Download - Respuesta neuroendocrina en TB
![Page 1: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/1.jpg)
Instituto de Inmunología, Facultad de Ciencias Médicas, UNR
Lic. Verónica V. Bozza
Directora: Dra. María Luisa Bay
Estudios moleculares y funcionales en células mononucleares de pacientes con Tuberculosis pulmonar, estimuladas in vitro con Mycobacterium tuberculosis y tratadas con Cortisol y/o Dehidroepiandrosterona
![Page 2: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/2.jpg)
Esta situación es equivalente a más de 10 Boeing 747 llenos de personas muriendo por día a causa de esta crisis global de salud Nature immunology, vol 4, Nº 10 octubre,2003.
¿Por que investigar sobre Tuberculosis?
Es la 1º causa de mortalidad debido a un agente bacteriano.1/3 de la población mundial se encuentra afectada.Mueren 4.900 personas por día
![Page 3: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/3.jpg)
Tuberculosis
Agente causal: Mycobacterium tuberculosis
Bacilo ácido-alcohol resistente
Aerobio estricto y de vida intracelular
Principal vía de transmisión:
AÉREA
Mayor incidencia de TB pulmonar
![Page 4: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/4.jpg)
Eventos cronológicos en la Eventos cronológicos en la patogénesis de la tuberculosis:patogénesis de la tuberculosis:
Inhalación del M. tuberculosis
Eliminación del patógeno
Complejo primario
Estabilización(latencia)
Infección localizada
Diseminación del M. tuberculosis
Infecciónaguda
Estabilización(latencia)
Reactivación(TBC secundaria)
![Page 5: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/5.jpg)
Th
Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:
M
CPA
IL-12
NK
Th1
IFN-
T citotóxico
RIN
RIO
IL-2
![Page 6: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/6.jpg)
Th
Respuesta inmune frente al M. tuberculosis:
CPA
TNF-
IL-12
NK
Th1
IFN-
T citotóxico
MRIN
RIO
IL-2 Granuloma
![Page 7: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/7.jpg)
EJE HIPOTALÁMICO-PITUITARIO-EJE HIPOTALÁMICO-PITUITARIO-ADRENALADRENAL
![Page 8: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/8.jpg)
GC
Sostenido apoptosis de linfocitos
Inhiben la síntesis de citocinas Th1
Inhiben la respuesta inflamatoria favoreciendo la actividad de linfocitos Th2
Optimizan el curso de respuestas biológicas agudas
![Page 9: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/9.jpg)
DHEA
Facilita el patrón Th1
Esteroide sintetizado fundamentalmente en corteza suprarrenal y SNC
En humanos muchas enfermedades caracterizadas por inflamación crónica presentan bajos niveles séricos de DHEA o DHEA-S
![Page 10: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/10.jpg)
OBJETIVO GENERAL DE LA LÍNEA DE TRABAJO
Estudiar los mecanismos inherentes a la interacción inmunoendócrina en pacientes con tuberculosis de distinta severidad, y convivientes íntimos no enfermos de estos pacientes.
![Page 11: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/11.jpg)
MUESTRAMUESTRASS
PACIENTES: PACIENTES:
Enfermos con diagnóstico de TBC pulmonar, basados en criterios clínicos y radiológicos e identificación de bacilos ácido-alcohol resistentes en el esputo
CLASIFICACIÓN: Leves: pacientes con un único lóbulo
involucrado sin cavidades visibles Moderados: pacientes que presenten
compromiso unilateral de 2 o más lóbulos y las cavidades, de hallarse presentes, no excedan un diámetro total de 4 cm
Severos: enfermedad bilateral con afectación masiva y cavidades múltiples
![Page 12: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/12.jpg)
GRUPO CONTROL:GRUPO CONTROL: Muestras provenientes de individuos sanos
similares en edad y sexo a los pacientes.
Tanto las muestras de los pacientes como las de los controles se analizaron en forma simultánea.
![Page 13: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/13.jpg)
Se excluyen del estudio aquellos sujetos que:
Presenten co-infección con HIV.
Hayan iniciado el tratamiento antituberculoso.
Presenten patologías con compromiso directo
de la glándula suprarrenal.
Presenten patologías que involucren los ejes
hipotálamo-hipófiso-tiroideo y gonadal.
Padezcan patologías que requieran del consumo
de drogas corticosteroideas, inmunosupresoras
o inmunomoduladoras.
![Page 14: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/14.jpg)
Muestra
Células
Tratamientos
Evaluar la
blastogénesis
Obtener sobrenadantes para dosar citocinas
![Page 15: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/15.jpg)
TRATAMIENTOSTRATAMIENTOS
Cortisol (Gc)Cortisol (Gc)
1010-6-6 Molar Molar 1010-7-7 Molar Molar
Dehidroepiandrosterona(DHEA)Dehidroepiandrosterona(DHEA)
1010-7 -7 Molar Molar 1010-8-8 Molar Molar 1010-9 -9 Molar Molar 1010-10-10 Molar Molar
Sonicado de Mycobacterium tuberculosis,
concentración: 8 g/ml (Tso)
Concanavalina A, concentración: 2,5g/ml (Con A)
![Page 16: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/16.jpg)
Los sobrenadantes se levantaron a las 36 hs y 4 días de cultivo Se fraccionaron y congelaron para la posterior determinación de las citocinas
D 10-10D 10-8 D 10-9
GC 10-6
GC 10-7
D 10-7
GC 10-6 GC 10-6GC 10-6
GC 10-7 GC 10-7 GC 10-7
D 10-7
D 10-8
D 10-8
D 10-9
D 10-9
Basal TSO
D 10-7
GC 10-7
D 10-10
GC 10-6
D 10-10
![Page 17: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/17.jpg)
TratamientoTratamiento GruposGrupos
ControlesControles LevesLeves ModeradosModerados SeverosSeveros
TsoTso 1274812748(7839-(7839-20834)20834)
25712571(1474-(1474-11049)11049)
64876487(1593-16439)(1593-16439)
42434243(600-(600-
7356)¶7356)¶
Tso +Tso +Cortisol 10Cortisol 10-6-6
MM
25712571(1333-(1333-8376)8376)**
881881(442-7857)(442-7857)
11351135(469-4620)(469-4620)**
18261826(359-(359-
3563)3563)**
Tso +Tso +Cortisol 10Cortisol 10-7-7
MM
87948794(3256-(3256-13994)13994)
14961496(1124-(1124-3611)3611)
35093509(794-6380)(794-6380)
27912791(498-(498-
12907)12907)
Difieren de Controles, ¶ p<0,04*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10-6 M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).
Resultados Previos:Scandinavian Journal of Immunology 60, 639–646, 2004
![Page 18: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/18.jpg)
TratamientoTratamiento GruposGrupos
ControlesControles LevesLeves ModeradosModerados SeverosSeveros
TsoTso 1274812748(7839-20834)(7839-20834)
25712571(1474-11048)(1474-11048)
64866486(1592-16439)(1592-16439)
42434243
(600-7356) (600-7356) ¶¶Tso +Tso +
Cortisol 10Cortisol 10-6-6 M M25702570
(1333-8376) (1333-8376) **880880
(441-7857)(441-7857)11351135
(469-4620) (469-4620) **18261826
(359-3563) (359-3563) **+ DHEA 10+ DHEA 10-7-7 M M 32193219
(840-9486)(840-9486)809809
(554-4881)(554-4881)17251725
(488-5533)(488-5533)15801580
(449-4314)(449-4314)
+ DHEA 10+ DHEA 10-8-8 M M 26752675(1034-8857)(1034-8857)
906906(471-7925)(471-7925)
11221122(512-4785)(512-4785)
16691669(419-4742)(419-4742)
+DHEA 10+DHEA 10-9-9 M M 27932793(755-9084)(755-9084)
760760(490-5284)(490-5284)
890890(552-6847)(552-6847)
18311831(467-4496)(467-4496)
+ DHEA 10+ DHEA 10-10-10 MM
22172217(822-8990)(822-8990)
809809(498-5812)(498-5812)
895895(713-5942)(713-5942)
21662166(464-3070)(464-3070)
Difieren de Controles, ¶ p<0,04*Comparaciones entre grupos: Cultivos estimulados con Tso vs cortisol (10-6 M), Controles (p<0,01), Moderados (p<0,025), Severos (p<0,05).
![Page 19: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/19.jpg)
1- Conocer si las modificaciones observadas en la respuesta inmune específica de las CPM frente a TSO, por el agregado de Cortisol y/o DHEA, se encontrarían asociadas a un patrón diferencial en el proceso de muerte celular programada y analizar los mecanismos implicados en este proceso.
![Page 20: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/20.jpg)
D 10-9D 10-7 D 10-8
GC 10-6D 10-7
GC 10-6 GC 10-6GC 10-6
D 10-8D 10-9
Basal TSOGC 10-6
solo
GC 10-7
soloD 10-7
sola
![Page 21: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/21.jpg)
Determinación de los niveles de apoptosis por citometría de flujo
Anexina V/IP(24 Horas de cultivo)
Hipodiploidía (IP)(4 días de cultivo)
![Page 22: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/22.jpg)
Anexina V/IP
![Page 23: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/23.jpg)
Hipodiploidía (IP) (4 días de cultivo)
Células apoptóticas
![Page 24: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/24.jpg)
Niveles de IL-10
Niveles de TGF-
Niveles de IFN-
Los pacientes TB presentaban:Niveles de
CortisolNiveles de DHEA
Niveles de IL-6
Resultados Previos en Plasma:
![Page 25: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/25.jpg)
CONVIVIENTES: CONVIVIENTES:
Personas que viven con un enfermo diagnosticado y con esputo positivo; sin sintomatología, RX normal y sin trastornos endócrinos
Tanto las muestras de los pacientes como las de los convivientes y controles se analizaron en forma
simultánea
![Page 26: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/26.jpg)
2- Analizar el perfil de citocinas (IFN-γ, TGF-β, IL-10, IL-6 y TNF-α) producidas en la respuesta inmune específica de CPM de pacientes y de convivientes íntimos; así como los niveles plasmáticos de los mencionados mediadores, y de Cortisol y DHEA en los distintos grupos de estudio
![Page 27: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/27.jpg)
Determinación de los niveles de citocinas en sobrenadantes de cultivo:
•IFN-
•TNF-
•IL-6
•IL-10
•TGF-
•24 Hs
•36 Hs
•4 Días
Las determinaciones se realizarán por ELISA, utilizando kits comerciales
![Page 28: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/28.jpg)
Resultados Previos:
Los pacientes TB presentaban:
En la producción de IFN-
En la producción de TGF-
= En la producción de IL-10
CULTIVOS ESTIMULADOS CON TSO:
(VS. CONTROL)
CULTIVOS ESTIMULADOS CON TSO + GC 10-6 M: (VS. CULTIVOS ESTIMULADOS)
En la producción de IFN-
= En la producción de TGF-
= En la producción de IL-10
![Page 29: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/29.jpg)
• Adaptación adherente de la línea original NCI-H295
que crece en suspensión.
• Se originaron a partir de un adenocarcinoma adrenal
proveniente de una mujer de edad media de raza
negra.
• Conservan la capacidad de respuesta a estímulos
fisiológicos produciendo todos los esteroides adrenales.
Línea celular adrenal NCI-H295-R
![Page 30: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/30.jpg)
Producción porcentual de DHEA en sobrenadantes de cultivos de células NCI-H295-R, adicionadas con pool de sobrenadantes de CPM de pacientes tuberculosos y controles sanos con o sin el agregado de TSO.
![Page 31: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/31.jpg)
4- Investigar qué mediador(es) secretados por las células periféricas mononucleares (estimuladas o no con TSO) estarían implicados en la inhibición de la síntesis de DHEA por parte de la línea celular adrenal humana NCI-H295-R.
![Page 32: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/32.jpg)
Cultivo de Células Periféricas Mononucleares con y sin el agregado de TSO
Recolección de sobrenadantes de 24, 36 hs y 4 días de cultivo
Adición de los sobrenadantes de las CPM a la línea adrenal NCI-H295-R
Luego de 48 horas de cultivo se retira el Sobrenadante de la línea adrenal
Cuantificación de DHEA y Cortisol
![Page 33: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/33.jpg)
Cultivo de Células Periféricas Mononucleares con y sin el agregado de TSO
Recolección de sobrenadantes de 24, 36 hs y 4 días de cultivo
Adición de los sobrenadantes de las CPM a la línea adrenal NCI-H295-R
Luego de 48 horas de cultivo se retira el Sobrenadante de la línea adrenal
Cuantificación de DHEA-S y Cortisol
Adición de anti-TGF-
![Page 34: Respuesta neuroendocrina en TB](https://reader034.vdocuments.co/reader034/viewer/2022051316/55cf8cdf5503462b13903a95/html5/thumbnails/34.jpg)
Muestra
Células
Tratamientos
Evaluar la
blastogénesis
Obtener sobrenadantes para dosar citocinas
Obtener células para estudiar apoptosis
Obtener sobrenadantes para exp. con la línea adrenal
HEMOGRAMA
POBLACIONES