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Práctica Enzimas de Restricción
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Enzimas de restricción Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Destruyen ADN de bacteriófagos que infectan bacterias Sistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propioSistema inmune bacteriano destruye ADN que no es propio
ADN bacteriano protegido por metilación. La enzima de restricción corta el ADN no metilado: no propio
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Enzimas de restricción
Se han identificado cientos La mayoría reconocen y cortan
secuencias palindrómicas Muchas dejan “puntas
pegajosas” Se pueden hacer cortes muy
precisos del ADN al escoger la enzima
Importante en biología molecular: puntas pegajosas se unen con secuencia complementaria
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Palíndrome
• oso• radar • reconocer• rotor • salas• seres • somos • sometemos • oro• ala • ojo
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Secuencia palindrómica en biología
5'- G A A T T C -3'
3'- C T T A A G -5'
• Locus de ADN en el que la secuencia 5'-a-3' es idéntica en ambas hebras
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Algunas enzimas usadas comúnmente
Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTTSac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG
Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI 5'-G | GATCC Pst I 5'-CTGCA | G
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Uso de enzimas de restricción
• La actividad depende de condiciones precisas:
pHTemperaturaConcentración de salesIones
• Unidad enzimática (u) es la cantidad de enzima requerida para digerir 1 ug de ADN bajo condiciones óptimas:
3-5 u/ug de ADN genómico1 u/ug ADN de plásmido Stocks típicamente 10 u/ul
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Tipos corte
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Utilidad para ADN recombinante
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Marcador de peso molecular
• Permite identificar tamaño (peso) aproximado de moléculas en un gel
• A menudo es ácido nucleico digerido con enzima de restricción
• Común: fago lambda digerido con HindIII: da 5 bandas
• O la escalera de 1kb
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Plásmidos en gel
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Electroforesis de plásmidos
• Plásmido sin cortar puede tomar 5 conformaciones
• No se puede determinar el tamaño de un plásmido no cortado.
• Si se corta con ER que corte en un sitio: se lineariza
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Digestión plásmidos
Número bandas= número de sitios de restricción
pG
EM
-T
pG
EM
-T/E
co
RI
pU
WL
201
pU
WL
201
/Ec
oR
I
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Digestión ADN genómico
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Diagnóstico deleciones/inserciones por electroforesis
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Deleción en FQ
Fibrosis quística
Recesiva
Deleción 3pb en gen CFTR, 70% de casos
Degradada en RE, no llega a membrana celular
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Diagnóstico por sitios de restricción
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Mutación: Cys282Tyr
Mutación Hemocromatosis
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Mutación: His63Asp
Mutación Hemocromatosis
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• http://www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Restriction_Digestion/index.html
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Lambda cortado con EcoRI
5 cortes
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Lambda cortado con Eco RI
6 fragmentos
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Práctica
• Digestión del fago Lambda con tres enzimas de restricción