LoquedeborecordardeWesternBlotDefinición
Esunatécnicadeinvestigaciónydiagnosticoqueseutilizaparadetectarlapresenciadeproteínasdeunpesoespecifico
Elprocedimientodemanerageneralconsistenen:
• Unpasodeseparacióndelasmuestrasenunamatrizdeacrilamida(puedeserencondicionesreductorasonativas).
• Unpasodetransferenciadelasproteínasseparadasaunamembrana(nitrocelulosaoPVDF)
• Unpasodeincubacióndelamembranaconelanticuerpoespecificoparalaproteínaquesedeseadetectar.
• Unpasodedeteccióndelaproteínamedianteunareacciónquímicaofísica
Recordemosquelasproteínastendránunpatróndemigraciónquedependerádeeltamañodelamuestraquesedeseadetectar,asícomolaconcentracióndeacrilamidaquetenganuestrogel.
ElSDSeselcompuestoquenospermitirásepararlasmuestrasmediantesumigraciónenlamatrizdeacrilamidacuandoseapliqueunacorrienteeléctrica,demaneraquelasproteínasaltenerunacarganegativa(conferidaporelSDS)lespermitirámigrarhaciaelpolopositivo.
ComosepuedeapreciarenlafiguraanteriorelSDSleconfierealasproteínasunacarganegativadebidoaqueesteseunealasecuenciadeaminoácidoseinhibelaformacióndeestructurassecundarias.
Despuésdelaelectroforesistendremoselsiguienteresultado:
Dondesepuedeapreciarqueelpatróndemigraciónmantienealasproteínasdemayortamañoenlaspartessuperioresdelgel,mientrasqueenlaparteinferiorseaprecianlasproteínasdemenortamaño.Ladiferenciaquetenemosentrecondicionesnativasycondicionesreductorasesjustamentelaadicióndeagentesdesnaturalizantesdeproteínas.Asípodemossaber(encondicionesnativas)elpesoquetienenproteínasconestructurascuaternarias.
Unavezquetenemosnuestrogelconlasproteínasseparadas,comenzamoselprocesodetransferencia,queconsisteenlamigracióndelasproteínasaunamembranaparasuposteriordetección.
Elpasodedetecciónsellevaacabomedianteelusodeunanticuerpoprimarioqueesespecificoparalaproteínaquesedeseadetectaryunanticuerposecundarioqueesespecificoparalaparteconstantedelanticuerpoprimario,deestamaneraelanticuerposecundariosoloseunealanticuerpoprimarioypermiteladetecciónespecificadelaproteínadeseada.
Existendiversostiposdedeteccióncomo:• Colorimétrico:quepermiteladeteccióndelaproteínadeseadamedianteuna
reaccióndeunamoléculaasociadaalanticuerposecundarioconunsustratoquedarácomoproductounaseñalcolorimétrica.
• Quimioluminiscencia:estareacciónesparecidaalacolorimétricasoloqueenelmomentoqueseactúasobreelsustratoseemiteunaseñaldeluzquepuedesercaptadaporunacámaraultrasensible.
• Fluorescencia:Estareacciónserealizamedianteelusodeunrayolaseryesdetectadaporunsistemasensibleaunespectrodeterminadodelaluzvisible(puedendetectarsediversasproteínasalmismotiempo,conelusodediversosfluorocromos).
UnejemplodelusodeWesternBlotenlaclínicaesladeteccióndeanticuerposcontralasdiferentesproteínasdeVIH.Comosepuedeverenlasiguientefiguralosanticuerposespecíficosparalasdiferentesproteínasdevirussehacenpresentesenelsuerodepacientesinfectadosconformelainfeccióncrónicaseestablece.
