Download - Preparación de tejidos
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Introducción a la Histología
Definir que es un tejido celular.
Enumerar los diferentes tipos de tejidos y su clasificación.
Describir los diferentes pasos del procesamiento histológico paramicroscopía óptica y electrónica.
Identificar el colorante y técnica apropiados para la demostraciónde un tejido o estructura celular específicos.
Identificar, a partir de imágenes, secciones teñidas con tincionestopográficas, histoquímicas, inmunocitoquímicas,inmunofluorescencia, micrografías electrónicas de transmisión yde barrido.
Concepto de Tejido
• Los tejidos son agrupaciones funcionales de células
• Conjunto de células ordenadas en una formaciónregular.
• Entramado, fisiológicamente útil al organismo,constituido por células especializadas morfológica yfuncionalmente.
• ....
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Concepto de Histología
• Término procedende del griego "histos" que significa tejido detelar y "logos" que significa estudio o aprendizaje. Histologíapuede definirse como el estudio de los tejidos
• Histología: Ciencia que estudia la estructura, la organización,la función y la capacidad de respuesta de los tejidos
• Histología: Ciencia que estudia los entramados celulares,fisiológicamente útiles para el organismo, que están constitudospor células especializades morfológica y funcionalmente
• Histología general: Rama de la Histología que comprende la Citología y elestudio de los tejido báicos.
• Histología especial: Rama de la Histología que comprende el estudiomicroscópico de órganos y sistemas.
Tejidos fundamentalesClasificación
• Tejidos epiteliales– epitelios de revestimiento– epitelios glandulares
• Tejidos conectivos– conjuntivo– sanguíneo– adiposo– cartilaginoso– óseo
• Tejidos musculares– muscular liso– muscular esquelético– muscular cardiaco
• Tejido nervioso
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Tejidos fundamentalesClasificación
• Tejidos epiteliales– epitelios de revestimiento– epitelios glandulares
• Tejidos conectivos– conjuntivo– sanguíneo– adiposo– cartilaginoso– óseo
• Tejidos musculares– muscular liso– muscular esquelético– muscular cardiaco
• Tejido nervioso
Tejidos fundamentalesClasificación
• Tejidos epiteliales– epitelios de revestimiento– epitelios glandulares
• Tejidos conectivos– conjuntivo– sanguíneo– adiposo– cartilaginoso– óseo
• Tejidos musculares– muscular liso– muscular esquelético– muscular cardiaco
• Tejido nervioso
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Tejidos fundamentalesClasificación
• Tejidos epiteliales– epitelios de revestimiento– epitelios glandulares
• Tejidos conectivos– conjuntivo– sanguíneo– adiposo– cartilaginoso– óseo
• Tejidos musculares– muscular liso– muscular esquelético– muscular cardiaco
• Tejido nervioso
Tejidos fundamentalesClasificación
• Tejidos epiteliales– epitelios de revestimiento– epitelios glandulares
• Tejidos conectivos– conjuntivo– sanguíneo– adiposo– cartilaginoso– óseo
• Tejidos musculares– muscular liso– muscular esquelético– muscular cardiaco
• Tejido nervioso
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Procesamiento histológico paramicroscopía óptica
• Fijación• Inclusión• Obtención de cortes• Tinción• Montaje permanente• Observación al microscopio• Obtención de microfotografías
Fijación
• Preservar el tejido de la putrefacción, autolisis, etc...
• Endurecer el tejido para permetir su manipulación y
evitar alteraciones morfológicas.
• Mantenimiento de la citoarquitectura y ultraestructura.
• Mantenimiento in situ de las moléculas(Importante para determinaciones histoenzimáticas e inmunocitoquímicas)
Fijadores: aldehidos, alcohol, mercurio, ácido pícrico
Formol: formaldehido + metanolParafolmadehido + tampón fosfatoBouin: ácido pícrico + formol + ácido acético
http://www.bris.ac.uk/depts/PathAndMicro/tutorials/sam/samples.html
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Métodos de Fijación
Fijación por inmersión
10 volúmenes de fijadorTiempo: 4-24 horas
Fijación por perfusión
Perfusión: 10 minutosPostfijación por inmersión: 4-24 horas
Procesamiento histológico paramicroscopía óptica
• Fijación• Inclusión• Obtención de cortes• Tinción• Montaje permanente• Observación al microscopio• Obtención de microfotografías
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Inclusión en parafina
Inclusión en parafinaInfiltración
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Inclusión en parafinaConfección de bloques
Procesamiento histológico paramicroscopía óptica
• Fijación• Inclusión• Obtención de cortes• Tinción• Montaje permanente• Observación al microscopio• Obtención de microfotografías
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Microtomo de parafina
Microtomo de parafina
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Microtomo de parafina
Microtomo de parafina
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Microtomo de parafina
Microtomo de parafina
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Microtomo de parafina
Microtomo de parafina
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Obtención de secciones o corteshistológicos
• Cortes de parafina 5–10 µm (Microtomo de parafina)
• Cortes por congelación: 5-30 µm (Criostato)
• Cortes vibratomicos 30-50 µm (Vibratomo)
• Cortes semifinos: 1-2 µm (Ultramicrotomo)
• Cortes ultrafinos: 300-700 Å (Ultramicrotomo)
Grosor de los cortes
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Grosor de los cortes
Procesamiento histológico paramicroscopía óptica
• Fijación• Inclusión• Obtención de cortes• Tinción• Montaje permanente• Observación al microscopio• Obtención de microfotografías
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Tinciones histológicas
• Técnicas topográficas
• Técnicas específicas
• Técnicas histoquímicas
• Técnicas inmunocitoquímicas
Tinciones
• Tinciones topográficas: basadas en la interacción desustancias colorantes con las estructuras celulares y tisulares.
– Colorantes iónicos ácidos: Tienen afinidad por estructurastisulares con carga positiva
– Colorantes iónicos básics: Tienen afinidad por estructurastisulares con carga negativa
Ejemplo: Tinción Hematoxilina-Eosina
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Tinción de Hematoxilina-Eosina
• Hematoxilina– Colorante iónico básico (carga positiva)
Tiñe estructuras con carga negativaNúcleos de color azul(basófilos)
• Eosina– Colorante iónico ácido (carga negativa)
Tiñe estructuras con carga positivaCitoplasmas de color rosado(esosinófilos)
Técnica de tinción
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Tinciones. Método
Tinciones. Método
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Procesamiento histológico paramicroscopía óptica
• Fijación• Inclusión• Obtención de cortes• Tinción• Montaje permanente• Observación al microscopio• Obtención de microfotografías
Montaje de las preparaciones
• Para observar con el microscopio óptico los cortes teñidos seprocede a montar las preparaciones utilizando una sustanciacementante (medio de montaje) y un cubreobjetos.
• El medio de montaje facilita la observación y si se trata de unmedio de montaje permanente estabiliza la coloraciónhistológica durante mucho tiempo.
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Procesamiento histológico paramicroscopía óptica
• Fijación• Inclusión• Obtención de cortes• Tinción• Montaje permanente• Observación al microscopio• Obtención de microfotografías
Observación al microscopioObtención de microfotografías
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Tinciones histológicas
• Técnicas topográficas
• Técnicas específicas
• Técnicas histoquímicas
• Técnicas inmunocitoquímicas
Técnicas histológicas específicas
• Técnicas para el tejido conjuntivo: tricrómicode Masson, van Gieson
• Glucógeno: carmin de Best
• Mucinas: azul alcian, mucicarmín
• Lípidos: oil red O, negro sudán B, OsO4
• Ácidos nucleicos: naranja de acridina, verdede metilo-pironina
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Tricrómico de Masson
Van Gieson
Técnicas histológicas específicasTejido conjuntivo
Técnicas histológicas específicasMucinas
Azul Alcián
Mucicarmin
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Oil red O
Técnicas histológicas específicasLípidos
Oil red O
Oil red O
Técnicas histológicas específicasÁcidos nucleicos
Naranja de acridina
Verde de metilo - pironina
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Tinciones histológicas
• Técnicas topográficas
• Técnicas específicas
• Técnicas histoquímicas
• Técnicas inmunocitoquímicas
Técnicas histoquímicas
• PAS (ácido periódico de Shiff): detección de carbohidratos– Ácido periodico que actúa sobre los carbohidratos produciendo la formación
de grupos aldehidos que son los que reaccionan con el colorante
• Lectinas: detección de residuos glucosilados– Lectinas biotinadas. Tripsina o neuraminidasa para exponer los residuos
escondidos. Avidina peroxidasa. Revelado con DAB
• Reacción de Feulgen: detección de ADN– Hidrólisis de la unión purina-deoxirribosa con HCl para formar aldheidos
que reaccionan con el colorante
• Técnicas histoenzimáticas: detección de proteínas enzimáticas
Implican una reacción química: transformación de unproducto en otro diferente con característicasdiferenciables
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PASAzul Alcian / PAS
Detección histoquímica de carbohidratos
Detección histoquímica de ADN
Feulgen
Feulgen
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Detección histoquímica de residuosglucosilados
Lectina de tomate
Revelado de la peroxidasa
H2O2
H2O 1/2 O2+ DAB
DAB-O
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Técnicas histoenzimáticas
• Detección de una fosfatasa: NDPasa
ADP P + AMP
Nitrato Pb
Fosfato de Pb
Sulfuro de Pb
NDPasa
Sulfuro amonio
NDPasa
Tinciones histológicas
• Técnicas topográficas
• Técnicas específicas
• Técnicas histoquímicas
• Técnicas inmunocitoquímicas
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Técnicas inmunocitoquímicas
• Se basan en el empleo de anticuerpos dirigidoshacia epitopos (grupos con característicasantigénicas) concretos de moléculas
• Los anticuerpos son proteinas séricas(inmunoglobulinas) sintetizadas por las célulasplasmáticas, derivadas de los linfocitos B activadostras reconocer un antígeno extraño (inmunógeno).Usualmente se utilizan IgG o IgM
•Anticuerpos policlonales: conjunto de anticuerpos específicos para uninmunógeno (diferentes epitopos)•Anticuerpos monoclonales: específicos de un epitopo único de uninmunógeno
Anticuerpos
Policlonales Monoclonales
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Detección inmunocitoquímica de GFAP
Biotina
Avidina
Peroxidasa
Ab1
Ab2
AntigenoGolgi
Astrocitos
GFAP
GFAP: Glial fibrilar acidic protein
TNF-alfa macrófagos Melanoma, TGF-alfa
Nódulo linfoide, Ki-67 Páncreas, insulina
Tinciones inmunocitoquímicas
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BL6 nuclear PNA citoplasmatico
Tinciones inmunocitoquímicasDobles mardados
Inmunofluorescencia
Moléculafluorescente
GFAP
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Microscopio de Fluorescencia
Preparación
Filtro barrera
Espejo dicroicoFiltro excitación
Inmunofluorescencia: dobles marcados
GFAPHSP47
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Tinciones inmunocitoquímicaspor inmunofluorescencia
Tinciones inmunocitoquímicaspor inmunofluorescencia
Aparato de GolgiMicrotúbulosNúcleo
Cultivo de células renales Cultivo de células Hella
TubulinaActinaNúcleo
Cultivo células musculares lisas
A-SM Actinab-NM Actina
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Microscopía Electrónica de Transmisión
• Fijación: glutaraldehido, paraformaldehido, tetróxidode osmio
• Deshidratación• Inclusión en resinas epoxi• Ultramicrotomía: secciones
ultrafinas• Montaje sobre rejillas• Contraste de las rejillas
con metales pesados(citrato de plomo)
• Observación al microscopio
MicroscopíaElectrónica deTransmisión
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Microscopía Electrónica de barrido(Scanning)
• Fijación: glutaraldehido, paraformaldehido, tetróxidode osmio
• Deshidratación• Desecación por unto crítico• Sombreado con oro• Observación al microscopio
http://www.mos.org/sln/sem/seminfo.html
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