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Química Biológica
Electroforesis
2009
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Electroforesis en Gel
• Migración de una molécula con carga neta en un campo eléctrico Separación de proteínas y otras macromoléculas (DNA, RNA)
• V migración (v) en el campo eléctrico depende de la fuerza del campo (E), la carga neta de la proteína (z) y del coeficiente friccional (f) v= Ez/f
• Ez propulsa la molécula cargada hacia el electrodo de carga opuesta
• La fuerza de arrastre f se opone al movimiento (fricción entre las moléculas en movimiento y el medio)
• f depende de la masa y la forma de la molécula, y de la viscosidad () del medio. Esfera de radio r f = 6rv
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• Si el campo aplicado es constante alcanza una velocidad constante.
• Bajo condiciones controladas la distancia recorrida es proporcional al tiempo de la corrida
Factores que influyen en la migración de los iones
Características del ión: carga (signo y magnitud); forma, tamaño, tendencia a disociarse, comportamiento anfotérico (si existe).
Características del medio: [C] electrolitos, fuerza iónica, propiedades dieléctricas, propiedades químicas, pH, T, viscosidad, presencia de moléculas no polares
Características del campo aplicado: intensidad, pureza, distribución.
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Características Técnicas
• Medios soportes: geles (actúan como tamiz molecular)
• Medios alternativos: papel y acetato de celulosa.
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• Las moléculas son forzadas a moverse a través de la matriz del gel, independientemente de su tamaño.
• La electroforesis se desarrolla en una tira vertical y delgada de poliacrilamida
• El flujo se desplaza desde la parte superior a la inferior.
• Los geles son químicamente inertes
• Se forman por polimerización de poliacrilamida entrecruzada con metil-bis-acrilamida .
• Gelificación completa: 2% de bis-acrilamida
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• El del poro depende de la [C] de acrilamida.
• A una dada [acrilamida] si [bis] esta en una concentración de 5% = del poro es mínimo
• Polimerización: ocurre en presencia de radicales libres (fotodescomposición de riboflavina), TEMED (catalizador) y Persulfato de Amonio (iniciador)
• Tipos de buffer: continuo y discontinuo
• Finalizada la corrida electroforética se visualizan las bandas de proteínas por tinción con Ag o colorantes (Coomasie Brilliant Blue)
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Suero humano (condiciones nativas)
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Electroforesis en condiciones desnaturalizantes
• Las proteínas se separan en base a su masa.
• Mezcla de proteínas en una solución de dodecilsulfato de Na (SDS) detergente aniónico que interrumpe prácticamente todas las interacciones no covalentes de la molécula nativa
• SDS= se unen a las cadenas principales en una relación = 1 anión SDS/2 residuos aa
• Complejo SDS-PROT desnaturalizada tiene carga neta negativa grande = proporcional a la masa de proteína.
• -mercaptoetanol /ditiotreitolreducen puentes disulfuro
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Glicoproteínas, Glucogeno, Glucosaminoglicanos
• Tinción con ácido Peryódico-Schiff (PAS)
bandas de color magenta con un fondo rosado débil
• Ruptura de la unión de los anillos de hexosas / enlaces de hexosaminas de los glucosaminoglicanos formando grupos aldehído.
• Reacción de estos grupos con el reactivo de Schiff(leucofucsina o bisulfato de fucsina)
Auto radiografíasSe detectan marcas radioactivas colocando un placa de Rx sobre el gel
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Lípidos
• Tinción con Colorantes SUDÁN (Negro Sudan, Sudan III/IV) prácticamente insoluble en agua
• El colorante se emplea disuelto en un solvente orgánico (lípidos y colorante son relativamente insolubles.
• El colorante debe ser más soluble en los lípidos que en el solvente la coloración tiene lugar porque las moléculas del colorante se distribuyen entre las moléculas de lípidos y del solvente en función de la solubilidad diferencial entre ambos.
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Determinación de la Masa (kDa) por PAGE
• La movilidad de la mayor parte de los polipéptidos es proporcional al log (masa)
• Algunas proteínas ricas en carbohidratos no obedecen esa relación empírica.
• Masa molecular de proteínas incógnita: electroforesis de una proteína de PM desconocido y de otras de PM conocido (patrones) a diferentes [gel]
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• SDS-PAGE es rápida, sensible y de alta resolución:
Se detecta una banda de aproximadamente 0.1 g de proteína (2 pmol) si se tiñe con Coomasie y < 0.02 g por tinción con Ag.
Se pueden distinguir proteínas que difieren en masa en un 2% ( 40 vs. 41 kDa, diferencia de 10 residuos)
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Isoelectroenfoque (IEF)
• Las proteínas se separan electroforéticamente en base al contenido relativo de residuos acídicos o básicos.
• Se forma en el gel un gradiente de pH, sometiendo a electroforesis una mezcla de polianfolitos (polímeros pequeños multicargados)
• pI : pH al cual la carga neta de la proteína es cero su movilidad es cero porque z es cero.
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• En la práctica el sistema se estabiliza (evitar convección y mezclado de anfolitos) incorporando sacarosa o construyendo el gradiente de pH sobre un medio soporte (polacrilamdia o agarosa)
• Por IEF se pueden resolver proteínas que difieren en < 0.01 pI difieren en una carga neta
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Electroforesis Bidimensional
• Combinación de la técnica de IEF con la de SDS-PAGE para lograr una separación de alta resolución.
• La muestra se somete primero a IEF. El gel obtenido se coloca luego horizontalmente en la parte superior de
una placa de SDS-PAGE las proteínas se extienden a lo largo del gel dependiendo de cuan lejos han migrado en el IEF.
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Las proteínas se desarrollan electroforéticamente en dirección perpendicular para dar un perfil de manchas en dos dimensiones las proteínas se separan en la dirección horizontal en base a su punto isoeléctrico y verticalmente en base a su masa.
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• Se pueden resolver en el orden de mil diferentes proteínas en un único experimento
• Proteínas aisladas de células bajo diferentes condiciones fisiológicas pueden ser desarrolladas en una electroforesis bidimensional y luego se evalúa la intensidad de las señales obtenidas se aplica para determinar cambios enla concentración de ciertas proteínas en respuesta al estado fisiológico.
• Problema: no se puede establecer cual proteína es la regulada? Ya que este sistema aunque despliega múltiples proteínas, estas no pueden ser identificadas.
• Hoy es posible la identificación acoplando un espectrómetro de masas.
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