ENERO 2017
INFORME DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE
DETERMINACIÓN DE HISTAMINA EN PRODUCTOS DE
LA PESCA MEDIANTE KIT ENZIMÁTICO
DESARROLLADO POR BioSystems S.A.
La validación de un método de ensayo consiste en un estudio sistemático que permite conocer si
las características técnicas del mismo cumplen las especificaciones relativas al uso previsto.
La validación de un método será poco exhaustiva, limitándola a la comprobación del
cumplimiento de las características especificadas en aquellos métodos que se consideran de
referencia, y mucho más completa y exhaustiva en las nuevas metodologías analíticas, en cuyo
caso, si es posible la validación debe basarse en normas reconocidas.
Existen algunas normas ISO para la validación de métodos microbiológicos, como es el caso de la
ISO 16140:2003 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo de
validación de métodos alternativos”, sin embargo no hay normas disponibles para la validación
de ensayos físico-químicos alternativos, aunque sí guías ampliamente reconocidas con
protocolos para la validación de métodos de ensayo, y que sirven de referencia a las entidades
que acreditan el cumplimiento de la UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 como son por ejemplo la guía
Eurachem (“The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics”), o el documento del CODEX “Guidelines on Establishing methods
criteria for the identification of relevant analytical methods”.
Además, la DECISIÓN DE LA COMISIÓN 2002/657 de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica la
Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la
interpretación de los resultados, establece normas relativas a los métodos analíticos de
muestras oficiales, y fija criterios comunes de interpretación de los resultados analíticos por
parte de los laboratorios oficiales de control. Concretamente, en su artículo 3, especifica que los
Estados miembros garantizarán que los métodos analíticos hayan sido validados de acuerdo con
los procedimientos que se especifican en dicha Decisión.
ANFACO-CECOPESCA ha recopilado estas y otras referencias bibliográficas en el Procedimiento
PG/0/06 para la validación de métodos de ensayo, integrado en el sistema de calidad según la
norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005, y que tiene por objeto definir la operativa establecida por
ANFACO-CECOPESCA para la validación de métodos o procedimientos de ensayo y la definición
de los formatos aplicables, en base a los siguientes documentos:
AOAC International (1998). AOAC Peer-verified methods program. Manual on policies
and procedures. Maryland. USA.
INTRODUCCIÓN
DECISIÓN DE LA COMISIÓN (2002/657/CE) de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica
la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos
y la interpretación de los resultados.
DIRECTIVA 98/53/CE, de la Comisión, de 16 de julio de 1998, por la que se fijan métodos
de toma de muestras y de análisis para el control oficial del contenido máximo de
algunos contaminantes en los productos alimenticios.
Ellison, S L R, Rosslein, M and Williams A. (2000). Quantifying Uncertainty in Anaytical
Measurement. 2ª edición. EURACHEM/CITAC Guide.
EURACHEM-GUIDE (1998). The fitness for purpose of analytical methods: A laboratory
guide to method validation and related topics. LGC, Teddington.
Horwitz, W. (1998). A simple Method for Evaluating Data from an Interlaboratory Study.
Journal of AOAC International Vol. 81, No. 6.
Hotwitz, W. (2003). Validation: An invisible component of Measurament. AOAC
International.
Huber, L. (1998). Validation of Analytical Methods: Review and Strategy. LC-GC
International,pp. 96-105.
J.C. Miller, J.N. Miller. (1993). Estadística para química analítica Addison-Wesley
Iberoamericana. 2ª edición.
Statistical Subcommittee of the AMC. (2004). The amazing Horwitz function. Technical
Brief No.17 July. Royal Society of Chemistry.
Thompson, M. (2000). Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb
concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst,
125 385-386.
Thompson, M, Ellison, S. L.R. and Wood, R. (2002). Harmonized guidelines for single-
laboratory validation of methods of analysis. IUPAC Technical report. Pure Appl. Chem.,
vol 74, Nº 5, pp. 835.855.
Nombre completo del método: Procedimiento para la determinación de histamina mediante la utilización de un kit enzimático y posterior medida en un analizador automático.
Tipo de método: Cuantitativo
Analito: Histamina
Unidades: mg/kg
Matriz: atún crudo, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite, semiconserva de anchoa Rango: de 10 a 200 mg/kg
Método de referencia utilizado:
Analito, rango y unidades: Histamina, rango de 10 a 500 mg/kg. Acreditación: PEE/1/119, acreditado por ENAC según UNE-EN ISO/IEC 17025 (Anexo Técnico nº 96/LE230) Matriz: Productos de la pesca, de la acuicultura y sus derivados Método: HPLC- detector UV
IDENTIFICACIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDADO
Definición: La selectividad y especificidad es la capacidad de un método de distinguir entre el analito que se está midiendo y otras sustancias. Descripción: Se realizó la prueba de selectividad a partir de extractos de las matrices de estudio adicionados con 1000 mg/kg de posibles interferentes. En este caso se realizó con agua, tiramina, putrescina y agmatina. Para ello se prepararon extractos sin histamina y extractos con 25 mg/kg de histamina con los distintos interferentes de estudio. Se midieron las concentraciones obtenidas en el equipo. Los resultados obtenidos han sido los siguientes:
PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
PRUEBAS REALIZADAS
Selectividad y Especificidad Linealidad Exactitud Precisión Robustez Límites de detección y de cuantificación
SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD
HISTAMINA
(mg/kg)
COMPUESTOS
REACCIÓN CRUZADA
(1000 ppm)
RESULTADOS (mg/kg)
AGUA 1,6
Tyramine 1,8
Putrescine 3,3
Agmatine 60,2
AGUA 25,6
Tyramine 25,2
Putrescine 29,4
Agmatine 84,7
ATÚN AL NATURAL
0
25
HISTAMINA
(mg/kg)
COMPUESTOS REACCIÓN
CRUZADA (1000 ppm)RESULTADOS (mg/kg)
AGUA 3,4
Tyramine 3,4
Putrescine 5,2
Agmatine 65,8
AGUA 28,2
Tyramine 26,7
Putrescine 28,7
Agmatine 90,2
ATUN CRUDO
0
25
HISTAMINA
(mg/kg)
COMPUESTOS REACCIÓN
CRUZADA (1000 ppm)RESULTADOS (mg/kg)
AGUA 4,2
Tyramine 4,2
Putrescine 5,8
Agmatine 52,7
AGUA 28,9
Tyramine 28,2
Putrescine 29,8
Agmatine 77,1
0
25
ATÚN EN ACEITE
HISTAMINA
(mg/kg)
COMPUESTOS REACCIÓN
CRUZADA (1000 ppm)RESULTADOS (mg/kg)
AGUA 5,1
Tyramine 4,8
Putrescine 4,9
Agmatine 56,2
AGUA 28,3
Tyramine 29,7
Putrescine 29,0
Agmatine 79,6
SARDINA FRESCA
0
25
Los resultados obtenidos muestran que la agmatina causa interferencias con el kit y por tanto debe indicarse en las instrucciones del mismo que si las muestras contienen agmatina las medidas proporcionadas por el mismo no son adecuadas.
Definición: Relación que existe entre la concentración de un determinado analito y la respuesta proporcionada por el método. Descripción: Se evalúa la linealidad en el rango de 10 a 200 mg/kg, comprobando el coeficiente de regresión r2 y el Factor Respuesta/Concentración:
LINEALIDAD
HISTAMINA
(mg/kg)
COMPUESTOS
REACCIÓN CRUZADA
(1000 ppm)
RESULTADOS (mg/kg)
AGUA 4,8
Tyramine 4,2
Putrescine 4,3
Agmatine 61,2
AGUA 30,1
Tyramine 30,5
Putrescine 30,8
Agmatine 85,9
0
25
SARDINA EN ACEITE
HISTAMINA
(mg/kg)
COMPUESTOS REACCIÓN
CRUZADA (1000 ppm)RESULTADOS (mg/kg)
AGUA 3,6
Tyramine 4,0
Putrescine 4,8
Agmatine 51,6
AGUA 28,5
Tyramine 29,2
Putrescine 30,7
Agmatine 75,1
0
25
SEMICONSERVA ANCHOA
Conclusión: Se observó que la recta es lineal en el intervalo de 10 a 200 mg/kg presentando un r2 de 0,9999 y que cumple los criterios factor respuesta/concentración establecidos.
10,03
10,03
9,86
9,80
50,89
50,61
50,67
50,67
99,50
99,15
99,50
99,55
150,85
150,33
150,33
150,91
199,16
198,30
199,62
198,59
% FR
99
100
99
101
99
0,99
1,00
0,99
FR
0,99
1,01
150
200
100
Concentración
patrón de
histamina
10
50
Respuesta
media
Respuesta
9,93
50,71
99,42
150,61
198,92
Valor obtenido Criterio de aceptabilidad
Se calcula el coeficiente de regresión lineal (r2) y el factor respuesta/concentración en cada nivel de concentración entre 10 y 200 mg/kg.
r2: 0,9999
Factor Respuesta / Concentración:
Ver siguiente tabla
r2 ≥ 0,99
Factor Respuesta / Concentración:
90- 110 % (Sólo un punto podrá desviarse de este criterio, y tendrá que cumplir el
intervalo máximo de 80-115 %)
Definición: La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Descripción: Se obtiene mediante el estudio de recuperaciones, en todo el rango de trabajo, desde 10 hasta 200 mg/kg, de modo que en cada nivel de concentración se analizaron las matrices de estudio. Se considera el método exacto si la recuperación media en todos los niveles de concentración cumple los criterios establecidos por la AOAC.
EXACTITUD
RESULTADOS EXACTITUD
RECUPERACIÓN
VALOR DE REFERENCIA
(mg/kg) MATRIZ Nº Réplicas
% REC. MEDIO
CRITERIO ¿se acepta?
10 ATÚN FRESCO 5 100 80-110 SI
50 ATÚN FRESCO 5 103 80-110 SI
100 ATÚN FRESCO 5 101 90-107 SI
150 ATÚN FRESCO 5 100 90-107 SI
200 ATÚN FRESCO 5 100 90-107 SI
10 ATÚN AL NATURAL 5 108 80-110 SI
50 ATÚN AL NATURAL 5 105 80-110 SI
100 ATÚN AL NATURAL 5 100 90-107 SI
150 ATÚN AL NATURAL 5 99 90-107 SI
200 ATÚN AL NATURAL 5 101 90-107 SI
10 ATÚN EN ACEITE 5 100 80-110 SI
50 ATÚN EN ACEITE 5 103 80-110 SI
100 ATÚN EN ACEITE 5 101 90-107 SI
150 ATÚN EN ACEITE 5 100 90-107 SI
200 ATÚN EN ACEITE 5 100 90-107 SI
VALOR DE REFERENCIA
(mg/kg) MATRIZ Nº Réplicas
% REC. MEDIO
CRITERIO ¿se acepta?
10 SARDINA FRESCA 5 100 80-110 SI
50 SARDINA FRESCA 5 103 80-110 SI
100 SARDINA FRESCA 5 101 90-107 SI
150 SARDINA FRESCA 5 100 90-107 SI
200 SARDINA FRESCA 5 100 90-107 SI
10 SARDINA EN ACEITE 5 98 80-110 SI
50 SARDINA EN ACEITE 5 98 80-110 SI
100 SARDINA EN ACEITE 5 94 90-107 SI
150 SARDINA EN ACEITE 5 94 90-107 SI
200 SARDINA EN ACEITE 5 98 90-107 SI
10 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 98 80-110 SI
50 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 103 80-110 SI
100 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 98 90-107 SI
150 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 96 90-107 SI
200 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 97 90-107 SI
MATERIALES DE REFERENCIA
ORGANIZADOR MATRIZ REFERENCIA VALOR
ASIGNADO (mg/kg)
RESULTADO BIOSYSTEMS
(mg/kg) ¿se acepta?
FAPAS CANNED FISH TET040RM 16.6 ± 0.9 16.4 SI
FAPAS CANNED FISH 27176 216
(186-247) 204 SI
INTERLABORATORIO
ORGANIZADOR MATRIZ REFERENCIA Z SCORE ¿se acepta?
FAPAS CANNED FISH FOOD CHEMISTRY
PROFICIENCY TEST 27189 0.6 SI
Conclusiones: El método se considera exacto en el rango de trabajo desde 10 a 200 mg/kg, en todas las matrices objeto de ensayo (atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite y semiconserva de anchoa), de acuerdo a los intervalos de recuperación aceptables establecidos por la AOAC. Asimismo, la participación en ejercicios intercomparativos y la medición de materiales de referencia arrojan resultados satisfactorios.
Definición: Grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos en condiciones predeterminadas. Descripción: La precisión se suele expresar como imprecisión mediante el cálculo de desviaciones estándar relativas calculadas y las desviaciones relativas estándar de Horwitz.
PRECISIÓN
PLANIFICACIÓN Y RESULTADOS PRECISIÓN
RDS
VALOR DE REFERENCIA
(mg/kg) MATRIZ
Nº Réplicas
RSDCALCULADA RSDHorwitz CRITERIO ¿se
acepta?
10 ATÚN FRESCO 5 7.81 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 ATÚN FRESCO 5 3.16 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 ATÚN FRESCO 5 3.96 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 ATÚN FRESCO 5 2.83 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 ATÚN FRESCO 5 5.04 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
10 ATÚN AL NATURAL 5 4.78 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 ATÚN AL NATURAL 5 3.00 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 ATÚN AL NATURAL 5 2.04 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 ATÚN AL NATURAL 5 0.97 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 ATÚN AL NATURAL 5 1.22 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
10 ATÚN EN ACEITE 5 0.90 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 ATÚN EN ACEITE 5 1.26 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 ATÚN EN ACEITE 5 1.46 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 ATÚN EN ACEITE 5 1.07 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 ATÚN EN ACEITE 5 0.90 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
10 SARDINA FRESCA 5 4.95 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 SARDINA FRESCA 5 1.76 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 SARDINA FRESCA 5 2.59 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 SARDINA FRESCA 5 1.78 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 SARDINA FRESCA 5 0.91 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
Conclusiones: El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 10 a 200 mg/kg en todas las matrices evaluadas: atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite y semiconserva de anchoa.
VALOR DE REFERENCIA
(mg/kg)
MATRIZ Nº
Réplicas RSDCALCULADA RSDHorwitz CRITERIO
¿se acepta?
10 SARDINA EN ACEITE 5 3.83 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 SARDINA EN ACEITE 5 1.89 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 SARDINA EN ACEITE 5 1.00 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 SARDINA EN ACEITE 5 1.39 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 SARDINA EN ACEITE 5 1.36 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
10 SEMICONSERVA DE
ANCHOA 5 4.26 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 SEMICONSERVA DE
ANCHOA 5 3.44 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 SEMICONSERVA DE
ANCHOA 5 1.46 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 SEMICONSERVA DE
ANCHOA 5 4.02 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 SEMICONSERVA DE
ANCHOA 5 3.37 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
Definición: Susceptibilidad de un método analítico a los cambios de las condiciones experimentales, como puede ser el tipo de matriz que se analice y que pueden expresarse en forma de lista de los materiales de la muestra, los analitos, las condiciones de almacenamiento o las condiciones ambientales o de preparación de la muestra en las que puede aplicarse el método tal cual o con determinadas modificaciones menores. Descripción: La idea fundamental para la prueba de la robustez es introducir deliberadamente pequeñas variaciones en el método y observar los efectos. Si los resultados se alteran, los usuarios deben ser advertidos de no desviarse de las condiciones especificadas en el manual de instrucciones. Para esta determinación se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluación de la robustez de un método químico analítico. Para ello a una muestra de conserva de atún al natural adicionada con 50 mg/kg de histamina se le varió el volumen de extracción (20, 25 y 30 ml), el tiempo de medida tras la extracción (10, 20 y 30 minutos) así como el tiempo de almacenamiento de la muestra antes del análisis a temperatura ambiental (30 minutos, 1 hora y 2 horas).
CONSERVA DE ATÚN AL NATURAL CON 50 PPM DE HISTAMINA
PARÁMETROS DE LA ROBUSTEZ VALOR 1 VALOR 2 VALOR 3
A. VOLUMEN DE EXTRACCIÓN 20 ml 25 ml 30 ml
B. TIEMPO DE EXTRACCIÓN 10 min 20 min 30 min
C. TIEMPO ALMACENAMIENTO MUESTRA ANTES DEL ANÁLISIS A TEMPERATURA AMBIENTAL
30 min 1 hora 2 horas
ROBUSTEZ
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A: 20 ml
a: 30 ml
a´: 25 ml
A A A A a a a a a´
B: 10 min
b: 20 min
b´: 30 min
B B b´ b´ B B b´ b´ b
C: 30 minutos
c: 1 hora
c´: 2 horas
C c´ C c´ C c´ C c´ c
(mg/kg) 47,5 46,6 47,2 48,8 50,3 51,5 47,8 48,2 48
Valor del factor FCombinación de las determinaciones
Conclusión: El método se considera robusto, pues la desviación estándar de las diferencias es, en todas las combinaciones, menor que la desviación estándar del método a ese nivel de concentración en la matriz de atún al natural evaluada.
Comparación de Variables
(X-x)
Diferencias
promedio
(Di)
SD de las
diferencias
(SDi)
SD del método en
50 mg/kg para
atún al natural
Criterio de
aceptaciónCumplimiento
Δ A, a 2,1 1,1 SI
Δ A, a´ 0,9 0,5 SI
Δ a, a´ 1,6 0,8 SI
Δ B, b 1,9 1,0 SI
Δ b,b´ 0,5 0,3 SI
Δ C, c 0,9 0,5 SI
Δ B, b´ 2,0 1,0 SI
Δ C, c´ 1,8 1,0 SI
Δ c, c´ 1,5 0,8 SI
1,6 SDi ≤ SD50
Definición: Límite de detección: concentración más baja de analito que se puede detectar en la muestra pero no necesariamente cuantificar con las condiciones experimentalmente establecidas. Límite de cuantificación: menor concentración del analito que puede determinarse con precisión y exactitud aceptables en una muestra, bajo las condiciones del método utilizado (verificado experimentalmente). Descripción: Límite de detección: Para el cálculo de LOD se aplica la siguiente fórmula:
LOD =
Donde: es el valor medio analítico de la matriz sin adicionar y es la interjección de
la recta; y m es la pendiente de la recta. Límite de cuantificación: se estima mediante la fórmula 3xLOD. Se verifica posteriormente el límite de cuantificación realizando 10 réplicas en cada matriz. Los resultados obtenidos han sido los siguientes:
SARDINA ACEITE
SEMICONSERVA ANCHOA
ATUN NATURAL
ATUN ACEITE
ATUN CRUDO
SARDINA FRESCA
LOD = 5,77 2,85 4,28 4,58 0,29 7,01
LOQ = 3 x LOD 17 8,5 13 14 0,9 21
Se verificaron los límites de cuantificación en todos los casos a 10 mg/kg obteniéndose los siguientes resultados:
0Xbs
LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN
MATRIZ
VALOR DE
REFERENCIA
(mg/Kg)
RESULTADO
(mg/kg)
MUESTRA SIN
ADICIÓN
(mg/Kg)
RESULTADO
FINALMEDIA % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
8,97 8,47
8,85 8,35
9,61 9,11
8,97 8,47
9,35 8,85
9,35 8,85
9,10 8,60
9,86 9,36
8,85 8,35
9,10 8,60
MATRIZ
VALOR DE
REFERENCIA
(mg/Kg)
RESULTADO
(mg/kg)
MUESTRA SIN
ADICIÓN
(mg/Kg)
RESULTADO
FINALAVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
11,08 9,87
11,00 9,79
10,97 9,76
11,03 9,82
11,30 10,09
10,78 9,57
10,94 9,73
11,19 9,98
10,82 9,61
10,89 9,68
MATRIZ
VALOR DE
REFERENCIA
(mg/Kg)
RESULTADO
(mg/kg)
MUESTRA SIN
ADICIÓN
(mg/Kg)
RESULTADO
FINALAVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
12,39 9,36
13,12 10,09
12,88 9,85
12,89 9,86
12,71 9,68
13,14 10,11
12,64 9,61
11,91 8,88
12,64 9,61
12,28 9,25
MATRIZ
VALOR DE
REFERENCIA
(mg/Kg)
RESULTADO
(mg/kg)
MUESTRA SIN
ADICIÓN
(mg/Kg)
RESULTADO
FINALAVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
17,34 11,40
17,82 11,88
16,37 10,43
15,41 9,47
15,89 9,95
15,41 9,47
15,65 9,71
16,62 10,68
16,13 10,19
15,65 9,71
MATRIZ
VALOR DE
REFERENCIA
(mg/Kg)
RESULTADO
(mg/kg)
MUESTRA SIN
ADICIÓN
(mg/Kg)
RESULTADO
FINALAVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
14,63 9,78
14,82 9,97
14,79 9,94
14,73 9,88
14,53 9,68
14,79 9,94
14,59 9,74
14,29 9,44
14,63 9,78
14,22 9,37
MATRIZ
VALOR DE
REFERENCIA
(mg/Kg)
RESULTADO
(mg/kg)
MUESTRA SIN
ADICIÓN
(mg/Kg)
RESULTADO
FINALAVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
12,82 9,82
12,10 8,10
11,77 8,77
12,52 9,52
11,92 8,92
12,22 8,22
12,62 9,62
12,54 9,54
11,92 8,92
12,31 9,31
0,21 2,11
SEMICONSERVA DE
ANCHOA10 3,00 9,1 91 -1 0,59 6,51
SARDINA EN ACEITE 10 4,85 9,8 98 0
0,38 3,97
SARDINA FRESCA 10 5,94 10,3 103 0 0,82 7,97
ATÚN EN ACEITE 10 3,03 9,6 87 0
0,34 3,86
ATÚN AL NATURAL 10 1,21 9,8 98 0 0,16 1,65
ATÚN FRESCO 10 0,50 8,7 87 -1
Conclusión: Los límites de detección obtenidos han sido los siguientes: Atún crudo: 0,29 mg/kg Atún al natural: 4,28 mg/kg Atún en aceite: 4,58 mg/kg Sardina fresca: 7,01 mg/kg Sardina en aceite: 5,77 mg/kg Semiconserva de anchoa: 2,85 mg/kg Se verificó que los límites de cuantificación obtenidos en todas las matrices de estudio han sido de 10 mg/kg y se observó que en todos los casos las RSD son menores del 10 %.
EVALUACIÓN VALIDACIÓN: Fecha: 25/01/17
RESUMEN Parámetro Características del método
Rango validado 10-200 mg/kg
Exactitud Aceptable en todo el rango
Precisión RSDCALC≤ RSDHOR
Selectividad / Especificidad Confirmación de la selectividad y especificidad con la
experiencia (interferencia con agmatina)
Robustez Método robusto
Linealidad Método lineal
Límite de cuantificación 10 mg/kg
Validado por: Validación Firma y Fecha
Nombre: Vanesa Losada Iglesias Cargo: Técnico especialista área de Asistencia Técnica
Aceptada
Rechazada
25/01/2017
ANEXO I
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN (EXACTITUD Y PRECISIÓN)
CRITERIOS DE EXACTITUD: Tabla de intervalos de recuperación aceptables
Intervalos de recuperaciones (%)
(AOAC Peer Verified Methods)
Analito (%)
Analito ratio
Unidades Media recomendada
(%)
100 1 100% 98-102
≥10 10-1 10% 98-102
≥1 10-2 1% 97-103
≥0.1 10-3 0.1% 95-105
0.01 10-4 100 ppm 90-107
0.001 10-5 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 70-110
0.0000001 10-9 1 ppb 70-110
CRITERIOS DE PRECISIÓN: La precisión de un método se evalúa comparando el valor obtenido de RSD con el valor de referencia (RSD de Horwitz) que dependerá del nivel de concentración y se calcula según las ecuaciones descritas a continuación:
cRSD Horwitz
Horwitz
100* ; para el cálculo de la Horwitz
Para concentraciones <120 ppb; mr
c22,0Horwitz
Para concentraciones entre 120 ppb y 13.8%; mr
cHorwitz
8495,002,0
Para concentraciones > 13.8%; mr
cHorwitz
5,001,0
ANEXO II
CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE
INCERTIDUMBRE Determinación de histamina
CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE TOTAL
CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE
Contribución global
(Factor de cobertura K=2)
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
CONCENTRACIÓN
(g/100 g)
INCERTIDUMBRE
EXPANDIDA
(%)
10 15
50 15
100 15
150 15
200 150,146 29,1
0,146 X C
Siendo C el valor de la concentración obtenido en el ensayo
INCERTIDUMBRE
(contribución global)
INCERTIDUMBRE
EXPANDIDA
0,146 1,5
0,146 21,8
0,073 0,146
INCERTIDUMBRE COMBINADA Y EXPANDIDA
0,146 7,3
0,146 14,6
U (R)
Fuentes de incertidumbre Incertidumbre estándar (U)
0,068
U (P) 0,026
INCERTIDUMBRE EXPANDIDA
(Contribución global)
I
INCERTIDUMBRE COMBINADA
(Contribución global)
U
INCERTIDUMBRE DEL VALOR
OBTENIDO
I
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,1
0,1
0,1
Contribuciones a la incertidumbre
Precisión
Exactitud
22 )P(URUU
KUI