
La brucelosis puede ser clasificada como aguda, subaguda o crónica en base al
tiempo de evolución de la misma [13, 113]. La virulencia y la tendencia a la cronicidad
varían entre especies de Brucella, siendo B. abortus y B. suis las de mayor tendencia a la
cronicidad. Por el contrario, B. melitensis produce las infecciones más severas, tanto en
humanos como en animales [13]. La etapa aguda se manifiesta con fiebre elevada,
escalofríos, sudoración de olor característico, dolores musculares y articulares [113]. Es
difícil la identificación de la enfermedad en esta etapa, ya que los signos y síntomas
pueden ser comunes a otras enfermedades como la fiebre tifoidea, tuberculosis y
leptospirosis. Debido al empleo de los antibióticos ya no se registra el clásico patrón de
fiebre ondulante. El recuento de células en sangre se caracteriza usualmente por una
leucopenia moderada y una relativa linfocitosis, junto con una leve anemia y
trombocitopenia [37]. La tercera parte de los pacientes presenta tos seca o productiva, el
30% estreñimiento, el 5-10% diarreas. En el 50% de los casos se produce hepatomegalia
(ligera o moderada) y esplenomegalia y en el 25% adenopatías. Más del 5% de los
pacientes presentan lesiones cutáneas: erupciones papulonodulares en el tronco y
extremidades, de las que puede aislarse el microorganismo. Es característico el desarrollo
de localizaciones específicas como la osteoarticular, respiratoria, genitourinaria y nerviosa.
Las recaídas o recidivas se presentan en el 15% de los casos, luego de 2 a 3 meses de la
finalización del tratamiento.
En ambas fases, aguda y crónica, se observa un proceso inflamatorio generalizado.
Los signos clínicos de esa inflamación son: fiebre ondulante, artritis, endocarditis,
meningitis, pleocitosis, infiltración monocitaria de las articulaciones, granulomas, etc. [13].
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La presencia de tejido granulomatoso es frecuentemente asociada con la persistencia de
Brucella. La liberación de bacterias de estos granulomas puede favorecer la diseminación
de la bacteria a distintas localizaciones a través de repetidos episodios de bacteremia
[114].
La complicación osteoarticular es la más frecuente de las formas localizadas de la
enfermedad, la cual puede afectar articulaciones periféricas, articulaciones sacroilíacas o
la columna vertebral [115-118]. En las etapas tempranas de la brucelosis humana se
puede presentar una artritis inflamatoria intermitente o crónica, que asemeja otras formas
de artritis inflamatorias humanas [13].
En el hígado, la infección con Brucella induce lesiones hepáticas que pueden ser
tanto granulomatosas como no granulomatosas [7, 119]. Histológicamente, los granulomas
muestran necrosis central, un infiltrado de células polimórficas y fibrosis periférica [120].
En neurobrucelosis, el rasgo característico de la inflamación es la meningoencefalitis,
la cual es ocasionada por la invasión al sistema nervioso central por Brucella [121]. El
examen del líquido cefalorraquídeo en la meningitis ocasionada por Brucella generalmente
revela un elevado contenido de proteínas y pleocitosis linfocítica [121]. Las biopsias
quirúrgicas del cerebro o meninges y el examen postmórtem del tejido nervioso evidencian
infiltrado linfocítico perivascular y formación de granulomas [121].
Factores de virulencia
Brucella presenta varias caraterísticas que la diferencian del resto de las bacterias
respecto a la virulencia; ya que no cuenta con factores clásicos de virulencia como
cápsulas, fimbrias, exotoxinas, exoenzimas incluyendo exoproteasas, citolisinas, formas de
resistencia, variaciones antigénicas, plásmidos y fagos lisogénicos [48, 122, 123]. En
cambio Brucella delega su virulencia en su capacidad de sobrevivir y replicarse en los
compartimentos fagocíticos vacuolares de los macrófagos.
Los macrófagos están altamente adaptados a la destrucción de bacterias, la
modulación de la apoptosis por algunas especies de bacterias es un mecanismo de
virulencia muy importante. Las cepas virulentas lisas como B. abortus 2308, son capaces
de inhibir la muerte celular programada en macrófagos humanos y de ratón [124-126]. La
inhibición de la muerte celular facilita la sobrevida y la replicación de las cepas lisas de
Brucella dentro de los macrófagos.
Respuesta inflamatoria y patogenia
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A pesar de la diversidad de signos y síntomas en la brucelosis humana, la
inflamación es un rasgo característico de esta enfermedad presente virtualmente en todos
los órganos afectados. Esta particularidad, junto con la detección de bacterias en los
tejidos inflamados, sugiere que Brucella estimula una robusta respuesta inflamatoria en los
sitios en que se localiza. La infección por B. abortus puede activar poderosamente el
sistema inmune innato y adaptativo, conduciendo a una fuerte respuesta pro-inflamatoria
que favorece un perfil Th1 tanto in vitro como in vivo [71, 99]. Como ya mencionamos, B.
abortus puede inducir en diversos tipos celulares la producción de citoquinas pro-
inflamatorias como IL-1β, IL-6, IL-12 y TNF-α [77, 96, 101, 105-107, 127, 128]. Estas
citoquinas generalmente poseen potentes funciones efectoras que se superponen para dar
lugar a distintos componentes de la inflamación como por ejemplo: necrosis tisular [129],
quimiotaxis de infiltrados celulares, inducir la secreción de colagenasas y prostaglandinas
por los fibroblastos sinoviales y condrocitos [130, 131], reabsorción ósea y destrucción del
cartílago [132], al igual que una plétora de mecanismos microbicidas. Además, se han
reportado niveles aumentados de IFN- en pacientes con brucelosis aguda [99]; y otros
estudios confirmaron que el IFN- y el TNF-α están involucrados en la patofisiología de la
brucelosis y que se encuentran estrechamente relacionados con la activación inflamatoria
de la enfermedad [99]. Sin embargo, los mecanismos por los cuales estas bacterias
desencadenan la respuesta inflamatoria son hasta el momento solo parcialmente
conocidos.
Activadores bacterianos de la respuesta inflamatoria
La mayoría de los rasgos relacionados con la patogenicidad de estas bacterias
parecen estar concentrados en su membrana externa. Dentro de los componentes de la
membrana con posible asociación a la patogenicidad, el LPS de Brucella ha suscitado
especial interés [133, 134], a pesar de que ha sido demostrado que la mayoría de las
características químicas, físicas y biológicas de esta molécula difieren cuantitativamente y
cualitativamente del LPS “clásico” de las enterobacterias [135]. A diferencia de otras
endotoxinas, el LPS de Brucella no es pirogénico, no induce una reacción de Shwartzman
localizada, no aumenta la sensibilidad del hospedador a la histamina, no activa la cascada
del complemento de manera significativa y es un mitógeno muy débil de linfocitos B
murinos y humanos. Comparado con el LPS de las enterobacterias [98, 106, 128], se
requieren concentraciones 100 veces más altas de LPS de Brucella para inducir muerte
por shock endotóxico. En cuanto a la producción de mediadores inflamatorios, se ha
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demostrado que la actividad biológica del LPS de Brucella es entre 3 y 4 órdenes de
magnitud menor que el LPS de las enterobacterias. Todas las propiedades biológicas del
LPS dependen del lípido A, cuya estructura está conservada en un gran número de
especies bacterianas [136]. La atenuada actividad biológica del LPS de Brucella parece
estar relacionada con el lípido A de esta molécula y su particular estructura química
mencionada anteriormente [137-139]. El mayor enigma que plantea el estudio de la
patogenicidad en brucelosis es cómo pueden las bacterias del género Brucella
desencadenar una respuesta inflamatoria si la actividad endotóxica de su LPS es
despreciable. En forma alternativa, B. abortus podría utilizar su ADN para provocar una
respuesta proinflamatoria. El ADN bacteriano se encuentra enriquecido en motivos CpG no
metilados los cuales han demostrado activar el sistema inmune innato [140]. Sin embargo,
se ha comprobado que el ADN de B. abortus es relativamente ineficiente en desencadenar
la producción de citoquinas [128]. Se ha demostrado que HKBA induce la producción de
TNF-α a través de una vía dependiente de TLR2; transductor específico de peptidoglicano
y lipoproteínas; e independiente de TLR4 y TLR9 [107]. Dado que el LPS y el ADN
bacteriano utilizan TLR4 y TLR9, respectivamente para estimular la producción de
citoquinas, éste último hallazgo sostiene la noción de que el LPS y el ADN de B. abortus
no están involucrados en desencadenar la respuesta proinflamatoria en brucelosis.
En estudios desarrollados en nuestro laboratorio, así como investigaciones
realizadas por otros grupos de trabajo [141-143], han demostrado que las lipoproteínas
bacterianas, ligandos TLR2 [144], son capaces de estimular la proliferación celular al igual
que la producción de citoquinas proinflamatorias. Este fenómeno está asociado a la
acilación de estas proteínas [141-143]. Además, se ha demostrado que las lipoproteínas
bacterianas también son capaces de inducir la producción de IL-10, una citoquina
antiinflamatoria, en monocitos humanos [145].
La inhibición tanto autócrina como exócrina de la producción de IL-10 da como
resultado un aumento en la producción de las citoquinas proinflamatorias IL-6 e IL-12
[146]. El hecho de que las lipoproteínas puedan inducir no sólo citoquinas inflamatorias,
sino también antiinflamatorias, como IL-10, ha reforzado la idea de que las lipoproteínas
son factores cruciales en la patogénesis de las infecciones bacterianas.
Mediante clonado y secuenciación se ha demostrado que tres genes que codifican
para Omps de B. abortus, Omp10, Omp16 y Omp19, exhiben características estructurales
de precursores de lipoproteínas, es decir que poseen un péptido señal aminoterminal que
conforma la secuencia consenso necesaria para la modificación lipídica y el procesamiento
de las lipoproteínas [147, 148]. El correcto procesamiento de Omp10, Omp16 y Omp19 en
Escherichia coli sugiere que el camino de maduración para las lipoproteínas es
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funcionalmente compartido entre Brucella spp. y E. coli [147]. Análisis fisicoquímicos y
funcionales confirmaron que Omp10, Omp16 y Omp19 son lipoproteínas y que se
encuentran expuestas en la superficie de la membrana externa de Brucella [149]. El mismo
trabajo ha demostrado que estas lipoproteínas están presentes en todas las especies del
género Brucella y sus biovares.
EL HUESO
El presente trabajo se enfoca en la patología osteoarticular mediada por Brucella, ya
que si bien las complicaciones osteoarticulares son las más frecuentes en la brucelosis
activa en el hombre los mecanismos inmunes implicados en la patología ósea o articular
por Brucella spp. no habían sido descriptos hasta el momento.
Composición y dinámica normal del hueso
El hueso es un tipo de tejido conectivo especializado el cual provee un sistema de
soporte interno a todos los vertebrados superiores. Además de su función de soporte y
protección, es la principal fuente de iones inorgánicos participando activamente en la
homeostasis de calcio en el cuerpo.
La matriz del hueso esta compuesta en un 50 a 70% por matriz mineral, 20 a 40%
por matriz orgánica, 5 a 10% por agua y < 3% por lípidos [150]. La matriz orgánica esta
compuesta en un 90% por proteínas colágenas, en su mayoría por colágeno tipo I con
trazas de colágeno tipo III y V. El restante 10% esta compuesto por proteoglicanos, como
el condroitín y el queratán-sulfato, por glicoproteínas, como la osteonectina y la
fibronectina, por proteínas con grupos -carboxiglutámicos, como la osteocalcina, y por
citoquinas como el factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y las proteínas
morfogenéticas óseas [150]. El contenido mineral del hueso es mayoritariamente
hidroxiapatita en forma de cristales [(Ca10(PO4)6(OH)2], con pequeñas cantidades de
carbonato, magnesio y fosfato ácido [150]. Estos componentes proporcionan rigidez
confiriéndole al hueso su resistencia a las fuerzas de compresión.
Para mantener la integridad estructural, el hueso se encuentra en continuo
remodelado lo cual hace posible reparar microlesiones de fatiga, cuya acumulación
comprometería la resistencia del hueso, y por otro lado permite una cierta adaptación de la
estructura ósea a los requerimientos físicos predominantes. El remodelado del hueso es
un proceso complejo y muy controlado llevado a cabo por dos tipos celulares claves: los
osteoclastos y los osteoblastos. Los osteoclastos son las células encargadas de degradar
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la matriz extracelular, mientras que los osteoblastos son las células especializadas en
sintetizar la matriz ósea [151], regular la mineralización y finalmente diferenciarse a
osteocitos o a “células de revestimiento” que tapizan las superficies óseas. Las actividades
de los osteoclastos y los osteoblastos se encuentran acopladas y altamente reguladas por
factores locales y sistémicos para mantener el equilibrio del hueso.
El remodelado del hueso ocurre dentro de las “Unidades Multicelulares Básicas”
[152] (Ilustración 2). El ciclo de remodelado comienza en la fase de iniciación que incluye
el reclutamiento de los precursores de osteoclastos, su diferenciación a osteoclastos
maduros, así como también la activación y el mantenimiento de la degradación del hueso.
Luego, sigue la fase de reversión en la cual la degradación del hueso es inhibida y los
osteoclastos mueren por apoptosis, mientras que los precursores de los osteoblastos son
reclutados y comienzan a diferenciarse. El último paso se denomina fase de terminación e
implica la formación de matriz por parte de los osteoblastos y la posterior mineralización
[153].
Ilustración 2
Unidad Multicelular BásicaUnidad Multicelular BásicaUnidad Multicelular Básica
Dado que el remodelado del hueso es un evento multicelular, la señalización e
interacción entre las células involucradas es importante en el control de este proceso.
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Los osteoclastos
Los osteoclastos son células gigantes multinucleadas que se forman a partir de la
fusión de los precursores del linaje monocito/macrófago en un proceso denominado
osteoclastogénesis [154]. Los mismos poseen dos fases funcionales, una fase móvil y una
degradativa [155]. Durante la fase móvil los osteoclastos migran desde la médula ósea al
sitio de degradación mediante la formación de lamelipodios. Durante la fase degradativa
los osteoclastos se polarizan a través de la reorganización de su citoesqueleto, lo cual
resulta en la formación de un borde rugoso con profundos pliegues por donde se secretan
iones H+, y se produce la exocitosis, mediada por vesículas, de las enzimas catepsina K y
metaloproteasas de matriz. Los iones H+ acidifican el medio lo cual disuelve la matriz
mineral mientras que las enzimas secretadas degradan la matriz proteica. El contacto con
la matriz ósea también genera en los osteoclastos la formación de un anillo rico en
filamentos de actina que rodea a la zona rugosa y sella el compartimento acidificado donde
ocurre la degradación, aislándolo del resto de la superficie ósea [156].
La diferenciación de los precursores de los osteoclastos requiere la presencia de dos
factores clave: el factor estimulante de colonias macrofágicas (M-CSF) y el ligando del
receptor activador del factor nuclear κB (RANKL). M-CSF producido por los osteoblastos
se une a su receptor c-fms en los precursores de los osteoclastos promoviendo su
sobrevida y proliferación [157]. RANKL es expresado en la superficie de los osteoblastos o
bien puede ser liberado en forma soluble, aunque también se ha documentado su
expresión por otros tipos celulares como fibroblastos, linfocitos B y T activados [158-160].
Su actividad biológica esta regulada por el inhibidor natural osteoprotegerina (OPG) que
actúa como un receptor soluble de RANKL que inhibe en forma competitiva la unión de
este último a su receptor RANK en la superficie de los precursores de osteoclastos [161]
Además de degradar matriz ósea los osteoclastos también pueden participar en la
regulación de la formación del hueso de diversas formas. A medida que los osteoclastos
degradan el hueso liberan factores inmersos en la matriz los cuales actuarían sobre los
osteoblastos promoviendo la formación del hueso. Ejemplos de estos factores son las
proteínas morfogenéticas óseas, los factores de crecimiento insulínico (IGFs) I y II, y TGF-
β [162-164]. Otro mecanismo por el cual los osteoclastos pueden regular la función de los
osteoblastos es a través del contacto directo célula-célula. Se ha reportado que la
interacción de las proteínas transmembrana ephrinB2 expresada por los osteblastos y
EphB4 expresada por los osteoclastos promueve la diferenciación de osteoblastos e inhibe
la diferenciación de los osteoclastos [165, 166]. La regulación también puede ocurrir a
través de factores liberados por los osteoclastos. Un ejemplo es el factor osteoclastico
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esfingosina 1-fosfato (SP-1) el cual ha sido involucrado en el reclutamiento de precursores
de osteoblastos y en el incremento de la producción de RANKL por estas últimas células
[167]. SP-1 también tiene efectos directos sobre los osteoclastos regulando la migración
de sus precursores [168].
Los osteoblastos
Los osteoblastos son las únicas células responsables de la formación del hueso. Se
originan a partir de células madre mesenquimales [169]. En presencia de los estímulos
adecuados estas pueden diferenciarse a preosteoblastos. Los preosteoblastos a su vez
dan lugar a osteoblastos maduros, los cuales residen a lo largo de la superficie del hueso
en los lugares de activa formación ósea. Los osteoblastos maduros secretan colágeno tipo
I y proteínas no colágenas incluyendo osteocalcina, osteopontina, sialoproteína y fosfatasa
alcalina (las cuales ejercen funciones de regulación del recambio óseo y control de la
mineralización) [170]. Los osteoblastos pueden seguir tres destinos diferentes: pueden ser
eliminados por apoptosis, pueden quedar embebidos dentro de la matriz mineralizada y
transformarse en osteocitos o pueden transformarse en células de revestimiento que
tapizan la superficie del hueso [151].
Una de las vías de señalización mas importantes que regulan la formación del hueso
es la vía Wnt/β-catenina [171]. La misma esta involucrada en la estimulación de la
proliferación y diferenciación, y promueve la sobrevida de los osteoblastos y osteocitos.
Otra vía de señalización importante involucrada en la diferenciación de los osteoblastos
incluye la vía de la superfamilia TGF-β, siendo dos miembros clave TGF-β y las proteínas
morfogenéticas óseas [172].
Como ya mencionamos los osteoblastos son capaces de regular la diferenciación de
los osteoclastos a través de la expresión de M-CSF, RANKL y OPG. Por otro lado, los
osteoblastos pueden inducir la migración de los precursores de los osteoclastos a la
superficie ósea a través de la secreción de factores quimioatractantes. Dos de estos
factores los cuales derivan de la matriz ósea son osteocalcina y colágeno tipo I [173].
Estos son producidos por los osteoblastos y son depositados en la matriz durante la
formación del hueso. Cuando los osteoclastos degradan la matriz liberan estos factores
atrayendo así más precursores de osteoclastos. La proteína quimioatractante de
monocitos-1 (MCP-1) producida por los osteoblastos también ha sido involucrada en la
atracción de los precursores de osteoclastos [174].
El proceso de remodelado también se encuentra regulado por factores sistémicos
entre los que se encuentran la hormona paratiroidea, la 1,25-dihidroxi vitamina D, los
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glucocorticoides y el estrógeno [175-178], estimulando la degradación o la formación de
hueso.
Los osteocitos
Los osteocitos son osteoblastos totalmente diferenciados que son incorporados
dentro de la matriz ósea mineralizada y constituyen las células mayoritarias del hueso. Los
mismos se encuentran espacialmente aislados unos de otros [179]. Sin embargo, poseen
una gran cantidad de prolongaciones citoplasmáticas que les permiten comunicarse entre
sí, y con los osteoblastos o las células de revestimiento que tapizan las superficies del
hueso [180]. Existen evidencias que sugieren que la principal función de los osteocitos es
la de sensar las fuerzas mecánicas e iniciar el proceso de remodelado del hueso en zonas
específicas. Las micro lesiones generadas en el hueso han sido implicadas en el inicio de
este proceso, aunque no esta muy claro aun cuáles son los mecanismos que disparan el
inicio del remodelado de la matriz ósea. Se ha descripto que los osteocitos próximos a las
microlesiones mueren por apoptosis lo cual ha sido correlacionado con un incremento en
la remodelación ósea, debido a un aumento en la producción de RANKL y un incremento
en la formación de osteoclastos [181]. Un estudio reciente ha demostrado que los mismos
osteocitos son capaces de producir RANKL [182].
El hueso en condiciones inflamatorias
Durante un proceso inflamatorio causado por ejemplo por una infección bacteriana de
los huesos y/o las articulaciones el balance existente entre la formación y la degradación
del hueso puede verse afectado. Las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e Il-6 han
sido implicadas en la progresión de enfermedades inflamatorias crónicas del hueso con un
aumento en la degradación ósea. El daño osteoarticular puede ocurrir a través de distintos
mecanismos:
(1) Producción de metaloproteasas de matriz. Se ha demostrado que los antígenos
bacterianos y las citoquinas proinflamatorias son capaces de inducir la producción
de metaloproteasas de matriz en varios tipos celulares como osteoblastos y
fibroblastos sinoviales [183, 184], presentes en los huesos y articulaciones,
respectivamente. Asimismo, los macrófagos y los neutrófilos atraídos a los tejidos
inflamados también pueden responder a dichos estímulos produciendo MMPs
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[185, 186]. Las MMPs han sido implicadas en el daño tisular dado que degradan
componentes de la matriz extracelular.
(2) Inducción de la osteoclastogénesis. Se ha reportado que TNF-α [187, 188] e IL-6
[189], así como también el incremento patológico en la expresión de RANKL por
parte de los osteoblastos [190] son capaces de inducir en forma directa la
diferenciación de los precursores de osteoclastos a osteoclastos maduros.
(3) Apoptosis e inhibición de la función de los osteoblastos. Las citoquinas
proinflamatorias TNF-α e IL-1β [191, 192] como así también distintos antígenos
bacterianos [193, 194] son capaces de inducir la apoptosis o inhibir la
diferenciación y función de los osteoblastos en la deposición de matriz orgánica y
mineral.
Brucelosis osteoarticular
Las complicaciones osteoarticulares son la forma localizada más frecuente de la
brucelosis. La prevalencia reportada de las mismas varía desde un 10% a un 85% [116,
195-198]. Esta variación ha sido atribuida a las diferencias en patogenicidad de la especie
de Brucella involucrada (siendo la infección por B. melitensis la más frecuente y grave de
las complicaciones osteoarticulares [196, 197, 199-202]), y a las diferencias en los
hospedadores y factores ambientales de la población estudiada. Las manifestaciones
clínicas más comunes son: espondilitis, sacroileítis y artritis periférica, afectando
usualmente la cadera, la rodilla, el tobillo y el hombro [115-118]. Menos frecuentemente
Brucella puede afectar otros sitios musculoesqueleticos produciendo tendinitis u
osteomieltis de huesos largos [203] y también se ha descripto infección en la bursa aunque
es inusual [204].
La espondilitis es una de las complicaciones más serias la cual se presenta en las
formas subagudas o crónicas de la enfermedad [37]. Ocurre con mayor frecuencia en las
personas mayores [205], y suele predominar el compromiso lumbar, seguido del cervical y
el dorsal. Con la extensión de la infección pueden aparecer abscesos paravertebrales,
abscesos epidurales espinales y complicaciones neurológicas [201, 202]. Incluso en
algunos casos se requiere tratamiento quirúrgico. Además del dolor lumbar los pacientes
suelen presentar fiebre, pérdida de peso, astenia y depresión. El dolor lumbar puede ser
gradual o súbito, con irradiación a los miembros inferiores con limitación en ocasiones para
la marcha.
La sacroileítis y las artritis periféricas usualmente reflejan las formas agudas de la
enfermedad y se acompañan con síntomas sistémicos. Frecuentemente responden a
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regímenes terapéuticos estándares [37]. A diferencia de la espondilitis, estas
complicaciones son reportadas usualmente dentro de las primeras tres décadas de vida
[206].
Como ocurre con otras infecciones articulares, la persistencia de la enfermedad en la
articulación infectada puede resultar en daño tisular. Aunque el cultivo de Brucella a partir
de muestras de fluido resulta dificultoso, el daño en las articulaciones ha sido
frecuentemente asociado con la presencia de Brucella en dichas articulaciones, como se
demostró por el cultivo in vitro de fluido y tejido sinovial [207, 208] demostrando que los
síntomas son causados por una verdadera infección de la articulación. Es importante
destacar que el tejido sinovial revela, característicamente, un infiltrado celular compuesto
principalmente por monocitos y neutrófilos, e hiperplasia de las células sinoviales [208-
211].
Las anormalidades radiográficas se desarrollan tarde en el curso de la brucelosis con
complicaciones osteoarticulares, y son poco frecuentes en artritis periféricas [116, 196,
212]. En la brucelosis vertebral los cambios destructivos debidos a la pérdida de tejido
óseo pueden no hacerse evidentes hasta el tercer mes de la enfermedad, en consecuencia
no se logra un diagnóstico temprano. El uso de la tomografía computada y la resonancia
magnética nuclear aportan una mejor sensibilidad para el diagnóstico temprano que los
estudios radiográficos convencionales. Por otro lado, el centellograma no es muy útil para
determinar el surgimiento de una afectación osteoarticular y para efectuar un seguimiento
ya que la incorporación anormal del material radioactivo puede persistir durante un largo
período [200, 213].
En cuanto al tratamiento terapéutico con antibióticos, se suele utilizar el mismo que
se describió anteriormente, doxiciclina y estreptomicina durante 6 a 8 semanas, aunque en
los casos de espondilitis se recomienda un período de tratamiento más prolongado, de 8
semanas o más [213, 214].
Si bien las complicaciones osteoarticulares son las más frecuentes en la brucelosis
activa en el hombre, no han sido descriptos aún los mecanismos inmunes implicados en la
patología ósea o articular por Brucella spp. Allí radica la importancia del estudio de esta
patología.
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Introducción
Hipótesis y objetivos
La brucelosis osteoarticular es la localización más común de la enfermedad activa en
el hombre, sin embargo, los mecanismos inmuno-patogénicos implicados no han sido aún
determinados.
El objetivo general de este trabajo es dilucidar los mecanismos inmunológicos
implicados en la patogénesis osteoarticular de la brucelosis.
La inflamación es un factor clave en la patogénesis de esta enfermedad. Nuestra
hipótesis es que durante la invasión al hueso y las articulaciones por parte de Brucella la
respuesta generada contra este organismo es capaz de producir un microambiente
inflamatorio responsable de la destrucción osteoarticular mediante diversos mecanismos.
Para poner a prueba esta hipótesis se propusieron los siguientes objetivos
específicos:
1) a) Evaluar la producción de metaloproteasas de matriz (MMPs) por parte de los
osteoblastos, fibroblastos sinoviales y de los neutrófilos y los monocitos
/macrófagos en respuesta a la infección por B. abortus.
b) Evaluar la producción de citoquinas, quemoquinas y factores de crecimiento por
parte de los distintos tipos celulares en respuesta a la infección.
c) Estudiar la interacción de los osteoblastos y fibroblastos sinoviales, con las
células inmunes. En particular evaluar si factores producidos por cada tipo celular
en respuesta a la infección induce la producción de MMPs en el otro tipo celular.
2) Investigar la capacidad de B. abortus de inducir la diferenciación de precursores de
osteoclastos a osteoclastos maduros con la capacidad de resorber matriz ósea, y
determinar los factores involucrados en dicho proceso.
3) Investigar si la infección con B. abortus inhibe la diferenciación y función de los
osteoblastos, y evaluar el rol de los macrófagos en dichos procesos.
Una hipótesis secundaria que será examinada es que las lipoproteínas de B. abortus,
y no su LPS, pueden inducir, parcial o totalmente, los efectos inflamatorios producidos por
la bacteria.
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CAPÍTULO I “Rol de las metaloproteasas de matriz en la patogénesis de la brucelosis osteoarticular” Introducción
Las metaloproteasas de matriz (MMPs) son una familia de endopeptidasas
dependientes de Zn+2 y Ca+2, que degradan proteínas de la matriz extracelular. Hasta el
momento se conocen al menos 23 MMPs en humanos, las cuales se encuentran
clasificadas según su especificidad de sustrato en colagensas (MMP-1, -8, -13 y -18),
gelatinasas (MMP-2 y MMP-9), estromelicinas (MMP-3, -10, -11 y -17), matrilicinas (MMP-
7 y -26), MMPs de unión a membrana (MT-MMPs, MMP-14, -15, -16, -17, -24 y -25) que
pueden degradar gelatina, fibronectina y laminina, y otras MMPs que no pueden ser
incluidas en ninguna de las clases mencionadas [215-219]. Las MMPs participan en
procesos fisiológicos normales que requieren la remodelación de la matriz extracelular tal
como el desarrollo embrionario, la angiogénesis, cicatrización de heridas, migración
celular, etc. Sin embargo, en condiciones patológicas, han sido asociadas al desarrollo de
enfermedades que involucran la destrucción del tejido conectivo tales como artritis,
invasión tumoral, progresión de varias enfermedades infecciosas y aterosclerosis [215,
220, 221]. Debido a su capacidad destructiva, la actividad de las MMPs se encuentra
estrictamente regulada en diferentes niveles. Su expresión es controlada a nivel
transcripcional por citoquinas, factores de crecimiento y hormonas. Son secretadas como
proenzimas que requieren ser clivadas para su activación y además poseen una marcada
regulación por parte de inhibidores endógenos, los inhibidores tisulares de
metaloproteasas (TIMPs). Los TIMPs son una familia de 4 proteínas secretadas (TIMP-1 a
TIMP-4) que se unen no covalentemente al dominio catalítico de las MMPs inhibiendo su
actividad [222]. Por lo tanto, la capacidad de degradar matriz depende del balance entre
los niveles de MMPs y la disponibilidad de los TIMPs extracelulares [223]. El balance entre
las MMPs y los TIMPs es un determinante crítico de la integridad y función de la matriz
extracelular, alteraciones en la relación MMP/TIMP pueden contribuir al desarrollo de
condiciones patológicas.
En numerosas enfermedades osteoarticulares incluyendo artritis reumatoidea,
osteoartritis y espondiloartritis se han detectado niveles incrementados de MMPs en forma
local [224-227]. También se ha demostrado la contribución de las MMPs en el desarrollo
de varias artritis infecciosas como en la enfermedad de Lyme, en periodontitis causadas
por diferentes bacterias y en artritis causadas por Staphylococcus aureus [228-230].
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Las metaloproteasas MMP-2 y MMP-9 son relevantes en las enfermedades
osteoarticulares dado que son capaces de degradar varios tipos de colágeno incluyendo
colágeno tipo IV (presente en la membrana basal), colágeno tipo V (presente en el hueso),
colágeno tipo II (presente en el cartílago) y colágeno fibrilar desnaturalizado (gelatina)
[217, 224]. Los monocitos y neutrófilos activados secretan altas cantidades de MMP-9
frente a diferentes estímulos bacterianos y citoquinas proinflamatorias como TNF-α e IL-1β
[185, 186, 231]. Por otro lado, también se ha demostrado que tanto los osteoblastos
(células del hueso que sintetizan la matriz ósea) como los fibroblastos sinoviales (células
que forman la membrana sinovial de las articulaciones) son capaces de secretar MMP-2
[183, 184].
Como se mencionó anteriormente la complicación osteoarticular es la presentación
más frecuente de las formas localizadas de la brucelosis. La presencia de infiltrado
inflamatorio [209, 210], junto con la detección de la bacteria en el fluido sinovial de
pacientes con brucelosis articular [207, 208], sugiere que Brucella estimula una robusta
respuesta inflamatoria local. Aunque el LPS de Brucella se encuentra desprovisto de
actividad proinflamatoria [98], se ha demostrado que la producción de citoquinas
proinflamatorias por varios tipos celulares se debe principalmente a las lipoproteínas de
Brucella [77, 108, 109, 232, 233]. Esta inflamación excesiva observada en los pacientes
con brucelosis podría causar daño en el hueso y en las articulaciones, en parte debido a
un incremento en los niveles de MMPs.
En este contexto nos propusimos investigar la participación de los osteoblastos y
fibroblastos sinoviales humanos, y su interacción con las células inmunes (monocitos y
neutrófilos) en la inducción de MMPs que podrían ser relevantes en la patogénesis
osteoarticular de la brucelosis. Nos focalizamos en el rol de las citoquinas proinflamatorias
y componentes bacterianos, principalmente las lipoproteínas, como mediadores del daño
óseo y articular a través de la inducción de las MMPs.
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Capítulo I
Materiales y métodos
1. Cultivo de bacterias
Brucella abortus S2308 fue crecida durante 18 hs. en 10 ml del medio tripteína de
soja en agitación constante de 150 rpm a 37°C. Las bacterias se centrifugaron por 15 min
a 6000g a 4°C y fueron lavadas dos veces en 10 ml de buffer fosfato salino (PBS). La
concentración de bacterias en cultivo fue estimada comparando la densidad óptica a
600nm con una curva estándar. Para preparar los inóculos, los cultivos fueron diluidos en
PBS a la concentración deseada en base a la densidad óptica medida, pero la
concentración precisa fue determinada por recuento de unidades formadoras de colonia
(UFC) en placas de agar tripteína de soja (TSA). Para obtener B. abortus muerta por calor
(HKBA), las bacterias fueron lavadas 5 veces con PBS por 10 min. cada lavado, fueron
calentadas a 70°C por 20 min., divididas en alícuotas y guardadas a -70°C hasta ser
utilizadas. La ausencia de viabilidad de B. abortus se comprobó mediante la ausencia de
crecimiento bacteriano en placas de agar tripteína de soja. Todas las manipulaciones de
las bacterias viables fueron realizadas en instalaciones con un nivel de bioseguridad 3,
localizados en el Centro Nacional de Referencia del SIDA, Facultad de Medicina,
Universidad de Buenos Aires, gracias a un convenio de colaboración establecido con el Dr.
H. Salomón.
2. Cultivo celular
La línea celular inmortalizada de osteoblastos fetales humanos hFOB 1.19 (en
adelante abreviada hFOB) fue obtenida de American Type Culture Collection (ATCC).
Estas células tienen la capacidad de diferenciarse a osteoblastos maduros que expresan el
fenotipo normal de osteoblastos [234]. La línea celular hFOB fue cultivada como una
monocapa en DMEM/F-12 (Gibco) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 10% de suero
fetal bovino (SFB, Gibco), 100 U de penicilina/ml, y 100 µg de streptomicina/ml.
La línea celular monocítica humana THP-1 fue cultivada en RPMI 1640 (Gibco)
suplementado con SFB, aminoácidos y antibióticos como se describió en el párrafo
anterior.
Los neutrófilos humanos fueron aislados de sangre venosa de voluntarios humanos
sanos mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll-Paque (GE Healthcare), seguido
de la sedimentación de los eritrocitos en dextran al 6% y una lisis hipotónica con agua
destilada durante 30 segundos. Los neutrófilos fueron recolectados, lavados dos veces con
PBS estéril, y resuspendidos a una concentración de 1x106 células/ml en RPMI 1640
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suplementado con 5% de SFB, 1 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de
estreptomicina. La viabilidad celular fue del 98%, determinada por la tinción con Azul
tripán. La pureza de la preparación final de los neutrófilos fue del 95%, evaluada mediante
examen morfológico luego de una tinción con Giemsa y mediante análisis de los patrones
de dispersión de la luz por citometría de flujo.
La línea celular inmortalizada de fibroblastos sinoviales SW982 fue obtenida de
ATCC. El fenotipo de las células SW982 ha sido demostrado por la expresión de
vimentina, un marcador de fibroblastos [235, 236]. Esta línea celular ha sido utilizada para
estudiar la expresión de citoquinas inflamatorias y MMPs por los fibroblastos sinoviales en
respuesta a diferentes estímulos [235, 237, 238]. Las células fueron cultivadas en
monocapa en DMEM (Gibco) suplementado con 2 mM L-glutamina, 10% de SFB, 100 U/ml
de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina.
Todas las líneas celulares fueron cultivadas en una atmósfera de 5% de CO2 a 37ºC.
3. Infección celular
Las células fueron cultivadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 5x105
células/ml en medio completo sin el agregado de antibióticos y fueron infectadas con B.
abortus S2308 a las multiplicidades de infección (MOIs) 1, 10, 25, 50 y 100 en el caso de
los monocitos, y 100, 250, 500 y 1000 en el caso de los osteoblastos, fibroblastos
sinoviales y neutrófilos. Luego de haber dispensado la suspensión de bacterias, las placas
fueron centrifugadas durante 10 min. a 1000 X g y luego incubadas por 2 hs. a 37ºC en
una atmósfera con 5% de CO2. Las células fueron lavadas con medio para remover las
bacterias extracelulares y luego incubadas en medio sin SFB y suplementado con
albúmina sérica bovina (BSA) 0,01%, con 100 µg/ml de gentamicina y 50 µg/ml de
estreptomicina para eliminar las bacterias extracelulares (medio completo). Para
monitorear la replicación intracelular de B. abortus, las células infectadas fueron lavadas y
lisadas a varios intervalos p.i. con 0,1% (vol/vol) de Tritón X-100. El número de bacterias
viables intracelulares (UFC/ml) fue determinado mediante el recuento de UFC de
diluciones seriadas al décimo en placas de TSA.
Los sobrenadantes de los cultivos infectados fueron recolectados a las 24 hs.
postinfección (p.i.) para ser utilizados como medio condicionado y a las 24 o 48 hs. p.i.
según el caso, para medir la producción de las MMPs y las citoquinas. Solo en el caso de
los neutrófilos las MMPs se midieron a las 2 hs. p.i.
4. Zimografía
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La actividad gelatinolítica fue evaluada mediante el método de Hibbs et. al. [239].
Brevemente, 20l de medio condicionado mezclado con 5 ul de buffer de siembra (0,25 M
Tris [pH 6,8], 50% de glicerol, 5% de dodecil sulfato de sodio [SDS], y Azul de Bromofenol)
fueron sembrados en cada calle de un gel de SDS-PAGE al 10% conteniendo 1 mg de
gelatina (Sigma-Aldrich)/ml. Luego de la electroforesis, los geles fueron lavados con 50
mM Tris-HCl (pH 7,5)- 2,5% Tritón X-100 durante 30 min. y con 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) -
2,5% de Tritón X-100 - 10mM CaCl2 – 200 mM NaCl durante 48 hs. a 37ºC. Este paso de
desnaturalización/renaturalización promueve la actividad de MMP sin el clivaje proteolítico
de la pro-MMPs. La actividad gelatinolítica fue visualizada mediante la tinción de los geles
con Azul de Coomassie. Las bandas sin teñir indicaron la presencia de actividad
gelatinolítica, y su posición determinó el peso molecular de las enzimas involucradas.
La identidad de la MMP candidata fue confirmada mediante un ensayo de ELISA
como se explica más adelante.
5. Medición de los niveles de MMP-9 y MMP-2
MMP-2 y MMP-9 presentes en el medio condicionado fueron cuantificadas mediante
ELISA de sándwich utilizando anticuerpos monoclonales según las instrucciones del
productor (R&D Systems).
6. Ensayo de migración
La migración celular fue evaluada utilizando placas de microquimiotaxis de 96
pocillos con filtros de policarbonato de un diámetro de poro de 5 M (Corning, NY). Los
monocitos (células THP-1) o los neutrófilos fueron depositados en el pocillo superior de las
cámaras (106 células /ml) y los estímulos indicados (diluciones de los sobrenadantes de
cultivo de los osteoblastos hFOB o de los fibroblastos sinoviales SW982 infectados) fueron
depositados en los pocillos inferiores. La migración fue determinada contando el número
de monocitos o neutrófilos que alcanzaron el pocillo inferior luego de 2 hs. La migración
hacia el N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (fMLP, 10-7 M) (Sigma-Aldrich) se utilizó
como control positivo. El número de células que migraron se expresó como el índice
quimiotáctico: el número de células que migraron en presencia del medio condicionado/ el
número de células que migraron en presencia de medio solo.
7. Estimulación con medio condicionado
Los sobrenadantes de cultivo de las células infectadas (MOI 100) fueron recolectados
a las 24 hs. p.i., esterilizados por filtración a través de un filtro de nitrocelulosa con un
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tamaño de poro de 0,22 µm, y utilizados para estimular células. Los sobrenadantes fueron
utilizados diluidos 1/2, 1/5 y 1/10 en medio completo. Luego de 48 hs. los sobrenadantes
de los cultivos estimulados fueron recolectados para medir MMPs.
8. Medición de la concentración de citoquinas
Se midieron las citoquinas humanas IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1, TNF-α y el factor
estimulante de colonia de granulocitos y monocitos (GM-CSF) en el sobrenadante de
cultivo mediante ELISA sandwich, usando anticuerpos monoclonales específicos según las
instrucciones del productor (BD Pharmingen).
Las citoquinas de ratón IL-1β, IL-6, MCP-1 (BD Pharmingen) y KC (quemoquina
quimioatractante de neutrófilos) fueron cuantificadas por ELISA (R&D Systems Inc.) en los
sobrenadantes de los homogenados de tejido de las rodillas de los ratones inoculados con
los antígenos de B. abortus.
9. Neutralización de las citoquinas y bloqueo de sus receptores
Los ensayos de neutralización y bloqueo fueron llevados a cabo con un anticuerpo
bloqueante contra el receptor de TNF I humano (anti-TNFRI, clon 16805, R&D Systems) o
su control de isotipo (clon 11711, R&D Systems), un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α
(clon Mab1, BD Biosciences) o su control de isotipo (107.3, BD Biosciences), un anticuerpo
neutralizante anti-GM-CSF (clon BVD2-23B6, BD Biosciences) o su control de isotipo (clon
R65-95, BD Biosciences), un anticuerpo neutralizante anti-IL-6 (clon MQ2-13A5, BD
Biosciences) o su control de isotipo, y el antagonista natural IL-1Ra (R&D Systems).
En los experimentos de bloqueo, las células fueron preincubadas con los anticuerpos
anti-TNFRI (25 ug/ml) o IL-1Ra (1 ug/ml) durante 1 h. a 37ºC antes de la estimulación con
los medios condicionados o con los antígenos de Brucella. En los experimentos en los que
se utilizaron los anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α (20 ug/ml), anti-GM-CSF (0,3 ug/ml;
1, 2 o 4 ug/ml) y anti-IL-6 (5 ng/ml), el medio condicionado fue preincubado con el
correspondiente anticuerpo (o el control de isotipo) durante 1 h. a 37ºC antes de ser
utilizados. En todos los casos se utilizó el control de isotipo correspondiente. Como control
positivo se utilizó TNF-α recombinante humano (TNFrh) (BD Biosciences) a una
concentración de 2 ng/ml.
10. Actividad gelatinolítica en condiciones nativas
La actividad gelatinolítica en los sobrenadantes de cultivo en condiciones nativas fue
medida mediante el kit EnzChek gelatinasa/colagenasa (Invitrogen) según las
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instrucciones del fabricante. El kit contiene gelatina DQ, una gelatina conjugada con altas
concentraciones de fluoresceína que determinan que la fluorescencia se encuentre
apagada. Cuando este sustrato es digerido por gelatinasas o colagenasas da como
resultado la aparición de péptidos fluorescentes, y el incremento de la fluorescencia es
proporcional a la actividad proteolítica. La colagenasa purificada de Clostridium
histolyticum que provee el kit, sirvió como una enzima control. Las placas fueron leídas en
un lector de fluorescencia (Victor3; Perkin-Elmer,Waltham, MA).
11. Clonado, expresión y purificación de la proteína recombinante Omp19 de B. abortus
La secuencia completa de la proteína Omp19 fue clonada en el vector pET22b+
(Novagen). Se diseñaron oligonucleótidos específicos conteniendo los sitios de restricción
para las enzimas NdeI y XhoI en el extremo 5’, de acuerdo a las secuencias publicadas
previamente por Tibor y col. [147, 148]. Los oligonucleótidos utilizados fueron los
siguientes:
sentido 5’GTTGCCCATATGGCGTCAAAGAA3’
antisentido 5’AAACTCGAGGCGCGACAGCGTCAC3’
Para obtener la versión no lipidada de la proteína se utilizó un oligonucleótido sentido
que amplifica la región 3’ del gen sin el extremo aminoterminal correspondiente a la
secuencia del péptido señal y la cisteína aminoterminal:
sentido 5’CTGGCCATATGCAGAGCTCCCG3’
En la reacción de PCR se utilizó como templado el ADN genómico de B. abortus 544.
El producto de la reacción de ligación se utilizó para transformar bacterias competentes de
la cepa JM109 y se purificó el ADN plasmídico con un kit comercial (Promega). Las
construcciones así obtenidas (pET/L-Omp19, pET/U-Omp19) conteniendo el gen con el
agregado de una cola de histidina-6X en el extremo carboxiterminal se utilizaron para
transformar bacterias competentes E. coli BL21 (DE3) en las cuales se expresaron las
proteínas recombinantes luego de la inducción con IPTG (1mM). La proteína recombinante
lipidada Omp-19 (L-Omp-19) fue aislada de la membrana bacteriana por extracción
selectiva por separación de fases con Tritón X-114 al 2% [240]. Esta preparación fue
purificada por cromatografía de afinidad con una columna de níquel-agarosa (Ni-NTA)
(Qiagen).
La proteína no lipidada (U-Omp19) fue extraída de la fracción citosólica por
sonicación. Posteriormente, las proteínas recombinantes fueron adsorbidas con
Sepharosa-Polimixina B (Sigma Aldrich) para eliminar la contaminación con LPS de E. coli.
La concentración de LPS en las preparaciones de proteínas recombinantes fue menor a
0,25 unidades de endotoxina por µg de proteína según se determinó por el ensayo de
“Limulus Amebocyte” (Associates of Cape Cod). La concentración proteica se determinó
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por el método de ácido bicinconínico (Pierce) utilizando seroalbúmina bovina como
estándar. La proteínas purificadas fueron alicuotadas y conservadas a -70°C hasta el
momento de ser utilizadas. La pureza de las proteínas recombinantes se verificó por SDS-
PAGE seguido de tinción argéntica, el tamaño molecular se corroboró por comparación
con marcadores de peso molecular. La identidad de las proteínas se confirmó por
“Western blot” con un anticuerpo monoclonal anti- Omp19 (5C10A8). Tal como fue
descripto en nuestro laboratorio [109].
12. Lipoproteínas y LPS
El LPS de B. abortus 2308 y el de E. coli O111 K58H2 fueron cedidos gentilmente
por el Dr. I. Moriyón (Universidad de Navarra, Pamplona, España). La calidad y pureza de
estas preparaciones se encuentran descriptas en la literatura [241]. El LPS fue solubilizado
en agua por sonicación en las concentraciones apropiadas y autoclavado previo a su uso.
El lipohexapéptido sintético Pam3Cys [tripalmitoyl-S-glyceryl-Cys-Ser-Lys4-OH] fue
obtenido de Boehringer Mannheim.
13. Estimulación con los antígenos de B. abortus y los agonistas de los TLRs
Las células (5x105 células/pocillo) fueron incubadas con LPS de E. coli (100 ng/ml),
LPS de B. abortus (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml), HKBA (1x106 a 1x109 bacterias/ml),
L-Omp19 (10 a 1000 ng/ml) o S-Omp19 (1000 ng/ml) en un volumen final de 0.5 ml. Los
cultivos fueron incubados durante 24 o 48 hs., y luego se midió la producción de citoquinas
y MMPs en los sobrenadantes.
14. Bloqueo de los receptores de tipo Toll (TLRs)
Las células fueron incubadas con 20 µg/ml de un anticuerpo bloqueante humano anti-
TLR2 (clon TL2.1), anti-TLR4 (clon HTA125), o un control de isotipo IgG2a (eBioscience)
durante 1 h a 37ºC y luego incubadas con LPS de E. coli (100 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml),
HKBA (108 bacterias/ml), o L-Omp19 (1000 ng/ml) en un volumen final de 0,5 ml. Las
células no tratadas fueron incubadas en paralelo con U-Omp19 (1000 ng/ml) y LPS de B.
abortus (1000 ng/ml) como controles. Los cultivos fueron incubados durante 24 hs. y los
sobrenadantes fueron utilizados para evaluar la producción de citoquinas y MMPs.
15. Evaluación de la reacción inflamatoria articular en el modelo murino
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Los ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad fueron anestesiados con
clorhidrato de ketamina (150 mg/kg) y xilazina (15 mg/kg), y luego inoculados en forma
intra-articular en las rodillas con 50ul de HKBA (1x106 UFC), L-Omp19 (500ng), LPS de E.
coli (500ng) como control positivo o con el vehículo PBS. Los animales fueron sacrificados
5 días después de la inoculación. Para determinar los niveles de citoquinas y MMPs en las
articulaciones, las rodillas fueron separadas removiendo la piel y cortando justo por encima
y por debajo de la articulación y fueron ubicados inmediatamente en 1 ml de PBS frío. La
extracción de las articulaciones fue realizada utilizando un homogeneizador de tejido. Los
homogenados fueron centrifugados a 2000 x g durante 20 min. a 4ºC, y los sobrenadantes
fueron utilizados para la determinación de citoquinas y MMPs. En otro grupo de ratones las
rodillas fueron fijadas durante 4 días con paraformaldehído 4% y decalcificadas con EDTA
10% en 1mM Tris-HCl (pH 7,4) durante 4 semanas a 4ºC. Los especímenes fueron
incluidos en parafina [242]. Se realizaron cortes para generar secciones de 5 micrómetros
de espesor las cuales fueron teñidas con hematoxilina y eosina.
16. Determinación de marcadores inflamatorios en las muestras de líquido
sinovial
Se determinó la producción de citoquinas y MMPs en dos muestras de líquido
sinovial provenientes de un paciente con bursitis prepatelar debido a una infección por B.
abortus. Una fue tomada al momento de la presentación de la bursitis y la otra 3 meses
más tarde. Para efectuar una comparación se analizaron también 5 muestras de líquido
sinovial de pacientes con artritis reumatoidea y una muestra de un paciente con artritis
séptica de la rodilla debido a una infección con S. aureus.
Las citoquinas humanas IL-1β, IL-8, MCP-1, TNF-α e INF-γ se midieron mediante
ELISA sandwich, usando anticuerpos monoclonales específicos según las instrucciones
del productor (BD Pharmingen). Las MMPs fueron detectadas por zimografía como se
describió en la sección 4.
17. Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados mediante el análisis de varianza de un factor
(ANOVA) seguido del test de Tukey, usando el software GraphPad Prism 4.0. Los datos
están presentados como la media un desvío estándar. Los datos mostrados
corresponden a un experimento representativo de 5 experimentos realizados.
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Resultados
La localización osteoarticular es la más común en la brucelosis activa en el hombre.
Nuestra hipótesis es que B. abortus puede causar inflamación osteoarticular causando
destrucción ósea y articular mediante diversos mecanismos. En el presente capítulo se
estudió la producción de las metaloproteasas de matriz (MMPs) por distintos tipos
celulares y su contribución al daño óseo.
1. Osteoblastos
Los osteoblastos son células óseas especializadas encargadas de sintetizar los
componentes minerales y orgánicos de la matriz del hueso, y están implicadas en la
homeostasis ósea. En esta sección se estudió el rol de los osteoblastos en la producción
de MMPs y su interacción con las células inmunes que podrían ser atraídas durante la
infección por Brucella.
1.1. B. abortus invade y se replica intracelularmente en la línea celular de osteoblastos humanos hFOB.
En primer lugar evaluamos la capacidad de B. abortus de invadir y replicarse en la
línea celular de osteoblastos humanos hFOB. Para ello las células fueron infectadas con B.
abortus 2308 tal como se detalla en la sección 3 de materiales y métodos. Las infecciones
se realizaron a distintas MOIs. La magnitud de la infección, determinada mediante el
recuento de las UFC intracelulares, fue directamente proporcional a la MOI utilizada
(Figura 1).
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1.2. La infección con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α o IL-1β, en osteoblastos.
Como se muestra en la Figura 2, la infección de los osteoblastos indujo la secreción
significativa de GM-CSF, MCP-1 e IL-8 en forma dependiente de la MOI utilizada (P <
0,05). Por el contrario la infección no indujo niveles detectables en la secreción de TNF-α
ni de IL-1β (no mostrado).
Figura 1. B .abortus infecta y se replica en la línea celular de osteoblastos humanos hFOB.
0 20 40 60 80102
103
104
105
106
MOI 1000MOI 500MOI 250MOI 100
Tiempo (h)
UFC
/ml
Los osteoblastos humanos de la línea celular hFOB fueron infectados con B. abortus a diferentes MOIs y luego de dos horas fueron incubados con antibiótico para eliminar a las bacterias extracelulares. Los lisados celulares obtenidos a diferentes tiempos post-infección fueron plaqueados en TSA para determinar las UFC intracelulares.
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1.3. B. abortus induce la producción de MMP-2 en osteoblastos a través de la secreción de GM-CSF.
Para determinar si B. abortus podía inducir la producción de MMPs por parte de los
osteoblastos, se analizó la secreción de MMPs por zimografía en los sobrenadantes de
cultivo de las células infectadas (usando como matriz gelatina) y su presencia fue
confirmada y cuantificada por ELISA. Como se muestra en la Figura 3 A y B, la infección
con B. abortus indujo la secreción de MMP-2 de un modo dependiente de la MOI utilizada
(P < 0,01).
Debido a que ha sido demostrado que las citoquinas proinflamatorias y los factores
de crecimiento pueden estimular la secreción de MMPs por diferentes tipos celulares [183,
185, 231, 243-245], decidimos analizar si GM-CSF producido por los osteoblastos
infectados estaba implicado en la inducción de MMP-2. Para llevar a cabo este objetivo,
los osteoblastos fueron infectados en presencia de un anticuerpo neutralizante anti-GM-
CSF. La neutralización de GM-CSF redujo significativamente la capacidad de B. abortus
de estimular la producción de MMP-2, mientras que el control de isotipo no tuvo ningún
efecto (Figura 3 C).
Figura 2. La infección de los osteoblastos con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8.
GM-CSF, IL-8 y MCP-1 fueron cuantificadas en el sobrenadante de los osteoblastos infectados con B. abortus a diferentes MOIs a las 48 h p.i. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control (sin infectar).
Control 100 250 500 10000
350
700
*
**
******
GM
-CSF
(pg/
ml)
Control 100 250 5000
15000
30000
***
***
***
IL-8
(pg/
ml)
Control 100 250 500 10000
375
750
**
***
******
MC
P-1
(pg/
ml)
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En conjunto estos resultados indican que B. abortus es capaz de infectar
osteoblastos humanos e inducir la producción de GM-CSF que actúa sobre las mismas
células induciendo la producción de MMP-2 (Esquema 1).
C
B
Control 100 250 500 1000
Sin
trat
ar
a-G
M-C
SF
Isot
ipo
Sin
trat
ar
a-G
M-C
SF
Isot
ipo
Control MOI 100
Sin
trat
ar
a-G
M-C
SF
Isot
ipo
Sin
trat
ar
a-G
M-C
SF
Isot
ipo
Control MOI 100
La producción de MMP-2 fue determinada por ELISA (A) y por zimografía (B) en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus a las 48 hs. p.i.. **P<0,01 versus el control sin infectar. Inhibición de la secreción de MMP-2 en osteoblastos infectados con B. abortus mediante el agregado de anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo. La producción de MMP-2 fue determinada por zimografía (C).
Control 100 250 500 10000
40
80
**
** **
**
MM
P-2
(ng/
ml)
A
Figura 3. B. abortus induce la secreción de MMP-2 por osteoblastos a través de la inducción de GM-CSF.
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1.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos.
Como se mencionó en la sección 1.2. los osteoblastos secretan MCP-1 e IL-8 en
respuesta a la infección con B. abortus. Dado que estas son moléculas quimioatractantes
de monocitos y neutrófilos respectivamente, decidimos evaluar si los sobrenadantes de los
osteoblastos infectados eran capaces de inducir la migración de estas células. Para ello,
realizamos un ensayo de migración en el cual la línea celular de monocitos humanos THP-
1 o neutrófilos purificados de sangre periférica se sembraron en el compartimiento superior
de una placa de quimiotaxis mientras que en el inferior se ubicaron diferentes diluciones de
los sobrenadantes de los osteoblastos previamente infectados con B. abortus o no
infectados como control. La migración fue analizada contando la cantidad de células que
alcanzaron el compartimiento inferior luego de una incubación de 2 hs. Como se observa
en la Figura 4 A y B la migración de los monocitos y neutrófilos en presencia de los
sobrenadantes de los osteoblastos infectados y el control positivo N-formil-L-metionil-L-
leucilfenilalanina (fMLP) fue significativamente superior (P < 0,001) que la migración basal.
Por otro lado, los sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no indujeron niveles
significativos de migración respecto del basal. Estos resultados indicarían que las
quemoquinas producidas por los osteoblastos infectados jugarían un rol muy importante en
el reclutamiento de los monocitos y de los neutrófilos al sitio de infección y por lo tanto en
la inflamación local.
Esquema 1. Esquema de la producción de MMP-2 por los osteoblastos durante la infección con B. abortus
B.abortus
GM-CSF
MMP-2
Osteoblasto
B.abortus
GM-CSF
MMP-2
Osteoblasto
La infección de los osteoblastos con B. abortus induce la producción de GM-CSF, y esta citoquina actúa sobre las mismas células induciendo la producción de MMP-2.
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2. Osteoblastos y su interacción con monocitos.
2.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos.
Debido a la capacidad de los osteoblastos infectados con B. abortus de secretar
MCP-1 que atraería a los monocitos al sitio de infección, decidimos evaluar si la infección
de los monocitos con B. abortus podía inducir la producción de MMPs y de este modo
contribuir al daño óseo. Como se muestra en la Figura 5 A y B la infección de los
monocitos con B. abortus indujo la secreción de altos niveles de MMP-9 dependiendo de la
MOI utilizada (P < 0,01).
Figura 4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos.
A B
fMLP 1 1/2 1/5 10
7
14
SC-hFOB InfectadosSC
-hFO
BN
o in
fect
ados
***
IQ m
onoc
itos
Se determinó la migración de los monocitos humanos (línea celular THP-1) (A) y de los neutrófilos purificados de sangre periférica (B) estimulados con diferentes cantidades (puro y diluciones 1/2 y 1/5) de los sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus o no infectados (puro), en placas de microquimiotaxis. Las células que migraron fueron contadas luego de 2 h. Los resultados están expresados como el índice quimiotáctico (IQ: número de células que migraron al medio condicionado dividido el numero de células que migraron al medio de cultivo). La migración inducida por fMLP se usó como control positivo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control tratado con sobrenadantes de las células sin infectar.
fMLP 1 1/2 1/5 10
4
8
SC-hFOB Infectados
SC-h
FN
o in
fect
ados
***
***
**
IQ n
eutr
ófilo
s
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2.2. Los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos debido principalmente a TNF-α.
Debido a la capacidad de los osteoblastos infectados de producir factores
quimioatractantes que potencialmente podrían atraer a los monocitos al sitio de infección,
decidimos entonces estudiar la interacción entre los osteoblastos y los monocitos frente a
la infección con B. abortus. Para ello analizamos el efecto de las citoquinas secretadas por
los monocitos infectados sobre la producción de MMPs por los osteoblastos y viceversa.
Para cumplir con este objetivo, se recolectaron los sobrenadantes de cultivo de los
osteoblastos y de los monocitos infectados con B. abortus a las 24 hs. p.i., los que
posteriormente se utilizaron para estimular a los monocitos y a los osteoblastos
respectivamente.
El estímulo de los osteoblastos con los sobrenadantes de los monocitos infectados
con B. abortus en diferentes proporciones (1/2, 1/5 y 1/10) indujo la secreción de niveles
significativos de MMP-2 (P < 0,01), en una forma dosis dependiente (Figura 6 A y B). No
se observó ningún efecto cuando estas células se estimularon con los sobrenadantes de
los monocitos no infectados. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio fue
demostrado que la infección con B. abortus induce la producción de citoquinas
proinflamatorias en monocitos [101], otros autores demostraron que TNF-α e IL-1β inducen
Figura 5. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de monocitos.
Control 1 10 25 50 1000
150
300
*****
***
***
***
MM
P-9
(ng/
ml)
A
Control 1 10 25 50 100Control 1 10 25 50 100
B
La producción de MMP-9 fue determinada por ELISA en los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus a las 48 h p.i. (A) y por zimografía (B). **, P<0.01; ***, P<0.001 versus el control (sin infectar).
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la producción de MMPs en diferentes tipos celulares [246-248]. Por lo tanto, se midieron
los niveles de estas citoquinas en los sobrenadantes de células THP-1 infectadas con B.
abortus a una MOI de 100 (4500 ± 240 pg/ml para TNF-α y; 72 ± 6 pg/ml para Il-1β). Para
determinar si dichos niveles de TNF-α eran suficientes para estimular la secreción de
MMP-2 por parte de los osteoblastos, estas células fueron estimuladas con los
sobrenadantes de los monocitos infectados preincubados o no durante 1 h. con
anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se muestra en la
Figura 6 C la neutralización de TNF-α redujo significativamente (P < 0,01) la capacidad de
los sobrenadantes de monocitos infectados de estimular la producción de MMP-2 por parte
de los osteoblastos, mientras que el control de isotipo y los sobrenadantes provenientes de
los monocitos no infectados no tuvieron ningún efecto. En contraste, el bloqueo del
receptor de IL-1β mediante la preincubación de los osteoblastos con el antagonista natural
IL-1Ra no afectó la secreción de MMP-2 inducida por los sobrenadantes (no mostrado).
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Estos resultados indican que TNF-α presente en el sobrenadante de los monocitos
infectados con B. abortus está implicado en la inducción de la secreción de MMP-2 por
parte de los osteoblastos (Esquema 2).
Figura 6. Los sobrenadantes de los monocitos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos debido
principalmente a TNF-α.
A B
C
La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes de los monocitos (SC-THP-1) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). **P<0,01; ***P<0,001 versus los osteoblastos tratados con SC-THP-1 no infectados. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes de monocitos infectados con B. abortus con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1 h, antes de agregarlos a los osteoblastos (C).
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-THP-1 InfectadosSC
-TH
P-1
No
infe
ctad
os1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
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SC-THP-1 InfectadosSC
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P-1
No
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ctad
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1/2 1/5
SC-THP-1 Infectados
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Fα
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SC-T
HP-
1 N
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Sin
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1/2 1/5
SC-THP-1 Infectados
1/2
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20
40
SC-THP-1 Infectados
***
**
**
SC-T
HP-
1N
o in
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ados
MM
P-2
(ng/
ml)
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
2.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, y este efecto está mediado principalmente por GM-CSF.
A continuación decidimos estudiar el proceso inverso, el efecto de los sobrenadantes
de los osteoblastos infectados con B. abortus sobre los monocitos. Demostramos que los
sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción
significativa de MMP-9 por parte de los monocitos, en forma dosis dependiente (Figura 7 A). Los sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no tuvieron ningún efecto.
Nosotros hemos demostrado que GM-CSF es producido por los osteoblastos en
respuesta a la infección con B. abortus (Figura 2). Por otro lado, GM-CSF fue el principal
factor involucrado en la inducción de MMP-9 por parte de monocitos en otros modelos
[231, 247]. Por lo tanto, decidimos evaluar si GM-CSF presente en el sobrenadante de los
osteoblastos infectados estaba involucrado en la inducción de la producción de MMP-9 por
parte de los monocitos, para ello estos últimos fueron estimulados con los sobrenadantes
de los osteoblastos infectados en presencia de un anticuerpo monoclonal neutralizante
anti-GM-CSF. Nuestros resultados demostraron que la neutralización de GM-CSF redujo
significativamente (P<0,05) la habilidad de los sobrenadantes de los osteoblastos
infectados de inducir la expresión de MMP-9 en monocitos (Figura 7 B y C). El control de
isotipo no tuvo ningún efecto.
Esquema 2. Esquema de la producción de MMP-2 por osteoblastos durante su interacción con monocitos infectados por Brucella.
Modelo propuesto para la producción de MMP-2 por osteoblastos durante su interacción con monocitos infectados por Brucella. Los osteoblastos producen MMP-2, principalmente en respuesta a TNF-α secretado por monocitos infectados con B. abortus.
TNF-α
Monocito
B. abortus
MMP-2
Osteoblasto
TNF-α
Monocito
B. abortus
MMP-2
Osteoblasto
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Figura 7. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de monocitos, y este efecto está
mediado principalmente por GM-CSF.
1/2 1/5 1/10 1/2 Co
ntro
lSC-hFOB Infectados
SC-h
FOB
No
infe
ctad
os1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
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SC-hFOB Infectados
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ctad
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M-C
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a-G
M-C
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ctad
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1/2 1/5
SC-hFOB Infectados
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M-C
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a-G
M-C
SF
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SC-h
FOB
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ctad
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Sin
trat
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1/2 1/5
SC-hFOB Infectados
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Sin
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stra
0
55
110Sin tratara-GM-CSFIsotipo
SC-hFOB Infectados
SC-h
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No
infe
ctad
os Cont
rol
1/2 1/5 1/10 1/2
* * *M
MP-
9 (n
g/m
l)
A B
C
La producción de MMP-9 fue determinada en el sobrenadante de los monocitos estimulados con sobrenadantes de osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 y 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por zimografía (A). En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo durante 1 h, antes de agregarlos a los monocitos, y se determinó la producción de MMP-9 por ELISA (B) y por zimografía (C). *P<0,05 versus los monocitos estimulados con SC-hFOB infectados sin el tratamiento con anti-GM-CSF (sin tratar).
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2.4. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de MMP-9 en los monocitos indirectamente a través de la inducción de TNF- α
En estudios previos realizados en nuestro laboratorio hemos demostrado que GM-
CSF presente en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus está
implicado en la inducción de la secreción de TNF-α e IL-1β por parte de los monocitos [32].
Debido a que, como mencionamos previamente, estas citoquinas podrían estimular la
secreción de MMP-9 por parte de los monocitos, decidimos evaluar si GM-CSF presente
en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados era el factor responsable de la
inducción de MMP-9 por parte de los monocitos en forma indirecta a través de la inducción
de TNF- y/o IL-1β.
Como los estudios previos fueron realizados utilizando líneas de osteosarcoma
decidimos, en primer lugar, estudiar si las observaciones realizadas podrían extenderse a
los osteoblastos de la línea hFOB. En concordancia demostramos que la estimulación de
los monocito con los sobrenadantes de los osteoblastos (hFOB) infectados con B. abortus
indujeron la producción de TNF- e IL-1β por parte de los monocitos (Figura 8 A y B) (P <
0,01), y que esta inducción se debió principalmente a GM-CSF presente en dichos
sobrenadantes (Figura 8 C y D) (P < 0,01).
Para determinar si GM-CSF presente en los sobrenadantes de los osteoblastos
infectados estaba induciendo la producción de MMP-9 por parte de los monocitos usando
como mediador TNF-α o IL-1β, los monocitos fueron preincubados con anticuerpos
bloqueantes anti- TNFRI, su control de isotipo, o el antagonista natural IL-1Ra durante 1 h.
y luego fueron estimulados durante 48 hs. con los sobrenadantes de los osteoblastos
infectados. Como se muestra en la Figura 9 A y B el bloqueo del receptor de TNF-α redujo
significativamente (P<0,01) la capacidad de los sobrenadantes de los osteoblastos
infectados de inducir la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos. Por otro lado, el
bloqueo del receptor de IL-1β con IL-1Ra no tuvo ningún efecto (no mostrado).
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Figura 8. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de TNF-α por parte de monocitos y este efecto
esta mediado por GM-CSF.
1/2 1/5 1/10 1/20
200
400
SC-hFOB Infectados Cont
rol
hFO
B In
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ados
hFO
BN
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SC-h
FOB
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***
**
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ml)
0
400
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1/2 1/5
******
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Cont
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0
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1/2 1/5
**
***
SC-hFOB Infectados
SC-h
FOB
No
infe
ctad
os Con
trol1/2
IL-1
(pg/
ml)
A B
C D
La producción de TNF-α (A) e IL-1β (B) fue determinada en el sobrenadante de los monocitos estimulados con los sobrenadantes de osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 y 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA. **P<0,01; ***P<0,001 versus los monocitos estimulados con SC-hFOB sin infectar. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los SC-hFOB infectados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo durante 1 h, antes de agregarlos a los monocitos, y se determinó la producción de TNF-α (C) e IL-1β (D). **P<0,01; ***P<0,001 versus los monocitos estimulados con SC-hFOB sin el tratamiento con anti-GMCSF (sin tratar).
1/2 1/5 1/10 1/20
875
1750
SC-hFOB Infectados Cont
rol
hFO
B In
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hFO
BN
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fect
ados
SC-h
FOB
no In
fect
ados
**
**
IL-1
(pg/
ml)
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
Estos resultados demuestran que GM-CSF presente en el sobrenadante de los
osteoblastos infectados con B. abortus induce la producción de TNF-α por parte de los
monocitos, el cual actúa sobre estas últimas células para inducir la secreción de MMP-9
(Esquema 3).
Figura 9. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus estimulan la producción de MMP-9 en monocitos indirectamente a través
de la inducción de TNF- α.
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
FR1
a-TN
FR1
Isot
ipo
Sin
trat
ar
1/2 1/5
SC-hFOB Infectados SC-h
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No
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ctad
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Cont
rol1/2
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
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a-TN
FR1
Isot
ipo
Sin
trat
ar
1/2 1/5
SC-hFOB Infectados SC-h
FOB
No
infe
ctad
os
Cont
rol1/2
0
375
750
1/2 1/5 1/10 1/2
SC-hFOB Infectados
SC-h
FOB
No
infe
ctad
os
Sin tratara-TNFRIIsotipo
*** *** **MM
P-9
(ng/
ml)
A
B
Los monocitos fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes del receptor de TNF (anti-TNFR1) o con el control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con los sobrenadantes de los osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 y 1/10) o sin infectar (1/2). Luego de 48 h de cultivo se evaluó la expresión de MMP-9 por ELISA (A) y por zimografía (B). **P<0,01; ***P<0,001 versus los monocitos sin pretratar con anti-TNFR1 (sin tratar).
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3. Osteoblastos y su interacción con neutrófilos
3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de neutrófilos
La capacidad de los osteoblastos infectados de producir factores quimioatractantes
podría atraer neutrófilos al sitio de infección ósea, por lo tanto decidimos evaluar si la
infección de los neutrófilos con B. abortus inducía la producción de MMPs. Como se
muestra en la Figura 10 A y B la infección de los neutrófilos con B. abortus indujo, la
secreción de niveles significativamente elevados de MMP-9 y de forma MOI dependiente
(P < 0,01).
Esquema 3. Esquema de la producción de MMP-9 por los monocitos durante su interacción con los osteoblastos infectados por Brucella.
GM-CSF secretado por los osteoblastos infectados con Brucella induce la producción de TNF-α por parte de los monocitos, el cual actúa sobre las ultimas células induciendo la producción de MMP-9.
Osteoblasto
B. abortus
TNF-αGM-CSF
Monocito
MMP-9
Osteoblasto
B. abortus
TNF-αGM-CSF
Monocito
MMP-9
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3.2. Los sobrenadantes de neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de osteoblastos
Decidimos luego estudiar la interacción entre los osteoblastos y los neutrófilos frente
a la infección con B. abortus. Para llevar a cabo este objetivo, se recolectaron los
sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos y de los neutrófilos infectados con B. abortus
a las 24 hs. p.i. El estímulo de los osteoblastos con los sobrenadantes de los neutrófilos
infectados con B. abortus en diferentes proporciones (1/2, 1/5 y 1/10) indujo la secreción
de niveles significativos de MMP-2, en una forma dosis dependiente (P < 0,01) (Figura 11 A y B). No se observó la secreción de MMPs cuando estas células se estimularon con los
sobrenadantes de neutrófilos no infectados.
Figura 10. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de neutrófilos.
Control 100 250 500 10000
30
60
**
***
***
***
MM
P-9
(ng/
ml) Control 100 250 500 1000Control 100 250 500 1000
A B
La producción de MMP-9 fue determinada en los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus a las 2 h p.i. por ELISA (A) y por zimografía (B)..**P<0,01; ***P<0,001 versus el control (sin infectar).
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Este resultado indica que factores solubles presentes en el sobrenadante de los
neutrófilos infectados con B. abortus inducen la secreción de MMP-2 por parte de los
osteoblastos (Esquema 4).
Figura 11. Los sobrenadantes de los neutrófilos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos.
La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes de los neutrófilos (SC-PMN) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por zimografía (A) y por ELISA (B). ***P<0,001 versus los osteoblastos tratados con SC-PMN no infectados.
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-PMN InfectadosSC
-PM
N
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nfec
tado
s
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-PMN InfectadosSC
-PM
N
No i
nfec
tado
s
A B
1/2 1/5 1/10 1/2 Control0
60
120
SC-PMN Infectados
SC-P
MN
No
infe
ctad
os
*** ***
***
MM
P-2
(ng/
ml)
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
3.3. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos
A continuación decidimos estudiar el proceso inverso, el efecto de los sobrenadantes
de los osteoblastos infectados con B. abortus sobre los neutrófilos. Demostramos que los
sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus indujeron la producción
significativa de MMP-9 por parte de los neutrófilos, en forma dosis dependiente (Figura 12). Los sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no tuvieron ningún efecto.
Esquema 4. Esquema de la producción de MMP-2 por los osteoblastos durante su interacción con los neutrófilos infectados por Brucella.
Neutrófilo Osteoblasto
B. abortus
MMP-2
Los osteoblastos producen MMP-2 en respuesta a factores solubles liberados por los neutrófilos infectados con B. abortus.
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Este resultado indica que factores solubles presentes en el sobrenadante de los
osteoblastos infectados con B. abortus inducen la secreción de MMP-9 por parte de los
neutrófilos (Esquema 5).
4. Interacción entre B. abortus, los osteoblastos, los monocitos y los neutrófilos como determinantes de patología ósea
Esquema 5. Esquema de la producción de MMP-9 por los neutrófilos durante su interacción con osteoblastos infectados con B. abortus.
Los neutrófilos producen MMP-9 en respuesta a factores solubles liberados por osteoblastos infectados con B. abortus.
NeutrófiloOsteoblasto
B. abortus
MMP-9
NeutrófiloOsteoblasto
B. abortus
MMP-9
Figura 12. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados por B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos.
1/2 1/5 1/10 1/2
Con
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SC-hFOB Infectados
SC-h
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No
infe
ctad
os
1/2 1/5 1/10 1/2
Con
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SC-hFOB Infectados
SC-h
Fob
No
infe
ctad
os
La producción de MMP-9 fue determinada por zimografía en el sobrenadante de los neutrófilos estimulados con los sobrenadantes de los osteoblastos (SC-hFOB) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 30 min.
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En el Esquema 6 se muestra un resumen de la interacción entre los osteoblastos y
las células inmunes durante la infección con B. abortus. Los osteoblastos responden a la
infección con B. abortus produciendo MMP-2 a través de la secreción de GM-CSF.
Además, los osteoblastos infectados producen las quemoquinas MCP-1 e IL-8 las cuales
son capaces de inducir la migración de monocitos y neutrófilos, respectivamente. Estas
últimas células también responden a la infección con B. abortus produciendo MMP-9. GM-
CSF secretado por los osteoblastos infectados induce la producción de TNF-α por parte de
los monocitos, el cual actúa sobre las ultimas células induciendo la producción de MMP-9.
Por otro lado, TNF-α liberado por los monocitos infectados induce la producción de MMP-2
por parte de los osteoblastos. Asimismo, factores liberados por los osteoblastos infectados
estimulan la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos, y en el sentido contrario,
factores liberados por los neutrófilos estimulan la producción de MMP-2 por parte de los
osteoblastos.
5. Fibroblastos sinoviales
Los fibroblastos sinoviales son las células que forman la membrana sinovial de las
articulaciones y secretan el liquido sinovial al interior de la cavidad articular, cuya función
principal es la de reducir la fricción entre los cartílagos articulares durante el movimiento.
Esquema 6. Resumen de la interacción entre los osteoblastos y las células inmunes estudiadas.
MMP-9
B. abortus
MMP-9
B. abortus
TNF-α
TNF-α
MCP-1
GM-CSF
IL-8
MMP-2
GM-CSF
B. abortus
Osteoblasto
Monocito
Neutrófilo
MMP-9
B. abortus
MMP-9
B. abortus
TNF-α
TNF-α
MCP-1
GM-CSF
IL-8
MMP-2
GM-CSF
B. abortus
Osteoblasto
Monocito
Neutrófilo
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Dado que la brucelosis afecta tanto al hueso como las articulaciones, decidimos estudiar
también el rol de los fibroblastos sinoviales en la producción de MMPs y su interacción con
las células inmunes que podrían ser atraídas durante la infección con Brucella.
5.1. B. abortus invade y se replica en la línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982
En primer lugar evaluamos la capacidad de B. abortus de infectar y replicarse en la
línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982. Para ello las células fueron
infectadas con B. abortus. Las infecciones se llevaron a cabo a distintas MOIs (100, 250,
500 y 1000). Los experimentos demostraron que B. abortus fue internalizada por los
fibroblastos sinoviales y que la magnitud de la infección, determinada por el recuento UFC
intracelulares, fue directamente proporcional a la MOI utilizada (Figura 13). El recuento de
UFC a distintos tiempos reveló que B. abortus es capaz de replicarse intracelularmente en
fibroblastos sinoviales. Las UFC intracelulares aumentaron entre 2 y 3 ordenes de
magnitud (dependiendo de la MOI utilizada) durante las primeras 48 hs. p.i.
Figura 13. B. abortus invade y se multiplica en la línea celular de fibroblastos sinoviales humanos SW982.
0 20 40 60 80
102
104
106
MOI 1000MOI 500MOI 250MOI 100
Tiempo (hs)
UFC
/ml
Los fibroblastos sinoviales humanos (línea celular SW982) fueron infectados con B. abortus a diferentes MOI y luego incubados con antibiótico para eliminar a las bacterias extracelulares. Los lisados celulares obtenidos a diferentes tiempos p.i. fueron plaqueados en TSA para determinar las UFC intracelulares.
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5.2. La infección de los fibroblastos sinoviales con B. abortus induce la producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α e IL-1β
Como se muestra en la Figura 14, la infección de fibroblastos sinoviales indujo la
secreción de GM-CSF, IL-6, MCP-1 e IL-8 en forma dependiente de la MOI utilizada (P <
0,05). Por el contrario la infección no indujo un incremento significativo en la secreción de
TNF-α ni de IL-1β (no mostrado).
5.3. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales
Figura 14. La infección con B. abortus induce la producción de IL-6, GM-CSF, MCP-1 e IL-8.
IL-6, GM-CSF, IL-8 y MCP-1 fueron cuantificadas en el sobrenadante de fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus a diferentes MOIs a las 48 h p.i. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 versus el control sin infectar.
Control 100 250 500 10000
300
600***
****
*IL-6
(pg/
ml)
Control 100 250 500 10000
250
500******
***
**IL-8
(pg/
ml)
Control 100 250 500 10000
150
300 ***
***
**
GM
-CSF
(pg/
ml)
Control 100 250 500 10000
2000
4000
******
**
MCP
-1 (p
g/m
l)
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Para determinar si la infección con B. abortus era capaz de inducir la producción de
MMPs por parte de los fibroblastos sinoviales, la secreción de MMPs fue analizada por
zimografía en los sobrenadantes de cultivo de las células infectadas y su presencia
confirmada y cuantificada por ELISA. Como se muestra en la Figura 15 la infección con B.
abortus indujo la expresión de niveles significativos de MMP-2 (P< 0,001) por parte de los
fibroblastos sinoviales, respecto de las células no infectadas, y mediante un mecanismo
dependiente de la MOI utilizada.
5.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos
Dado que hemos demostrado que los fibroblastos sinoviales infectados con B.
abortus secretan las quemoquinas MCP-1 e IL-8 decidimos evaluar si los sobrenadantes
de los fibroblastos sinoviales infectados con Brucella eran capaces de inducir la migración
de monocitos y neutrófilos. Para lograr este objetivo se realizó el mismo procedimiento que
se describió en la sección 1.4 de resultados. Como se muestra en la Figura 16 la
migración tanto de los monocitos como de los neutrófilos en presencia de los
sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados y el control positivo fMLP fue
significativamente superior que la migración basal (P < 0,05). Por otro lado, los
Figura 15. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales.
La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus 48 hs. p.i. por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus el control sin infectar.
Control 100 250 500 10000
30
60***
***
***
***
MM
P-2
(ng/
ml)
A B
Control 100 250 500 1000Control 100 250 500 1000
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
sobrenadantes de los osteoblastos no infectados no indujeron niveles significativos de
migración respecto del basal.
6. Fibroblastos sinoviales y su interacción con monocitos y neutrófilos 6.1. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α
Los resultados mostrados en la sección anterior sugieren que IL-8 y MCP-1
secretados por los fibroblastos sinoviales infectados con Brucella jugarían un rol
regulatorio importante en la inflamación debido a sus funciones quimioatractantes,
reclutando a las células inflamatorias al sitio de infección. Decidimos entonces estudiar la
interacción entre los fibroblastos sinoviales y los monocitos y neutrófilos frente a la
infección con B. abortus.
Figura 16. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la migración de monocitos y neutrófilos.
La migración de los monocitos (A) o de los neutrófilos (B) estimulados con diferentes cantidades (puro y diluciones 1/2 y 1/5) de los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales (SC-FS) infectados con B. abortus o no infectados (puro), fue determinada utilizando placas de microquimiotaxis. Las células que migraron fueron contadas luego de 2 h. Los resultados fueron expresados como el índice quimiotáctico (IQ: número de células que migraron al medio condicionado dividido el numero de células que migraron al medio de cultivo). La migración inducida por fMLP fue utilizada como control positivo. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS no infectados.
fMLP 1 1/2 1/5 10
5
10
15
20
25
*
**
*
SC-FS Infectados SC-FS No Infectados
IQ m
onoc
itos
fMLP 1 1/2 1/5 10
4
8 ***
***
***
**
SC-FS Infectados SC-FS No Infectados
IQ n
eutr
ófilo
s
A B
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
El estímulo de los fibroblastos sinoviales con los sobrenadantes de los monocitos
infectados con B. abortus en diferentes proporciones (1/2, 1/5 y 1/10) indujo la secreción
de niveles significativos de MMP-2 (P < 0,001), en una forma dosis dependiente (Figura 17 A y B). Por otro lado, no se observó un aumento significativo en los niveles de MMP-2
cuando estas células se estimularon con los sobrenadantes de los monocitos no
infectados.
Como se mencionó en la sección 1.7., se determinó la presencia de niveles
significativos de TNF-α e IL-1β en los sobrenadantes de cultivo de los monocitos
infectadas con B. abortus respecto de los no infectados. Debido a que ha sido descripto
que TNF-α es una de las principales responsables de inducir la producción de MMP-2 en
varios tipos celulares, incluyendo fibroblastos sinoviales [249, 250] decidimos estudiar la
contribución de esta citoquina en la inducción de la expresión de MMP-2 por parte de los
mismos. Para ello los fibroblastos sinoviales fueron estimulados con los sobrenadantes de
los monocitos infectados con B. abortus en presencia de un anticuerpo neutralizante anti-
TNF-α. Como se muestra en la Figura 17 C y D la neutralización de TNF-α redujo
significativamente (P < 0,001) la habilidad de dichos sobrenadantes de inducir la expresión
de MMP-2 en los fibroblastos sinoviales, mientras que el control de isotipo no tuvo ningún
efecto. Comparado con los sobrenadantes sin tratar, la neutralización de TNF-α redujo un
91,1% los niveles de expresión de MMP-2.
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Figura 17. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados por B. abortus inducen las producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos
sinoviales a través de la inducción de TNF-α. A B
1/2 1/5 1/10 1/2 Control0
20
40
SC-THP-1 Infectados
SC-T
HP-
1N
o In
fect
ados
*** *** ***
MM
P-2
(ng/
ml)
1/2 1/5 1/10 1/2
Con
trol
SC-THP-1 Infectados
SC-T
HP-
1 N
o in
fect
ados
1/2 1/5 1/10 1/2
Con
trol
SC-THP-1 Infectados
SC-T
HP-
1 N
o in
fect
ados
0
40
80
rhTNF2 ng/ml
Sin tratara-TNFIsotipo
SC-THP-1Infectado
*** ***
SC-T
HP-
1N
o In
fect
ado
1/2
Cont
rol
MM
P-2
(ng/
ml)
C D
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
Fα
a-TN
Fα
Isot
ipo
SC-T
HP-
1 N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-THP-1 Infectados
1/2
rhTNF2 ng/ml
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
Fα
a-TN
Fα
Isot
ipo
SC-T
HP-
1 N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-THP-1 Infectados
1/2
rhTNF2 ng/ml
La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales estimulados con los sobrenadantes de los monocitos (SC-THP-1) infectados por B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-THP-1 no infectados. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1 h antes de agregarlos a los fibroblastos sinoviales, y se determinó la producción de MMP-2 por ELISA (C) y por zimografía. (D). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-THP-1 infectados sin tratar con el anticuerpo anti-TNF-α.
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Estos resultados indican que los sobrenadantes de cultivo de los monocitos
infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos
sinoviales, y este efecto estaría mediado principalmente por TNF-α. (Esquema 7).
6.2. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-9 por parte de los monocitos a través de GM-CSF
A continuación decidimos estudiar el proceso inverso, el efecto de los sobrenadantes
de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus sobre los monocitos. Como se
muestra en la Figura 18 A y B los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados
con B. abortus indujeron la producción significativa de MMP-9 por parte de los monocitos,
en forma dosis dependiente (P < 0,05). Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales
no infectados no tuvieron ningún efecto.
Como se ha mencionado previamente varias citoquinas y factores de crecimiento son
capaces de estimular la producción de MMP-9 por parte de los monocitos incluyendo TNF-
α, IL-1β y GM-CSF [185, 231, 247]. Sin embargo, tal como hemos mencionado en la
sección 2.3 los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus no secretan TNF-α ni IL-
1β. Por el contrario como se mostró en la Figura 14 los fibroblastos sinoviales infectados
secretan GM-CSF. Para evaluar si GM-CSF presente en el sobrenadante de los
fibroblastos infectados estaba involucrado en la inducción de la producción de MMP-9 por
parte monocitos, estos últimos fueron estimulados con los sobrenadantes de los
Esquema 7. Esquema de la producción de MMP-2 con fibroblastos sinoviales durante su interacción con monocitos infectados con Brucella.
Los osteoblastos producen MMP-2 en respuesta a TNF-α secretado por monocitos infectados con B. abortus.
MMP-2
Fibroblasto sinovialMonocito
TNF-α
B. abortus
MMP-2
Fibroblasto sinovialMonocito
TNF-α
B. abortus
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fibroblastos sinoviales infectados en presencia de un anticuerpo monoclonal neutralizante
anti-GM-CSF o un control de isotipo. Como se muestra en la Figura 18 C y D la
neutralización de GM-CSF abolió la habilidad de los sobrenadantes de los fibroblastos
sinoviales infectados de estimular la producción de MMP-9 por parte de los monocitos (P <
0,001), mientras el control de isotipo no tuvo ningún efecto.
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Figura 18. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 en monocitos a
través de GM-CSF.
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-FS Infectados
SC-F
S N
o inf
ecta
dos
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-FS Infectados
SC-F
S N
o inf
ecta
dos
Isot
ipo
a-GM
-CSF
SC-F
S N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-FS Infectados
1/2Is
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o
a-GM
-CSF
SC-F
S N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-FS Infectados
1/2
A B
C D
1/2 1/5 1/10 1/2 Control0
100
200
300
SC-FS Infectados
SC-F
SN
o In
fect
ados
***
***
*
MM
P-9
(ng/
ml)
0
20
40
1/2 SC-FS Infectados
***
SC-F
SN
o in
fect
ados
Cont
rol
Isotipoa-GM-CSFSin tratar
MM
P-9
(ng/
ml)
La producción de MMP-9 fue determinada en el sobrenadante de los monocitos estimulados con los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales (SC-FS) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). *P<0,05; ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS no infectados. En otro experimento SC-FC fueron pretratados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF o un control de isotipo durante 1 h antes de agregarlos a los monocitos, y se determinó la producción de MMP-9 por ELISA (C) y por zimografía. (D). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS infectados sin tratar con el anticuerpo anti-GM-CSF (sin tratar).
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Estos resultados indican que GM-CSF presente en el sobrenadante de los
fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte
de los monocitos (Esquema 8).
6.3. Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de TNF-α
Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus indujeron la
secreción de niveles significativos de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales en
una forma dosis dependiente (1/2, 1/5 y 1/10) (P < 0,001) (Figura 19 A y B). En estudios
previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que los neutrófilos infectados con
B. abortus secretan niveles significativamente elevados de TNF-α e IL-1β a las 24 hs. p.i.
[33]. Por lo tanto, decidimos evaluar la contribución de TNF-α en la inducción de la
expresión de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales. Como se muestra en la
Figura 19 C el pretratamiento con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α redujo la
habilidad de los sobrenadantes de los neutrófilos infectados con B. abortus de estimular la
secreción de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales, mientras que el control de
isotipo no tuvo ningún efecto.
Esquema 8. Esquema de la producción de MMP-9 por monocitos durante la interacción con fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus.
MonocitoFibroblasto sinovial
GM-CSF
B. abortus
MMP-9
MonocitoFibroblasto sinovial
GM-CSF
B. abortus
MMP-9
Fibroblasto sinovial
GM-CSF
B. abortus
MMP-9
Los monocitos producen MMP-9 en respuesta a GM-CSF secretado por los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus.
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Estos resultados sugieren que los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos
infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-2 por los fibroblastos sinoviales ,
y este efecto esta mediado principalmente por TNF-α (Esquema 9).
Figura 19. Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen las producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos
sinoviales a través de la inducción de TNF-α. A B
C
1/2 1/10 1/5 1/2 Control0
55
110
SC-PMN Infectados
SC-P
MN
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*** *** ***
MM
P-2
(ng/
ml)
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-PMN Infectados
SC-P
MN
N
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fect
ados
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-PMN Infectados
SC-P
MN
N
o in
fect
ados
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-PMN Infectados
SC-P
MN
N
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fect
ados
Isot
ipo
a-TN
F-α
SC-P
MN
N
o in
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ados
Sin
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Cont
rol
1/2 SC-PMN Infectados
1/2
Isot
ipo
a-TN
F-α
SC-P
MN
N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-PMN Infectados
1/2
La producción de MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales estimulados con sobrenadantes de neutrófilos (SC-PMN) infectados con B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus los estimulados SC-PMN no infectados. En otro experimento los SC-PMN fueron pretratados con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1h., antes de su agregado a los monocitos, y se determinó la producción de MMP-2 por zimografía (C). ***P<0,001 versus los estimulados con los SC-PMN infectados sin tratar con el anticuerpo anti-TNF-α (sin tratar).
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6.4. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos a través de IL-6
El estudio del proceso inverso reveló que los sobrenadantes de cultivo de los
fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus eran capaces de estimular la producción
de niveles significativos de MMP-9 por parte de los neutrófilos (P < 0,001) (Figura 20 A y B). Por el contrario la secreción de MMP-9 no fue inducida por los sobrenadantes de los
fibroblastos sinoviales no infectados con Brucella.
Dado que GM-CSF e IL-6 también han demostrado ser inductores de MMPs en
diferentes tipos celulares [231, 251, 252] y estos factores son producidos por los
fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus decidimos estudiar el rol de estas dos
citoquinas en la inducción de la expresión de MMP-9 por parte de los neutrófilos. Para
llevar a cabo este objetivo los neutrófilos fueron estimulados con los sobrenadantes de
cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus en presencia de un
anticuerpo neutralizante anti-GM-CSF o anti-IL-6, o sus respectivos controles de isotipo.
Como se muestra en la Figura 20 C la neutralización de GM-CSF no inhibió la capacidad
de los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados de inducir la producción de
MMP-9 por los neutrófilos, aún siendo utilizado a 4 ug/ml, una concentración 40 veces más
alta que la sugerida por el fabricante del anticuerpo para neutralizar completamente la
concentración de GM-CSF detectada por ELISA en dichos sobrenadantes. Por el contrario,
Esquema 9. Los fibroblastos sinoviales producen MMP-2 en respuesta a TNF-α secretado por los neutrófilos infectados con B. abortus.
B. abortus
NeutrófiloFibroblasto sinovial
TNF-α
MMP-2
B. abortus
NeutrófiloFibroblasto sinovial
TNF-α
MMP-2
Los fibroblastos sinoviales producen MMP-2 en respuesta a TNF-α secretado por los neutrófilos infectados con B. abortus.
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la neutralización de IL-6 inhibió parcialmente la capacidad de los sobrenadantes de inducir
la producción de MMP-9 por los neutrófilos (Figura 20 D).
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Figura 20. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus inducen la producción de MMP-9 en neutrófilos a través de la
inducción de IL-6. A B
C
1/2 1/5 1/10 1/2 Control0
20
40
60
80
SC-FS Infectados
SC-F
SN
o In
fect
ados
***
***
***
MM
P-9
(pg/
ml)
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-FS Infectados
SC-F
S N
o in
fect
ados
1/2 1/5 1/10 1/2
Cont
rol
SC-FS Infectados
SC-F
S N
o in
fect
ados
Isot
ipo
a-GM-CSF
SC-F
S N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-FS Infectados
1/21 2 4
Isot
ipo
a-GM-CSF
SC-F
S N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-FS Infectados
1/21 2 4
Isot
ipo
a-IL
6
SC-F
S N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-FS Infectados
1/2
Isot
ipo
a-IL
6
SC-F
S N
o in
fect
ados
Sin
trat
ar
Cont
rol
1/2 SC-FS Infectados
1/2
D
La producción de MMP-9 fue determinada en los sobrenadantes de los neutrófilos estimulados con los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales (SC-FS) infectados por B. abortus (adicionados en las proporciones 1/2, 1/5 o 1/10) o sin infectar (1/2) durante 30 min, por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P<0,001 versus los estimulados con SC-FS no infectados. En otro experimento SC-FC fueron pretratados con anticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF (1, 2 o 4ug/ml) o IL-6 o un control de isotipo durante 1 h antes de su agregado a los neutrófilos, y se determinó la producción de MMP-9 por zimografía (C) y (D).
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Estos resultados sugieren que la citoquina IL-6 presente en los sobrenadantes de los
fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus, esta involucrada en la inducción de la
expresión de MMP-9 por parte de los neutrófilos (Esquema 10).
7. Interacción entre B. abortus, los sinoviocitos, los monocitos y los neutrófilos
En el Esquema 11 se muestra un resumen de la interacción entre los fibroblastos
sinoviales y las células inmunes durante la infección con B. abortus. Los fibroblastos
sinoviales responden a la infección con B. abortus produciendo MMP-2 como así también
las quemoquinas MCP-1 e IL-8 las cuales son capaces de inducir la transmigración de
monocitos y neutrófilos, respectivamente. Estas últimas células también responden a la
infección con B. abortus produciendo MMP-9. GM-CSF secretado por los fibroblastos
sinoviales infectados induce la producción de MMP-9 por parte de los monocitos. Por otro
lado, TNF-α liberado por los monocitos infectados induce la producción de MMP-2 por
parte de los fibroblastos sinoviales. Asimismo, IL-6 liberado por los fibroblastos sinoviales
infectados estimula la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos, y en el sentido
contrario, TNF-α producido por los neutrófilos infectados estimula la producción de MMP-2
por parte de los fibroblastos sinoviales.
Esquema 10. Esquema de la producción de MMP-9 con los neutrófilos durante la interacción con los fibroblastos sinoviales infectados con
Los neutrófilos producen MMP-9 en respuesta a IL-6 secretada por los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus.
Fibroblasto sinovialNeutrófilo
IL-6
B. abortus
MMP-9
Fibroblasto sinovialNeutrófilo
IL-6
B. abortus
MMP-9
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8. B. abortus produce un incremento neto en la actividad de las metaloproteasas secretadas por los osteoblastos, monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales
La actividad de las MMPs in vivo está altamente regulada y se encuentra
contrarrestada por la actividad de inhibidores tisulares específicos denominados TIMPs.
Por lo tanto, la actividad proteolítica neta, depende del balance entre la actividad de las
MMPs y de las TIMPs [215]. Esta actividad neta podría no ser detectada por zimografía ya
que los complejos MMP-TIMP podrían disociarse durante la electroforesis. Para poner en
evidencia si el entorno de las células infectadas permitía un incremento en la actividad
proteolítica neta, los sobrenadantes de cultivo provenientes de los osteoblastos,
monocitos, neutrófilos o fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus fueron incubados
con un conjugado de gelatina-FITC que no fluoresce cuando la molécula está integra, pero
sí cuando la misma es degradada por la acción de proteasas. Como se muestra en la
Figura 21 la fluorescencia se vio incrementada en forma significativa (P < 0,01) cuando la
gelatina-FITC fue incubada con los sobrenadantes de las células infectadas con B. abortus
y además la intensidad de fluorescencia fue dependiente de la MOI utilizada.
Esquema 11. Resumen de la interacción entre los fibroblastos sinoviales y las células inmunes.
B. abortus
TNF-α
MCP-1
GM-CSF
B. abortusMonocito
Fibroblasto sinovial
MMP-9
Neutrófilo
B. abortus
TNF-αIL-8
IL-6
MMP-9
MMP-2
B. abortus
TNF-α
MCP-1
GM-CSF
B. abortusMonocito
Fibroblasto sinovial
MMP-9
Neutrófilo
B. abortus
TNF-αIL-8
IL-6
MMP-9
MMP-2
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Este resultado muestra que la infección con B. abortus produce un incremento neto
en la actividad de las metaloproteasas con actividad gelatinasa secretadas por los
osteoblastos, monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales.
9. Componentes estructurales de B. abortus están implicados en la inducción de MMPs por sinoviocitos, monocitos y neutrófilos
Figura 21. B. abortus produce un incremento neto en la actividad de las metaloproteasas secretadas por osteoblastos, monocitos, neutrófilos y
fibrobastos sinoviales.
Control 100 250 500 10000
5
10
15
*** *** *** ***
UF
Osteoblastos Monocitos
Control 100 250 10000
10
20
**
***
***
UF
Fibroblastos sinoviales Neutrófilos
SI 100 250 10000
5
10
******
***
UF
Los sobrenadantes provenientes de los osteoblastos, monocitos, neutrófilos o fibroblastos sinoviales infectados por B. abortus a diferentes MOIs fueron incubados con un conjugado gelatina-FITC que no fluoresce cuando la molécula está integra, pero sí cuando la misma es degradada por la acción de proteasas. Se midió la fluorescencia emitida en un fluorómetro. Los resultados fueron expresados en unidades arbitrarias de fluorescencia (UF). *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 versus los sobrenadantes provenientes de las células no infectadas (control).
Control 10 25 50 1000
5
10
15
****** *** ***
UF
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9.1. Monocitos
9.1.1. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los monocitos, pero no de MMP-2 por parte de los osteoblastos
A continuación nos propusimos evaluar si era necesaria la viabilidad de la bacteria
para inducir la producción de MMPs por parte de los monocitos y de los osteoblastos, o si
por el contrario podían ser inducidas por componentes estructurales de B. abortus. Para
lograr este objetivo ambos tipos celulares fueron estimulados con B. abortus muerta por
calor (HKBA). Demostramos que los osteoblastos estimulados con HKBA no secretaron
niveles detectables de MMP-2, aún cuando la concentración de HKBA fue de 109 UFC/ml
(no mostrado) lo que correlaciona con una MOI de 1000 que es mucho más elevada que la
MOI mínima utilizada capaz de inducir niveles detectables de MMP-2, tal como se mostró
en la Figura 3. En contraste, los monocitos respondieron secretando niveles significativos
de MMP-9 luego de ser estimulados con diferentes dosis de HKBA (Figura 22) (P < 0,001).
Este resultado sugiere que algunos componentes estructurales de B. abortus podrían
estimular la producción de MMP-9 por monocitos.
Por otro lado, debido a que las citoquinas proinflamatorias han sido implicadas como
responsables de la producción de MMPs por parte de monocitos [243, 253] y que en
estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que las lipoproteínas de
Brucella (y no su LPS) son las principales responsables de la inducción de citoquinas
proinflamatorias en distintos tipos celulares [109, 232], nos preguntamos si las
lipoproteínas podrían ser los componentes constitutivos de Brucella que estarían
involucrados en la inducción de MMP-9 en monocitos. Para ello se usó como modelo de
lipoproteína Omp19 (L-Omp19). Los monocitos fueron incubados con L-Omp19 y los
sobrenadantes de cultivo fueron recolectados a las 48 hs. para determinar la presencia de
MMP-9 por zimografía y por ELISA. Como se muestra en la Figura 6 A y B, L-Omp19
indujo la expresión de MMP-9 en forma dosis dependiente. Se detectó un aumento
significativo de MMP-9 aun con la concentración de L-Omp19 más baja (10 ng/ml) (P <
0,01). Por otro lado, vimos que este fenómeno dependía de la porción lipídica ya que
Omp19 no lipidada (S-Omp19) no indujo la secreción de MMP-9 (Figura 6 A y B). Dado
que la expresión de MMP-9 también aumentó en monocitos incubados con el
lipohexapéptido sintético (Pam3Cys) conteniendo una secuencia peptídica irrelevante,
podemos concluir que el efecto producido por L-Omp19 se podría extender a todas las
lipoproteínas de B. abortus. Por otro lado, el LPS de B. abortus no fue capaz de inducir la
producción de MMP-9 aún a altas concentraciones (1000 ng/ml), mientras que si lo hizo el
LPS de E. coli a una concentración de 100 ng/ml (Figura 22).
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9.1.2. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos vía TLR2
En estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que TLR2 media
las respuestas en monocitos frente al estímulo con HKBA y con las lipoproteínas de B.
Figura 22. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de monocitos, pero no de MMP-2 por parte
de osteoblastos.
Contro
l 6
HKBA 107
HKBA 108
HKBA 109
HKBA 10
LPS Ec 100
LPS Ba 100
0
L-Omp1
9 10
L-Omp1
9 100
L-Omp1
9 100
0
S-Omp1
9 100 Cys
3
Pam
0
50
100
150
200
***
***
***
***
******
******
**MM
P-9
(ng/
ml)
LPS
Ba10
00
LPS
Ec10
0
Cont
rol
109 108 107 106
HKBA
LPS
Ba10
00
LPS
Ec10
0
Cont
rol
109 108 107 106
HKBA
Pam
3cys
S-O
mp1
9
Cont
rol
1000 100 10
L-Omp19
Pam
3cys
S-O
mp1
9
Cont
rol
1000 100 10
L-Omp19
A
B
La producción de MMP-9 fue determinada en los sobrenadantes de monocitos estimulados con HKBA (106 a 109 UFC/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 48 h, por ELISA (A) y por zimografía (B). **P <0,01; ***P <0,001 versus el control sin estímulo.
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abortus [109]. Por lo tanto, decidimos analizar el rol de TLR2 en la producción de MMP-9
inducida por HKBA y L-Omp19. Para llevar a cabo este objetivo las células monocíticas
THP-1 fueron preincubadas durante 1 h. con anticuerpos bloqueantes anti-TLR2, anti-
TLR4 o los correspondientes controles de isotipo, y luego fueron estimuladas con HKBA o
L-Omp19. La preincubación de los monocitos con el anticuerpo anti-TLR2 bloqueó
significativamente (P < 0,001) la inducción de la producción de MMP-9 mediada por L-
Omp19 y HKBA (Figura 23 A y B). Por otro lado, la preincubación con el anticuerpo anti-
TLR4 no modificó significativamente el efecto de L-Omp19 o HKBA sobre la producción de
MMP-9. Los controles de isotipo no tuvieron ningún efecto.
Estos resultados indican que las lipoproteínas de B. abortus serían las principales
responsables de la inducción de MMP-9 por parte de los monocitos vía TLR2.
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9.1.3. L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos a través de la inducción de TNF- α.
Figura 23. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos vía TLR2.
0
80
160
L-Omp19 Pam3cysHKBA LPS Ec
a-TLR2a-TLR4Isotipo
Sin tratar
Ba L
PS
S-O
mp1
9
*** *** *** ***
Cont
rol
MM
P-9
(pg/
ml)
a-TL
R2
a-TL
R4
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Isot
ipo
Sin
trat
ar
Sin
trat
ar
LPS
Ba
Cont
rol
HKBA LPS Ec
a-TL
R2
a-TL
R4
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Isot
ipo
Sin
trat
ar
Sin
trat
ar
LPS
Ba
Cont
rol
HKBA LPS Ec
a-TL
R2
a-TL
R4
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Isot
ipo
Sin
trat
ar
Sin
trat
ar
S-O
mp1
9
Cont
rol
L-Omp19 Pam3Cys
a-TL
R2
a-TL
R4
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Isot
ipo
Sin
trat
ar
Sin
trat
ar
S-O
mp1
9
Cont
rol
L-Omp19 Pam3Cys
A
B
Los monocitos humanos de la línea THP-1 fueron preincubados con anticuerpos neutralizantes anti-TLR2 o anti-TLR4 o un control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con HKBA (107 UFC /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), L-Omp19 (100 ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml). Luego de 48 h de cultivo, se evaluó la expresión de MMP-9 en sobrenadantes por ELISA (A) y por zimografía (B). ***P <0,001 versus el tratamiento con anti-TLR2 o anti-TLR4 (según corresponda).
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En estudios previos realizados en nuestro laboratorio demostramos que L-Omp19 es
el componente estructural de B. abortus responsable de inducir la producción de TNF-α,
IL-1β e IL-6 por parte de monocitos [109]. Debido a que nosotros utilizamos un medio de
cultivo modificado para poder analizar la producción de MMPs por zimografía, decidimos
analizar en primer lugar si los niveles de citoquinas secretadas por los monocitos
estimulados con HKBA o con L-Omp19 se mantenían en estas nuevas condiciones de
cultivo. Como se muestra en la Figura 24, L-Omp19 indujo un aumento significativo (P <
0,001) en los niveles de TNF-α e IL-1β en forma dosis dependiente y a niveles
comparables a los obtenidos previamente [109]. Como esperábamos, la versión no
lipidada S-Omp19 no tuvo ningún efecto y el LPS de B. abortus no indujo la expresión de
niveles significativos de estas citoquinas.
Debido a que otros autores demostraron que TNF-α e IL-1β pueden inducir la
producción de MMP-9 en varios tipos celulares [246-248], decidimos estudiar la
contribución de estas dos citoquinas en la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos
estimulados con HKBA o L-Omp19. Para llevar a cabo este objetivo, decidimos neutralizar
la acción de estas citoquinas usando un anticuerpo bloqueante del receptor I de TNF-α
Figura 24. La lipoproteína L-Omp19 induce la producción de TNF-α e IL-1β por parte de monocitos.
A Con
trol 6
HKBA 107
HKBA 108
HKBA 10LPS EcLPS Ba
L-Omp1
9 10
L-Omp1
9 100
L-Omp1
9 100
0S-O
mp19
Cys 3
Pam0
1500
3000
IL-1
(pg/
ml)
******
***
***
*** *** *** ***
B
La producción de TNF-α e IL-1β fue determinada en el sobrenadante de cultivo de los monocitos estimulados con HKBA (106 a 108 UFC /ml), LPS de E. coli (50 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 48 h, por ELISA. **P<0,01; ***P <0,001 versus el control sin estímulo.
Contro
l 6
HKBA 107
HKBA 108
HKBA 10LPS EcLPS Ba
L-Omp1
9 10
L-Omp1
9 100
L-Omp1
9 100
0S-O
mp19 Cys
3
Pam
0
3000
6000
TNF-
(pg/
ml)
******
***
***
***
***
*** ***
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(TNFRI) o su control de isotipo, y el antagonista natural del receptor de IL-1β (IL-1Ra).
Como se muestra en la Figura 25 el bloqueo de TNFRI redujo significativamente (P <
0,01) la capacidad de L-Omp19 y HKBA de inducir la producción de MMP-9 en monocitos.
Por otro lado, el tratamiento con el antagonista natural IL-1Ra no afectó el nivel de
expresión de MMP-9 inducido por estos estímulos (no mostrado).
Estos resultados junto con los descriptos en las secciones anteriores indican que
Brucella a través de sus lipoproteínas inducen la producción de TNF-α mediante el
reconocimiento de TLR2, y TNF-α actúa sobre las mismas células estimulando la
producción de MMP-9 en los mismos monocitos (Esquema 12).
Figura 25. L-Omp19 induce la producción de MMP-9 por parte de monocitos a través de la inducción de TNF- α.
0
55
110
L-Omp19 Pam3CysHKBA rhTNF-
** *** ** **
Sin tratara-TNFR1Isotipo
LPS
Ba
S-O
mp1
9
Cont
rol
MM
P-9
(ng/
ml)
A
B
Los monocitos fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes del receptor de TNF (a-TNFR1) o un control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con HKBA (107 UFC/ml), L-Omp19 (100 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o rhTNF-α (2 ng/ml). Luego de 48 h de cultivo se evaluó la expresión de MMP-9 en el sobrenadante por ELISA (A) y por zimografía (B).**P <0,01; ***P<0,001 versus los monocitos estimulados con el antígeno correspondiente, pero sin pretratar con anti-TNFR1 (sin tratar).
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
FR1
a-TN
FR1
Isot
ipo
S-O
mp1
9
Sin
trat
ar
Cont
rol
L-Omp19 Pam3Cys
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
FR1
a-TN
FR1
Isot
ipo
S-O
mp1
9
Sin
trat
ar
Cont
rol
L-Omp19 Pam3CysHKBA rh TNF-α
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
FR1
a-TN
FR1
Isot
ipo
LPS
Ba
Sin
trat
ar
Con
trol
HKBA rh TNF-α
Sin
trat
ar
Isot
ipo
a-TN
FR1
a-TN
FR1
Isot
ipo
LPS
Ba
Sin
trat
ar
Con
trol
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
9.2. Neutrófilos.
9.2.1 Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos.
A continuación nos propusimos evaluar si era necesaria la viabilidad de la bacteria
para inducir la producción de MMPs por parte de los neutrófilos, o si por el contrario podían
ser inducidas por componentes estructurales de B. abortus. Para lograr este objetivo las
células fueron estimuladas con B. abortus muerta por calor (HKBA). Los neutrófilos
respondieron secretando altos niveles de MMP-9 luego de ser estimulados con diferentes
dosis de HKBA (P < 0,01) (Figura 26). Este resultado sugiere que algunos componentes
estructurales de B. abortus podrían estimular la producción de MMP-9 por parte de los
monocitos.
Nuevamente nos preguntamos si las lipoproteínas podrían ser los componentes
constitutivos de Brucella que estarían involucrados en la inducción de MMP-9 en
neutrófilos. Los neutrófilos fueron incubados con L-Omp19 y los sobrenadantes de cultivo
fueron recolectados para medir la expresión de MMP-9 por ELISA. Como se muestra en la
Figura 26, L-Omp19 indujo la expresión de MMP-9 en forma dosis dependiente. Se
detectó un aumento significativo de MMP-9 (P < 0,001) aun con la concentración de L-
Omp19 más baja (10 ng/ml). Como esperábamos, vimos que este fenómeno dependía de
la porción lipídica ya que S-Omp19 no indujo la secreción de MMP-9 (Figura 26), mientras
que el lipohexapéptido Pam3Cys indujo un aumento significativo (P < 0,001) en los niveles
L-Omp19 induce la producción de TNF-α a través del reconocimiento de TLR2, y TNF-α actúa sobre las mismas células estimulando la producción de MMP-9.
MMP-9
Monocito
L-Omp19
TLR2
MMP-9
Monocito
L-Omp19
TLR2
Esquema 12. Esquema de la producción de MMP-9 por monocitos durante la infección con B. abortus.
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de MMP-9. Por otro lado, el LPS de B. abortus no fue capaz de inducir la producción de
MMP-9 aún a altas concentraciones (1000 ng/ml), mientras que si lo hizo el LPS de E. coli
a una concentración de 100 ng/ml (Figura 26).
9.3. Fibroblastos sinoviales
9.3.1. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas en fibroblastos sinoviales humanos, y este efecto está mediado por L-Omp19 a través del reconocimiento de TLR2.
A continuación estudiamos el efecto de HKBA y el rol de componentes bacterianos
específicos sobre los fibroblastos sinoviales. Como se muestra en la Figura 27 A los
fibroblastos sinoviales estimulados con HKBA produjeron niveles elevados de GM-CSF, IL-
6, IL-8, MCP-1 y MMP-2 en una forma dosis dependiente (P < 0,05), indicando que la
secreción de estos factores puede ser estimulada por un componente estructural de B.
abortus. Dado que está descripto y hemos comprobado previamente en este trabajo que
las lipoproteínas son capaces de inducir la secreción de citoquinas, quemoquinas y MMPs
Figura 26. Componentes estructurales de B. abortus inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos.
La producción de MMP-9 fue determinada en el sobrenadante de cultivo de los neutrófilos estimulados con HKBA (106 a 108 UFC /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 30 min, por ELISA. **, P<0.01; ***, P<0.001 versus el control sin estímulo.
Contro
l 6
HKBA 107
HKBA 108
HKBA 10LPS Ec
LPS Ba
L-Omp1
9 10
L-Omp19
100
L-Omp1
9 100
0
S-Omp1
9 100
0
Cys 50
3
Pamp
0
35
70
***
******
***
***
**
***
***
MM
P-9
(ng/
ml)
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
en diferentes tipos celulares [77, 108, 109, 232, 254], nos planteamos como hipótesis que
las lipoproteínas podrían también mediar esos efectos en los fibroblastos sinoviales. Los
fibroblastos sinoviales fueron estimulados con L-Omp19 y los sobrenadantes se
recolectaron 48 hs. después para medir la secreción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2
por ELISA. Como se muestra en la Figura 27 L-Omp19 indujo la secreción de GM-CSF,
IL-6, IL-8, MCP-1 y MMP-2 en una forma dosis dependiente, y una expresión significativa
de todos estos factores fue detectada incluso con la concentración más baja de L-Omp19,
10 ng/ml (P < 0,05). En todos los casos la inducción fue dependiente de la porción lipídica
ya que S-Omp19 no fue capaz de inducir la producción de los factores analizados, aún
siendo utilizado a una concentración elevada de 1000 ng/ml. Como esperábamos el LPS
de B. abortus no indujo la producción de ninguno de los factores analizados aún siendo
utilizado a una concentración elevada de 1000 ng/ml, mientras que 100 ng/ml de LPS de
E. coli indujo la secreción de altos niveles de todos los factores.
En resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio y en la sección 1.5. de este
trabajo fue demostrado que TLR2 media las respuestas frente al estímulo con HKBA y las
lipoproteínas de B. abortus en diferentes tipos celulares [77, 109]. En consecuencia
analizamos el rol de TLR2 en la inducción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2 por parte
de los fibroblastos sinoviales en respuesta a HKBA y L-Omp19. Los fibroblastos sinoviales
fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes anti-TLR2 o anti-TLR4 o sus respectivos
controles de isotipo y luego estimulados con HKBA y L-Omp19 durante 48 hs. El LPS de E.
coli y Pam3Cys fueron utilizados como agonistas controles de TLR4 y TLR2
respectivamente. La producción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2 fue evaluada en el
sobrenadante de cultivo por ELISA y zimografía respectivamente. Como se muestra en la
Figura 28 la preincubación de los fibroblastos sinoviales con un anticuerpo anti-TLR4 no
tuvo ningún efecto en la producción de GM-CSF, IL-6, IL-8, MCP-1 o MMP-2 en respuesta
a HKBA o L-Omp19, pero como esperábamos bloqueó significativamente la producción de
estos factores en respuesta al LPS de E. coli (P < 0,001). Por el contrario, la preincubación
con un anticuerpo anti-TLR2 inhibió significativamente la producción de todos los factores
analizados en respuesta a Pam3Cys, L-Omp19 y HKBA (P < 0,001). Los controles de
isotipo no tuvieron efecto en ninguna de las respuestas investigadas.
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
Figura 27. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas por parte de los fibroblastos sinoviales.
Contro
l 7
HKBA 108
HKBA 10
9
HKBA 10L-O
mp19 1
0
L-Omp1
9 100
L-Omp1
9 100
0
S-Omp1
9 100
0Cys
3
Pam LPS BaLPS Ec
0
500
1000
******
***
***
***
***
***
***IL
-6 (p
g/m
l)Con
trol 7
HKBA 108
HKBA 10
9
HKBA 10L-O
mp19 10
L-Omp1
9 100
L-Omp1
9 100
0
S-Omp19
1000 Cys
3
Pam LPS BaLPS Ec
0
40
80 **
*****
****
*
MCP
-1 (n
g/m
l)
Contro
l 7
HKBA 108
HKBA 10
9
HKBA 10L-O
mp19 10
L-Omp19
100
L-Omp1
9 100
0
S-Omp1
9 1000 Cys
3
Pam LPS BaLPS Ec
0
125
250*** *** ***
********* ******
GM
-CSF
(pg/
ml)
Contro
l 7
HKBA 108
HKBA 10
9
HKBA 10L-O
mp19 1
0L-O
mp19 1
00
L-Omp1
9 100
0
S-Omp1
9 100
0Cys
3
Pam LPS BaLPS Ec
0
600
1200
***
*****
*** ***
***
******
IL-8
(pg/
ml)
La producción de GM-CSF, MCP-1, IL-8, IL-6 y MMP-2 fue determinada en el sobrenadante de los fibroblastos sinoviales estimulados con HKBA (107 a 109 bacterias /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) durante 48 h por ELISA . *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control (sin estímulo). Con
trol 8
HKBA 10LPS Ec 1
00LPS Ba 1
000
L-Omp1
9 100
S-Omp1
9 100
0Cys
503
Pam
0
50
100 *** *** *** ***
MM
P-2
(ng/
ml)
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
Figura 28. B. abortus induce la secreción de MMP-2 y citoquinas por parte de los fibroblastos sinoviales, y este efecto está mediado por L-
Omp19 a través del reconocimiento de TLR2.
HKBA LPS Ec
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
LPS
Ba
Cont
rol
HKBA LPS Ec
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
LPS
Ba
Cont
rol
L-OMP19 Pam3Cys
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
Cont
rol
L-OMP19 Pam3Cys
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
a-TL
R4
a-TL
R2
Isot
ipo
Sin
trat
ar
Cont
rol
Los fibroblastos sinoviales fueron preincubados con anticuerpos bloqueantes anti-TLR2 o anti-TLR4 o un control de isotipo durante 1 h, y luego estimulados con HKBA (107 UFC /ml), LPS de E. coli (100 ng/ml), L-Omp19 (100ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml). Luego de 48 hs. de cultivo se evaluó la producción de citoquinas por ELISA y de MMP-2 por zimografía. ***P<0,001 versus el tratamiento con anti-TLR2 o anti-TLR4 (según cada caso).
0
750
1500
HKBA LPS Ec L-Omp19 Pam3Cys
*** *** *** ***
Cont
rol
LPS
Ba
IL-6
(pg/
ml)
B
0
750
1500
HKBA LPS Ec L-Omp19 Pam3Cys
*** *** *** ***
Con
trol
LPS
Ba
IL-8
(pg/
ml)
0
200
400
HKBA LPS Ec L-OMP19 Pam3Cys
*** ******
***
Sin tratara-TLR2a-TLR4Isotipo
Cont
rol
LPS
Ba
GM
-CSF
(pg/
ml)
0
300
600
HKBA LPS Ec L-Omp19 Pam3Cys
*** ***
******
Cont
rol
LPS
Ba
MCP
-1 (p
g/m
l)
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
Estos resultados indican que la secreción de citoquinas, quemoquinas y MMP-2 por
parte de los fibroblastos sinoviales en respuesta a HKBA depende del reconocimiento de
ligandos vía TLR2. Además estos resultados sugieren fuertemente que los ligandos TLR2
son las lipoproteínas de Brucella. Por el contrario el LPS de B. abortus, no esta involucrado
en la producción de citoquinas, quemoquinas o MMP-2 por parte de los fibroblastos
sinoviales en respuesta a HKBA.
10. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c.
Para determinar la relevancia in vivo de nuestra hipótesis, utilizamos el modelo
murino. Ratones BALB/c fueron inoculados con HKBA, L-Omp19 y S-Omp19 en la
articulación de la rodilla de los miembros posteriores. Luego de 5 días los animales fueron
sacrificados. Las rodillas fueron separadas para preparar un homogenado de tejido y medir
la producción de citoquinas por ELISA y la expresión de MMPs por zimografía, o fijadas y
embebidas en parafina para realizar cortes histológicos que fueron teñidos con eosina-
hematoxilina. Como se muestra en la Figura 29 A los niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-
1 e IL-8 aumentaron significativamente (P < 0,01) en las rodillas de los ratones inoculados
con HKBA, L-Omp19 o con el LPS de E. coli (control positivo), comparado con las rodillas
inoculadas con PBS (control negativo). Por el contrario, los niveles de las citoquinas no se
vieron incrementados en las rodillas de los ratones inoculados con S-Omp19. Los niveles
de expresión de MMP-2 y MMP-9 se incrementaron en las rodillas inoculadas con HKBA,
L-Omp19 o LPS de E. coli comparado con las rodillas inoculadas con el vehículo en el que
están disueltos los antígenos (PBS), y permanecieron sin modificarse en las rodillas
inoculadas con S-Omp19 (Figura 29 B).
Como se muestra en la Figura 30 los cortes histológicos teñidos con eosina-
hematoxilina de las rodillas inoculadas con HKBA, L-Omp19 o LPS de E. coli exhibieron un
infiltrado inflamatorio (neutrófilos y monocitos), vasodilatación, estasis, edema e
hiperplasia sinovial, mientras que aquellas inoculadas con S-Omp19 o PBS solo mostraron
una extravasación de glóbulos rojos debido al procedimiento de inyección aplicado. No se
observó reclutamiento de ningún leucocito en la articulación contralateral de los animales
inoculados con los antígenos (no mostrado) o de la articulación de los animales inoculados
con PBS.
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Figura 29. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c.
6
HKBA 10L-O
mp19S-O
mp19
Ec LPS
Contro
l
0
2500
5000
**
***
**
MCP
-1 (p
g/m
l)
6
HKBA 10L-O
mp19
S-Omp1
9
Ec LPS
Contro
l
0
90
180***
*** ***
TNF-
a (p
g/m
l)
6
HKBA 10L-O
mp19S-O
mp19
Ec LPS
Contro
l
0
75
150***
*****
IL-1
b (p
g/m
l)
6
HKBA 10L-O
mp19
S-Omp1
9
Ec LPS
Contro
l
0
400
800 ***
******IL
-6 (p
g/m
l)
6
HKBA 10L-O
mp19
S-Omp1
9
Ec LPS
Contro
l
0
20
40***
***
***
IL-8
(ng/
ml)
A
Cont
rol
HKBA 10
6
L-Omp1
9 S-
Omp19
EcLP
S
Cont
rol
HKBA 10
6
L-Omp1
9 S-
Omp19
EcLP
S B
MMP-9
MMP-2
Ratones Balb/c fueron inyectados con HKBA (106 bacterias/ml), L-Omp19 (100 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml) o PBS (control) en las articulaciones de las rodillas y luego de 5 días los animales fueron sacrificados. Se separó la rodilla para preparar homogenados de tejido o para una evaluación histopatológica. Los extractos de tejido se utilizaron para medir la producción de citoquinas por ELISA (A) y la expresión de MMP por zimografía (B). **P<0,01; ***P<0,001 versus el control.
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Estos resultados indican que la presencia de B. abortus dentro de la articulación
puede inducir una respuesta inflamatoria que conlleva a un infiltrado de monocitos y
neutrófilos.
11. Bursitis prepatelar causada por la infección con B. abortus: producción local de citoquinas proinflamatorias y gelatinasas
Por otro lado, pudimos corroborar que muchos de los mediadores de inflamación
estudiados en los modelos de infección con B. abortus desarrollados en nuestro laboratorio
estaban presentes en el líquido sinovial de un paciente con brucelosis prepatelar.
Determinamos la producción de varias citoquinas, quemoquinas y MMPs en dos muestras
de fluido sinovial de un paciente con bursitis prepatellar debida a una infección con B.
abortus. Una muestra fue tomada al inicio de la presentación de la bursitis y otra muestra 3
meses después.
Figura 30. B. abortus y L-Omp19 inducen una respuesta inflamatoria en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c.
HKBA 106 L-Omp19 S-Omp19 Ec LPS Control HKBA 106 L-Omp19 S-Omp19 Ec LPS Control
Ratones Balb/c fueron inyectados con HKBA (106 UFC/ml), L-Omp19 (100 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml) o PBS (control) en las articulaciones de las rodillas y luego de 5 días los animales fueron sacrificados. Se realizó un examen histopatológico de las articulaciones representativas. Los paneles superiores muestran las imágenes tomadas en la magnitud original (100x), y los paneles inferiores muestran en detalle las áreas perisinoviales seleccionadas para documentar la presencia o ausencia de infiltrado leucocitario (magnitud 400x).
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Los niveles de TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1 e IFN- fueron determinados por ELISA.
Con el objetivo de realizar una comparación también se analizaron cinco muestras de
fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoidea y una muestra proveniente de un
paciente con artritis séptica de rodilla debido a una infección con S. aureus.
Tabla 1. Bursitis prepatelar debida a la infección por B. abortus: producción local de citoquinas.
Muestra TNF-α IL-1β IFN- IL-8 MCP-1
Bursitis 1 34.36 (32.24–36.47)
7.51 (7.12–7.90)
14.57 (10.13–19.00)
9.53 (9.30–9.75)
11.81 (0.72)
Bursitis 2 79.73 (76.34–83.12)
16.62 (15.08–18.16)
22.45 (20.04–24.87)
25.55 (25.23–25.89)
16.35 (1.23)
Artritis séptica
3.95 (3.90–4.00)
9.75 (9.50–10.01)
7.30 (7.00–7.60)
4.75 (4.50–5.00)
3.41 (3.40–3.42)
RA 1 4.68 (4.67–4.70)
3.32 (3.20–3.45)
10.50 (10.05–11.00)
3.62 (3.50–3.73)
2.10 (2.00–2.21)
RA 2 5.99 (5.98–6.00)
3.55 (3.50–3.60)
15.55 (15.10–16.00)
3.25 (3.20–3.30)
1.57 (1.53–1.60)
RA 3 3.37 (3.30–3.45)
2.77 (2.75–2.80)
8.05 (8.00–8.10)
4.05 (4.00–4.10)
1.15 (1.00–1.29)
RA 4 13.67 (13.60–13.74)
10.50 (10.00–11.00)
8.95 (8.90–9.00)
4.17 (4.14–4.20)
0.85 (0.84–0.85)
RA 5 8.11 (8.00–8.23)
9.73 (9.67–9.80)
12.15 (12.00–12.30)
4.14 (4.00–4.28)
2.27 (2.19–2.34)
La producción de citoquinas fue determinada por ELISA en el líquido sinovial de un paciente con bursitis brucelar (Bursitis 1, muestra tomada al momento de la presentación de la bursitis; Bursitis 2, muestra tomada 3 semanas más tarde); de 5 pacientes con artritis reumatoidea (RA 1-5) y de un paciente con artritis séptica. Los resultados estan expresados en ng/ml.
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Como se muestra en la Tabla 1, los niveles de TNF-α, IL-8 y MCP-1 fueron elevados
en las dos muestras de fluido sinovial provenientes del paciente con bursitis, comparado
con las muestras provenientes de los pacientes con artritis reumatoidea y artritis séptica
Los niveles de IL-1β e IFN- de la muestra proveniente del paciente con bursitis en su
presentación inicial fueron similares a los detectados en las muestras de pacientes con
artritis reumatoidea y con artritis séptica, sin embargo los niveles en la muestra del
paciente con bursitis obtenida 3 meses después de la presentación se incrementaron
notablemente. Puede concluirse que los niveles de todos los factores analizados
aumentaron entre la muestra tomada durante la presentación inicial de la bursitis y la
tomada 3 meses después lo que evidencia la presencia de un proceso inflamatorio en
curso.
La presencia de MMPs fue analizada en las mismas muestras mencionadas en el
párrafo anterior mediante zimografía. La presencia de MMP-9 (90 kDa) fue detectada en
las dos muestras provenientes del paciente con bursitis, en dos de las muestras de los
pacientes con artritis reumatoidea y en la proveniente del paciente con artritis séptica
(Figura 31). También se detectó la presencia de MMP-2 (60 kDa) con menor actividad
gelatinasa en todas las muestras analizadas excepto en la proveniente del paciente con
artritis séptica. Estos resultados aportan una evidencia del rol de las MMPs in vivo en el
daño osteoarticular durante la infección por Brucella en el hombre.
Figura 31. Bursitis prepatelar debida a la infección por B. abortus: producción local de gelatinasas.
1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8
La producción de MMPs con actividad gelatinasa fue determinada por zimografía en el líquido sinovial de un paciente con bursitis brucelar (calle 1, muestra tomada al momento de la presentación de la bursitis; calle 2, muestra tomada 3 semanas mas tarde); Calles 3-7, muestras de 5 pacientes con artritis reumatoidea, y Calle 8, muestra de un paciente con artritis séptica. La actividad gelatinasa en las regiones de peso molecular 90 y 60 kDa esta indicada por una flecha superior y otra inferior, respectivamente.
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Capítulo I Discusión
En la mayoría de los casos de artritis séptica y osteomielitis, el daño en el hueso y en
las articulaciones resulta a partir de una reacción inflamatoria producida por la infección.
Esta inflamación incluye también un aumento en la actividad de las MMPs. En artritis
asociadas con la enfermedad de Lyme [228], en periodontitis causadas por diferentes
bacterias [229], y en artritis séptica causada por la infección con S. aureus [230] se ha
demostrado la presencia de niveles elevados de MMPs. En estos procesos patológicos las
fuentes de MMPs pueden ser las células residentes tales como osteoblastos, osteoclastos,
fibroblastos sinoviales o condrocitos, así como también fagocitos atraídos al foco
inflamatorio. La potencial contribución de las MMPs al daño tisular en la brucelosis
osteoarticular no había sido evaluada hasta el momento.
Osteoblastos
Los osteoblastos pueden producir varias MMPs en respuesta a diferentes estímulos,
entre las cuales MMP-2 es particularmente importante debido a que además de degradar
colágeno desnaturalizado, también degrada colágeno tipo I presente en el hueso, colágeno
tipo II presente en el cartílago y colágeno tipo IV de la membrana basal. [217, 255]. En el
presente trabajo se detectó un incremento en la actividad de MMP-2 en los sobrenadantes
de los osteoblastos humanos (línea celular hFOB) infectados con B. abortus. En estudios
previos se ha demostrado que la producción de MMPs puede ser estimulada por GM-CSF
en varias líneas celulares [231, 244]. Debido a que este factor es producido por los
osteoblastos infectados con B. abortus, evaluamos si GM-CSF podía inducir la producción
de MMP-2 por parte de estas mismas células. Nuestros resultados demostraron que GM-
CSF es el principal mediador en la producción de MMP-2 por osteoblastos infectados con
B. abortus. Aunque otras citoquinas tales como TNF-α e IL-1β han sido involucradas en la
inducción de MMP-2 en osteoblastos [256, 257], solo estudiamos el rol de GM-CSF dado
que los osteoblastos infectados con B. abortus no producen niveles detectables de
ninguna de las dos citoquinas.
Como se mencionó, los fagocitos atraídos al sitio de infección también pueden
producir MMPs. En concordancia con estudios previos realizados en nuestro laboratorio en
células de osteosarcoma [32], en este trabajo demostramos que los osteoblastos de la
línea hFOB responden a la infección con B. abortus con una producción significativa de
MCP-1 e IL-8, quimioatractantes de monocitos y neutrófilos, respectivamente.
Notablemente, se ha observado un infiltrado inflamatorio en la membrana sinovial y en el
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hueso de pacientes con artritis brucelar y osteomielitis respectivamente [258]. Por lo tanto,
los osteoblastos infectados no solo estarían involucrados en la degradación de la matriz
mediante la secreción de MMP-2 sino también por su habilidad de reclutar monocitos y
neutrófilos al foco de infección. Estas últimas células responden a la infección con B.
abortus produciendo MMP-9, la cual degrada colágeno tipo V presente en el hueso y
colágeno tipo IV presente en la membrana basal [217, 253, 259, 260]. Los monocitos
infectados con B. abortus secretan citoquinas proinflamatorias como TNF-α e Il-1β. Se ha
reportado que ambas citoquinas inducen la expresión de MMPs en osteoblastos,
condrocitos, fibroblastos sinoviales, y monocitos, entre otros tipos celulares [243, 253, 261-
264]. Nuestros resultados demuestran que los sobrenadantes de los monocitos infectados
con B. abortus estimulan la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos y que
TNF-α es el principal mediador de este efecto. De acuerdo con estudios previos, Il-1β no
está involucrado en la inducción de MMP-2 [257, 265]. Por otro lado, los sobrenadantes de
los neutrófilos infectados también indujeron un incremento en la producción de MMP-2 por
parte de los osteoblastos.
Además nuestra hipótesis es que factores producidos por los osteoblastos podrían
influenciar la producción de MMPs por parte de los monocitos y neutrófilos. De hecho,
demostramos que los sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos infectados indujeron la
producción de MMP-9 por parte de los monocitos mediante un mecanismo que depende
de GM-CSF, el cual también ha sido implicado en la producción de MMPs en otros
modelos [231, 247]. Esta citoquina también media la producción de TNF-α e IL-1β por
parte de los monocitos, como se demostró en este trabajo y en resultados previos
obtenidos en nuestro laboratorio [32]. Por lo tanto, evaluamos si el efecto estimulatorio de
GM-CSF derivado de los osteoblastos infectados estaba mediado por estas citoquinas.
Nuestros resultados demostraron que el efecto de GM-CSF fue indirecto, ya que este
factor indujo la secreción de TNF-α por parte de los monocitos, el cual a su vez fue el
principal responsable de estimular la secreción de MMP-9 por estas últimas células.
Por otro lado, también demostramos que los sobrenadantes de los osteoblastos
infectados inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos.
Fibroblastos sinoviales
Los fibroblastos sinoviales han sido reconocidos como mediadores del daño articular
en enfermedades inflamatorias tanto de origen infeccioso como no infeccioso. Además de
su rol patogénico directo debido a la producción de MMPs que degradan colágeno, los
fibroblastos sinoviales también pueden producir citoquinas, quemoquinas y factores de
crecimiento que, al igual que describimos para los osteoblastos, pueden mediar el
reclutamiento de leucocitos al sitio de infección osteoarticular. En concordancia con este
rol propuesto para los fibroblastos sinoviales en las artritis, en el presente trabajo
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demostramos que B. abortus puede invadir y replicarse intracelularmente en los
fibroblastos sinoviales humanos y que dicha infección induce la producción de MMP-2 y
mediadores proinflamatorias por parte de estas células, así como también quemoquinas
MCP-1 e Il-8, que atraerían monocitos y neutrófilos al sitio de infección. Estas últimas
células podrían contribuir al daño tisular fagocitando a las bacterias en el foco de infección
y produciendo citoquinas proinflamatorias las cuales podrían inducir la secreción de más
MMPs por parte de los fibroblastos sinoviales. Además, los sobrenadantes de cultivo de
los monocitos y neutrófilos infectados con B. abortus indujeron la producción de MMP-2
por parte de los fibroblastos sinoviales. Nuestros resultados demuestran que TNF-α
desempeño un rol preponderante en la inducción de MMP-2 por parte de los fibroblastos
sinoviales. El rol de TNF-α como inductor de MMPs en fibroblastos sinoviales coincide con
resultados obtenidos en varios estudios previos [184, 249, 266] y con nuestros resultados
obtenidos en la interacción de osteoblastos y monocitos frente a la infección por Brucella
descritos previamente. Estudios realizados por otros autores revelaron que TNF-α se
encuentra incrementado en las articulaciones de los ratones con artritis causada por S.
aureus y que la secreción local de TNF-α en la cavidad articular puede correlacionarse con
el del daño articular [267]. Como ya mencionamos, en este trabajo demostramos que los
monocitos y los neutrófilos producen MMP-9 en respuesta a la infección por B. abortus y
también en respuesta a factores solubles liberados por los fibroblastos sinoviales
infectados, mediante un mecanismo mediado casi exclusivamente por GM-CSF en
monocitos y al menos parcialmente por IL-6 en neutrófilos.
La actividad de las MMPs se encuentra contrarrestada in vivo por la actividad de
inhibidores específicos, incluyendo TIMPs [215]. En las infecciones osteoarticulares
frecuentemente sucede que los TIMPs no se incrementan en la misma proporción que lo
hacen las MMPs, resultando en un incremento de la relación MMP/TIMP, lo cual agrava la
degradación del cartílago y del hueso promoviendo la destrucción de las articulaciones
[268, 269]. De acuerdo con estas observaciones, demostramos que los sobrenadantes de
los osteoblastos, fibroblastos sinoviales, monocitos o neutrófilos infectados con B. abortus
indujeron la degradación de gelatina en fase fluida bajo condiciones nativas en las cuales
los complejos MMP-TIMP no se encuentran disociados.
Las lipoproteínas de Brucella en la inducción de MMPs
La secreción de MMP-9 por parte de los monocitos y los neutrófilos fue también
producida por HKBA, indicando la presencia de uno o más componentes estructurales
involucrados. Dado que las lipoproteínas de Brucella son las responsables de muchos de
los fenómenos inducidos por la infección por Brucella en varios tipos celulares [108, 109,
232], nustra hipótesis es que dichas lipoproteínas también podrían mediar la inducción de
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MMP-9 en los monocitos y en los neutrófilos. Demostramos que L-Omp 19, pero no su
forma no lipidada, indujo la producción de MMP-9 en estas células. El mismo efecto fue
observado para Pam3Cys, un lipohexapéptido sintético que imita la estructura lipídica de
las lipoproteínas bacterianas. En contraste, el LPS de B. abortus no fue capaz de inducir
estas respuestas.
Las lipoproteínas de Brucella inducen la producción de citoquinas proinflamatorias en
monocitos, como se demuestra en este trabajo y en estudios previos realizados en nuestro
laboratorio [109]. Nuestros resultados revelan que la producción de MMP-9 por parte de
monocitos está mediada por TNF-α. Por otro lado en nuestro laboratorio demostramos que
la producción de distintos mediadores por parte de los monocitos y de otros tipos celulares
en respuesta a HKBA y las lipoproteínas estaba mediada por TLR2 [108, 109, 232]. En
concordancia, observamos que la producción de MMP-9 por los monocitos dependía de
TLR2. Como el genoma de Brucella contiene al menos 80 genes putativos que codifican
para lipoproteínas, varias de las cuales son expresadas en la membrana externa, la
concentración de las lipoproteínas de Brucella en el foco de infección dentro del hueso
serían suficientes para ejercer los efectos biológicos ya descriptos.
Los fibroblastos sinoviales expresan TLRs, incluyendo TLR2 [270] y por lo tanto
también pueden producir citoquinas y MMPs no solo en respuesta a la infección sino que
también en respuesta a antígenos bacterianos [271, 272]. De acuerdo con esta última
observación demostramos que HKBA y L-Omp19 también fueron capaces de estimular la
producción de MMP-2 por parte de los fibroblastos sinoviales, y esto dependió del
reconocimiento por TLR2. En contraste, si bien los osteoblastos expresan algunos TLRs,
tales como TLR4 [273], TLR5 [274] y TLR9 [275], no ha sido descripto la expresión de
TLR2 por parte de estas células. Esto explicaría por que los osteoblastos no son capaces
de responder frente a los estímulos de HKBA o L-Omp19.
Modelo murino
Se utilizó un modelo murino de inoculación intraarticular para determinar si el
incremento de los mediadores proinflamatorias y MMPs en respuesta a los antígenos
bacterianos observados in vitro también ocurría in vivo. Notablemente, los niveles de TNF-
α, IL-1β, IL-6, MCP-1, IL-8, MMP-2 y MMP-9 se incrementaron en forma significativa en las
articulaciones de los ratones inoculados con HKBA y L-Omp19 (pero no en ratones
inoculados con S-Omp19) demostrando que la presencia de los antígenos de Brucella en
los tejidos articulares inducen la producción local de mediadores inflamatorios y MMPs.
Estos resultados coinciden con resultados previos en modelos murinos de artritis séptica
por staphylococci, streptococci y Borrelia burgdorferi [267, 276, 277].
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Paciente con bursitis brucelar
En dos muestras de líquido sinovial provenientes de un paciente con bursitis
prepatelar ocasionada por la infección por B. abortus demostramos la presencia de altos
niveles de TNF-α e Il-1β junto con niveles incrementados de las quemoquinas (MCP-1 e
IL-8), así como también de IFN- y MMP-9. Los niveles de TNF-α, Il-8 y MCP-1 en las dos
muestras provenientes de la bursitis fueron más altos que los detectados en las muestras
de artritis reumatoidea y artritis séptica, y lo mismo se observó para Il-1β e IFN- en la
muestra de fluido sinovial tomada tres meses después de la presentación de la bursitis.
Los niveles de todos los marcadores inflamatorios evaluados se incrementaron en la
segunda muestra comparada con la inicial. Notablemente observamos que la actividad
gelatinasa fue más evidente en las muestras provenientes del caso de la bursitis y de los
casos de las artritis sépticas y artritis reumatoidea, los cuales exhibieron los niveles más
altos de TNF-α o IL-1β. Estos resultados aportan una evidencia in vivo del rol de las MMPs
en la patología osteoarticular por Brucella y el rol de las citoquinas proinflamatorias en la
producción de las mismas.
En resumen, demostramos que B. abortus es capaz de infectar y replicarse en
osteoblastos y fibroblastos sinoviales e inducir en estas células la producción de MMP-2,
citoquinas proinflamatorias y quemoquinas. Las quemoquinas derivadas de estos dos tipos
celulares pueden mediar la migración de monocitos y neutrófilos, los cuales responden a la
infección produciendo MMP-9. Por otro lado, puede establecerse una red de
estimulaciones recíprocas mediada por citoquinas entre las células residentes y las células
fagocíticas en respuesta a la infección con B. abortus aumentando aún mas la producción
de MMP-2 y MMP-9. La producción de MMPs y citoquinas por parte de los fibroblastos
sinoviales y los fagocitos atraídos puede producirse también en respuesta a antígenos de
B. abortus, en particular a sus lipoproteínas. Un aumento en la producción de mediadores
inflamatorios, entre ellos las MMPs, en respuesta a las lipoproteínas de Brucella pudo
demostrarse in vivo usando el modelo murino. En concordancia con estos resultados, la
presencia de los mediadores inflamatorios también fue determinada en el fluido sinovial de
un paciente con bursitis debido a una infección por B. abortus, aportando una evidencia del
rol de las MMPs in vivo en el daño osteoarticular durante la infección por Brucella en el
hombre.
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CAPÍTULO II “Inducción de la osteoclastogéneis por la infección con B. abortus” Introducción
Como se mencionó en la introducción general el metabolismo del hueso es un
proceso complejo y muy controlado. En los individuos sanos existe un balance continuo
entre la degradación y la formación de hueso nuevo. Los osteoclastos son las únicas
células encargadas de degradar la matriz del hueso. Los mismos se originan a partir de la
fusión de precursores pertenecientes al linaje monocito/macrófago, lo cual resulta en la
generación de células multinucleadas gigantes con la capacidad de resorber hueso,
mediante la secreción de protones (disolución de matriz mineral) y de enzimas proteolíticas
(degradación de matriz orgánica). La degradación de la matriz orgánica involucra
principalmente dos clases de enzimas: las cisteína proteasas lisosomales como la
catepsina K [278], y las MMPs incluyendo principalmente MMP-9 [279].
La diferenciación de los osteoclastos requiere la presencia de dos factores críticos: el
factor estimulante de colonias macrofágicas (M-CSF) y el ligando del receptor activador de
NF-κB (RANKL). RANKL es expresado en la superficie de los osteoblastos o bien puede
ser liberado en forma soluble, aunque también se ha documentado su expresión por otros
tipos celulares como fibroblastos, linfocitos B y T activados [158, 159, 280]. Su actividad
biológica esta regulada por el inhibidor natural osteoprotegerina (OPG) que actúa como un
receptor soluble de RANKL que inhibe en forma competitiva la unión de este último a su
receptor RANK en la superficie de los precursores de osteoclastos [161].
Tanto la forma transmembrana como la soluble de RANKL inducen la formación de
osteoclastos in vitro cuando los precursores de estas células son cultivados con el factor
estimulante de colonias macrofágicas (M-CSF) [281]. Sin embargo, la diferenciación de los
osteoclastos también puede ocurrir por un proceso independiente de la interacción
RANKL-RANK. Se ha reportado que TNF-α [187, 188] e IL-6 [189] también son capaces de
inducir en forma directa la formación de osteoclastos in vitro, en presencia de M-CSF. Esto
sugiere que ambas citoquinas proinflamatorias juegan un rol importante en la
osteoclastogenesis.
En las enfermedades inflamatorias crónicas del hueso, se ha demostrado que tanto
RANKL como las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-1β e IL-6 son importantes en la
progresión de la enfermedad y destrucción ósea [282, 283]. Es importante destacar que los
macrófagos en los tejidos inflamados no solo tienen la capacidad de diferenciarse a
osteoclastos [284], sino que pueden acelerar la degradación del hueso a través de la
producción de citoquinas proinflamatorias [285].
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En el capítulo I describimos un mecanismo por el cual B. abortus podría inducir daño
osteoarticular, mediante la producción de MMPs. Para establecer otra conexión entre la
infección por B. abortus y la pérdida de hueso, y teniendo en cuenta que la infección por
Brucella produce una potente respuesta inflamatoria local, nuestra hipótesis es que la
infección podría crear un microambiente que también promovería la generación de
osteoclastos, las únicas células capaces de degradar el hueso en forma eficiente. Por tal
motivo, evaluamos la capacidad de B. abortus de inducir la formación de osteoclastos, y
estudiamos los mecanismos inmunes y los determinantes bacterianos involucrados en
dicho proceso.
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Capítulo II Materiales y métodos 1. Animales
Los ratones hembra de la cepa salvaje C57BL/6J, y MyD88 [84], TLR2 , TLR4 [286] y
TNFRp55 [287] KO de 6 a 8 semanas de edad fueron cedidos por la Universidad Federal
de Mina Gerais (Belo Horizonte, Brasil) o la Universidad de La Plata (Argentina). Los
animales fueron alojados en condiciones controladas de temperatura (22°C ± 2°C) y luz
artificial bajo ciclos de 12 h en un ambiente libre de patógenos en un gabinete de presión
positiva, y fueron provistos de comida y agua ad libitum.
2. Cultivo de bacterias
El cultivo de bacterias fue realizado tal como fue descripto en la sección 1 de
Materiales y Métodos del Capítulo I.
3. Lipoproteínas y LPS
Las lipoproteínas, el LPS de B. abortus y el LPS de E. coli fueron obtenidos como se
describió en las secciones 11 y 12 de Materiales y Métodos del Capítulo I.
4. Cultivo celular
Todos los experimentos fueron realizados en una atmósfera de 5% de CO2 a 37ºC en
medio de cultivo α-MEM, suplementado con 2mM de L-glutamina, 10% de SFB (Gibco, Life
Technologies), 100 U de penicilina/ml y 100 µg de estreptomicina/ml (medio completo). Los
macrófagos peritoneales inducidos mediante la inoculación de tioglicolato fueron aislados
como se describió previamente [109] a partir de los ratones C57BL/6J WT, MyD88, TLR2 o
TLR4 KO.
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas fueron aisladas
de la sangre de donantes sanos de acuerdo a los lineamientos del Comité de Etica del
instituto IDEHU. Un consentimiento escrito fue obtenido de todos los donantes. Las células
fueron obtenidas mediante la centrifugación en un gradiente de Ficoll-Hypaque (GE
Healthcare Bio-Sciences) de sangre humana obtenida de individuos adultos sanos. Los
monocitos fueron aislados luego de centrifugar los PBMCs en un gradiente de Percoll (GE
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Healthcare Bio-sciences) y fueron resuspendidos en medio completo. La viabilidad de las
células fue de > 95% en todos lo experimentos, según el test de exclusión de Azul Tripán.
5. Infección celular
Los macrófagos peritoneales murinos y los monocitos humanos fueron cultivados en
placas de 24 pocillos a una densidad de 5x105 células /ml en medio completo sin el
agregado de antibióticos. Las células fueron infectadas tal como fue descripto en la
sección 3 de Materiales y Métodos del Capítulo I.
El número de bacterias internalizadas por los macrófagos peritoneales luego de 24
hs. de infección fue la siguiente: MOI 25 (6.533 611,01 bacterias), MOI 50 (15.200
1.014,88 bacterias) y MOI 100 (27.466 3.946 bacterias).
6. Ensayos de infección o estimulación de los macrófagos/monocitos con B. abortus
Los macrófagos peritoneales de ratones C57BL/6J WT, MyD88, TLR2 o TLR4 KO, o
los monocitos humanos fueron infectados con B. abortus a diferentes MOIs o estimulados
durante 24 hs. con diferentes concentraciones de HKBA, L-Omp19, U-Omp19 (1000
ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), LPS de E. coli (100 ng/ml) y Pam3Cys (50 ng/ml).
Los medios condicionados fueron recolectados, esterilizados por filtración a través de un
filtro de nitrocelulosa con un poro de 0,22 µm, y guardados a -70ºC hasta su utilización
para la determinación de citoquinas por ELISA o los ensayos de diferenciación de
osteoclastos.
7. Ensayo de formación de osteoclastos
Los monocitos derivados de médula ósea fueron inducidos a diferenciarse a
osteoclastos como se ha descripto previamente [288]. En resumen, los precursores de
médula ósea de ratones C57BL/6J WT o TNFRp55 KO fueron cultivados en medio
completo conteniendo 5 ng/ml de rM-CSF murino (R&D Systems) durante 12 hs. en placas
de 24 pocillos. Las células no adherentes fueron recolectadas, cultivadas con 30 ng/ml de
M-CSF en placas de 24 pocillos durante otras 24 hs. y fueron utilizadas como monocitos
derivados de médula ósea, los cuales fueron sembrados en cubreobjetos de vidrio dentro
de placas de 24 pocillos (5x104 células/0,5 ml/pocillo) y cultivados durante 6 días en medio
completo conteniendo 30 ng/ml M-CSF y 0,2 ml del medio condicionado de los macrófagos
peritoneales infectados con B. abortus o estimulados con antígenos de Brucella. También
se determinó la capacidad de la infección directa de B. abortus (MOI 100) de estimular la
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formación de osteoclastos. Como control positivo de la formación de osteoclastos los
monocitos derivados de médula ósea fueron estimulados con 50 ng/ml de TNF-α murino o
RANKL humano. Para identificar los osteoclastos las células fueron fijadas en
paraformaldehído 4% y teñidas para revelar la presencia de fosfatasa ácida resistente a
tartrato (TRAP) (Sigma-Aldrich). Las células multinucleadas (más de tres núcleos) TRAP
positivas fueron definidas como osteoclastos, y el número de osteoclastos fue determinado
por recuento al microscopio. Para obtener osteoclastos humanos a partir de monocitos
humanos, se llevó a cabo el mismo procedimiento utilizando citoquinas recombinantes y
factores de crecimiento de origen humano. En los ensayos de neutralización de TNF-α, los
sobrenadantes de los monocitos humanos infectados o estimulados como se describió
previamente fueron tratados con 20 g/ml de anticuerpo neutralizante anti-TNF-α (clon
Mab1, BD Biosciences) o su control de isotipo (clon 107.3, BD Biosciences).
8. Análisis de la expresión del receptor de vitronectina
La expresión del receptor de vitronectina (CD51) fue determinada por microscopía de
fluorescencia usando un anticuerpo anti-CD51 de ratón marcado con ficoeritrina (PE) (clon
RMV-7, BioLegend). Las células multinucleadas (más de tres núcleos) CD51 positivas
fueron definidas como osteoclastos.
9. Análisis por RT-PCR
El RNA total fue extraído con Trizol (Invitrogen) y el cDNA fue obtenido mediante
transcripción inversa, según las instrucciones del productor. Las secuencias de los
cebadores para RANK, catepsina K y Ckb utilizadas fueron las publicadas por otros
autores [289-291]. Se realizaron 30 ciclos (RANK), 35 ciclos (Ckb), o 20 ciclos (catepsina k
y β-actina) de desnaturalización (94ºC), hibridación (58ºC) y elongación (72ºC). Los
mismos fueron realizados en un termociclador MJ Mini (Bio-Rad). En cada ensayo se
incluyeron los correspondientes controles positivos y negativos para confirmar que solo
eran detectados los cDNA producto de la reacción de PCR y que ninguno de los reactivos
se encontraba contaminado con cDNA o DNA.
10. Medición de citoquinas y RANKL
Las concentraciones de IL-1β, IL-6, TNF-α (BD PharMingen), RANKL (R&D
Systems), y TGF-β (eBioscience) en los medios condicionados fue determinada mediante
kits de ELISA comerciales, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
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11. Ensayo de degradación de dentina
Los monocitos derivados de médula ósea de los ratones C57BL/6J WT o TNFRp55
KO, o los monocitos humanos fueron sembrados en discos de dentina (BD BioCoat
Osteologic, BD Biosciences) en placas de 96 pocillos (2x104 células/0,25 ml/pocillo): Los
mismos fueron cultivados en medio completo conteniendo 100 µl de medio condicionado
de monocitos humanos o macrófagos peritoneales de ratones WT infectados con B.
abortus o estimulados con L-Omp19 o S-Omp19, en presencia de M-CSF (30 ng/ml)
durante 6 días.
El medio y los reactivos fueron renovados todos los días para evitar la acidificación
del medio. Luego del cultivo con las células los discos de dentina fueron lavados con
NH4OH 1M para remover las células adherentes. Luego de un lavado con agua los discos
fueron visualizados por microscopía de luz para determinar y enumerar los focos de
degradación.
12. Evaluación de la formación de osteoclastos en un modelo in vivo
Los ratones C57BL/6J WT o TLR2 KO de 6 a 8 semanas de edad fueron inoculados
en forma intra-articular en las rodillas con 50 µl de HKBA (1x106 bacterias), L-Omp19 (500
ng), S-Omp19 (500 ng), LPS de E. coli (500 ng), Pam3Cys (50 ng) y el vehículo PBS, tal
como se describió en la sección 15 de materiales y métodos del Capítulo I. Los cortes
histológicos de la tibia proximal (7 µm) fueron teñidos para revelar la presencia de TRAP.
Las células multinucleadas (más de tres núcleos) TRAP positivas fueron definidas como
osteoclastos.
13. Análisis estadístico
El analisis estadístico se realizó tal como fue descripto en la sección 17 de Materiales
y Métodos del Capítulo I.
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Capítulo II RESULTADOS 1. Los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos
Los osteoclastos juegan un rol importante en la degradación del hueso y se originan
a partir de la fusión de precursores del linaje monocito/macrófago [292, 293]. Este proceso
podría involucrar mediadores solubles provenientes de células inflamatorias como pueden
ser los macrófagos infectados con B. abortus, junto con la presencia de M-CSF. [288].
Para determinar si factores solubles secretados por los macrófagos infectados con B.
abortus podían inducir la formación de osteoclastos a partir de los precursores de médula
ósea, estas últimas células fueron incubadas con M-CSF junto con sobrenadantes de
cultivo de macrófagos peritoneales murinos infectados con B. abortus. La generación de
osteoclastos fue determinada mediante la detección de células multinucleadas que
expresan fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) y el receptor de vitronectina. Para
confirmar la presencia de osteoclastos maduros se determinó también, la expresión de tres
genes involucrados en el proceso de diferenciación, como RANK, catepsina K y creatina
quinasa b (Ckb) por RT-PCR. TNF-α y RANKL fueron usados como controles positivos.
Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus indujeron la formación de
células que expresaban TRAP (Figura 32 A y C), el receptor de vitronectina (Figura 32 B)
y los tres genes involucrados en la diferenciación de osteoclastos (Figura 32 D), mientras
que los sobrenadantes provenientes de macrófagos no infectados no tuvieron ningún
efecto. La magnitud de la osteoclastogénesis fue dependiente de la MOI utilizada para
infectar los macrófagos (P < 0,01). Como esperábamos, RANKL y TNF-α indujeron la
diferenciación de osteoclastos. El efecto directo de la bacteria en la osteoclastogénesis
también fue examinado. La infección con B. abortus de los monocitos derivados de médula
ósea no indujo osteoclastogénesis (datos no mostrados), por lo tanto podemos afirmar que
la bacteria sola no induce la diferenciación de osteoclastos. Estos resultados indican que
los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos peritoneales promueven la formación de
osteoclastos funcionales a partir de monocitos derivados de médula ósea.
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Con
trol
MO
I 25
MO
I 50
MO
I 100
TN
F-
0
1250
2500
******
***
# cé
lula
s TR
AP
(+) /
wel
l
A
C D
B Control MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-αControl MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-α
Control MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-α RANKLControl MOI 25 MOI 50 MOI 100 TNF-α RANKL
Figura 32. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos infectados con B. abortus inducen la diferenciación de monocitos derivados de médula
ósea a osteoclastos.
Los monocitos derivados de la médula ósea fueron estimulados con los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos peritoneales infectados con B. abortus o no infectados (control), durante 24 h junto con M-CSF. RANKL (50 ng/ml) y TNF (50 ng/ml) se usaron como control positivo. Luego de 5 días se determinó la osteoclastogenesis mediante la detección de células multinucleadas TRAP-positivas (A y C) y que expresan el receptor de vitronectina (B). Se tomaron las imágenes representativas por miscroscopía de luz blanca (A) y microscopía de fluorescencia (B). Las células TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas (C). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados. **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar. La upregulación de la expresión de tres genes involucrados en la diferenciación de osteoclastos-RANK, catepsina K y CkB- se determinó por RT-PCR (D).
Catepsina-K
Rank
β-actina
Ckb
Cont
rol
MO
I 100
MO
I 50
MO
I 25
TNF-
αCatepsina-K
Rank
β-actina
Ckb
Cont
rol
MO
I 100
MO
I 50
MO
I 25
TNF-
α
β-actina
Ckb
Cont
rol
MO
I 100
MO
I 50
MO
I 25
TNF-
α
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2. Los macrófagos murinos infectados con B. abortus producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero no RANKL o TGF-β
La habilidad de B. abortus de inducir la secreción de citoquinas proinflamatorias ha
sido reportada previamente en macrófagos y en diferentes tipos celulares [77, 96, 101,
106, 108, 109, 232, 233] sin embargo, hasta el momento no había sido determinado el rol
de las citoquinas en la inducción de la osteoclastogénesis durante la infección con
Brucella. En consecuencia, se determinó la producción de TNF-α, IL-1β, IL-6 y RANKL
soluble en los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos peritoneales infectados con B.
abortus. La infección indujo la secreción de niveles significativos de IL-6, IL-1β y TNF-α en
una forma MOI dependiente (P < 0,05) (Figura 33 A). Sin embargo, no fue detectada la
producción de RANKL por parte de los macrófagos infectados.
Para determinar si era necesaria la bacteria viva para producir una respuesta
proinflamatoria, los macrófagos fueron estimulados con HKBA. La producción de IL-6, IL-
1β y TNF-α se incrementó significativamente (P < 0,05) en los sobrenadantes de los
macrófagos estimulados con HKBA comparado con las células no estimuladas (Figura 33 A). En cambio, la estimulación con HKBA no indujo la secreción de RANKL. Dado que ha
sido demostrado que TGF-β puede inducir la osteoclastogénesis [285], decidimos medir
también los niveles de este factor. Los niveles de TGF-β en el sobrenadante de las células
infectadas con B. abortus o estimuladas con HKBA fueron similares a los de las células no
estimuladas (no mostrado).
Estos resultados indican que los macrófagos infectados con B. abortus secretan
citoquinas proinflamatorias pero no producen RANKL soluble o TGF-β. También sugiere
que la respuesta proinflamatoria puede ser inducida por componentes estructurales de B.
abortus.
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A B Con
trol
MOI 25
MOI 50
MOI 100
6
HKBA 10
7
HKBA 10
8
HKBA 10
9
HKBA 10
0
2500
5000
*
**
**
*
**
****
TNF-
(pg/
ml)
Contro
l LPS Ec 1
0LPS Ba 1
000
Cys 50
3
Pam L-Omp19
10L-O
mp19 1
00L-O
mp19 1
000
S-Omp1
9 100
0
0
3500
7000
****
***
**
TNF-
(pg/
ml)
Contro
lMOI 2
5MOI 5
0MOI 1
00
6
HKBA 10
7
HKBA 10
8
HKBA 10
9
HKBA 10
0
550
1100**
*** ***
** **
*
IL-6
(pg/
ml)
Contro
lLPS Ec 1
0LPS Ba 1
000
Cys 50
3
Pam L-Omp1
9 10
L-Omp1
9 100
L-Omp1
9 100
0S-O
mp19 1
000
0
450
900
****
**
***IL
-6 (p
g/m
l)
Contro
lMOI 2
5MOI 5
0MOI 1
00
6
HKBA 10
7
HKBA 10
8
HKBA 10
9
HKBA 10
0
35
70
IL-1
(pg/
ml)
Contro
lLPS Ec 1
0LPS Ba 1
000
Cys 50
3
Pam L-Omp19
10L-O
mp19 1
00L-O
mp19 1
000
S-Omp19
1000
0
350
700 ***
IL-1
(pg/
ml)
Figura 33. Los macrófagos murinos infectados con B. abortus producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero no RANKL o
TGF-β.
Los macrófagos peritoneales se infectaron con B. abortus a diferentes MOIs (25, 50, 100) o se estimularon con HKBA (106-109 bacterias/ml, A) y con LPS de E. coli (10 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 y 1000 ng/ml), U-Omp19 (1000 ng/ml), o Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control) (B). La presencia de TNF-α, IL-6 e IL-1β se determinó en los sobrenadantes por ELISA.*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar.
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3. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos murinos estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos
Debido a que como ya se mencionó las lipoproteínas de Brucella (y no su LPS) son
las principales responsables de la inducción de citoquinas proinflamatorias en diferentes
tipos celulares, decidimos evaluar la contribución de las lipoproteínas en la producción de
los mediadores inflamatorios, y en la inducción de la osteoclastogénesis. Para ello, los
monocitos derivados de médula ósea fueron estimulados con los sobrenadantes de cultivo
de los macrófagos estimulados con L-Omp19, en presencia de M-CSF, y se evaluó la
formación de osteoclastos. La producción de TNF-α, IL-1β, IL-6 y RANKL en el
sobrenadante de cultivo de los macrófagos estimulados fue determinada por ELISA. Como
control positivo se usó TNF-α recombinante y el sobrenadante de cultivo de macrófagos
estimulados con LPS de E. coli. Demostramos que los sobrenadantes de cultivo de los
macrófagos estimulados con L-Omp19 indujeron la formación de osteoclastos a partir de
monocitos derivados de médula ósea, demostrado por la presencia de células
multinucleadas que expresan TRAP (P < 0,05), Ckb, RANK y catepsina K (Figura 34).
Asimismo, los macrófagos estimulados con L-Omp19 produjeron niveles significativos de
TNF-α, IL-1β e IL-6 en forma dosis dependiente (P < 0,01), pero no de RANKL (Figura 33 B). La secreción de citoquinas y la inducción de la formación de osteoclastos dependieron
de la lipidación de L-Omp19 ya que la versión no lipidada S-Omp19 fue incapaz de
producir estos fenómenos. El lipohexapeptido sintético Pam3Cys también indujo la
producción de los mediadores inflamatorios y la concomitante formación de osteoclastos,
lo cual confirma el requerimiento de la lipidación de L-Omp19 para inducir estos
fenómenos (Figura 33 B y 34). Por otro lado, no hubo un aumento significativo de los
niveles de las citoquinas en los sobrenadantes de macrófagos estimulados con el LPS de
B. abortus, y los mismos no fueron capaces de inducir la formación de osteoclastos
(Figura 43 B y 34). Como esperábamos TNF-α o el sobrenadante de cultivo de
macrófagos estimulados con LPS de E. coli indujeron la formación de osteoclastos (Figura 34).
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A
Contro
lMOI 1
006
HKBA 10
7
HKBA 10LPS Ec 1
0
LPS Ba 100
0L-O
mp19 10
L-Omp19
100
L-Omp1
9 100
0
S-Omp1
9 1000
Cys 50
3
Pam
TNF-
0
750
1500 **
**
**** ** *
**
# d
e cé
lula
sTRA
P (+
)/wel
lB
C
Control LPS Ec 10LPS Ba 1000
L-Omp19 1000L-Omp19 100L-Omp19 10 S-Omp19 1000 Pam3Cys 50
HKBA 107HKBA 106
TNF-α
MOI 100Control LPS Ec 10LPS Ba 1000
L-Omp19 1000L-Omp19 100L-Omp19 10 S-Omp19 1000 Pam3Cys 50
HKBA 107HKBA 106
TNF-α
MOI 100
L-O
mp1
9 10
00
Cathepsin-K
Rank
Con
trol
LPS
Ba10
00
LPS
Ec10
L-O
mp1
9 10
L-O
mp1
9 10
0
S-O
mp1
9 10
00
Pam
3Cys
50
MO
I 100
MO
I 25
HK
BA 1
06
HK
BA 1
07
TNF-
α
β-actin
Ckb
L-O
mp1
9 10
00
Cathepsin-K
Rank
Con
trol
LPS
Ba10
00
LPS
Ec10
L-O
mp1
9 10
L-O
mp1
9 10
0
S-O
mp1
9 10
00
Pam
3Cys
50
MO
I 100
MO
I 25
HK
BA 1
06
HK
BA 1
07
TNF-
α
β-actin
Ckb
Cathepsin-K
Rank
Con
trol
LPS
Ba10
00
LPS
Ec10
L-O
mp1
9 10
L-O
mp1
9 10
0
S-O
mp1
9 10
00
Pam
3Cys
50
MO
I 100
MO
I 25
HK
BA 1
06
HK
BA 1
07
TNF-
α
β-actin
Ckb
Figura 34. Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos murinos estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos
derivados de médula ósea a osteoclastos.
Los monocitos derivados de médula ósea fueron estimulados con sobrenadantes de los macrófagos peritoneales infectados con B. abortus o estimulados con HKBA (106y 107 bacterias/ml), LPS de E. Coli (10 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 y 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), o Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control), durante 24hs junto con M-CSF. TNF-α se utilizó como control positivo. Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la generación de células multinucleadas, TRAP-positivas. Se tomaron imágenes representativas por microscopía (A). Las células TRAP-positivas fueron contabilizadas (B). Los resultados fueron expresados como la media ± SEM., a partir de duplicados.*P<0,05; **P<0,01 versus el control. El aumento de la expresión de RANK, catepsina K y CkB se determinó por RT-PCR (C).
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4. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp 19 y la concomitante osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2
Tal como mencionamos en el capitulo I la señalización a través de TLR2 es crucial en
las respuestas inflamatorias inducidas por B. abortus y L-Omp19 [77, 109, 233]. Para
evaluar el rol de TLR2 en la producción de citoquinas proinflamatorias, los macrófagos
peritoneales de ratones C57BL/6J WT o de MyD88 KO, TLR2 KO y TLR4 KO fueron
infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 y la producción de citoquinas fue
analizada en los sobrenadantes de cultivo por ELISA. Los macrófagos provenientes de
ratones WT secretaron IL-6 y TNF-α cuando fueron infectados con B. abortus o
estimulados con L-Omp19. Por otro lado, la infección con B. abortus o la estimulación con
L-Omp19 no indujo la secreción de ninguna de las dos citoquinas en ratones MyD88 KO
(Figura 35). Estos resultados indican que la secreción de IL-6 y TNF-α inducida por B.
abortus o sus lipoproteínas es dependiente de MyD88, lo cual sugiere la participación de
un TLR. La producción de TNF-α e IL-6 por parte de los macrófagos provenientes de
ratones TLR2 KO disminuyó en forma significativa comparado con los ratones WT en
respuesta a la infección por B. abortus o la estimulación con L-Omp19. Por otro lado, los
macrófagos de los ratones TLR4 KO produjeron niveles de TNF-α e IL-6 similares a los
provenientes de los ratones WT (Figura 35). Como esperábamos los macrófagos de los
ratones TLR2 KO y TLR4 KO no produjeron citoquinas proinflamatorias en respuesta a sus
ligandos agonistas (Pam3Cys y LPS de E. coli, respectivamente), mientras que los
macrófagos de ratones WT respondieron a ambos antígenos (Figura 35).
Para verificar el rol de TLR en la inducción de la osteoclastogénesis, los
sobrenadantes de cultivo de los macrófagos de ratones C57BL/6J WT, MyD88 KO, TLR2
KO y TLR4 KO infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19, fueron utilizados
para estimular los monocitos derivados de médula ósea en presencia de M-CSF.
La formación de osteoclastos solo fue inducida por los sobrenadantes de cultivo de
los macrófagos de ratones WT o TLR4 KO, tanto infectados con B. abortus como también
estimulados con L-Omp19. Los sobrenadantes de los macrófagos de ratones MyD88 KO o
TLR2 KO infectados o estimulados con L-Omp19 no fueron capaces de inducir
osteoclastogénesis (Figura 36). Los sobrenadantes de los macrófagos estimulados con S-
Omp19 no indujeron la formación de osteoclastos en ningún caso. Como esperábamos, los
sobrenadantes de los macrófagos de ratones TLR2 KO o TLR4 KO estimulados con
Pam3Cys o LPS de E. coli respectivamente, no indujeron la formación de osteoclastos
(Figura 36).
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En conjunto estos resultados indican que la señalización vía TLR2 esta involucrada
en la producción de citoquinas en respuesta a B. abortus o sus lipoproteínas, y estas
respuestas determinan la concomitante osteoclastogénesis.
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Cont
rol
MO
I 100
L-O
mp1
9 10
L-O
mp1
9 10
0L-
Om
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1000
S-O
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9 10
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3500
7000
TNF-
(pg/
ml)
Cont
rol
MO
I 100
L-O
mp1
9 10
L-O
mp1
9 10
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Om
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1000
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(pg/
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WT MyD88 KO
TLR4 KO TLR2 KO
WT MyD88 KO TLR2 KO
Figura 35. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp 19 depende de la
presencia de MyD88 y TLR2.
TLR4 KO
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IL-6
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Los macrófagos peritoneales de los ratones Wt, MyD88, TLR2 y TLR4 KO fueron infectados con B. abortus a MOI 100 o estimulados con L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o LPS de E. Coli (10 ng/ml) o no estimulados (control). Se determinó la producción de TNF-α e IL-6 en sobrenadantes por ELISA (A y B). *P<0,05; **P<0,01;***P<0,001 versus el control .
Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
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Figura 36. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos murinos infectados o estimulados con L-Omp19 y la concomitante
osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2.
Los monocitos derivados de la médula ósea de los ratones WT fueron estimulados con sobrenadantes de macrófagos peritoneales provenientes de ratones WT, MyD88, TLR2 y TLR4 KO que fueron infectados con B. abortus a MOI 100 o estimulados con L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o LPS de E. Coli (10 ng/ml) o no estimulados (control). Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la generación de células multinucleadas, TRAP-positivas. Se tomaron imágenes representativas por microscopía (A). Las células TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas (B). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados. *P<0,05; ***P<0,001.
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5. La formación de osteoclastos inducida por los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 está mediada por TNF-α
Como se mencionó anteriormente TNF-α es una citoquina clave que puede estar
involucrada en la diferenciación de monocitos derivados de médula ósea a osteoclastos
[187, 188]. Para evaluar el rol de TNF-α en la formación de osteoclastos inducida por B.
abortus o L-Omp19, los monocitos derivados de médula ósea de ratones TNFRp55 KO
fueron estimulados con sobrenadantes de cultivo de macrófagos peritoneales de ratones
C57BL/6J WT, infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 y se evaluó la
osteoclastogénesis mediante la detección de células multinucleadas que expresan TRAP.
Como control se utilizaron precursores de médula ósea de los ratones WT. Los
sobrenadantes de cultivo de macrófagos infectados con B. abortus o estimulados con L-
Omp19 no fueron capaces de inducir la diferenciación a osteoclastos a partir de los
monocitos derivados de la médula ósea provenientes de los ratones TNFRp55 KO (Figura 37 A y B). Por otro lado, ambos sobrenadantes sí fueron capaces de inducir
osteoclastogénesis de los monocitos derivados de médula ósea provenientes de los
ratones WT. Los sobrenadantes de los macrófagos estimulados con S-Omp19 no
indujeron la diferenciación a osteoclastos de los monocitos provenientes de ninguna de las
dos cepas de ratones (Figura 37 A y B). Como esperábamos TNF-α no indujo la
diferenciación a osteoclastos de los monocitos derivados de medula ósea de ratones
TNFRp55 KO, pero si indujo la diferenciación a osteoclastos de los provenientes de los
ratones WT. Por otro lado, RANKL indujo la osteoclastogénesis de los monocitos
derivados de medula ósea provenientes de ambas cepas de ratones. Estos resultados
indican que TNF-α secretado por los macrófagos peritoneales infectados con B. abortus o
estimulados con L-Omp19 determina la osteoclastogénesis actuando a través de TNFRI.
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Control MOI 100TNF-α RANKL
p55TNF- -/-
p55TNF- -/-
WT
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L-Omp19 1000L-Omp19 100L-Omp19 10 S-Omp19 1000 Pam3Cys 50
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Figura 37. La formación de osteoclastos inducida por los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados por B.abortus o estimulados con L-Omp19
está mediada por TNF-α.
Monocitos derivados de médula ósea de ratones TNFRp55 -/- o WT fueron estimulados con sobrenadantes de macrófagos peritoneales provenientes de ratones WT los cuales fueron infectados previamente con B. abortus a una MOI 100 o estimulados con L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), S-Omp19 (1000 ng/ml), Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control). Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la detección de células multinucleadas, TRAP-positivas. Se tomaron imágenes representativas por microscopía (A). Las células TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas (B). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados.**P<0,01; ***P< 0,001.
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6. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la infección con B. abortus a través de la secreción de TNF-α
Como mencionamos, la brucelosis osteoarticular es la forma localizada más común
de la brucelosis activa en el hombre. Por lo tanto, decidimos estudiar si el efecto de B.
abortus y L-Omp19 en la osteoclastogénesis podía extenderse a los monocitos humanos,
ya que ha sido demostrado que los monocitos humanos de sangre periférica tienen la
capacidad de diferenciarse a osteoclastos [294, 295]. Para lograr este objetivo, los
monocitos humanos obtenidos de sangre periférica fueron estimulados con sobrenadantes
de cultivo de monocitos infectados con B. abortus o estimulados con HKBA, L-Omp19 o S-
Omp19, en presencia de M-CSF, y la formación de osteoclastos fue determinada por la
presencia de células multinucleadas que expresan TRAP. Los sobrenadantes de cultivo de
los monocitos infectados con B. abortus o estimulados con HKBA o L-Omp19 indujeron la
formación de osteoclastos. Por otro lado, los sobrenadante de los monocitos estimulados
con S-Omp19 no tuvieron ningún efecto.
A continuación nos preguntamos si TNF-α estaba involucrado en la inducción de la
osteoclastogénesis. Los monocitos fueron estimulados con sobrenadantes de monocitos
infectados o estimulados con los diferentes antígenos, en presencia de M-CSF y de un
anticuerpo neutralizante anti-TNF-α. Como se observa en la Figura 38 la presencia del
anticuerpo redujo casi completamente la osteoclastogenesis inducida por los
sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus o estimulados con HKBA o L-
Omp19, mientras que el control de isotipo no tuvo ningún efecto (P<0,001) (Figura 38).
Estos resultados indican que TNF-α secretado por los monocitos en respuesta a B. abortus
o sus lipoproteínas estaría involucrado en la inducción de la osteoclastogénesis y por lo
tanto en el daño observado en la focalización osteoarticular de la brucelosis humana.
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B
C
Figura 38. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la infección por B. abortus a través de la secreción de TNF-α.
Los monocitos humanos de sangre periférica fueron estimulados con sobrenadantes de cultivo de otros monocitos humanos de sangre periférica previamente infectados con B. abortus a diferentes MOIs o estimulados con HKBA (106 y107 UFC/ml), LPS de E. coli (10 ng/ml), LPS de B. abortus (1000 ng/ml), L-Omp19 (10, 100 o 1000 ng/ml), U-Omp19 (1000 ng/ml) o Pam3Cys (50 ng/ml) o no estimulados (control), durante 24hs junto con M-CSF. TNF-α (50 ng/ml) fue utilizado como control positivo. Luego de 5 días, se determinó la osteoclastogénesis mediante la detección de células multinucleadas TRAP-positivas (A), en presencia de anticuerpos anti-TNF-α (B) o un control de isotipo (C). Las células multinucleadas TRAP-positivas fueron identificadas y contabilizadas. Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados. **P<0,01; ***P<0,001 versus el control .
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7. L-Omp19 y B. abortus inducen osteoclastos diferenciados capaces de degradar matriz mineral
Nuestra hipótesis se basa en que la infección con B. abortus podría crear un
microambiente que promovería la generación de osteoclastos provocando pérdida de
hueso. En consecuencia, evaluamos la actividad funcional de los osteoclastos formados en
respuesta a la infección por B. abortus mediante su habilidad para degradar dentina.
Para llevar a cabo este objetivo, se realizaron los ensayos de diferenciación sobre
una matriz de dentina. Los osteoclastos diferenciados a partir del tratamiento con los
sobrenadantes de cultivo de monocitos humanos o macrófagos peritoneales murinos
infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 indujeron la degradación de dentina
en forma dosis dependiente por parte de monocitos humanos o monocitos derivados de
medula ósea, respectivamente (Figura 39). Por otro lado, los sobrenadantes de cultivo de
las células estimuladas con S-Omp19 o no estimuladas no tuvieron ningún efecto. En los
experimentos realizados con células humanas la degradación de dentina fue bloqueada
mediante la presencia de un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α pero no lo hizo el control
de isotipo (Figura 39 C y D). Asimismo, los monocitos derivados de médula ósea
provenientes de ratones TNFRp55 KO fueron incapaces de degradar dentina frente a
todos los estímulos (Figura 39 A y B).
Estos resultados indican que los sobrenadantes de cultivo de los monocitos humanos
o macrófagos murinos infectados con B. abortus promueven la formación de osteoclastos
funcionales a partir de monocitos humanos o monocitos derivados de médula ósea, a
través de TNF-α.
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TNFRp55 KO
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Control L-Omp19 1000L-Omp19 100L-Omp19 10 S-Omp19 MOI 50MOI 25
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Figura 39. L-Omp19 y B. abortus inducen osteoclastos diferenciados capaces de degradar matriz mineral.
La actividad funcional de los osteoclastos inducidos por B. abortus y L-Omp19 fue determinada mediante la habilidad de degradar dentina. Los monocitos derivados de médula ósea de los ratones WT o TNFRp55 -/- (A y B) o los monocitos humanos periféricos (C y D) fueron cultivados en discos de dentina bajo las mismas condiciones ya descriptas. Luego de 5 días, las células fueron removidas, y se evaluó la degradación de la dentina por microscopía (A y C), y se cuantificó el número de focos de resorción (B y D). Los resultados se expresan como la media ± SEM., a partir de duplicados.. **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin tratamiento.
C
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8. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos en la tibia de ratones mediante un mecanismo dependiente de TLR2
Para determinar la relevancia de nuestra hipótesis in vivo, ratones C57BL/6J WT o
TLR2 KO fueron inoculados con HKBA, L-Omp19 y S-Omp19 en las rodillas. Como
controles positivos se usaron LPS de E. coli y Pam3Cys y como control negativo el
vehículo en el que están disueltos los antígenos (PBS). Luego de 5 días los animales
fueron sacrificados, las rodillas fueron removidas, y se hicieron cortes histológicos de la
tibia proximal los cuales fueron teñidos para revelar la actividad de TRAP. Se observó una
extensa osteoclastogénesis, determinada por la presencia de células multinucleadas que
expresan TRAP, en las tibias de todos los ratones WT inoculados con HKBA, L-Omp19 y
LPS de E. coli, mientras que en los ratones inoculados con S-Omp19 o PBS no se observó
la formación de osteoclastos. Por otro lado, solo el LPS de E. coli fue capaz de inducir la
formación de células multinucledas que expresan TRAP en los ratones TLR2 KO (Figura 40). Estos resultados indican que la presencia de B. abortus y L-Omp19 dentro del tejido
óseo es capaz de promover una respuesta inflamatoria que provoca la formación de
osteoclastos, y que este fenómeno esta mediado por TLR2.
Control LPS Ec 500L-Omp19 500 S-Omp19 500HKBA 106 Pam3Cys
WT
TLR2-/-
Control LPS Ec 500L-Omp19 500 S-Omp19 500HKBA 106 Pam3Cys
WT
TLR2-/-
Figura 40. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos en la tibia de ratones en una forma dependiente de TLR2.
La capacidad de HKBA y de L-Omp19 de inducir osteoclastogénesis fue determinada in vivo en ratones WT y TLR2 KO. Los ratones fueron inoculados en la región articular de los miembros posteriores y a los 5 días post inoculación se removieron las tibias, se realizaron cortes histológicos y se tiñeron para TRAP. Las células multinucleadas TRAP positivas fueron observadas (flechas rojas) en las tibias de todos los animales inyectados con HKBA, L-Omp19, Pam3Cys o LPS de E. coli en ratones WT, o con LPS de E. coli en ratones TLR2 KO.
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9. Esquema con los resultados mostrados en este capítulo.
Esquema 13.
Monocito/Macrófago
B. abortus
L-Omp19
TLR2
MyD88
Precursor de osteoclasto
(Monocito /Macrófago)
TNF-α
Osteoclastomaduro
Degradación de matriz
Diferenciación
Monocito/Macrófago
B. abortus
L-Omp19
TLR2
MyD88
Precursor de osteoclasto
(Monocito /Macrófago)
TNF-α
Osteoclastomaduro
Degradación de matriz
Diferenciación
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Capítulo II DISCUSIÓN
En este capítulo describimos otro mecanismo inmune implicado en la degradación
inflamatoria del hueso que ocurre en respuesta a la infección por B. abortus.
Aunque en varios trabajos se ha documentado el papel que desempeñan las células
T y B en la degradación del hueso [296-299], se ha demostrado que los macrófagos son
también células inmunes importantes en este fenómeno [288]. Nuestros resultados ponen
en evidencia la contribución de los macrófagos en la respuesta a la infección por B.
abortus y la consecuente inducción de osteoclastogénesis. Demostramos que los
macrófagos infectados con B. abortus secretan mediadores inflamatorios capaces de
inducir la formación de osteoclastos a partir de células no diferenciadas provenientes de la
médula ósea. La generación de osteoclastos fue determinada fenotípicamente mediante la
formación de células multinucleadas TRAP positivas, que expresan el receptor de
vitronectina, e incrementan la expresión de tres genes involucrados en la diferenciación de
los osteoclastos, tales como RANK, catepsina K y Ckb; y funcionalmente por la habilidad
de estas células de inducir la degradación de dentina. Además, la presencia de B. abortus
o L-Omp19 en la tibia de ratones indujo la formación de células multinucleadas TRAP
positivas. La inducción de la osteoclastogénesis no fue un fenómeno particular de las
células de ratón. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos humanos infectados con
B. abortus también indujeron la osteoclastogénesis de monocitos humanos provenientes
de donantes sanos. Por lo tanto, el paralelismo entre los ratones y los humanos, pone
nuevamente en evidencia la utilidad del modelo murino desarrollado en esta investigación
para estudios futuros de los mecanismos inmunes que podrían estar implicados en la
patogénesis osteoarticular de la brucelosis humana.
En las enfermedades inflamatorias crónicas del hueso como la artritis reumatoidea,
se ha demostrado que las citoquinas proinflamatorias TNF-α, Il-1β e IL-6, así como
también RANKL y TGF-β, son importantes en la progresión de la enfermedad y en la
inducción patológica de osteoclastogénesis [282, 283, 285, 288, 300, 301]. Por otro lado,
ha sido demostrado que TNF-α estimula la osteoclastogénesis mediante un mecanismo
independiente de RANKL [187, 188]. La infección de los macrófagos murinos con B.
abortus indujo la secreción de TNF-α, Il-1β e IL-6 pero no de RANKL. El hecho de que la
osteoclastogénesis pueda ser inducida por los sobrenadantes de cultivo conteniendo estas
citoquinas sugiere que, al igual que ocurre en la degradación del hueso en respuesta a la
infección con Porphyromonas gingivalis [288], RANKL no estaría involucrado en la
degradación del hueso inducida por B. abortus. Kim et al. [302] han demostrado que TGF-
β juega un rol importante en la osteoclastogénesis inducida por TNF-α. Dado que TGF-β
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está presente en el SFB, no podemos descartar en forma definitiva el rol de TGF-β en la
osteoclastogénesis inducida por B. abortus.
La producción de citoquinas por los macrófagos murinos y la concomitante inducción
de la osteoclastogénesis en respuesta a la infección con B. abortus no dependieron de la
viabilidad de la bacteria, ya que ambos fenómenos fueron también inducidos en respuesta
a la estimulación con HKBA. En particular demostramos que la lipoproteína L-Omp19
reprodujo los cambios fenotípicos y funcionales inducidos por la infección con B. abortus,
estimulando la activación de los osteoclastos. Por el contrario, S-Omp19 fue incapaz de
inducir estos cambios, confirmando que la porción lipídica es necesaria para inducir la
producción de los mediadores inflamatorios y en consecuencia estimular la activación de
los osteoclastos, como ha sido demostrado en el capítulo I de la presente tesis y en
trabajos previos [77, 108, 109, 233].
Los TLRs reconocen diversos patrones moleculares de los patógenos e inician las
reacciones inflamatorias en las células de la inmunidad innata [82]. Nuestros resultados
obtenidos utilizando ratones deficientes en la expresión de MyD88 indican que la
producción de mediadores inflamatorios en respuesta a la infección por B. abortus y la
estimulación con L-Omp19, que genera un aumento de la osteoclastogénesis, depende de
la molécula adaptadora MyD88, iniciador de la vía de señalización intracelular de los TLRs.
Estos resultados concuerdan con los obtenidos por otros investigadores [107]. Además,
demostramos que ambos fenómenos están mediados por TLR2 y no por TLR4,
confirmando que las lipoproteínas serían los ligandos TLR2 utilizados por la bacteria para
inducir la producción de los mediadores inflamatorios que inducen la osteoclastogénesis.
La incapacidad de B. abortus y de L-Omp19 de inducir la formación de células
multinucleadas TRAP positivas en la tibia de ratones deficientes en TLR2 enfatiza la
relevancia de la respuesta inflamatoria mediada por TLR2 en la osteoclastogénesis
inducida por B. abortus.
TNF-α regula varias funciones celulares, tales como la proliferación, la diferenciación,
el mantenimiento de un fenotipo diferenciado, y la apoptosis en varios tipos celulares [303].
En el microambiente del hueso, TNF-α puede estimular a las células óseas induciendo
varias respuestas [304]. Enfermedades como la artritis reumatoidea, la necrósis aséptica
del hueso y las enfermedades periodontales han sido asociadas con la acumulación de
TNF-α y/ u otras citoquinas proinflamatorias, las cuales probablemente medien la
destrucción local del hueso estimulando la actividad de los osteoclastos [283, 300, 305,
306]. TNF-α es un potente inductor de la degradación del hueso a través de la activación
de los osteoclastos maduros [307-309] o mediante la estimulación de la proliferación y
diferenciación de los precursores de los osteoclastos [187, 310]. La señalización de TNF-α
vía el receptor p55 (TNFR tipo I) pareciera ser el único determinante de la
osteoclastogénesis inducida por B. abortus y sus lipoproteínas ya que la formación de
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células multinucleadas con la capacidad de resorber dentina fue completamente inhibida
en los monocitos derivados de médula ósea provenientes de ratones TNFRp55-/-. Aunque
los progenitores de los osteoclastos expresan TNFRp55 y –p75 [187], se ha descripto que
la mayoría de las actividades biológicas de TNF-α son iniciadas por TNFRp55 en estas
células. Mediante la utilización de monocitos derivados de médula ósea provenientes de
ratones deficientes en el TNFR (p55-/-, p75-/- y ambos), Abu-Amer et al. [311] demostraron
que la osteoclastogénesis inducida por el LPS estaba mediada por TNF-α y mediante un
mecanismo dependiente de la presencia de un receptor p55 funcional pero no del receptor
p75. Además, usando anticuerpos bloqueantes anti-p55 y -p75, Azuma et al. [187]
demostraron que la inducción de células multinucleadas TRAP positivas en respuesta a
TNF-α fue inhibida completamente en presencia de los anticuerpos anti-p55. Nuestros
experimentos también demostraron que los anticuerpos anti-TNF-α inhiben la formación de
osteoclastos y la degradación de dentina en las células humanas. Por lo tanto, nuestros
resultados nos permiten concluir que TNF-α es la principal citoquina involucrada en la
osteoclastogénesis inducida por B. abortus y la consecuente degradación del hueso
observada en la brucelosis humana.
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CAPÍTULO III “Inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos por la infección con B. abortus” Introducción
Los osteoblastos son células óseas especializadas en producir los componentes de
la matriz del hueso y se originan a partir de células mesenquimales pluripotenciales de la
médula ósea [169]. La vida de un osteoblasto consiste en múltiples pasos de
diferenciación (osteoblastogénesis). En primer lugar ocurre la diferenciación de las células
mesenquimales al linaje osteogénico, llamadas células osteoprogenitoras. Luego, estas
últimas proliferan y se diferencian a pre-osteoblastos. En esta etapa los pre-osteoblastos
comienzan a producir los componentes orgánicos de la matriz ósea, principalmente
colágeno tipo I y se diferencian a osteoblastos maduros, los cuales continúan sintetizando
proteínas de la matriz extracelular hasta que en última instancia inician la mineralización
de la misma a través de la deposición de cristales de hidroxiapatita (fosfato de calcio
cristalino con la fórmula (Ca10(PO4)6(OH)2). Finalmente, una fracción de los osteoblastos
maduros queda embebida por la matriz mineralizada y se convierte en osteocitos, mientras
que la otra fracción permanece tapizando la superficie del hueso o muere por apoptosis.
Cada uno de los múltiples pasos de la osteoblastogenesis se encuentra regulado por
hormonas, factores de crecimiento, citoquinas y proteínas de la matriz extracelular [170].
Estas señales exógenas inician cascadas de señalización y activan factores de
transcripción que median y controlan la osteoblastogenesis.
Los osteoblastos totalmente diferenciados se caracterizan por la expresión de
fosfatasa alcalina y colágeno tipo I, ambos importantes para la síntesis de la matriz ósea y
la posterior mineralización [312]. Los osteoblastos maduros también secretan factores
reguladores de la mineralización como osteocalcina y osteopontina, cuya máxima
expresión es detectada en el inicio de la etapa de mineralización [313, 314].
Dado que los osteoblastos son las células especializadas en la formación de la matriz
ósea la inhibición de la diferenciación y actividad de los mismos provocaría una alteración
del balance óseo disminuyendo así la densidad del hueso.
Existen evidencias que demuestran que las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-1β
[191, 192] como así también distintos antígenos bacterianos [193, 194] son capaces de
inhibir la diferenciación y mineralización de los osteoblastos. Esto sugiere que los procesos
inflamatorios juegan un rol importante en la disminución de la formación del hueso.
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Por lo tanto, en este capítulo evaluamos si la infección por B. abortus es capaz de
inhibir la diferenciación y función de los osteoblastos contribuyendo a la pérdida de hueso.
Además, considerando la relevancia de los macrófagos en la supervivencia intracelular de
Brucella, y en la producción de citoquinas proinflamatorias en respuesta a la infección,
también investigamos el rol de estas células como moduladores de la diferenciación y
función de los osteoblastos.
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Capítulo III Materiales y métodos 1. Cultivo de bacterias
El cultivo de B. abortus S2308, su mutante isogénica en el sistema de secreción de
tipo IV, virB10 polar (cedida por el Dr. Diego Comerci) y S. aureus fue realizado tal como
fue descripto en la sección 1 de Materiales y Métodos del Capítulo I.
2. Cultivo celular
Los osteoblastos de cultivo primario fueron aislados de la calvaria de ratones
neonatos utilizando el método descripto por Wong and Cohn [315]. En resumen, las
calvarias fueron sometidas a digestiones secuenciales de 15 min. a 37ºC en una mezcla
enzimática conteniendo 0,05% de tripsina y 0,1% de colagenasa tipo IV (Gibco). Las
fracciones celulares 3 a 5 fueron juntadas y resuspendidas en DMEM conteniendo 10% de
SFB, 100 U/ml de penicilina y 100 µg de estreptomicina/ml (medio completo). Las células
fueron cultivadas en frascos de cultivo estándar en medio completo. El medio fue renovado
cada 3 o 4 días, y al llegar a confluencia, las células fueron recolectadas utilizando tripsina
y resuspendidas en medio completo.
Para los experimentos de diferenciación y función, las células fueron sembradas a
una densidad de 5x105 células/pocillo, y el medio fue renovado a las 24 hs. Para inducir la
diferenciación de los osteoblastos se utilizó el medio α-MEM conteniendo SFB 10%, 50
mg/ml de ácido ascórbico y 4mM β-gliceraldehído fosfato (medio de diferenciación) y el
medio fue renovado todos los días, hasta la finalización del cultivo. La línea celular de
macrófagos murinos J774.A1 (ATCC) fue crecida en DMEM conteniendo 10% de SFB, 100
U/ml de penicilina y 100 µg de estreptomicina/ml (medio completo).
3. Infección celular
Los osteoblastos fueron infectados con B abortus a diferentes MOIs, y los
macrófagos J774.A1 a una MOI de 100, tal como fue descripto en la sección 3 de
Materiales y Métodos del Capítulo I.
4. Estimulación con medio condicionado
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Los sobrenadantes de cultivo de los macrófagos J774.A1 infectados con B. abortus a
una MOI de 100 fueron recolectados a las 24 hs. p.i. esterilizados por filtración a través de
un filtro de nitrocelulosa con un poro de 0,22 µm y utilizados para estimular los
osteoblastos no infectados. Los sobrenadantes fueron utilizados diluidos 1/2, 1/5 y 1/10 en
medio completo. Luego de 24 hs., los osteoblastos fueron recolectados para determinar la
apoptosis o analizados a los 7, 14 y 30 días para medir osteocalcina, colágeno, depósitos
de calcio y la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL)
5. Zimografía
La actividad gelatinolítica fue analizada por el método de Hibbs et al. [239] tal como
se describió en la sección 4 de Materiales y Métodos del Capítulo I.
6. Medición de la concentración de citoquinas
Se cuantificó la secreción de IL-1β, IL-6, TNF-α y MCP-1 en los sobrenadantes
mediante un kit de ELISA de BD. La quemoquina quimioatractante de neutrófilos (KC) y
RANKL fueron cuantificadas por ELISA (R&D Systems).
7. Bloqueo de TNF-α
Los experimentos de neutralización fueron llevados a cabo con un anticuerpo
neutralizante anti-TNF-α (clon Mab1, BD Biosciences, 20 ug/ml) o su control de isotipo
(clon 107.3, BD Biosciences). Los sobrenadantes de cultivo fueron pretratados con el
anticuerpo durante 1h. antes de agregarlos al cultivo de los osteoblastos.
8. Expresión de RANKL
Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus a distintas MOI o estimulados con
los sobrenadantes de los macrófagos J774.A1 infectados, durante 24 hs. Como control
positivo las células fueron infectadas con S. aureus a una MOI de 100. Al final del cultivo
las células fueron lavadas y lisadas en buffer de lisis frío que consiste en 20 mM de
HEPES pH 8,5, 5 mM de EDTA, 0,4% de Tritón X-100, y un cóctel de inhibidores de
proteasas (Sigma-Aldrich). El extracto fue recolectado y centrifugado a 10.000x g por 10
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min. RANKL fue detectado en los sobrenadantes de cultivo y en los lisados mediante un kit
de ELISA (R&D Systems) según las instrucciones del productor.
9. Evaluación de la apoptosis
Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus o su mutante isogénica polar
virB10. Luego de 24 hs. las células fueron lavadas y el porcentaje de células apoptóticas
fue evaluada mediante la tinción con anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína, Sigma
Aldrich) y posterior análisis por citometría de flujo. La apoptosis también fue analizada por
citometría de flujo utilizando la técnica de TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase-
mediated dUTP-biotin nick end labeling) con el kit fluorescein-FragEL DNA fragmentation
detection kit (Calbiochem). El porcentaje de células apoptóticas fue determinado por
microscopía de fluorescencia luego de marcar las células con la técnica de TUNEL o con
el colorante nuclear Hoechst 33342. Como control positivo de apoptosis se utilizó
paraformaldehído al 4% (PFA). Para bloquear la actividad de las caspasas los
osteoblastos sembrados en las placas de 24 pocillos fueron tratados con o sin 50 µM del
inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK (carbobenzoxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-
fluorometilcetona; R&D Systems) durante 2 hs. y luego fueron infectados con B. abortus a
una MOI de 100 o tratados con 4% PFA o medio durante 24 hs. La apoptosis fue
determinada por microscopía de fluorescencia luego de teñir los núcleos con Hoechst
33342.
10. Diferenciación de osteoblastos
Los osteoblastos fueron sembrados en cubreobjetos de vidrio y fueron infectados con
B. abortus a una MOI de 100 o fueron estimulados con los sobrenadantes de los
macrófagos infectados con B. abortus, en medio de diferenciación (ver sección 2 de
materiales y métodos). Luego de 7, 14 y 30 días de diferenciación se determinó la
actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL), el depósito de calcio, colágeno y
osteocalcina.
11. Determinación de la deposición de colágeno mediante tinción con Rojo Sirio
El depósito de colágeno fue cuantificado mediante tinción con Rojo Sirio, un
colorante aniónico que se une fuertemente a las moléculas de colágeno [316]. El colorante
fue disuelto en ácido pícrico acuoso saturado a una concentración de 0,1%. El fijador de
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Bouin (para la fijación celular) fue preparado mezclando 15 ml de ácido pícrico acuoso
saturado con 5 ml de formaldehído al 35% y 1 ml ácido acético glacial. La monocapa
celular fue lavada con PBS previamente a ser fijada con 1 ml del fijador de Bouin por
pocillo durante 1 h. El fijador fue removido y las células fueron lavadas con agua
desionizada 3 veces. Las células fueron teñidas con 1 ml de Rojo Sirius por pocillo durante
18 hs. en agitación suave.
Las células teñidas fueron lavadas con 0,01 N de ácido clorhídrico para remover el
colorante no unido. Los cubreobjetos fueron montados en PBS-glicerina (9:1 [vol/vol]) y
fueron analizados por microscopía de luz blanca. Para un análisis cuantitativo el colorante
unido fue disuelto en 0,2 ml de hidróxido de sodio 0,1 N en agitación suave durante 30
min. La solución fue transferida a placas de microtitulación y se midió la densidad óptica
(DO) con un lector de placas (Metertech) a 550 nm contra el blanco hidróxido de sodio 0,1
N.
12. Determinación del depósito de osteocalcina
Para determinar el depósito de osteocalcina extracelular los osteoblastos fueron
sembrados a una densidad de 1x104 células/pocillo en placas de 24 pocillos. A los 7, 14 y
30 días las células fueron fijadas con formaldehido al 4%, y posteriormente lavadas 3
veces con PBS durante 5 min. cada lavado. Las células fueron marcadas con un
anticuerpo anti-osteocalcina (sc-7449; Santa Cruz Biotechnology), seguido de un
anticuerpo IgG de cabra anti-conejo conjugado con FITC a una dilución 1:200 en 0,5%
PBS-BSA (Invitrogen).
13. Determinación de la deposición de calcio mediante Alizarina Roja
Los osteoblastos fueron fijados en PFA 4% durante 10 min a temperatura ambiente.
Las células fueron lavadas con agua desionizada, teñidas con Alizarina Roja 2% y fueron
visualizadas por microscopía de luz. Para realizar un análisis cuantitativo el colorante fue
disuelto según las instrucciones del productor. En resumen, las células fueron incubadas
con ácido acético al 10% durante 30 min en agitación. Se levantaron las células, se
calentaron a 85 °C durante 10 min y se centrifugaron a 20000 xg por 15 min. Se tomó el
sobrenadante y se neutralizó el pH con hidróxido de amonio 10%. La solución fue
transferida a placas de microtitulación para medir la DO a 405 nm.
14. Determinación de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL)
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La actividad de FAL se puso en evidencia utilizando la solución BCIP (5-bromo-4-
cloro-3-indolilfosfato)-NBT (azul de nitro-tetrazolio) (Sigma-Aldrich) según las instrucciones
del fabricante. Se midió la DO a 420 nm.
15. Análisis estadístico
El analisis estadístico se realizó tal como fue descripto en la sección 17 de Materiales
y Métodos del Capítulo I.
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Capítulo III Resultados
Los osteoblastos son las células responsables de la deposición de la matriz ósea y
también facilitan la calcificación y mineralización de la misma. Dado que la función de los
osteoblastos puede ser alterada en condiciones patológicas tanto infecciosas como no
[317, 318], nos propusimos estudiar si la infección con B. abortus era capaz de inhibir la
diferenciación y función de los osteoblastos contribuyendo a la pérdida del hueso.
1. B. abortus invade y se multiplica en osteoblastos provenientes de cultivo primario de calvaria murina
Como mostramos en la figura 1 del capítulo I del presente trabajo y en trabajos
previos realizados en nuestro laboratorio [32], B. abortus puede invadir y replicarse en
líneas celulares de osteoblastos humanos. Dado que las células inmortalizadas pueden
tener modificaciones fenotípicas respecto de las células normales decidimos extender
estos resultados a un cultivo primario. Para cumplir con este objetivo, los osteoblastos
provenientes de un cultivo primario de la calvaria de ratones neonatos de la cepa BALB/c
fueron infectados con B. abortus. Los experimentos demostraron que B. abortus invade y
se replica en los osteoblastos del cultivo primario (Figura 41). Estos resultados indican que
la habilidad de B. abortus de infectar el cultivo primario de osteoblastos murinos fue similar
a la obtenida previamente para las líneas celulares humanas.
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2. La infección con B. abortus induce la expresión de KC, MCP-1 y MMPs por parte de los osteoblastos de calvaria
A continuación decidimos investigar la habilidad de los osteoblastos murinos de
secretar quemoquinas y MMPs en respuesta a la infección con B. abortus. En
concordancia con los resultados obtenidos con las células humanas, los osteoblastos
murinos provenientes del cultivo primario de calvaria secretaron a las 48 hs. p.i. MCP-1 y
KC (33,66 ± 2,45 ng/ml para MCP-1 y; 70,16 ± 15,38 ng/ml para KC) cuando fueron
infectados a una MOI de 100. Los osteoblastos también secretaron MMPs en respuesta a
la infección con B. abortus (Figura 42).
Figura 41. B. abortus invade y se multiplica en un cultivo primario de osteoblastos murinos de calvaria.
0 20 40 60 80102
103
104
105
Tiempo (hs)
UFC
/ml
Los osteoblastos murinos obtenidos de un cultivo primario de calvaria fueron infectados con B. abortus a MOI 100 y luego de dos horas fueron incubados con medio con antibiótico para eliminar a las bacterias extracelulares. Los lisados celulares obtenidos a diferentes tiempos post-infección fueron plaqueados en TSA para determinar las UFC intracelulares.
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3. La infección con B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos
La apoptosis de los osteoblastos induce pérdida ósea por resultar en la eliminación
de las células responsables de la deposición de matriz [319, 320]. Por lo tanto, decidimos
investigar si B. abortus era capaz de inducir apoptosis en los osteoblastos provenientes del
cultivo primario de calvaria murina. Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus, y
luego de 24 hs. las células fueron teñidas con Anexina V/IP y analizadas por citometría de
flujo. Como control positivo se utilizó PFA 4%. La infección con B. abortus indujo apoptosis
de los osteoblastos en una forma MOI dependiente (Figura 43 A). La presencia de
apoptosis fue confirmada mediante la técnica de TUNEL (Figura 43 B y D) y por
morfología nuclear mediante la tinción con Hoechst 33342 (P<0,01) (Figura 43 C y E). La
apoptosis dependió de la expresión de un sistema de secreción tipo IV funcional, ya que el
porcentaje de células apoptóticas no se modificó en forma significativa entre los
osteoblastos infectados con la cepa mutante polar virB10 de B. abortus y los osteoblastos
no infectados (P<0,01) (Figura 44 A).
La apoptosis mediada por B. abortus ha sido descripta en varios tipos celulares
incluyendo astrocitos, hepatocitos y linfocitos T [33, 108, 321]. Por otro lado, ha sido
demostrado que la apoptosis de los astrocitos inducida por B. abortus involucra la
activación de caspasas [108]. Para determinar el rol de las caspasas en la apoptosis de los
osteoblastos en respuesta a la infección con B. abortus, estas células fueron tratadas con
un inhibidor general de caspasas (Z-VAD-FMK) y luego fueron infectadas con B. abortus a
una MOI de 100. La apoptosis fue determinada mediante la tinción de los núcleos con
Hoechst 33342 y luego fueron analizadas por microscopía de fluorescencia. Z-VAD-FMK
Figura 42. La infección con B. abortus induce la expresión de MMPs por parte de los osteoblastos de calvaria.
Control 50 100 250 500 1000Control 50 100 250 500 1000
Producción de MMP-2 y MMP-9 por parte de los osteoblastos primarios infectados con B. abortus a diferentes MOIs (50 a 1000) o no infectados (control).
MMP-9
MMP-2
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inhibió en forma significativa (P<0,01) la apoptosis de los osteoblastos inducida por la
infección (Figura 44 B).
En conjunto estos resultados indican que la infección con B. abortus induce la
apoptosis de los osteoblastos, a través de la activación de caspasas mediante un
mecanismo dependiente de la presencia de una sistema de secreción de tipo IV funcional.
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Figura 43. B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos.
100
250 500
PFA1000
Control 100
250 500
PFA1000
Control
Control
100250
500
1000
Control
100250
500
1000
Cont
rol
100
250
500
1000
PFA
0
25
50
**
*****
***
***
% d
e cé
lula
s apo
ptót
icas
Cont
rol
100
250
500
1000
PFA
0
25
50
****
***
******
% d
e cé
lula
s apo
ptót
icas
100
250 500
PFA1000
Control 100
250 500
PFA1000
Control
A
B C
D E
Los osteoblastos fueron infectados con B. abortus a diferentes MOIs (100 a 1000) o fueron tratados con paraformaldehído (PFA) 4% como control positivo. La apoptosis fue determinada por Anexina V, TUNEL y Hoechst 33342. Análisis por citometría de flujo de las células apoptóticas mediante la tinción con Anexina V-FITC (A). Análisis por microscopía de fluorescencia de las células apoptóticas mediante TUNEL (B y D) y tinción con Hoechst 33342 (C y E). **P<0,01;***P<0,001 versus el control (sin infectar).
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4. La infección con B. abortus induce la expresión de RANKL en los osteoblastos de calvaria
Como mencionamos, RANKL es una molécula implicada en el remodelado óseo
normal. Los osteoblastos que expresan RANKL constituyen las principales células
implicadas en la inducción de la osteoclastogénesis [322]. Por lo tanto, un incremento en la
expresión de RANKL induciría un aumento patológico de la resorción ósea.
Consecuentemente, investigamos si la infección con B. abortus aumentaba la expresión de
RANKL por parte de los osteoblastos. Para llevar a cabo este objetivo, se evaluó mediante
la técnica de ELISA la presencia de RANKL en los lisados celulares y en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus. Demostramos que RANKL
aumenta significativamente y en forma dependiente de la MOI utilizada en los lisados
celulares de los osteoblastos (P<0,01) (Figura 45). Como esperábamos la infección con S.
Figura 44. B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos en una forma dependiente de caspasas y de un sistema de secreción de tipo IV
funcional.
Cont
rol
Sin
trat
ar
Z-VA
D-F
MK
PFA
0
25
50
**
MOI 100%
célu
las a
popt
ótic
as
Cont
rol
WT
VirB
10
PFA
0
25
50
**
MOI 100
% d
e cé
lula
s apo
ptót
icas
Análisis por microscopía de fluorescencia de las células apoptóticas teñidas con Hoechst 33342. Los osteoblastos fueron infectados a una MOI 100 con B. abortus wild type (WT) o una mutante isogenica virB10 (VirB10) (A). **P<0,01 versus los osteoblastos infectados con la bacteria WT. En otro experimento los osteoblastos fueron tratados con un inhibidor general de caspasas y dos horas después fueron infectados por B. abortus (B). **P<0,01 versus los osteoblastos infectados sin tratar con el inhibidor.
A B
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aureus también indujo un aumento de la expresión de RANKL (Figura 45). Por el contrario,
no se detectó un aumento de RANKL en los sobrenadantes de los osteoblastos infectados
respecto del control sin infectar (no mostrado). Estos resultados indican que la expresión
de RANKL por parte de los osteoblastos infectados con B. abortus podría contribuir a la
destrucción ósea a través de la activación de los osteoclastos.
5. La infección con B. abortus inhibe la diferenciación de los osteoblastos de calvaria
La enzima FAL es un marcador fenotípico de los osteoblastos y es esencial para el
proceso de mineralización [323]. Además, la expresión de FAL se encuentra asociada a la
diferenciación de osteoblastos [324]. Por lo tanto, evaluamos el efecto de la infección con
B. abortus en la diferenciación de los osteoblastos mediante la medición de la actividad de
FAL. Como se muestra en la Figura 46 la infección redujo significativamente la actividad
de FAL por parte de los osteoblastos en una forma dependiente de la MOI utilizada y este
efecto inhibitorio se mantuvo incluso a tiempos tan largos como 30 días post infección
(P<0,001). Estos resultados indican que la infección con B. abortus inhibe la actividad de
FAL y por lo tanto interfiere con la función de los osteoblastos.
Figura 45. B. abortus induce la expresión de RANKL en los osteoblastos de calvaria.
Cont
rol
100
250
500
1000
S.au
reus
0
125
250
****
***
RAN
KL
(pg/
ml)
La producción de RANKL fue determinada por ELISA en los lisados de los osteoblastos de calvaria infectados con B. abortus a diferentes MOIs a las 24 hs. p.i. Como control positivo se infectaron osteoblastos con Staphylococcus aureus a MOI 100. **P<0,01; ***P<0,001.
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6. B. abortus inhibe la deposición de minerales por parte de los osteoblastos de calvaria
La diferenciación de los osteoblastos in vivo e in vitro también puede ser
caracterizada por su capacidad para depositar y mineralizar matriz lo que aumenta la
rigidez del sistema óseo [325, 326]. La mineralización se inicia entre los días 7 a 10 y
puede ser detectada mediante la tinción de los depósitos minerales en el cultivo de los
osteoblastos. Por lo tanto, investigamos el efecto de la infección con B. abortus en el
Figura 46. La infección por B. abortus inhibe la diferenciación de osteoblastos de calvaria.
100 Control
7 días
14 días
30 días
100 Control100 Control
7 días
14 días
30 días
Cont
rol
100
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500
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7
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***
*** *** ***
Activ
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rel
ativ
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FAL
Cont
rol
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250
500
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*** *** ***Activ
idad
rel
ativ
a de
FAL
7 días
14 días
30 días
A B
Cont
rol
100
250
500
1000
0
7
14
***
***
******
Activ
idad
rel
ativ
a de
FALEfecto de la infección con B. abortus en la
diferenciación de los osteoblastos de calvaria. La actividad de la enzima fosfatasa alcalina (FAL) fue determinada mediante el agregado de la solución BCIP-NBT. Se tomaron las imágenes representativas por microscopía de luz blanca (A) y se cuantificó la actividad enzimática por espectrofotometría (B). ***P<0,001 versus el control sin infectar.
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proceso de mineralización por parte de los osteoblastos, mediante la tinción de los
depósitos ricos en calcio con el colorante Alizarina Roja. Los osteoblastos de calvaria tanto
infectados como no infectados, depositaron progresivamente mayor cantidad de mineral
con el tiempo. Sin embargo, aquellas células infectadas produjeron significativamente
menos mineral y en forma MOI dependiente, respecto de las no infectadas en los días 7,
14 y 30 (P<0,05) (Figura 47). Estos resultados indican que la infección con B. abortus
inhibe capacidad de depositar matriz mineral por parte de los osteoblastos.
Figura 47. B. abortus inhibe la capacidad de depositar matriz mineral por parte de los osteoblastos de calvaria.
Efecto de la infección con B. abortus en la deposición de matriz mineral por parte de los osteoblastos de calvaria. El depósito de calcio fue revelado mediante la tinción con Alizarina Roja. Se tomaron las imágenes representativas por microscopía de luz (A) y se cuantificó la Alizarina Roja mediante espectrofotometría (405 nm) (B).*P<0,05 ; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar.
A B
7 días
14 días
30 días
100 Control
7 días
14 días
30 días
100 Control
7 días
14 días Co
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******
Aliz
arin
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250
500
1000
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800
***
****** ***Al
izar
ina
Roja
uM
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7. B. abortus inhibe la deposición de matriz orgánica
El colágeno representa el 85-90 % de toda la matriz orgánica del hueso [327]. El
hueso muestra varias organizaciones estructurales que están relacionadas con el balance
entre la cantidad de colágeno y de minerales [328]. No solo la deposición de matriz mineral
es esencial para asegurar un hueso saludable, aportando fuerza y rigidez al sistema
esquelético, sino que también la deposición adecuada de matriz orgánica contribuye a la
estructura de este sistema. Por lo tanto, nos preguntamos también si B. abortus era capaz
de inhibir la deposición orgánica por parte de los osteoblastos. El colágeno fue detectado
mediante tinción con Rojo Sirio, un colorante aniónico que se une fuertemente a las
moléculas de colágeno. Los osteoblastos provenientes del cultivo primario, infectados y no
infectados, depositaron progresivamente mayor cantidad de colágeno con el tiempo. Sin
embargo, aquellos infectados produjeron significativamente menos colágeno en forma MOI
dependiente, respecto de las no infectadas en los días 7, 14 y 30 (P<0,05) (Figura 48 A y C). Estos resultados indican que la infección con B. abortus inhibe el depósito de colágeno
por parte de los osteoblastos.
Para determinar si estos resultados podían ser extendidos a otra proteína que forma
parte de la matriz orgánica del hueso, estudiamos el efecto de la infección con B. abortus
en la deposición de osteocalcina. La osteocalcina es una proteína de secreción no
colágena y altamente conservada la cual esta asociada a la matriz mineralizada del hueso
[326]. Mediante la utilización de un anticuerpo anti-osteocalcina marcado con FITC
demostramos que la infección con B. abortus también inhibe la deposición de osteocalcina
en una forma MOI dependiente (Figura 48 B).
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8. TNF-α presente en los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos de calvaria
Figura 48. La infección con B. abortus inhibe la deposición de matriz orgánica de osteoblastos de calvaria.
A B
C
7 días
14 días
30 días
100 Control 100 Control
7 días
14 días
30 días
100 Control 100 Control
Cont
rol
100
250
500
1000
0.0
0.6
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***
******
***
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(550
nm
)
7 días 14 días 30 días
Cont
rol
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1.2
*
****
***
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nm
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100
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500
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0.0
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******
DO
(550
nm
)
Efecto de la infección con B. abortus sobre la deposición de matriz orgánica por parte de los osteoblastos. El depósito de colágeno fue revelado mediante la tinción con Rojo Sirio (A). El depósito de osteocalcina fue revelado por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico marcado con FITC (B). Se tomaron las imágenes representativas por microscopía de luz blanca y de fluorescencia (A y B, respectivamente) y se cuantificó el Rojo Sirio mediante espectrofotometría (C). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 versus el control sin infectar.
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Teniendo en cuenta la capacidad de los osteoblastos infectados con B. abortus de
secretar la quemoquina MCP-1 (Figura 42), nuestra hipótesis es que los macrófagos
podrían ser atraídos al sitio de infección. Por lo tanto, decidimos investigar el efecto de las
citoquinas presentes en los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus en
la producción de RANKL por parte de los osteoblastos. Para lograr este objetivo los
sobrenadantes de la línea celular de macrófagos murinos J774.E1 infectados con B.
abortus fueron utilizados para estimular a los osteoblastos. El agregado de los
sobrenadantes de los macrófagos infectados en diferentes proporciones (1/2 a 1/10) indujo
una aumento en la expresión de RANKL en una forma dosis dependiente, comparado con
los osteoblastos no estimulados o los estimulados con los sobrenadantes de macrófagos
no infectados (proporción 1/2) (P<0,05) (Figura 49 A). TNF-α puede inducir la expresión
de RANKL en varios tipos celulares [329-331]. Para verificar que los niveles de TNF-α
presentes en los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus podían
estimular la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos, estas últimas células
fueron estimuladas con los sobrenadantes de los macrófagos infectados preincubados
durante 1 h. con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se
muestra en la Figura 49 B la neutralización de TNF-α redujo significativamente (P<0,001)
la habilidad de los sobrenadantes de estimular la expresión de RANKL por parte de los
osteoblastos. El control de isotipo no tuvo ningún efecto. Estos resultados indican que la
infección de los macrófagos con B. abortus podría alterar la homeostasis ósea mediante la
inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos, a través de la
secreción de TNF-α.
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9. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados con B. abortus está involucrado en la inducción de apoptosis de los osteoblastos de calvaria
Los macrófagos pueden mediar el daño al tejido en diferentes órganos incluyendo el
hueso, a través de la secreción de citoquinas proinflamatorias [332]. Para analizar si los
factores secretados por los macrófagos infectados con B. abortus podían inducir daño en
los osteoblastos estudiamos el efecto del medio condicionado de los macrófagos
infectados sobre los osteoblastos. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B.
abortus agregados en diferentes diluciones (1/2 a 1/10) indujeron la apoptosis de los
Figura 49. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos
infectados por B. abortus está involucrado en la inducción de la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos de calvaria.
A B 1/
2
1/5
1/10 1/2
Cont
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0
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*
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TNF-
Isot
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0
40
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***
RAN
KL
(pg/
ml)
La producción de RANKL fue determinada por ELISA en los lisados de los osteoblastos de calvaria estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos J774 (SC-J774) infectados (adicionados en las proporciones 1/2 a 1/10) o no infectados (A). *P<0,05; ***P<0,001 versus los osteoblastos tratados con los sobrenadantes sin infectar. En otro experimento se inhibió el efecto estimulatorio mediante el pretratamiento de los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α o un control de isotipo durante 1h, antes de agregarlos a los osteoblastos, y se determinó la producción de RANKL por ELISA (B). ***P<0,001 versus los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes infectados sin el tratamiento con anti-TNF-α.
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osteoblastos en una forma dosis dependiente (P < 0,01) (Figura 50 A). Por el contrario, los
niveles de apoptosis de los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes de los
macrófagos no infectados fueron similares al de las células sin estimular.
TNF-α es una citoquina proinflamatoria que puede inducir apoptosis en varios tipos
celulares, incluyendo los osteoblastos [332, 333]. Para evaluar si TNF-α era la citoquinas
responsable de la inducción de la apoptosis de los osteoblastos, estimulamos a estos
últimos con los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus pretratados
con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se muestra en la
Figura 50 B la neutralización de TNF-α inhibió parcialmente la habilidad de los
sobrenadantes de inducir apoptosis (P<0,05), mientras que el control de isotipo no tuvo
ningún efecto.
La señalización de TNF-α vía TNFR1 induce apoptosis a través del acoplamiento de
caspasa-8 con TRADD (dominios de muerte asociados a TNFRSF1A), el cual a su vez
activa caspasa-3 [334]. Para determinar si las caspasas estaban involucradas en la
apoptosis inducida por los sobrenadantes de los macrófagos infectados, los osteoblastos
fueron pretratados con un inhibidor general de caspasas (Z-VAD-FMK) y luego
estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus. La
apoptosis fue determinada mediante la tinción con Hoechst 33342 y luego fue analizada
por microscopía de fluorescencia. El inhibidor general de caspsas, Z-VAD-FMK inhibió la
apoptosis de los osteoblastos inducida por los sobrenadantes de los macrófagos
infectados (P < 0,05) (Figura 50 B). En conjunto, estos resultados indican que los
sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus inducen apoptosis de los
osteoblastos a través de TNF-α, y mediante un mecanismo que involucra la activación de
caspasas.
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10. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus inhiben y la deposición de matriz orgánica y mineral por parte de los osteoblastos de calvaria, principalmente a través de TNF-α
Otro mecanismo por el cual los macrófagos podrían mediar daño óseo es mediante la
inhibición de la diferenciación de los osteoblastos. Para comprobar esta hipótesis los
osteoblastos fueron estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos infectados. Los
sobrenadantes de los macrófagos infectados agregados en diferentes diluciones (1/2 a
1/10) inhibieron en forma significativa la capacidad de los osteoblastos de secretar matriz
orgánica y mineral, en forma dosis dependiente, comparado con los osteoblastos
estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos no infectados o los osteoblastos sin
estimular, ambos crecidos en medio de diferenciación (no mostrado).
Figura 50. La infección con B. abortus está involucrado en la inducción de la apoptosis de los osteoblastos.
A B 1/
2
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1/10 1/
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Los osteoblastos de calvaria fueron estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos (SC-J774) infectados con B. abortus o no infectados. La apoptosis fue analizada por microscopía de fluorescencia mediante la tinción con Hoechst 33342 (A). **P<0,01; ***P<0,001 versus los osteoblastos estimulados con los SC-J774 sin infectar. En otro experimento, los sobrenadantes de los macrófagos infectados fueron preincubados durante 1 h. con un anticuerpo anti-TNF-α antes de ser agregados a los osteoblastos, o los osteoblastos fueron preincubados con un inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK antes de ser estimulados con los sobrenadantes de los macrófagos infectados. *P<0,05 versus los osteoblastos estimulados con SC-J774 infectados sin tratamiento (Sin tratar).
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TNF-α podría desempeñar un rol importante en la inhibición de la diferenciación de
los osteoblastos [335]. Para evaluar si los niveles de TNF-α presentes en los
sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus podía inhibir la diferenciación
de los osteoblastos, estas últimas células fueron estimuladas con los sobrenadantes de los
macrófagos infectados preincubados o no durante 1 h. con un anticuerpo neutralizante
anti-TNF-α o un control de isotipo. Como se muestra en la Figura 51 la neutralización de
TNF-α redujo la habilidad de los sobrenadantes de inhibir la diferenciación de los
osteoblastos (P<0,05), mientras que el control de isotipo no tuvo ningún efecto. Estos
resultados indican que TNF-α juega un rol clave en la inhibición de la diferenciación de los
osteoblastos contribuyendo de esta forma a la perdida de matriz ósea.
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Figura 51. Los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus
inhiben la deposición de matriz orgánica y mineral por parte de los osteoblastos de calvaria, principalmente a través de TNF-α.
Cont
rol
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a-TNF-α
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Control
Los sobrenadantes de los macrófagos infectados fueron pretratados con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α antes de ser agregados sobre los osteoblastos. Se determinó la deposición de matriz orgánica y mineral a diferentes días. Tinción con Alizarina Roja (A), actividad de FAL revelada con BCIP/NBT (B), tinción con Rojo Sirio (C), y deposición de osteocalcina determinada por inmunofluorescencia (D). Análisis cuantitativo de Alizarina Roja (E), de la actividad relativa de FAL (F) y de Rojo Sirio (G).*P<0,05 versus los osteoblastos estimulados con los sobrenadantes infectados sin tratamiento (sin tratar).
Cont
rol
Sin
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Repositorio Institucional Digital de Acceso Abierto, Universidad Nacional de Quilmes
11. Esquema con los resultados obtenidos en este capítulo
Pre-Osteoblasto
B. abortus
RANKL
Monocito
B. abortus
TNF-α
Osteoblasto maduro
Apoptosis
Producción de matriz orgánica
y mineral
Diferenciación
Pre-Osteoblasto
B. abortus
RANKL
Monocito
B. abortus
TNF-α
Osteoblasto maduro
Apoptosis
Producción de matriz orgánica
y mineral
Diferenciación
Esquema 14.
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Capítulo III Discusión
En este capítulo describimos las modificaciones que ocurren en el metabolismo de
los osteoblastos cuando estas células son infectadas con B. abortus, y cómo esta
respuesta inhibe la diferenciación y función de los osteoblastos provocando la pérdida del
hueso. En primer lugar, demostramos que B. abortus es capaz de invadir y replicarse en
osteoblastos murinos obtenidos a partir de un cultivo primario de calvaria, del mismo modo
que lo hacen en osteoblastos humanos (línea hFOB) tal como fue descripto en este
trabajo, y en las líneas de osteosarcoma como fue demostrado en trabajos previos de
nuestro laboratorio [32]. La infección por B. abortus también indujo la producción de las
quemoquinas MCP-1 y KC, así como también la secreción de MMP-2 y MMP-9 por parte
de los osteoblastos de calvaria murina. Nuevamente esta correlación entre los resultados
obtenidos utilizando líneas celulares humanas y las células de cultivo primario murino,
avalan el uso de este modelo en los estudios de la patología osteoarticular desencadenada
por la infección por Brucella.
La brucelosis osteoarticular, incluyendo la espondilitis y la artritis, puede ser
destructiva y estar asociada a la presencia de osteopenia y daño en el cartílago [336].
Dicho daño tisular podría ser causado además de por los mecanismos ya descriptos en el
presente trabajo, por una alteración en el número, diferenciación y función de los
osteoblastos. En primer lugar, demostramos que la infección con B. abortus induce la
apoptosis de los osteoblastos. Si la apoptosis inducida por un patógeno es perjudicial o
beneficiosa para el hospedador ha sido una fuente de debate por varios autores [337, 338].
En este sentido, la apoptosis de los osteoblastos podría ser responsable, en parte, del
daño óseo, ya que provocaría una reducción en el número de los osteoblastos en el hueso
capaces de producir matriz ósea. Por otro lado, puede resultar contradictorio que B.
abortus sea capaz de inducir la apoptosis de los osteoblastos cuando ha sido reportado
que inhibe la apoptosis en los macrófagos [125, 339]. Sin embargo, estos resultados no
resultan sorprendentes teniendo en cuenta que Brucella spp. se encuentra particularmente
adaptada para establecer una infección crónica en los macrófagos [340]. Nuestros
resultados sugieren que los osteoblastos no constituyen un nicho en el cual Brucella podría
sobrevivir y permanecer por un largo período de tiempo durante las localizaciones
osteoarticulares, lo cual concuerda con el hecho de que Brucella es capaz de inducir
apoptosis en otras células diferentes a los macrófagos [33, 108]. En contraste, los
osteoblastos secretan la quemoquina MCP-1 en respuesta a la infección con B. abortus, la
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cual atrae nuevos monocitos/macrófagos al sitio de infección, incrementando así las
posibilidades de que la bacteria encuentre un nicho replicativo en el cual permanecer.
La mineralización es un proceso en el cual se produce la deposición de fosfatos y
calcio en el hueso, y junto con la deposición adecuada de matriz orgánica contribuyen a la
arquitectura del hueso [341]. Nosotros demostramos que la infección por B. abortus inhibió
la diferenciación de los osteoblastos y disminuyó la actividad de FAL, un marcador
específico de diferenciación involucrado en la mineralización del hueso. Además, se
observó una disminución en la deposición de matriz orgánica y mineral, lo cual contribuiría
a la pérdida de hueso observada en la patología osteoarticular ocasionada por Brucella. En
conjunto, estos resultados indican que B. abortus puede afectar la formación del hueso, al
menos a través de dos mecanismos, limitando la diferenciación de los osteoblastos y por lo
tanto disminuyendo su capacidad de depositar matriz y/o induciendo la apoptosis de estas
células. Otro mecanismo de destrucción ósea ya descripto en el capítulo II del presente
trabajo, es la inducción patológica de la osteoclastogénesis. En este proceso RANKL
expresado en la membrana de los osteoblastos o secretado en forma soluble juega un rol
clave en la inducción de la diferenciación de los osteoclastos y por lo tanto en la
degradación del hueso [322]. Como ocurre en otras infecciones osteoarticulares [193, 342,
343], la infección con B. abortus indujo un aumento en la expresión de RANKL por parte de
los osteoblastos. El aumento en la expresión de RANKL probablemente estimule la
degradación del hueso a través de la formación de osteoclastos, y por lo tanto constituya
un mecanismo más que permite explicar porque los pacientes con osteomielitis brucelar
muestran pérdida ósea [258, 336, 344-346].
Los macrófagos también pueden contribuir a los mecanismos de daño ya descriptos.
Nosotros demostramos que estas células indujeron la apoptosis de los osteoblastos a
través de la secreción de TNF-α. Esta citoquina presente en los sobrenadantes de los
macrófagos infectados con B. abortus parece ser la única citoquina involucrada en la
apoptosis de los osteoblastos, ya que dicho proceso fue inhibido cuando los
sobrenadantes fueron incubados con anticuerpos neutralizantes anti-TNF-α. La inhibición
de la apoptosis por un inhibidor general de caspasas constituye una evidencia más de la
relevancia de TNF-α en este fenómeno, ya que se ha reportado que las caspasas están
involucradas en la inducción de la apoptosis mediada por TNF-α [334]. Además, TNF-α
presente en los sobrenadantes de los macrófagos infectados con B. abortus es la citoquina
responsable de inhibir la deposición de matriz orgánica y mineral, ya que cuando los
sobrenadantes fueron pretratados con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α la inhibición
fue revertida. Estos resultados concuerdan con resultados obtenidos por otros autores que
demuestran que TNF-α modula la mineralización del hueso [263]. Si bien demostramos
que la infección por B. abortus induce un incremento en la expresión de RANKL por parte
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de los osteoblastos, los macrófagos también pueden contribuir en este proceso, ya que
demostramos que factores solubles producidos por los macrófagos infectados inducen un
aumento en la expresión de RANKL por parte de los osteoblastos. Mediante el
pretratamiento con un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α demostramos que este
fenómeno también dependía de la presencia de TNF-α en los sobrenadantes de los
macrófagos infectados con B. abortus.
En resumen demostramos que B. abortus infecta los osteoblastos inhibiendo su
diferenciación y función. Los osteoblastos infectados también aumentan la expresión de
RANKL, la principal citoquina involucrada en la diferenciación de los osteoclastos
interactuando con el receptor RANK en la superficie de los precursores de estas últimas
células, contribuyendo a la degradación patológica del hueso. Los osteoblastos infectados
secretan la quemoquina MCP-1, la cual atrae macrófagos al sitio de infección. En la
situación in vivo, los macrófagos residentes y aquellos atraídos al sitio de infección podrían
responder a la infección con B. abortus produciendo citoquinas proinflamatorias. En este
sentido, TNF-α es la principal citoquina involucrada en la alteración de la función de los
osteoblastos ya que está implicada en el aumento en la expresión de RANKL por parte de
los osteoblastos, así como también en la inducción de apoptosis e inhibición de la
diferenciación y función de los osteoblastos.
En este contexto, hipotetizamos que B. abortus puede dañar la función de los
osteoblastos directa e indirectamente, constituyendo un mecanismo más que contribuye la
destrucción del hueso y de las articulaciones que se observa en los pacientes con
complicaciones osteoarticulares por brucelosis.
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Discusión general
La brucelosis es un problema sanitario de gran importancia para Argentina y para
otros países, especialmente los subdesarrollados. La falta de una terapia apropiada
durante la etapa aguda de la enfermedad puede resultar en la localización de la bacteria
en varios tejidos llevando a una enfermedad crónica que puede presentar severas
manifestaciones clínicas [9]. Estas bacterias invaden las células del sistema retículo-
endotelial y son secuestradas dentro de los macrófagos localizados en órganos tales como
el bazo, el cerebro, el corazón, el hígado y las articulaciones. La brucelosis es una
enfermedad con un gran componente inflamatorio. Los signos clínicos de esa inflamación
son: artritis, osteomielitis, endocarditis, meningitis, pleocitosis, infiltración monocitaria de
las articulaciones, granuloma hepático, etc.[13].
Si bien las complicaciones osteoarticulares son las más frecuentes en la brucelosis
activa en el hombre, los mecanismos inmunes implicados en la patología ósea o articular
por Brucella spp. no han sido descriptos aún. Por lo tanto, en este trabajo nos focalizamos
en dilucidar los mecanismos inmunes involucrados en la degradación del hueso y en el
daño articular que tiene lugar en respuesta a la infección con B. abortus.
En este sentido, demostramos que B. abortus es capaz de infectar y replicarse en
osteoblastos y fibroblastos sinoviales humanos. La capacidad de B. abortus de invadir,
sobrevivir y replicar dentro de estas células concuerda con su capacidad de replicar en
otras células no fagocíticas, incluyendo las células epiteliales, endoteliales, los astrocitos y
los hepatocitos [33, 34, 108, 254]. Hasta el momento no se ha documentado la habilidad
de Brucella de infectar osteoblastos así como fibroblastos sinoviales in vivo. Esto podría
ser explicado en parte en función de restricciones éticas, dado que una biopsia del hueso o
de la articulación afectada solo sería justificada en situaciones excepcionales. Sin
embargo, en algunos estudios realizados en perros en los cuales se tomaron muestras de
tejido óseo pudo aislarse la bacteria a partir de dichas muestras [347, 348]. Además, se
han encontrado bacterias intracelulares en las epífisis y metáfisis de articulaciones
periféricas, así como también en la región subcondral de las vértebras durante una
infección experimental llevada a cabo en ratones [349]. Por otro lado, Brucella también se
ha aislado en cultivos de muestras de membrana sinovial, en los cuales el cultivo de fluido
sinovial fue negativo, sugiriendo que la bacteria estaba localizada intracelularmente en la
membrana sinovial [207, 350]. Estas evidencias dan relevancia a nuestros resultados in
vitro en los cuales Brucella puede invadir y replicarse en osteoblastos y fibroblastos
sinoviales humanos.
En artritis asociadas con la enfermedad de Lyme [228], en periodontitis causadas por
diferentes bacterias [229], y en las artritis séptica causada por la infección con S. aureus
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[230] se ha demostrado la presencia de niveles elevados de MMPs. En estos procesos
patológicos las fuentes de MMPs pueden ser células residentes o fagocitos atraídos al foco
inflamatorio. Nosotros demostramos que los osteoblastos y los fibroblastos sinoviales
responden a la infección con B. abortus con la producción de MMP-2, una MMP
particularmente importante ya que es capaz de degradar componentes constitutivos del
hueso y del cartílago.
Respecto de la atracción de células inmunes al foco inflamatorio, nosotros
demostramos que los osteoblastos y los fibroblastos sinoviales producen las quemoquinas
(IL-8 y MCP-1) en respuesta a la infección por B. abortus. Por otro lado, los niveles de
quemoquinas secretados fueron capaces de inducir la migración de monocitos y
neutrófilos. Además, tanto los monocitos como los neutrófilos están implicados en la
reacción inflamatoria durante la artritis brucelar [258, 351, 352]. El estudio de un caso de
infección natural por Brucella indicaría que nuestros resultados son congruentes con estas
observaciones ya que, en dos muestras de líquido sinovial de un paciente con bursitis que
fue analizada en nuestro laboratorio, demostramos la presencia de IL-8 y MCP-1 así como
también de infiltrado leucocitario, incluyendo la presencia de monocitos y células
dendríticas. En la situación in vivo, los monocitos y los neutrófilos reclutados podrían
contribuir al daño osteoarticular mediante la producción de MMP-9 en respuesta a la
infección con B. abortus y también mediante la secreción de citoquinas proinflamatorias
que pueden inducir la producción de MMPs en otras células. Nosotros demostramos que
los sobrenadantes de cultivo de los monocitos y los neutrófilos infectados con B. abortus
son capaces de inducir la producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos y los
fibroblastos sinoviales, y que en ambos casos la principal citoquina involucrada es TNF-α.
Por otro lado, factores producidos por los osteoblastos y fibroblastos sinoviales infectados
inducen la producción de MMPs por parte de los monocitos y neutrófilos. Demostramos de
GM-CSF secretado por los osteoblastos y fibroblastos sinoviales infectados está
involucrado en la inducción de MMP-9 por parte de los monocitos y neutrófilos. Además,
IL-6 derivada de los fibroblastos sinoviales infectados participa al menos parcialmente en
la inducción de la secreción de MMP-9 por parte de los neutrófilos. Estos resultados
sugieren que existe una red de interacciones mediada por citoquinas entre las células
residentes y las células inmunes atraídas en respuesta a la infección, resultando en un
incremento en la producción de MMP-2 y MMP-9, las cuales contribuyen a la destrucción
del hueso y las articulaciones.
El hecho de que HKBA también sea capaz de inducir la producción de MMP-9 por
parte de monocitos, neutrófilos y sinoviocitos demuestra que por lo menos uno de los
ligandos celulares estimulatorios es un componente estructural de la bacteria. Los estudios
previos realizados en nuestro laboratorio indicarían que el LPS de B. abortus no sería una
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de las principales moléculas implicadas en dichos fenómenos. L-Omp19 utilizada como
modelo de lipoproteína mimetiza el efecto inductor de MMP-9 observado para HKBA. Dado
que la actividad de las lipoproteínas reside en el dominio lipídico y que este dominio es
probablemente compartido por todas las lipoproteínas bacterianas, el efecto observado por
L-Omp19 podría extenderse a todas las lipoproteínas de Brucella. En el caso de los
monocitos demostramos que la secreción de MMP-9 por L-Omp19 involucra el
reconocimiento de TLR2, y que esta mediada indirectamente por la producción de TNF-α.
Los fibroblastos sinoviales también expresan TLRs, incluyendo TLR2 [270]. En
concordancia con esta última observación demostramos que L-Omp19 también es capaz
de estimular la producción de MMP-2 por parte de estas células, y esto depende del
reconocimiento por dicho receptor.
Otro mecanismo de daño descripto en enfermedades inflamatorias crónicas del
hueso es la inducción patológica de osteoclastogénesis. En este contexto ha sido
demostrado que las citoquinas proinflamatorias TNF-α, Il-1β e IL-6, así como también
RANKL y TGF-β, son importantes en la progresión de la enfermedad y en el aumento de la
osteoclastogénesis [282, 283, 285, 288, 300, 301, 353]. Es importante destacar que los
monocitos/ macrófagos residentes o aquellos atraídos no solo son capaces de producir
mediadores inflamatorios sino que también tienen la capacidad de diferenciarse a
osteoclastos [284]. En este trabajo demostramos que las citoquinas proinflamatorias
producidas por monocitos/macrógafos, tanto de origen murino como humano, infectados
con B. abortus son capaces de inducir la formación de osteoclastos a partir de células no
diferenciadas, mediante un mecanismo en el cual TNF-α es la principal citoquina
implicada. L-Omp19 utilizada como modelo de lipoproteína también es capaz de inducir la
producción de citoquinas proinflamatorias y la concomitante osteoclastogénesis a través
del reconocimiento de TLR2.
Los osteoblastos son las células del hueso responsables de depositar los
componentes de la matriz ósea tanto orgánica como mineral por lo tanto, la reducción en el
número de los mismos o la alteración de su función provocan una disminución en la
deposición de matriz, contribuyendo al desbalance óseo. En este trabajo demostramos que
la infección con B. abortus induce la apoptosis de los osteoblastos, así como también la
inhibición de su diferenciación y de la deposición de matriz orgánica y mineral. Los
osteoblastos infectados también aumentan la expresión de RANKL, considerada la
principal citoquina involucrada en la regulación de la diferenciación de los osteoclastos
interactuando con RANK en la superficie de los precursores de los osteoclastos. Como ya
mencionamos, los monocitos/macrófagos atraídos pueden responder a la infección con B.
abortus produciendo citoquinas proinflamatorias. Dentro de estas últimas TNF-α es la
principal citoquina involucrada en el aumento de la expresión de RANKL por parte de los
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osteoblastos, en la inducción de la apoptosis de los mismos, así como también en la
inhibición de su función y diferenciación.
En resumen, en una situación de infección con Brucella in vivo nosotros proponemos
el siguiente escenario basado en nuestros resultados y en las evidencias acumuladas
hasta el momento. Una vez que Brucella alcanza el sitio de localización osteoarticular, la
bacteria puede infectar y replicarse en osteoblastos y fibroblastos sinoviales. Estas células
responden a la infección produciendo MMP-2 y las quemoquinas MCP-1 e IL-8 las cuales
atraen monocitos y neutrófilos al sitio de infección. Estas células fagocíticas en el foco
inflamatorio responderían a la infección con B. abortus y sus lipoproteínas, y a factores
liberados por los osteoblastos y fibroblastos sinoviales infectados, produciendo MMP-9.
Además, la infección por B. abortus y sus lipoproteínas pueden inducir la producción de
citoquinas proinflamatorias por parte de los monocitos/macrófagos y neutrófilos. En este
sentido, TNF-α juega un papel importante en los distintos mecanismos involucrados en el
incremento patológico de la osteoclastogénesis, inhibición de la diferenciación y función de
los osteoblastos así como también en la inducción de la secreción de MMPs. Además, la
producción local de TNF-α es capaz de provocar un aumento en la producción de MCP-1
por parte de los osteoblastos [32], atrayendo de esta manera más monocitos al sitio de
infección, aumentando la inflamación local e incrementando así las posibilidades de que la
bacteria encuentre un nicho replicativo en el cual permanecer. De esta forma se genera un
círculo vicioso patológico que determinaría el destino de la brucelosis osteoarticular.
Los resultados de esta tesis sustentan un modelo en el cual por lo menos tres
mecanismos estarían involucrados en el desarrollo de la patología osteoarticular de la
brucelosis humana: la producción de MMP-2 y MMP-9, la inducción de la
osteoclastogénesis y una alteración en el número y función de los osteoblastos. En este
contexto las células inmunes atraídas al foco de infección jugarían un rol fundamental en el
desarrollo de una respuesta inflamatoria que favorece el desarrollo de estos mecanismos
de daño osteoarticular.
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Conclusión general
1. Producción de metaloproteasas de matriz
Osteoblastos. B. abortus es capaz de infectar y replicarse en la línea celular de
osteoblastos humanos hFOB. Dicha infección induce la producción de GM-
CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α o IL-1β en estas células. B. abortus induce la producción de MMP-2 en osteoblastos a través de la
secreción de GM-CSF. Los osteoblastos infectados con B. abortus, secretan MCP-1 e IL-8. Los
sobrenadantes de cultivo de los osteoblastos infectados inducen la
migración de monocitos y neutrófilos in vitro. Interacción de los osteoblastos con los monocitos.
B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los monocitos. Los sobrenadantes de los monocitos infectados con B. abortus inducen la
producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos mediante un
mecanismo dependiente principalmente de la presencia de TNF-α. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen
la producción de MMP-9 por parte de los monocitos. Este efecto está
mediado principalmente por GM-CSF, que media la producción de TNF-α
por parte de monocitos que a su vez induce la producción de MMP-9.
Interacción de los osteoblastos con los neutrófilos. B. abortus induce la secreción de MMP-9 por parte de los neutrófilos. Los sobrenadantes de los neutrófilos infectados con B. abortus inducen la
producción de MMP-2 por parte de los osteoblastos. Los sobrenadantes de los osteoblastos infectados con B. abortus inducen
la producción de MMP-9 por parte de neutrófilos. Fibroblastos sinoviales.
B. abortus invade y se replica en la línea celular de fibroblastos sinoviales
humanos SW982. La infección de los fibroblastos sinoviales con B. abortus induce la
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producción de GM-CSF, MCP-1 e IL-8, pero no de TNF-α e IL-1β. La infección con B. abortus induce la producción de MMP-2 en fibroblastos
sinoviales. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus
inducen la migración de monocitos y neutrófilos.
Interacción de los fibroblastos sinoviales con los monocitos. Los sobrenadantes de cultivo de los monocitos infectados con B. abortus
inducen las producción de MMP-2 por parte de sinoviocitos a través de
TNF-α. Los sobrenadantes de cultivo de los fibroblastos sinoviales infectados con
B. abortus inducen las producción de MMP-9 por parte de los monocitos a
través de GM-CSF. Interacción de los fibroblastos sinoviales con los neutrófilos.
Los sobrenadantes de cultivo de los neutrófilos infectados con B. abortus
inducen la producción de MMP-2 en fibroblastos sinoviales a través de
TNF-α. Los sobrenadantes de los fibroblastos sinoviales infectados con B. abortus
inducen la producción de MMP-9 por parte de los neutrófilos a través de IL-
6. Determinación de la actividad gelatinolítica neta.
La infección por B. abortus produce un incremento neto en la actividad
gelatinasa de las metaloproteasas secretadas por los osteoblastos,
monocitos, neutrófilos y fibroblastos sinoviales. Las lipoproteínas de Brucella en la inducción de metaloproteasas.
HKBA y la lipoproteína L-Omp19 inducen la producción de MMP-9 por
parte de los monocitos vía TLR2 y a través de la inducción de TNF-α. En
contraste, los osteoblastos no son capaces de producir MMP-9 en
respuesta a dichos estímulos. HKBA y L-Omp19 inducen la producción de MMP-9 por parte de
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neutrófilos. HKBA induce la secreción de MMP-2 y citoquinas en fibroblastos sinoviales
humanos, y este efecto está mediado por L-Omp19 a través del
reconocimiento de TLR2. Modelo murino.
HKBA y L-Omp19 inducen la producción de citoquinas proinflamatorias,
quemoquinas y MMP-2 y-9 cuando son inoculados en la articulación de la
rodilla de ratones BALB/c. Paciente con bursitis brucelar.
Se detectó la presencia de TNF-α, IL-1β, IL-8, MCP-1 e IFN-, así como
también la producción de MMP-9 en dos muestras de fluido sinovial
obtenidas de un paciente con bursitis prepatelar debido a una infección con
B. abortus. Una de las muestras fue tomada al momento de la presentación
y la otra 3 meses después. Los niveles de todas las citoquinas se
incrementaron en la segunda muestra respecto de la tomada al inicio de la
presentación.
2. Inducción de la osteoclastogénesis
Los sobrenadantes de los macrófagos murinos infectados con B. abortus o
estimulados con L-Omp19 inducen la diferenciación de los monocitos
derivados de médula ósea a osteoclastos.
Los macrófagos murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-
Omp19 producen las citoquinas proinflamatorias TNF-α, IL-6 e IL-1β, pero
no RANKL ni TGF-β. La producción de citoquinas proinflamatorias por parte de los macrófagos
murinos infectados o estimulados con L-Omp19 y la concomitante
osteoclastogénesis depende de la presencia de MyD88 y TLR2. La formación de osteoclastos inducida por sobrenadantes de macrófagos
murinos infectados con B. abortus o estimulados con L-Omp19 está
mediada principalmente por TNF-α. Los monocitos humanos se diferencian a osteoclastos en respuesta a la
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infección con B. abortus a través de la secreción de TNF-α. B. abortus y L-Omp19 inducen osteoclastos diferenciados capaces de
degradar matriz mineral. HKBA y L-Omp19 inducen la formación de osteoclastos cuando son
inoculados en la tibia de ratones mediante un mecanismo dependiente de
TLR2.
3. Inhibición de la diferenciación y función de los osteoblastos
B. abortus invade y se multiplica en osteoblastos provenientes de un cultivo
primario de calvaria murina. La infección con B. abortus induce la expresión de KC, MCP-1 y MMP-2 y -
9 por parte de los osteoblastos de calvaria. La infección con B. abortus induce apoptosis de los osteoblastos y estimula
la expresión de RANKL por parte de estas células. Además, la infección
inhibe la diferenciación de los osteoblastos, así como también la
mineralización y la deposición de matriz orgánica. TNF-α presente en los sobrenadantes de macrófagos murinos infectados
con B. abortus está involucrado en la estimulación de la expresión de
RANKL por parte de los osteoblastos, la inducción de la apoptosis y la
inhibición de la mineralización y deposición de matriz orgánica por parte de
los mismos.
En el Esquema 15 se presenta un resumen de las interacciones celulares y los
mecanismos inmunomoleculares de la brucelosis osteoarticular descriptos en esta tésis
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Esquema 15.
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