SeenfatizalarecomendaciónquetodaslasmuestrasdeinfluenzatipoAnosubtificablesseanenviadasdeinmediatoparaeldiagnósticoylacaracterizaciónadicionalaunodeloscincoCentrosColaboradoresdelaOMSparalagripe.
21demayodel2009EstedocumentopresentainformaciónsobrelosmediosdediagnósticodisponiblesalafechaindicadaparaelvirusdelainfluenzatipoAhumana(H1N1)A/California/4/2009yvirussimilares.Lainformaciónsobreeldiagnósticoseactualizarácuándoéstaseencuentredisponible.Muestras Lasmuestrasmásapropiadassegúnlorecomendadoporlasinvestigacionesdelainfluenzaestacionalsonaquellasdeltractorespiratoriosuperior.Lasmuestrasdebentomarsedelosorificiosnasalesprofundos(hisoponasal),nasofaringe(hisoponasofaríngeo),aspiradonasofaríngeo,gargantaoaspiradobronquial.Todavíanosesabequémuestraclínicaproporcionaelmejorrendimientoeneldiagnóstico.La(s)persona(s)quetome(n)lamuestradebe(n)cumplirconlasprecaucionesapropiadasdetomademuestrasyaquepuede(n)exponerseasecrecionesrespiratoriasdelospacientes.Hastaahora,noexisteningunainformaciónsobreelvalordediagnósticodelasmuestrasnorespiratorias,porejemplo,muestrasdeheces.Muestrasdesueroagudoyconvalecientedebenusarseparaladeteccióndelostítulosascendentesdeanticuerpo.Pruebas de laboratorio Diagnostico molecular LosmediosdediagnosticomolecularsonactualmenteelmétodopreferidoparalainfluenzaA(H1N1)linajeporcino(swl)virus(A/California/4/2009yvirussimilares).Elusodeensayoscondiferentesgenesblancosesmásapropiadoparalaidentificacióndeestevirus.Lossiguientesgenesblancossonimportantes:genmatrizdelaInfluenzadetipoA;elgendelahemaglutininaespecíficodelvirusdelaInfluenzaA(H1N1)swlyelgendelahemaglutininaespecíficodelaInfluenzaestacionalAH1/H3yotrossubtipos.
Información de la OMS para diagnóstico de laboratorio del nuevo virus de la Influenza A (H1N1) en seres humanos
Lossiguientesprotocolosestánactualmentedisponibles:PCRconvencionalespecíficoparainfluenzatipoAyRT‐PCRentiemporeal(véaseanexos1y2);RT‐PCRentiemporealdelosCDC(rRT‐PCR)paraladetecciónycaracterizacióndelainfluenzatipoA(H1N1)(versión2009)1ElanálisissecuencialdelproductodelPCRdelgenmatrizdelainfluenzatipoAusandoloscebadoresdelosprotocolosdelaOMS(véaseanexo1)diferenciaráentregenesMdelinajeporcinoyvirusH1N1estacionales.Sinembargo,unanálisisadicionaldebeserrealizadoparaconfirmarelorigendelvirus.Enestemomento,laspruebasdeRT‐PCRconvencionalestánsiendoevaluadas.Unaactualizaciónsepublicarácuandoestedisponible.Aislamiento y tipificación del virus mediante la inhibición de hemaglutinina o la inmunofluorescencia: SepuedenutilizarlosprotocolosvigentesparaelaislamientodevirusdelainfluenzaestacionalusandocélulasdeMDCKeinoculación devirusenhuevosembrionados,aunquesusensibilidadestáaúnpendientededeterminarse(véaseseccióndebioseguridadabajo).Loseritrocitosdepavos,pollos,conejillosdeindiasyhumanosseaglutinaránconelvirusdelainfluenzaA(H1N1)swl.LosanticuerpospoliclonalesespecíficosparaelsubtipoH1delosvirusdelainfluenzaestacionaldelkitdelaOMSnoreaccionaránconlapruebadeinhibicióndehemaglutinación(HAI)delvirusactualdelainfluenzaA(H1N1).LosresultadosobtenidosutilizandolosanticuerposmonoclonalesH1delkitdelaOMSnodebetomarsecomocomprobaciónconcluyenteyserecomiendarealizarunaverificaciónadicional.Pruebas de inmunofluorescencia rápida: Lasensibilidadyespecificidaddelaspruebasdeinmunofluorescenciarápidaenellugardeatención,diseñadasparaladeteccióndirectadelosvirusdelainfluenzatipoAsonactualmentedesconocidas.Unaactualizaciónsepublicarácuándoexistaevidenciadisponible.DeberecalcarsequeestaspruebasnodiferenciaránlainfluenzaestacionaldeladelvirusdeinfluenzadetipoA(H1N1)swl.
1 http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html
Serología SeesperaquelaspruebasdeHAIylasreaccionesdemicro‐neutralizaciónempleandoelvirusdelainfluenzaA(H1N1)swlpuedandetectarrespuestasdeanticuerposdespuésdelainfección.Interpretación de los resultados de laboratorio
• PCR:UnamuestraseconsiderapositivasilosresultadosdelaspruebasusandodosdiferentesblancosdePCR(porejemplo,iniciadoresespecíficosparagenMygenporcinodehemaglutininaH1)sonpositivosperoelPCRparavirushumanoH1+H3esnegativo.SielPCRentiemporeal(RT‐PCR)parahemaglutininamúltiple(HA)(esdecir,H1,H3yH1delinajeporcino)daresultadospositivosenlamismamuestra,laposibilidaddecontaminacióndePCRdebeserprimeramenteexcluidaalrepetirelprocedimientodePCRusandoARNnuevoextraídodelamuestraoriginaloARNextraídodeotramuestra.SiserepitenlosresultadospositivosparalosblancosmúltiplesdeHA,existeentonceslaposibilidaddecoinfección,quedebeconfirmarsemediantesecuenciaciónocultivoviral.ElAnexo3muestraundiagramadeflujoparafacilitarlainterpretacióndelosresultadosdePCR.
• RT‐PCR en tiempo real de los CDC:Losresultadosdebeninterpretarsesegúnlo
descritoenelmanualdepruebasdeH1N1entiemporealdelosCDC.1
• Un resultado de PCR negativo no permite descartar que la persona pueda estar infectada por el virus de la influenza A (H1N1):Losresultadosdebeninterpretarseconjuntamenteconlainformaciónclínicayepidemiológicadisponible.LasmuestrasdelospacientescuyosresultadosdePCRsonnegativosperoparaquieneshayunaaltasospechadeinfecciónconH1N1debeninvestigarsemásafondoyseranalizadasporotrosmétodoscomoelcultivooserologíaviral,paradescartarinfecciónporinfluenzaA(H1N1)swl(véasediagramadeflujoenAnexo3).
• Serología:Unincrementocuádrupleenlosanticuerposneutralizantes
específicosdelvirusdelainfluenzaA(H1N1)indicainfecciónrecienteconelvirus.
• Secuenciación:enestaetapa,lasecuenciacióndealmenosunodelosblancos
esesencialparalaconfirmaciónporPCRconvencional.
• Aislamiento del virus:LaidentificaciónytipificacióndelcultivodevirusdeinfluenzapuedelevarseacaboporPCR,porlatécnicadelanticuerpofluorescenteindirecto(IFA),lapruebausandoanticuerposmonoclonales
específicosdeNP,oelanálisisdeHAyelanálisisantigénico(subtipificación)porHAIusandoantisuerosdereferenciaseleccionados.
Referencia para la confirmación y caracterización adicionales: AloslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddediagnósticodelvirusdelainfluenzaAselesrecomiendaenviarlasmuestrasrepresentativasdeloscasossospechososdeinfluenzaA(H1N1),deacuerdoaladefinicióndecasodelaOMS2,aunodelosCentrosColaboradoresdelaOMSparainfluenza(WHOCCs).LasmuestrasconresultadosdelaboratoriopositivasparainfluenzaAperonosubtipificables(esdecir,negativasparainfluenzaA(H1)yA(H3));seconsiderancomonoconfirmadasdeacuerdoaloscriteriosdelaOMS)debenremitirseaunodelosWHOCCsparalaconfirmación.Loslaboratoriosquenocuentenconcapacidaddeaislamientodelvirus(oquenotenganelnivelnecesariodemedidasdebioseguridad)debenremitirlasmuestrasacualquieradelosWHOCCs.EnadiciónalosreglamentospertinentesdeIATA,sedebenseguirlasnormasordinariasdealmacenamiento,envasadoyenvíodemuestrasdeinfluenza.Bioseguridad EltrabajodelaboratorioconmuestrasclínicasdepacientesconsideradoscomocasossospechososdeinfecciónporvirusdeinfluenzaA(H1N1)swlsedebenrealizaraplicandolasnormasyprocedimientosdeniveldebioseguridad2utilizandoelequipodeprotecciónpersonalapropiado(PPE).Todamanipulacióndemuestrasdebehacersedentrodeunacabinadebioseguridadcertificada(BSC).VerManualdebioseguridadenellaboratoriodelaOMS,3.ªed.3Actualmente,elaislamientoviralrequieremayoresmedidasdebioseguridad.Paralasrecomendacionesespecíficasver:GestióndelosriesgosbiológicosenloslaboratoriosdondesemanipulanmuestrashumanasquecontienenopuedencontenerelvirusdelagripeA(H1N1)queestácausandolasactualesepidemiasinternacionales.4
2 http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/interim_guidance/en/index.html 3 http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/ 4 http://www.who.int/entity/csr/resources/publications/swineflu/Laboratorybioriskmanagement_es.pdf
Prueba de los algoritmos ElmétodogeneraldeladeteccióndevirusdelainfluenzaporPCR‐RTdebeconsiderarseenelcontextodelasituaciónnacional,porejemplo,cuántasmuestraspuedenprocesarse(producto),elblancoutilizadoparalasecuenciadelgenporPCR‐RT,ysiseutilizalacomprobaciónconcurrenteosecuencialdeM,NPygenesdeHAporPCR‐RT.Buenas prácticas de laboratorio Losprotocolosestándarparatodoslosprocedimientosdebenexistiryserrevisadosregularmente.Esfundamentalasegurarsequelosreactivosrecomendadosseusenymanejenadecuadamenteyaquelasreaccionessoncomplejasyproblemasinclusosóloconunreactivopuedentenerefectossignificativossobrelosresultadosobtenidos.Validación Todoslosprotocolosdebenservalidadosencadaunodeloslaboratoriosparaevaluarquesuespecificidadysensibilidadalusarlosmismoscontrolesencadarondaseanadecuadas.Aseguramiento de la calidad Losprotocolosdeaseguramientodelacalidadybuenasprácticasdelaboratoriodebenexistir.LaparticipaciónenlosejerciciosdeevaluacióndelosCentrosNacionalesdeInfluenza(Proyectodeevaluaciónexternadelacalidad)esaltamenterecomendadaparaconfirmarqueloslaboratoriosestánalcanzandounniveladecuadodesensibilidadyespecificidadensuspruebas.Capacitación del personal Lafamiliaridaddelpersonalconlosprotocolosyexperienciaenlainterpretacióncorrectadelosresultadossonpiedrasangularesparalaejecuciónexitosadelaspruebasdiagnósticas.Instalaciones y áreas de manejo Debenexistirinstalacionesadecuadasparaelmanejodemuestrasyreactivos(incluyendocadenasdefrío)conunaseparaciónapropiadaparalasdiferentesetapasdeRT‐PCRafindeprevenirlacontaminacióncruzada.Lasinstalacionesyelequipodebencumplirconelniveldebioseguridadapropiado.ElRT‐PCRdeberealizarseenunespacioseparadodelusadoparalastécnicasdeaislamientodevirus.
Equipo Elequipodeequipodebeusarseymantenersedeacuerdoalasrecomendacionesdelfabricante.Anexo 1: Análisis de RT‐PCR convencional del gen matriz de los virus de Influenza de tipo A Protocolo Convencional de RT‐PCR 5 Acontinuaciónsepresentanlosprotocolosycebadores(oprimers)dePCRconvencionalyelectroforesisengeldeproductosparadetectarvirusdeinfluenzatipoAenmuestrasdesereshumanos.EstosprotocoloshandemostradoserampliamenteefectivosparalaidentificacióndelvirusdeinfluenzadetipoAcuandoselesutilizaconlosreactivosycebadoresindicados.SerecomiendaqueloslaboratoriosquetengandudassobrelaidentificacióndelosvirusactualmentecirculantescontactaraunodelosLaboratoriosdeReferenciaH5delaOMS6oaunodeWHOCCsparalainfluenza7afinderecibirayudaparalaidentificacióndeloscebadoresóptimosparasuusoMateriales requeridos • QIAamp®ViralRNAMiniKit(QIAGEN,Cat#52904.Otroskitsdeextracciónpueden
serusadosdespuésdehabersidosujetosaunaevaluaciónapropiada).• OneStepRT‐PCRKit(QIAGEN,,Cat#210212)• InhibidordeRNase20U/μl（AppliedBiosystems,Cat#N8080119）• Aguadestilada(libredeRNase)• Ethanol(96–100%)• Microcentrífuga(ajustablehasta13000rpm)• Pipetasajustables(10,20,200,and100μl）• Puntasparapipetaestériles(libresdeRNase)conbarreradeaerosol• Vortex• Tubosparamicrocentrífuga（0.2,1.5ml）• Termociclador(equipodePCR)• Conjuntodecebadores• Controlpositivo(estepuedesolicitarsealWHOCCenlosCDCdeAtlanta,EEUU)
5 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China (WHO H5 Reference Laboratory). 6 http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/referencelabs/en/ 7 http://www.who.int/csr/disease/influenza/collabcentres/en/
Cebadores Gen:MVirusInfluenzaASecuenciasdecebadoresM30F2/08: 5`‐ATGAGYCTTYTAACCGAGGTCGAAACG‐3`M264R3/08: 5`‐TGGACAAANCGTCTACGCTGCAG‐3`Tamañoesperadodelproducto244bp(referencia:NIID8) Procedimiento
1. ExtraerARNviraldelamuestraclínicaconelMiniKitQIAampViralRNAokitdeextracciónequivalente,deacuerdoalasinstruccionesdelfabricante.
2. RealiceelRT‐PCRdeunaetapa.• Sacarlosreactivosdesualmacén,déjelosdescongelaratemperatura
ambiente.Unavezdescongelados,manténgalosenhielo.• Prepararlamezclamaestra(operadaenhielo)• Agregarlosiguienteauntuboparacentrífugaymezclarlobien
agitándoloparaarribayparabajo10veces,(Nota:Afindeevitardiferenciaslocalizadasenlaconcentracióndesales,esmuyimportantemezclarlassolucionesantesdesuuso).
Reacción sin solución Q Aguadestilada(sinRNasa)9.5μlAmortiguador5xQIAGENRT‐PCR5.0μlMezcladedNTP1.0μlCebadorsentido(+)(10μM)1.5μlCebadorantisentido(‐)(10μM)1.5μlMezclaenzimática1.0μlInhibidordelaRNasa(20U/μl)0.5μlVolumentotal20.0μl/pruebaDistribuir20μldelamezclamaestraencadatubodereaccióndePCR.Añadir5μldeRNAdelamuestraalamezclamaestra.Paralasreaccionesdecontrol,usar5 μldeaguadestiladalibredeRNaseparacontrolnegativoy5μldelosRNAviralesadecuadosparacontrolpositivo.Programareltermocicladordeacuerdoalascondicionesdetermociclado.IniciarelprogramadeRT‐PCRmientraslostubosdePCRseencuentrenaúnenelhielo.Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzadolos50˚C.LuegocolocarlostubosdePCReneltermociclador.
8 Primers designed by Laboratory at National Institute of Infectious Diseases (NIID), Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza)
Condiciones de ciclado de la temperatura para PCR Transcripcióninversa30min,50°CActivacióndelaPCRinicial15min,95°CCicladoentresetapasDesnaturalización30seg,94°CTemplado30seg,50°CExtensión1min,72°CNúmerodeciclos45Extensiónfinal10min,72°CMantener4°C3. Electroforesis en gel de agarosa de productos de RT‐PCR Prepararelgeldeagarosa,cargarlosproductosdePCRyelmarcadordepesomolecular,ejecutardeacuerdoconlosprotocolosestándar.Visualizarlapresenciadelmarcadorconluzultravioleta.Materiales requeridos • Bandejaparageldeagarosaycámaradeelectroforesis• Suministroeléctricoyelectrodos• CajadeluzUV(302nm)• CámaraypelículaPolaroidocomputadoraconectadaalacámara• Pipetasajustables• Geldeagarosaal2%en1×TAE• Amortiguador1×TAE• Bromurodeetidio(10mg/ml)• 6xSoluciónamortiguadoraconcargadegel(GLB)Procedimiento A)Fundirungeldeagarosa:I. Colocarunabandejaparafundicióndelgeldentrodeunabaseparafundiciónde
gel.Inserteunpeineynivelelabase.II. Prepararagarosaal2%pesando4gdepolvodeagarosaydisuélvalaen200ml1×
amortiguadorTAE.Disuelvaelagarcalentándoloenhornodemicroondas.III. Enfriarelagarderretidohastaaproximadamente60°C,yluegoagregue10μlde
bromurodeetidio.IV. Verterlaagarosaderretidaenunabandejaparafundicióndegel.V. Dejarqueelgelsesolidifiqueatemperaturaambiente.VI. Retirarelpeinedelmarco.
VII. Colocarlabandejadentrodelacámaradeelectroforesisconlasfosasdelladodeloscátodos.
VIII. Llenarlacámaraamortiguadoracon1×TAEaunnivelquepuedacubrirlapartesuperiordelgel.
B)Cargadelasmuestras:I. Agregar5μldeGLBdePCR.II. Cargarelmarcadordepesomolecularenlafosadelgeldeagarosa.III. Pipetear15μldelproductodePCR/GLBenelgel.IV. Cerrarlatapadelacámarayconecteloselectrodos.Correrelgela100Vdurante
30–35min.V. VisualizarlapresenciadebandasdemarcadoresyproductosdePCRconluzUV.VI. Documentarlaimagendelgelconunafotografía.Interpretación de los resultados EltamañodelosproductosdePCRobtenidosdebecompararseconeltamañoesperadodelosproductos.Silapruebaseejecutasinuncontrolpositivo,losproductosdebenserconfirmadosmediantesecuenciaciónycomparaciónconlassecuenciasdisponibles.Anexo 2: Análisis de RT‐PCR en tiempo real de la matriz de los virus de Influenza de tipo A LaRTPCRentiemporealpresentadiferentesdesafíosencomparaciónconlaRT‐PCRconvencional.AdemásdelasconsideracionessobreRT‐PCRdescritasenelAnexo1,lasconsideracionesespecíficasparaRT‐PCRentiemporealincluyen:• Garantizarqueseusenymanipulencorrectamentelosequipos,elsoftwareylos
reactivosparafluorescenciaadecuados.• Garantizarlacapacitaciónadecuadadelpersonalparalainterpretacióndelos
resultados(esesenciallaexperienciaparareconocerlosverdaderospositivos,interpretacióndeloscontroles/valorCtyfluorescenciaaberrante,etc.).
• Parahacerdeterminacionescuantitativas,esesenciallavalidaciónenellaboratorioylaoptimizacióndelasreacciones.
• Haypocaprobabilidaddecontaminacióncuandosedescartanlasreaccionesdespuésderealizarlaspruebas.Sinembargo,muchoslaboratorioshacenanálisispostreacciónadicionales(porej.,polimorfismodelongituddefragmentosderestricciónusandogeles,secuenciación)quepuedenreintroducirlacontaminación.
Protocolo de RT‐PCR en tiempo real9 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicosegúnsedescribeenelAnexo1:AnálisisdeRT‐PCRconvencionalMateriales requeridos TranscripciónInversaAmortiguadorI10XPCRcon15mMMgCl(AppliedBiosystems)Hexámeroaleatorio50μM(AppliedBiosystems)TranscriptasaInversadeMuLV50U/μl(AppliedBiosystems)InhibidordelaRNasa20U/μl(AppliedBiosystems)PCRentiemporealKitLightCycler®–FastStart™DNAMasterHybProbes(Roche)Cebadoresymezcladesondas:AgregarigualvolumendelossiguientescomponentesparaprepararloscebadoresylamezcladesondasparaH5ygenMCebadoresysondasVirusdeinfluenzatipoASecuenciadecebadoresFLUAM‐1F:5'‐AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA‐3'(10μmol/l)FLUAM‐2F:5'‐CATTGGGATCTTGCACTTGATATT‐3'(10μmol/l)FLUAM‐1R:5'‐CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC‐3'(10μmol/l)FLUAM‐2R:5'‐AAACCGTATTTAAGGCGACGATAA‐3'(10μmol/l)FLUA‐1P:5'‐(FAM)‐TTTGTGTTCACGCTCACCGT‐(TAMRA)‐3'(5μmol/l)FLUA‐2P:5'‐(FAM)‐TGGATTCTTGATCGTCTTTTCTTCAAATGCA‐(TAMRA)‐3'(5μmol/l)Elcebadoractivoylamezcladesondassepreparamezclandolos6reactivosenvolúmenesiguales.
9 Protocol provided by Virology Division, Centre for Health Protection, Hong Kong SAR, China, WHO H5 Reference Laboratory
Procedimiento 1.RealizarRTutilizandolosreactivosquesemuestranenlasiguientetablaylasinstrucciones1‐3alcalcedelatabla.
Reactivo Volumen(μl)porreacciónAmortiguador10xPCRIcon15mmol/lMgCl2 2Extra25mmol/lMgCl2 2.82.5mmol/ldNTPs 8Hemámeroaleatorio50μM 1InhibidordelaARNasa20U/μl 1TranscriptasaInversa50U/μl 1ARNextraído 4.2
I. AgitarenVortexycentrifugareltuboconlamezclabrevemente(aprox.3seg.)II. Mantenereltuboatemperaturaambientedurante10minutosyluegoincubara
42°Cporlomenosdurante15minutosIII. Incubareltuboa95°Cdurante5minutosyluegoenfriarenhielo.
2.RealizarPCRentiemporeal
I. Prepararlamezcladereacción“HotStart”pipeteandosuavemente60μldeSondasdeHibridaciónparaMezcladeReacciónLC‐FastStart™(frascoampolla1b)enelLC‐EnzimaFastStart™(frascoampolla1a).
II. Paracadamuestradepruebaycontrolespositivosynegativos,prepararlamezcladelreactivoconcebadoresymezcladesondasdeacuerdoconlosiguiente
Mezclamaestra:
Reactivo Volumen(μl)H2OgradoPCR 7.6MgCl2(25mmol/l) 2.4Cebadoresymezclaparasondas 3Mezclaparareacción“HotStart” 2Volumentotal 15Cadareacción:Mezclamaestra 15ADNc: 5
CondicionesdecicladodelatemperaturadePCR
Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)
No.deciclos
95 10:00 195 0:1056 0:1572 0:10
}50
40 0:30 1Protocolo de RT‐PCR en tiempo real10 ExtraerelARNviraldelespécimenclínicocomosedescribeenAnálisisdeRT‐PCRconvencionalMateriales requeridos • QIAGEN®QuantiTect,EquipodeSondaparaRT‐PCR(#204443):
o 2xQuantiTect®,MezclaMaestradeSondadeRT‐PCRo QuantiTect®,MezclaRTo AguasinRNasa
• InhibidordelaARNasa• Cebadores• SondaTaqMan®MGB• Equipo:SistemadeDeteccióndePCRentiemporealChromo‐4™(BioRad);
LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche)PCRentiemporealLaPCRentiemporealserealizamedianteRT‐PCRdeunsolopasousandounasondaTaqMan®Cebadoresysondas:Gen:TipoA(M)SecuenciasdecebadoresMP‐39‐67For 5'‐CCMAGGTCGAAACGTAYGTTCTCTCTATC‐3'(10μmol/l)MP‐183‐153Rev 5'‐TGACAGRATYGGTCTTGTCTTTAGCCAYTCCA‐3'(10μmol/l)
10 Protocol provided by National Institute of Infectious Diseases (NIID), Center for Influenza Virus Research, Tokyo, Japan (WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza).
SecuenciadesondasMP‐96‐75ProbeAs 5'(FAM)‐ATYTCGGCTTTGAGGGGGCCTG‐(MGB)‐3'(5pmol/μl)MezcladeReacción
Reactivo Volumen(μl)MezclaMaestraparaSondadeRT‐PCR2xQuantiTect® 12.5CebadorDirecto(10μM) 1.5CebadorInverso(10μM) 1.5SondaTaqMan®MGB(5pmol/μl) 0.5MezclaQuantiTect® 0.25AguasinRNasa 3.75Total 20Procedimiento
1) Distribuir20μldelamezcladereacciónencadaplacadereacciónparaRT‐PCR.
2) Agregar5μlARNdemuestraalamezcladereacción.Parareaccionesdecontrol,usar5μldeaguadestiladaparacontrolnegativo,y5μldeARNviralespositivosadecuadosparacontrolpositivo.
3) Programareltermocicladordeacuerdoconelprogramaquesedescribeacontinuación.
4) IniciarelprogramadeRT‐PCRentiemporealmientrasquelasplacasdereacciónparaRT‐PCRtodavíaestánenhielo.
5) Esperarhastaqueeltermocicladorhayaalcanzado50C.Luego,colocarlasplacasdereacciónparaRT‐PCReneltermociclador.
CondicionesdecicladodetemperaturadeRT‐PCR:SistemadedeteccióndePCRChromo‐4‐Real‐time(BioRad)
Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)
No.deciclos
50 30:00 195 15:00 194 0:1556 1:00
}45
CondicionesdecicladodetemperaturadeRT‐PCR:LingtCycler2(Roche)oLingtCycler480(Roche)
Temperatura(°C) Tiempo(minuto:segundo)
No.deciclos
50 30:00 195 15:00 194 0:15
(ramprate1.2oC/seg)56 1:00
(ramprate1.2oC/seg)Recopilacióndedatos
}45
Anexo 3: Algoritmo de prueba por PCR e interpretación de resultados
