UNIVERSIDAD DE COLIMADOCTORADO EN CIENCIAS: AREA CIENCIAS AGRICOLAS Y
FORESTALES
EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO ENLOS PROCESOS DE ORGANOGÉNESIS Y
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA DE AGUACATE(Persea americana Mill . )
TESIS
Que para obtener el grado deDOCTOR EN CIENCIAS:
ÁREA CIENCIAS AGRÍCOLAS Y FORESTALES
Presenta:IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZ
Asesores:DR. RAFAEL SALGADO GARCIGLIA
DR. MIGUEL ÁNGEL GÓMEZ LIM
TECOMÁN, COLIMA, MÉXICO. NOVIEMBRE DEL 2002
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
OFICIO No. 590/2002.
C. IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZEGRESADO DEL DOCTORADO EN CIENCIASÁREA: CIENCIAS AGRICOLAS Y FORESTALESPRESENTE.
Con fundamento en el dictamen emitido por el jurado revisor del colegiado del área: deCiencias Agrícolas y Forestales de esta Facultad a mi cargo, de su trabajo de tesis de Doctorado yen virtud de que efectuó las correcciones y acató las sugerencias que le habían indicado losintegrantes del mismo, se le autoriza la impresión de la tesis " Efecto de los reguladores decrecimiento en los procesos de organogénesis y embriogénesis somática de aguacate (Perseaamericana Mill) ", misma que ha sido dirigida por los C.C. Dr. Rafael Salgado Garciglia,Profesor Investigador de la UMSNH.
Este documento reunió todas las características apropiadas como requisito parcial paraobtener el grado de Doctor en Ciencias; Area: Ciencias Agrícolas y Forestales y fue revisado encuanto a forma y contenido por los C.C. Dr. Miguel A. Gómez Lim, CINVESTAV-IPN UnidadIrapuato, Dr. Joel E. López Meza, Profesor- Investigador de la UMSNH, Dr. Roberto LezamaGutierrez y el Dr. Alfonso Pescador Rubio, Profesores-Investigadores de la Universidad deColima.
Sin otro particular de momento, me despido de usted muy cordialmente.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, a la
Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo y al Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados del IPN por las facilidades proporcionadas para desarrollar la
presente investigación.
A la Fundación Produce Michoacán, A.C. por el apoyo económico en mis estudios de
doctorado y en la investigación que se presenta.
Mi profunda gratitud y reconocimiento al Dr. Rafael Salgado Garciglia por sus
consejos, orientaciones y excelente asesoría en el desarrollo de la tesis.
Al Dr. Miguel Ángel Gómez Lim por su apoyo en la interacción con investigadores
como el Dr. Richard E. Litz y Fernando Pliego Alfaro, así como en sus sugerencias y
asesoría en la tesis.
A los Doctores Joel Edmundo López Meza, Alfonso Pescador Rubio y Roberto
Lezama Gutiérrez por sus comentarios y sugerencias que indudablemente
enriquecieron el escrito final.
A todos mis compañeros del PICAF, muy especialmente a mi hermano José Agustín
Vidales Fernández y amigos Ercelia Ángel Palomares, Jesús García Magaña y Mario
Aguilar Ramírez, con quienes compartimos cursos, exámenes y horas de desvelo.
A mis compañeros del Campo Experimental Uruapan particularmente a los M.C. José
de la Luz Sánchez Pérez, José Alvarez Silva, José Luis Aguilera Montañez y José Luis
Rocha Arroyo, así como al Dr. Héctor Guillén Andrade y a la Sra. Evelia Capiz Villa,
por su apoyo y consejos.
DEDICATORIA
A MI REYNA Y QUERIDA COMPAÑERA:
Por su apoyo, comprensión y paciencia en los momentos
difíciles de la vida.
A MIS HIJOS:
CARLOS ALBERTO, CONSTANZA Y JUDITH
Por ser mi fortaleza y la razón de mi superación.
A MIS ABUELITOS Y PADRES:
IGNACIO (q.e.p.d.) Y JUANITA (q.e.p.d.); AGUSTÍN (q.e.p.d.) Y
ELVIRA
Por ser mi guía en el camino de la vida.
A MIS HERMANOS:
AGUSTÍN, GUADALUPE, ENRIQUE, ROSA, JOSÉ, ELVIRA, JESÚS,
HERLINDA, JUAN Y ADELAIDA.
Por la gran familia y unión que formamos.
CONTENIDO
Página
LISTA DE CUADROS i
LISTA DE FIGURAS iv
RESUMEN vii
SUMMARY viii
I. INTRODUCCIÓN 1
Hipótesis 5
Objetivo 5
II. REVISIÓN DE LITERATURA 7
2.1. Hormonas y reguladores de crecimiento 7
2.1.1. Auxinas 7
2.1.2. Citocininas 12
2.1.3. Giberelinas 17
2.1.4. Otras hormonas y reguladores de crecimiento 21
2.2. Bases moleculares de la acción hormonal 24
2.3. Micropropagación 31
2.3.1. Organogénesis 33
2.3.1.1. Organogénesis en aguacate 34
2.3.2. Embriogénesis somática 42
2.3.2.1. Embriogénesis somática en aguacate 45
2.4. Factores que intervienen en la morfogénesis in vitro 52
2.4.1. Inóculo o explante 53
2.4.2. Factores físicos 53
2.4.3. Factores químicos 55
Página
III. MATERIALES Y MÉTODOS 62
3.1. Localización del sitio de investigación 62
3.2. Material biológico 62
3.3. Reactivos utilizados 62
3.4. Organogénesís de aguacate criollo 63
3.4.1. Definición de las condiciones asépticas del explante 63
3.4.2. Prevención de necrosis del explante 64
3.4.3. Tipos y dosis de reguladores de crecimiento y otros
compuestos del medio de cultivo para lograr la
organogénesis in vitro de aguacate criollo 65
3.4.3.1. Inducción de brotes 65
3.4.3.2 Multiplicación de brotes obtenidos in vitro 67
3.4.3.3. Enraizamiento de brotes obtenidos in vitro 67
3.4.4. Aclimatación de plántulas de aguacate obtenidas
in vitro 68
3.5. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 70
3.5.1. Desinfección de frutos y procedimientos de extracción
de la nucela 70
3.5.2. Productos y procedimientos para evitar la necrosis
oxidación de la nucela 70
3.5.3. Tipo y dosis de reguladores de crecimiento, para lograr
la embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 71
3.5.3.1. Generación de callo embriogénico 71
3.5.3.2. Multiplicación y desarrollo de embriones
somáticos 71
3.5.3.3 Maduración de embriones somáticos 72
3.5.3.3.1. Análisis de almidón y glucosa de
embriones somáticos maduros 72
3.5.3.4. Germinación de embriones somáticos 73
Página
3.6. Condiciones de incubación de los explantes 74
3.7. Análisis estadístico 75
IV. RESULTADOS 76
4.1. Organogénesis de aguacate criollo 76
4.1.1. Desinfección externa 76
4.1.2. Desinfección interna 76
4.1.3. Prevención de necrosis del explante 80
4.1.4. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros
compuestos del medio de cultivo en la organogénesis
in vitro de aguacate criollo 82
4.1.4.1. Iniciación o establecimiento in vitro de yemas
axilares 82
4.1.4.2. Multiplicación de brotes 85
4.1.4.3. Enraizamiento de brotes 92
4.1.5. Aclimatación de plántulas de aguacate criollo
obtenidas in vitro 94
4.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 98
4.2.1. Efecto del ácido ascórbico, cisteína y luz en la
necrosis del tejido nucelar 98
4.2.2. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros
componentes del medio de cultivo en la
embriogénesis somática 100
4.2.2.1. Inducción de callo embriogénico 100
4.2.2.2. Multiplicación y desarrollo de embriones
somáticos 102
4.2.2.3. Maduración de embriones somáticos 106
Página
4.2.2.3.1. Análisis de almidón y glucosa de
embriones somáticos maduros 110
4.2.2.4. Germinación de embriones somáticos maduros 110
V. DISCUSIÓN 113
5.1. Organogénesis de aguacate criollo 113
5.1.1. Condiciones óptimas de asepsia para el establecimiento
in vitro de yemas axilares de aguacate. 113
5.1.2. Prevención de necrosis de yemas axilares de aguacate. 114
5.1.3. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del
medio de cultivo en la organogénesis in vitro de
aguacate. 114
5.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass 119
5.2.1. Prevención de necrosis de tejido nucelar de aguacate 119
5.2.2. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del
medio de cultivo en la embriogénesis somática de
aguacate. 120
VI. CONCLUSIONES 125
VII. LITERATURA CITADA 126
ANEXOS 141
LISTA DE CUADROS
Cuadro No. Página1 Embriogénesis somática en frutales perennes y otras
especies de cultivo. 46
2 Respuesta al ambiente en la micropropagación convencional.16
3 Tratamientos evaluados en el estudio sobre concentración desales minerales MS, WPM y McCown's, en la fase deinducción de brotes. 66
4 Composición de sales minerales MS y modificadas enmacroelementos, utilizadas en pruebas de multiplicación yenraizamiento in vitro de brotes de aguacate. 68
5 Tratamientos evaluados en las nueve pruebas de aclimataciónde brotes de aguacate criollo obtenidos in vitro.
69
6 Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares deaguacate criollo a los 12 días del establecimiento en dosmedios de cultivo (A y B), en la prueba de dosis de Benlate.
77
7 Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacatecriollo a diferentes días después del establecimiento portratamiento para permanencia continua y en etapas derecultivo a medio sin plaguicidas. 78
8 Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares deaguacate criollo a diferentes días después del establecimientopor tratamiento para permanencia continua con dosseveridades de desinfección superficial y en etapas derecultivo a medio sin plaguicidas. 79
9 Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacatecriollo a 7 y 14 días del establecimiento, en estudio depretratamiento de explantes en solución con Benlate másAgrimicin 100 a diferentes tiempos de permanencia.
80
i
PáginaCuadro No.
10 Porcentaje de necrosis y brotación de yemas axilares deaguacate criollo por tratamiento en el estudio depretratamiento del explante con ácido ascórbico. 81
11 Porcentaje de brotación de yemas axilares de aguacate criolloa diferentes días por tratamiento en estudio sobreconcentración de tres sales minerales. 83
12 Prueba de comparación de medias (Tukey α = 0.01) para lavariable longitud del brote (mm) de yemas axilares deaguacate criollo, a los 127 días del establecimiento. 85
13 Número de brotes por explante y longitud del brote deaguacate criollo en los tratamientos de la interacción BA-AIBen sales modificadas completas (MS 100%) y MS 1/2 de suconcentración. 86
14 Comparación de medias Tukey (α = 0.05) en la variablenúmero de brotes promedio por frasco de aguacate criollo alos 25 y 85 días, en tratamiento con reguladores BA-AIB.
88
15 Comparación de medias Tukey (α = 0.05) en la variablelongitud promedio de brote de yemas axilares in vitro deaguacate criollo a los 85 días, en tratamientos conreguladores de crecimiento (BA-AIB). 89
16 Características cualitativas de los brotes in vitro de aguacatecriollo en los diferentes tratamientos a los 85 días delestablecimiento, en tratamientos con reguladores decrecimiento (BA-AIB). 90
17 Comparación de medias Tukey (α = 0.05) en la variablelongitud de raíz por brote de aguacate criollo a los 54 y 88 días,en prueba de enraizamiento de brotes in vitro con AIB einteracción AIB AG3. 93
18 Respuesta al enraizamiento de los brotes de aguacate criolloobtenidos in vitro a los 88 días del establecimiento, en pruebade dosis de AIB e interacción AIB-AG3. 93
19 Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en elestudio de dosis de Folicote. 96
ii
PáginaCuadro No.
20 Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en elestudio de preaclimatación con filtro bacteriológico encomparación a Folicote. 96
21 Prueba de comparación de medias Tukey (α = 0.05) en lavariable frecuencia de estomas en hojas de aguacate criollo.
97
22 Porcentaje de necrosis en tejido nucelar de aguacate cv. Hassen diferentes tratamientos de antioxidantes e intensidad deluz. 99
23 Porcentaje de formación de callo embriogénico en tejidonucelar de aguacate cv. Hass, color y diámetro en lostratamientos donde se formaron las estructurasembriogénicas. 101
24 Número de estructuras embrionarias (globulares yacorazonados) en callos de aguacate cv. Hass a los 20 díasdel establecimiento. Significancia estadística Tukey (α = 0.01). 104
25 Número y porcentajes de viabilidad de estructurasembrionarias de aguacate cv. Hass en sus diferentes fases,por cada 10 ml de medio, a los 20 días de cultivo. 106
26 Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv.Hass por caja de petri, a los 36 días. Significancia estadísticaTukey (α = 0.01). 108
27 Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv.Hass por caja de petri a los 23 días. Significancia estadísticaTukey (α = 0.01). 108
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura No. Página1 Factores que pueden influir en el crecimiento y morfogénesis
de las plantas in vitro. 60
2 Número de brotes laterales en yemas axilares in vitro deaguacate criollo en MS 20% de sus sales, a los 127 días desu cultivo. 83
3 Crecimiento promedio (mm) del brote principal en yemasaxilares in vitro de aguacate en diferentes tratamientosevaluados y a 55, 72, 86, 100, 117 y 127 días delestablecimiento, estudio de concentración de tres salesminerales. 84
4 Brotes en yemas axilares in vitro de aguacate criollo conformación de callo en la base del explante y hojas deformes(MS 100% y BA 0.9 mg/I). 88
5 Brotes de aguacate criollo a partir de yemas axilares in vitrocon la mayor longitud de brote (MS 100%, sin reguladores). 90
6 Brotes de aguacate criollo a partir de yemas axilares in vitro,de color verde oscuro en el tratamiento 2 (MS 100% y 0.3 mg/lde BA). 91
7 Enraizamiento in vitro de brotes de aguacate criollo (MS 100%y 0.4 mg/1 de AIB), en prueba de dosis de AIB e interacciónAIB-AG3. 94
8 Plántulas de aguacate criollo micropropagadas en la fase detrasplante y aclimatación, tratadas con Folicote (ceras) 1 parteen 20 de agua. 95
9 Estomas de hojas de aguacate criollo árbol adulto (A) yde plántulas micropropagadas (B). 97
10 Tejido nucelar in vitro de aguacate cv. Hass sin necrosis(MS 50% y picloram 2 mg/I). 99
11 Callo embriogénico de aguacate cv. Hass (MS completo y 1012 mg/1 de picloram), después de 40 días de cultivo.
iv
Figura No. Página12 Necrosis en callo embriogénico de aguacate cv. Hass,
después de 60 días de cultivo. 102
13 Masas proembriogénicas (MPE) y estructuras globulares (EG)de aguacate cv. Hass a los 20 días del recultivo (MS 100% sinreguladores de crecimiento). 103
14 Estructuras embriogénicas acorazonados (EA) y en fase detorpedo (ET) en callos de aguacate cv. Hass, a los 20 días delrecultivo (MS 100% con 400 mg/1 de caseína). 105
15 Embriones somáticos maduros de aguacate cv. Hass (MS100% y 20 g/I de agar); A, a los 35 días del recultivo; B, a 40días del recultivo. 109
16 Embriones somáticos de aguacate cv. Hass para sugerminación en frascos de cultivo tipo magenta, en laspruebas de dosis adenina y tiempos de inmersión. 111
17 Germinación de embriones somáticos de aguacate cv. Hass;A, emisión de brotes en medio MS con BA-AIB (0.4-0.01 mg/I),a los 32 días; B, emisión de raíces en medio MS con BA-2,4-D(0.1-0.05 mg/l), a 55 días. 111
18 Plántula de aguacate cv. Hass a partir de embrión somáticoen medio MS con 0.3 mg/I de BA, después del recultivo previopor 90 días en medio con sales de Anderson modificadas ysin reguladores de crecimiento. 112
v
EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN LOSPROCESOS DE ORGANOGÉNESIS Y EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
DE AGUACATE(Persea americana Mill.)
Ignacio Vidales Fernández
Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima,Apartado postal No. 36, C.P. 28100, Tecomán, Colima, México
RESUMEN
El efecto de los reguladores de crecimiento sobre la morfogénesis in vitro deaguacate fue estudiado. La organogénesis se estableció en yemas axilares deaguacate criollo raza mexicana (Persea americana Mill. var. drymifolía), se logró laformación de brotes en MS 20% con 2 mg/1 de BA y 0.2 mg/l de AIB, mientras que labrotación múltiple en MS 100% con 0.3 mg/1 BA; el enraizamiento de los brotes fuehasta del 44.4% con 0.4 mg/1 de AIB; la aclimatación al 100% de supervivencia fue conla aplicación de ceras. La inducción de embriogénesis somática se obtuvo con tejidonucelar de aguacate cv. Hass, se generó callo embriogénico (MS 50%, 4 mg/Ide picloram y 0.4 mg/1 de AIB), multiplicación de masas proembriogénicas (MS 100%,sin reguladores de crecimiento), desarrollo de embriones somáticos (MS,con 400 mg/1 de caseína hidrolizada), maduración de embriones somáticos (MS, con 20g/I de agar-agar), y la germinación de éstos (10%) bajo un cultivo de dos fases:primero en un medio bajo en nitratos y sin reguladores; y posteriormente en medioMS con 0.3 mg/1 de BA.
PALABRAS CLAVE: Organogénesis, embriogénesis somática, aguacate,reguladores de crecimiento.
vii
SUMMARY
The effect of plant growth regulators on morphogenesis of avocado was studied. Theorganogenesis was established with axillary buds of avocado Mexican race (Perseaamericana Mill. var. drymifolia), the sprout buds in MS 20%, with BA and IBA at 2 and0.2 mg/1 each, while a multiple budding was obtained in MS 100% and BA 0.3 mg/I;sprouts rooting were 44.4% with IBA at 0.4 mg/l; the acclimatization at 100% survivalwas obtained with wax foliar applied. Somatic embryogenesis was induced withnucellar tissue of cv. Hass avocado, embryogenic callus was obtained (MS 50%,4 mg/l of picloram and 0.4 mg/1 of IBA), proembryogenic masses multiplication (MS100%, without plant growth regulators), developed somatic embryos (MS withhydrolyzed casein 400 mg/I); mature embryos (MS with agar-agar 20 g/I), and theembryos germination was 10%, with two phase culture: first in a Iow nitrate mediumwithout regulators; and after culturing in MS with BA 0.3 mgll.
KEY WORDS: Organogenesis, somatic embryogenesis, avocado, plant growthregulators.
viii
I. INTRODUCCIÓN
Por el tipo de polinización cruzada altamente heterocigótica que tiene el
aguacate (Persea americana Miller), en el sistema común de reproducción masiva no
se garantiza la pureza genética del patrón o portainjerto, solamente del injerto, por su
incremento vegetativo con la utilización de tejido somático. De ahí que resulte
imposible a través de la semilla multiplicar portaínjertos sobresalientes por sus
características agronómicas, desde el punto de vista de la perpetuación de los genes
deseables.
El germoplasma de aguacate que se ha seleccionado por su tolerancia a
enfermedades de la raíz, como Phytophthora cinnamomi Rands (KÖhne, 1992)
tradicionalmente se ha propagado con la técnica de Frolich (Frolich y Platt, 1972), un
procedimiento que requiere un injerto en patrón nodriza y etiolación del brote a
enraizar.
El aguacate presenta enfermedades severas que en casos extremos provocan
la muerte del árbol y en general, disminución en la producción que llega a alcanzar el
14% y una reducción en la calidad en un 10% (SAGAR-INIFAP, 1996). Las de mayor
importancia económica son seis: la antracnosis Colletotrichum gloeosporioides Penz,
roña Sphaceloma persea Jenkins, anillamiento causado por el complejo de bacterias y
hongos Pseudomonas sp., Xanthomonas sp., Corynebacterium sp., Alternaría sp.,
Diplodia sp., Dothiorella sp. y Pestalotia sp., tristeza P. cinnamomi, cáncer de tronco
y ramas Fusarium epishaeria Snyder y Hansen, P. boehmeriae Sawada y Nectria
galligena Snyder y Hansen, y enfermedades de postcosecha Diplodia natalensis Pole
evans, Rhizopus nigricans Ehr., Alternaria sp., Verticillum sp., Fusarium roseum
Snyder y Hansen, Colletotrichum gloeosporioides Penz y Sphaceloma persea
Jenkins (Vidales, 2001 b).
2
La obtención de un cultivar de aguacate resistente a enfermedades es urgente
y necesaria, ésto con la finalidad de evitar una catástrofe por la vulnerabilidad
genética que pudiera presentar el cultivar (cv.) Hass, ya que en la zona productora
del estado de Michoacán se depende en un 99% de este genotipo; así, con la
generación del nuevo cultivar se busca también disminuir los costos de producción y
reducir en gran medida la contaminación del ambiente, ya que solamente para el
control de la antracnosis se realizan de 5 a 7 aplicaciones de fungicidas al año, cuyo
costo fluctúa entre los 7 mil y 10 mil pesos por hectárea, y se emiten en la región
productora de aguacate aproximadamente 500 ton de productos químicos en la
prevención y control del patógeno.
Por otra parte, la colecta y conservación de germoplasma es urgente y
necesaria para recuperar los genes que se requieren en la formación de nuevos
cultivares de aguacate; instituciones como INIFAP y CICTAMEX han realizado
esfuerzos importantes en la colecta y conservación en campo, sin embargo el
mantenimiento de las colecciones demandan grandes erogaciones en mano de obra
y espacio, además de que están sujetas a altos riesgos de pérdida debido a
enfermedades, plagas y alteraciones del medio ambiente entre otras.
La biotecnología es una herramienta que se puede emplear para la obtención
de un cultivar resistente a enfermedades, bien sea mediante la formación de un
organismo transgénico o al generar variación somaclonal, en donde están presentes
las mutaciones, los cambios epigenéticos y el efecto del rejuvenecimiento fisiológico;
sin embargo, para utilizar estos mecanismos de mejoramiento genético in vitro se
requiere el sistema de regeneración de una planta completa a través de
embriogénesis somática y el sistema de organogénesis que permita la multiplicación,
el enraizamiento y la aclimatación de los genotipos transformados o seleccionados.
Con el cultivo de tejidos vegetales in vitro se proporcionan ventajas de calidad
sanitaria en la producción de planta de aguacate al ser utilizada como portainjerto o
injerto, se disminuye el tiempo para propagar un genotipo sobresaliente y se
3
garantiza la similitud genética del material parental, por reproducción clonal. Además
de las facilidades que ofrece este procedimiento en el mejoramiento genético y en la
preservación de germoplasma, la donación puede lograrse por injerto, enraizamiento
de estacas, micropropagación o embriogénesis somática (Bonga y Von Aderkas,
1992). La conservación in vitro es una opción para mantener el conjunto de genes
con menor riesgo, en forma más económica, disponibles para su utilización en
cualquier época del año y con alta seguridad sanitaria (Maruyama et al., 1996); no
obstante para lograrlo se demanda en primera instancia la definición de un sistema
de regeneración de plantas altamente eficiente y posteriormente trabajar en los
factores que influyen en el crecimiento y desarrollo del explante.
Un sistema de regeneración in vitro, bien sea a través de organogénesis o
embriogénesis somática, requiere de manera específica la definición de los
componentes de los medios de cultivo para sus diferentes etapas, por ser
determinantes en el crecimiento y desarrollo celular; las hormonas o reguladores de
crecimiento vegetal (auxinas, citocininas, giberelinas, etileno y ácido abscísico) son
muy importantes en los procesos de crecimiento o diferenciación (Salisbury y Ross,
1994) o en todos los aspectos del desarrollo (Klee y Estelle, 1991; Davis, 1995);
éstas son responsables en primer lugar de la distribución de los compuestos que la
planta biosintetiza y también determinan el crecimiento relativo de todos los órganos
de la planta.
En los procesos de morfogénesis in vitro son elementales las auxinas, las
citocininas y las giberelinas, ya que estimulan la elongación y división celular, según
la combinación y concentración de éstos. Los reportes de regeneración ín vitro,
indican que la respuesta del tejido depende del tipo de regulador de crecimiento y la
dosis utilizada, la cual es diferente para cada especie vegetal, por lo que no existe
una regla general para una respuesta morfogenética.
Como respuesta a un balance en la cantidad entre auxinas y citocininas, se
regula la dominancia apical o bien el crecimiento lateral; el efecto de la auxina sobre
4
la diferenciación vascular está bien establecido, la auxina afecta la formación de
xilema, ya que las plantas sobreproductoras de auxina contienen más elementos de
xilema, aunque las células son pequeñas; al incrementar la concentración de auxinas
se estimula la formación de raíces adventicias, pero la sobreproducción de esta
hormona puede llevar a un crecimiento epinástico de las hojas, debido a la inducción
del etileno, además de que las hojas son generalmente pequeñas y más estrechas
que las no tratadas. Una baja producción de auxina, en contraste, conduce a un
arrugamiento de la hoja, debido a un incompleto desarrollo del sistema vascular en
relación al resto de la hoja (Klee y Estelle, 1991). Lo anterior indica que existe una
interacción entre hormonas, y que tanto la sobreproducción como la deficiencia
influyen en la formación precisa de células y tejidos de la planta.
Con base en la carencia de un protocolo común de regeneración in vitro para
todas las plantas, es necesario continuar con investigaciones en diversas especies
vegetales, sobre todo en aquellas donde no se han encontrado las condiciones
óptimas del cultivo, para lograr procesos de organogénesis o embriogénesis
somática in vitro y así ofrecer un conocimiento más amplio que lleve a definir cuáles
son los factores determinantes en la regeneración de plantas in vitro.
Tal es el caso del aguacate, en el cual no ha sido posible optimizar la
regeneración in vitro en muchos de sus cultivares comerciales, por lo tanto en la
presente investigación se planteó utilizarlo como una planta modelo que permitiera
avanzar en el conocimiento de la respuesta morfogenética in vitro con la aplicación
de reguladores de crecimiento, particularmente en los procesos de organogénesis y
embriogénesis somática. El establecer sistemas de regeneración in vítro de esta
planta, permitiría la obtención de material bajo conservación in vitro, de plantas
mejoradas con alguna característica agronómica importante y de la propagación
masiva de injertos y portainjertos homogéneos (clonas).
5
Hipótesis
En base a lo anterior, en el presente estudio se partió de la siguiente hipótesis
de trabajo:
Al aplicar diferentes dosis y tipos de reguladores de crecimiento a cultivos
(tejidos) in vitro de aguacate, será posible activar la capacidad de regeneración de
plantas por los procesos de organogénesis y embriogénesis somática.
Así, los objetivos que se plantean son:
Objetivos
Objetivo general
Evaluar el efecto de los reguladores de crecimiento sobre la inducción y
desarrollo de la organogénesis y embriogénesis somática en aguacate.
Objetivos específicos
1. Determinar los procedimientos de desinfección y reducción de necrosis de
microestacas y frutos, para el establecimiento óptimo de los cultivos in vitro de
yemas axilares de aguacate criollo y tejido nucelar de aguacate cv. Hass,
respectivamente.
2. Evaluar el efecto de diferentes tipos y dosis de auxina, citocinina y giberelina
sobre la inducción, multiplicación y enraizamiento de brotes de las yemas
axilares de aguacate criollo.
6
3. Determinar la influencia del tipo y dosis de auxinas, citocíninas, giberelinas y
ácido abscísico (ABA) y otros componentes de los medios de cultivo para la
generación de callo embriogénico, multiplicación, desarrollo, maduración y
germinación de embriones somáticos.
3. Establecer las condiciones óptimas de cultivo durante el transplante y
aclimatación de plántulas de aguacate obtenidas in vitro, que permita el mayor
porcentaje de supervivencia y lograr plantas aclimatadas en el menor tiempo
posible.
7
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1. Hormonas y reguladores de crecimiento
Son compuestos orgánicos -diferentes de los nutrimentos- que en pequeñas
cantidades, fomentan, inhiben o modifican de alguna forma cualquier proceso
fisiológico vegetal (Weaver, 1990). Las hormonas vegetales se sintetizan en alguna
parte de la planta y se translocan a otra, en donde concentraciones muy bajas
causan una respuesta fisiológica, que promueve diferentes tipos de crecimiento; en
la actualidad, las auxinas, citocininas, giberelinas, inhibidores y retardadores del
crecimiento, etileno, ácido salicílico, triacontanol, brasinoesteroides, turgorinas y
poliaminas, son consideradas dentro del grupo de hormonas y reguladores de
crecimiento (Salisbury y Ross, 1994).
2.1.1. Auxinas
El ácido indolacético (AIA) fue la primera auxina natural identificada, y hoy es
considerada la principal auxina en plantas, otras auxinas naturales han sido
identificadas, se incluye al 4-CI-AIA y ácido indolbutírico (AIB). Existen auxinas
sintéticas, tales como el ácido 2,4-d i cl orofenoxi acético (2,4-D) y ácido naftalenacético
(ANA), las cuales en bioensayos inducen efectos similares a las auxínas naturales. Al
usar diversas concentraciones de auxina se ha demostrado que existen diferencias
en la sensibilidad a esta hormona (Sitbon y Perrot-Rechenmann, 1997).
La auxina es la hormona vegetal que influye en numerosos aspectos del
crecimiento y desarrollo (Chen et al., 1998; Guilfoyle et al., 1998), se incluye el
desarrollo vascular, iniciación de raíces laterales, dominancia apical, fototropismo,
gravitropismo, embriogénesís, maduración de frutos (Hobbie et al., 1994; Davis,
1995; Macdonald, 1997), senescencia, abscisión, floración, elongación y división
celular (McClure et al., 1989; Hooley, 1998; Eckardt, 2001).
8
Los efectos de las auxinas son generalmente divididos en dos principales
categorías: respuesta rápida tal como la elongación celular, ésta es una de las
respuestas hormonales más rápidas conocidas con un periodo latente de 10 a 25
minutos; y respuestas de término largo tal como la división celular, diferenciación, y
morfogénesis con un período latente de horas o días (Theologis, 1986). La iniciación
de la división celular ocurre de 10 a 24 horas después del tratamiento con auxina y la
diferenciación de células vasculares en 3 días (Macdonald, 1997).
El AlA se sintetiza a partir de compuestos tipo indol y las evidencias indican
que el AlA se produce a partir del aminoácido triptofano. Con plantas mutantes de
Arabidopsis, deficientes o que sobre expresan la síntesis de auxina, se ha revelado
que hay rutas de síntesis independientes de triptofano (Leyser, 1997). Esta y otras
investigaciones aseguran que esta auxina puede también producirse por una
variedad de rutas metabólicas que son activadas por varías señales del desarrollo o
del ambiente. Las más importantes son las vías metabólicas del corismato y
antranilato, dos rutas metabólicas secundarias importantes en plantas, aunque la ruta
de biosíntesis de AlA aun se desconoce (Dolan, 1998; Normanly y Bartel, 2000).
También se ha elucidado que el nivel de la auxina en los tejidos vegetales se
determina no solamente por la síntesis, sino por el transporte y su metabolismo
(conversión, conjugación, desconjugación y catabolismo). Con las técnicas de
cuantificación de compuestos marcados (radioisótopos), es posible monitorear en
plantas mutantes o transgénicas, el metabolismo del AlA (Normanly, 1997). Esta
hormona es activada primeramente como ácido libre y los niveles endógenos son
controlados in vivo a nivel de síntesis, conjugación y degradación. Estos procesos
pueden llevarse a cabo por la conjugación con azúcares, aminoácidos y pequeños
péptidos; y por la oxidación del grupo indol, enzimáticamente (AIA-oxidasa) o por luz
ultravioleta (UV) (Ostin et al., 1998).
La producción de la auxina se ha demostrado que ocurre primordialmente en
los ápices meristemáticos de tejido verde (tallos, primordios de hoja y hojas jóvenes).
9
Aunque se encuentra en grandes cantidades en ápices radicales, flores, frutos,
semillas y otras partes vegetativas, las evidencias indican que no se producen allí,
sino que son transportadas por los haces vasculares. El movimiento de la auxina
tanto en tallo como en raíz es lento (aprox. 1 cm/h), polar o unidireccional: hacia la
base (basipétalo) en tallos y hojas y hacia el ápice (basipétalo) en raíces (Lomax et
al., 1995). A diferencia de los fotosintatos y otros solutos, que se transportan a través
de los conductos como xilema y floema, el AlA es conducido vía células
parenquimatosas del floema y que rodean los tejidos vasculares. De esta manera, las
auxinas pueden ser transportadas por difusión de célula a célula, creándose un flujo
unidireccional. Además, el transporte de auxinas ocurre de célula a célula en la
región del cambium vascular (Jones, 1998; Raven et al., 1999).
El transporte polar de la auxina juega un papel importante en los procesos de
crecimiento regulados por esta hormona y en la formación del cotiledón durante el
desarrollo del embrión (Liu et al., 1993; Estelle, 1998). Ensayos de transporte de
auxina han sido usados para mostrar que los hipocotilos de embriones maduros
disectados de semillas de gimnospermas y angiospermas muestran un pronunciado
transporte polar de la auxina hacia el final de la raíz indiferentemente de su
orientación y, que este transporte es completamente bloqueado por ácido 2,3,5-
triyodobenzoico (TIBA) (Cooke y Cohen, 1993). El papel del transporte polar de auxina
en embriogénesis somática fue estudiado también por Schiavone y Cooke
(1987) en embriones somáticos de zanahoria con TIBA y un inhibidor de transporte
de auxina diferente, el ácido N-1-naftilftalámico (NPA); ambos inhibidores a una
concentración de 1 µM fueron eficientes para bloquear la capacidad de la
embriogénesis somática. El NPA actúa al romper la respuesta trópica, reducir la
dominancia apícal, inhibir la formación de yema floral y de raíz lateral (Estelle, 1998).
Cuando plántulas de Arabidopsis thaliana crecieron en luz sobre medio que contenía
1.0 µm de NPA, se inhibió la elongación de hipocotilo y de raíz, y el gravitropismo; sin
embargo, cuando crecieron en la oscuridad, el NPA rompió la respuesta a la gravedad
pero no afectó la elongación (Jensen et al., 1998).
10
Uno de los mejores estudios de respuesta de auxina es la rápida elongación de
secciones disectadas de coleoptilo, tallo o hipocotilo. De acuerdo a la hipótesis de
crecimiento ácido, la elongación celular en secciones del tallo es debida a la
acidificación inducida por auxina en la pared celular (Rayle y Cleland, 1992; Hobbie
et al., 1994). Estos últimos autores mencionan que fue demostrado que la aplicación
de auxina a tallos intactos de chícharo puede también inducir elongación, este
resultado in vivo sostiene la relevancia fisiológica de la auxina durante el crecimiento
o elongación, sin embargo, es poco claro como un crecimiento ácido contribuye a la
elongación inducida por auxina in vivo. Asimismo, indican que existe la idea de que la
acidificación de la pared celular es causada por la activación de la H+-ATPasa en la
membrana plasmática y que concentraciones fisiológicas de auxina (<µM) incrementan
la actividad de esta enzima en coleoptilos de maíz. Este incremento en la actividad de
la H+-ATPasa resulta en un incremento en el flujo de protones y por eso un mayor
potencial negativo en la membrana celular (hiperpolarización), sin embargo las
auxinas inactivan también la hiperpolarización producida en este sistema,
presumiblemente al activar la H+-ATPasa. Como las auxinas inactivas no inducen
crecimiento o elongación, este resultado sugiere que sólo la activación de la H+-
ATPasa no es suficiente para explicar ese efecto.
Aunque hay reportes de que la auxina por sí sola no es la responsable de la
elongación, la teoría ácida es la más aceptada (Keller y Volkenburg, 1998).
La dominancia apical se explica por la auxina producida en el meristemo
apical y transportado basipetalmente a los tejidos blanco, donde inhibe el crecimiento
de las ramas laterales (Jensen et al., 1998). En plantas leñosas, las auxinas
promueven la actividad del cambium vascular, estimulan la división celular, se
expanden las yemas por el movimiento de la auxina hacia los tallos y se forma tejido
vascular secundario, que da como resultado la brotación lateral (Rayen et al., 1999)
11
El papel de la auxina en la elongación celular y su posible interacción con
etileno y giberelina fue estudiada en el hipocotilo de Arabidopsis, cuando plántulas de
tipos silvestres cultivadas sobre medio que contenía distintas concentraciones de
auxina, el crecimiento del hipocotilo se inhibió, sin embargo, cuando los mutantes
axr1-12 y 35S-iaaL (los cuales tienen reducida respuesta a auxina) crecieron en las
mismas condiciones, la auxina fue capaz de promover el crecimiento del hipocotifo
(Collett et al., 2000). Estos mismos investigadores indican que cuando la respuesta a
etileno fue reducida usando los mutantes resistentes a etileno etr1 o el compuesto
aminoetoxivinilglicina (un inhíbidor de la síntesis de etileno), las respuestas a la auxina
fueron inalteradas o iguales, se indica que la auxina no inhibió la elongación
del hipocotilo por medio de etileno. En relación a las pruebas sobre las interacciones
entre auxina y giberelina, las mutantes de auxina crecieron sobre medio que contenía
giberelina y las mutantes de giberelina crecieron sobre medio con auxina; la
respuestas encontradas son las mismas a las plántulas de tipo silvestre en todos los
casos; en suma, 1 µM del inhibidor de transporte de la auxina NPA no altera la
respuesta de las plántulas de tipo silvestre a giberelina; dobles mutantes fueron
hechos entre mutantes de giberelina y auxina y los fenotipos de éstos parecen
aditivos; estos resultados indican que la auxina, la giberelina y el etileno actúan
independientemente en la elongación del hipocotilo.
Una de las aplicaciones prácticas de las auxinas es la estimulación de la
formación de raíces adventicias en segmentos disectados de plantas, lo que las ha
hecho comercialmente importantes. Las auxinas están involucradas también en la
formación de frutos y en la formación completa de las semillas. Actualmente se ha
estudiado el papel de las auxinas en las respuestas de defensa de las plantas, se
evidencia su acción en plantas enfermas por patógenos, enfermedades y por
factores del ambiente (estrés hídrico, por altas y bajas temperaturas, etc.) (Rayen et
al., 1999; Zolman et al., 2000).
12
2.1.2. Citocininas
En 1948, Skoog y Tsui descubrieron que la adenina junto con fosfato no sólo
contrarrestó los efectos inhibitorios de auxina sobre el crecimiento de la yema, sino
que promovió la formación de yemas y aumentó el crecimiento de tejido de callos. En
el año 1955, Miller y col., basados en los resultados de bíoensayos con tabaco,
obtuvieron de levadura (Saccharomyces cerevisiae) una pequeña cantidad del factor
citocinina altamente activo concentrado, el cuál aunque no identificado, muestra las
propiedades de una purina; fue descubierto que el ADN degradado de esperma de
arenque y autoclaveado fueron las dos fuentes de actividad de la citocinina; la
estructura química del material aislado (p.e. cinetina o 6-furfurilaminopurina) fue
deducido de la composición elemental (C10H9N5O) y de la degradación de productos
(adenina y ácido levulénico); aunque la cinetina posteriormente demostró ser un
artificio que surge espontáneamente en las preparaciones de ADN de
deoxiadenosina, su eficacia como citocinina en muy bajas concentraciones fue
irrefutable, y ésta es ampliamente usada como citocinina sintética en nuestros días
(Minorsky, 2001).
Las citocininas permanecen como uno de los grupos más misteriosos de las
hormonas vegetales, tienen una estructura química simple (N6-sustituto derivados de
adenina) e influyen en una gran variedad de eventos diferentes (Mikiashevichs y
Walden, 1997). La citocinina más activa encontrada naturalmente en plantas, fue
denominada zeatina (ZEA), ya que fue aislada por primera vez de mazorcas de maíz.
Se encuentra principalmente en tejidos de alta división celular, se incluyen semillas,
frutos, hojas, meristemos radicales, y en la savia de cortes realizados en plantas.
Debido a que los estudios en plantas han revelado que el papel fisiológico de las
citocininas está íntimamente relacionado con la presencia o ausencia de las auxinas,
éstas son aplicadas de manera comercial para modificar algunos efectos de las
auxinas, como la dominancia apical y la germinación de yemas o semillas.
13
Las citocininas están involucradas en el retraso de la senescencia de hojas, ya
que con una aplicación exógena de éstas en hojas que han iniciado amarillamiento,
se previene su caída natural. Las evidencias revelan que debido a la ruptura de tejido
vascular entre las hojas y el tallo principal, se evita el transporte de citocininas, las
cuales se acepta que son sintetizadas en los meristemos de las raíces y se
transportan por xilema hacia la parte aérea vegetal (Rayen et al., 1999).
Otras investigaciones han demostrado que la concentración de auxinas
aunado a la de citocininas, es la responsable de los primeros eventos de la
morfogénesis, ya que en células que presentan alta tasa de división celular, que
permanecen sin diferenciarse (células meristemáticas), se han encontrado altos
niveles de citocininas y en aquellas que sufren elongación celular (células en proceso
de diferenciación), el nivel más alto lo presentan las auxinas. En cultivos in vitro, se
ha generalizado el uso de alta concentración de auxinas para la formación de raíces
en tejidos no diferenciados y, al adicionar una alta concentración de citocinina se
determina la formación de brotes adventicios; en concentraciones iguales, el callo
continua proliferando sin presentar eventos de morfogénesis (Rayen et al., 1999). Sin
embargo, el tejido in vitro presenta diferencias en su capacidad de respuesta, por la
cantidad endógena de las hormonas y a las proteínas receptoras que existan en las
plantas, es variable en genotipo, edad, parte de la planta y etapa fenológica. Por lo
tanto, es necesario realizar estudios que lleven a conocer el tipo y dosis de
reguladores de crecimiento para cada tipo de planta o especies, como modelo para
la aplicación en diferentes razas, cultivares o variedades.
La aplicación de una dosis baja de citocinína a la yema apical de plantas que
crecieron en días cortos es otro tratamiento no inductivo que causa varios eventos
normalmente observados en el meristemo después de la inducción del fotoperiodo de
floración, tal como un incremento en la proporción y sincronización de la división
celular (Bernier et al., 1993); estudios de efectos causados por la aplicación exógena
de citocininas o, la expresión de genes bacteriales involucrados en la biosíntesis de
citocinina revelan que ellas interactúan con otras hormonas, en el control de la
14
división celular, la morfogénesis y el crecimiento de yemas laterales (Davies, 1995;
Cline, 1996), la iniciación y crecimiento de brotes, la senescencia de la hoja y el
desarrollo fotomorfogénico (Brandstatter y Kieber, 1998).
Las citocininas liberan a las semillas de la dormancia y a las yemas axilares de
la dominancia apical, además de que retrasan la senescencia de las hojas (Brault et
al., 1997); estas hormonas participan en el control de la división celular y
diferenciación, en bioensayos de cultivo de tejidos, los efectos de las citocininas
están bien definidos (Mok y Mok, 2001), ellas controlan la diferenciación de
cloroplastos por incremento de la expresión de genes nucleares que codifican
proteínas de cloroplasto; están involucradas además en la regulación de la expresión
de genes importantes como el gene de la subunidad pequeña de la enzima ribulosa
1,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) o el gene de la nitrato reductasa (Lu et al., 1990;
Brault et al., 1997).
Dewitte y col. (1999) estudiaron el papel de las citocininas en los procesos de
desarrollo tales como: iniciación foliar, inducción floral y formación de flores; para tal
efecto consideraron la distribución de las citocininas en ápices de brotes de tabaco
(Nicotiana tabacum L.) en distintas fases del desarrollo al utilizar inmunocitoquímica
unida a espectometría de masas cuantitativa; en contraste a los ápices vegetativos y
yemas florales, detectaron bases de citocinina libre (zeatina, dihidrozeatina, o
isopentiladenina) en ápices de transición preflorales; además observaron una
disminución de 3 veces en el contenido de ribósidos de citocinina (ribósido de
zeatina, ribósido dihidrozeatina e isopentiladenosina) durante esta fase de transición;
estos investigadores concluyeron que la formación de órganos (p.e. hojas y flores)
está caracterizada por un incremento en el contenido de citocinina, en contraste a los
muy bajos niveles de citocinina endógena encontrada en ápices de transición prefloral,
los cuales no demostraron organogénesis. Los análisis inmunocitoquímicos
revelaron disentimiento o no estar de acuerdo con la localización intracelular de las
bases de citocinina; la dihidrozeatina e isopentiladenina estuvieron principalmente en
el citoplasma y en el perinúcleo, mientras la zeatina mostró un claro corte de marcaje
15
nuclear; las citocininas no parecen actuar como efectos positivos en la fase de
transición prefloral en ápices de brotes de tabaco, además, las diferencias en la
distribución a nivel celular pueden indicar un papel fisiológico específico de zeatina
en los procesos del núcleo.
El tidiazuron (TDZ) es entre las substancias denominadas citocininas la más
activa en el cultivo de tejidos de plantas leñosas, lo cual facilita la eficiencia de la
micropropagación de muchas especies leñosas recalcitrantes. Bajas concentraciones
(<1µM) pueden inducir una gran proliferación axilar en comparación con otras
citocininas, sin embargo, TDZ puede inhibir la elongación de los brotes, en algunos
casos es necesario transferir brotes a un medio de elongación con un bajo nivel de
TDZ y/o una menor actividad de la citocinina. En concentraciones mayores a 1 µM, el
TDZ puede estimular la formación de callos, brotes adventicios o embriones
somáticos y el subsiguiente enraizamiento de microbrotes puede ser afectado o
ligeramente inhibido por una exposición previa a TDZ (Huetteman y Preece, 1993).
En relación a la síntesis de citocinina se tiene que en conversiones entre
bases de citocinina, nucleósidos y nucleótidos, generalmente las interconversiones
involucran enzimas comunes al metabolismo de las purinas, estas enzimas
usualmente tienen alta afinidad para adenina, adenosina y AMP; por ejemplo, la 5'-
nucleotidasa del germen de trigo y tomate convierte AMP a adenina y nucleótidos de
citocinina a bases de citocinina pero tienen alta afinidad a AMP (Mok y Mok, 2001).
Estos investigadores en su revisión mencionan que el conocimiento de la biosíntesis
de citocinina en plantas es muy limitado, generalmente es asumido que i6Ade y
zeatina tienen un origen común y que el primer producto de la biosíntesis es i6AMP,
aunque esta ruta metabólica parece lógica, particularmente en el conocimiento de la
acción del gene ipt de Agrobacterium tumefaciens.
Por muchos años, ha sido sujeto de debate el ARNt como una fuente de
citocinina; mediciones de la descomposición de ARNt indican que este proceso
puede contribuir arriba del 50% de las citocininas libres; frecuentemente
16
encontramos argumentos en contra de que el ARNt es una considerable fuente de
citocinina en el hecho que cis-zeatina es la principal citocinina en el ARNt, sin
embargo, este problema puede ser potencialmente resuelto por la isomerización de
cis-zeatina a trans-zeatina por cis-trans isomerasas; otra objeción es la naturaleza
general de la descomposición del ARNt, que ocurre en todos los tejidos, mientras la
producción de citocinina se localiza en las puntas de la raíz, meristemos de los
brotes y en semillas inmaduras, y debe ser altamente regulado (Mok y Mok, 2001).
Brandstatter y Kieber (1998) describen el análisis de dos genes homólogos,
ibc6 y ibc7 (inducidos por citocinina), que son inducidos minutos después de la
exposición a citocinina exógena; esta rápida inducción, acoplada con la insensibilidad
de inducción a ciclohexamida y la especificidad de la inducción por citocininas,
sugiere que ibc6 y ibc7 pueden ser genes de respuesta primaria a citocinina, las
secuencias de ibc6 y ibc7 son similares a dos componentes reguladores de
respuesta bacteria¡, estos resultados sugieren que ibc6 y ibc7 pueden estar
involucrados en una etapa temprana de sensibilidad a citocinina.
Existen una serie de mutantes identificados en Arabidopsis para citocininas,
tales como: amp1 con elevado nivel de citocinina, el stp1 y cyr1 resistentes a
citocinina y, cki1 y cki2 mutantes que proliferan y producen brotes en ausencia de
citocinina; ckil fue incapaz de producir raíces y flores normales y fue estéril, mientras
cki2 fue capaz de crear semillas, al formar callo tuvo la habilidad de crecer y formar
brotes en ausencia de citocinina; el msh mutante que también forma muchos brotes
en ausencia de citocinina pero no prolifera rápidamente (Miklashevichs y Walden,
1997). Sin embargo, por la carencia de mutantes biosintéticos y de señalización, el
papel regulador de las citocininas no está bien entendido; por ingeniería genética se
logró la expresión de la citocinina oxidasa en plantas de tabaco transgénico para
reducir su contenido de citocinina endógeno, las plantas deficientes en citocinina
desarrollaron brotes cortos con pequeños meristemos apicales y la producción de
células de la hoja fue solo del 3-4% respecto al tipo silvestre, al indicar un absoluto
requerimiento de citocininas para el crecimiento de la hoja; en contraste, los
17
meristemos radicales de las plantas transgénicas fueron agrandados y dieron
elevado crecimiento rápido y más ramificación de raíces, estos resultados sugieren
que las citocininas son un importante factor regulador de la actividad del meristemo
de la planta y morfogénesis, con papel contrario en brotes y raíces (Werner et al.,
2001).
2.1.3. Giberelinas
Las giberelinas se descubrieron por primera vez en Japón por Kurosawa en
1926, un fitopatólogo que estudió las enfermedades en arroz, específicamente la
nombrada como "bakanae" (plántula loca), las plántulas afectadas tenían una altura
que superaba en un 50% o más a las de las plantas sanas, pero formaban menos
semillas; la enfermedad era provocada por un hongo ascomiceto (Giberella fujikuroi
forma sexual y Fusarium moniliforme etapa asexual); Kurosawa demostró que la
causa era una sustancia termoestable y junto con sus colegas bosquejó las
propiedades químicas del material activo (Weaver, 1990). En la década de 1930,
Yabuta y Hayashi aislaron un compuesto activo del hongo, al que denominaron
giberelina (Salisbury y Ross, 1994).
Las giberelinas son una familia de compuestos terpenoides los cuales regulan
muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de plantas, se incluye la germinación de
la semilla, elongación del tallo y peciolo, expansión foliar, floración, crecimiento de
semillas y fruto (Hooley, 1994; Blázquez et al., 1998; Hedden, 1999).
Estas hormonas vegetales han sido implicadas en el control de la floración en
varias especies. En Arabidopsis, una severa reducción de giberelinas endógenas
retrasa la floración en días largos y evita la floración en días cortos (Blázquez et al.,
1998), estos investigadores estudiaron como los efectos diferenciales de las
giberelinas sobre floración correlacionan con la expresión de LEAFY, un gen de
identidad del meristemo floral. Ellos encontraron que el fracaso de mutantes ga1-3
deficientes en giberelina para florecer en días cortos, fue paralelo a la ausencia de la
18
inducción del promotor LEAFY. Una conexión causal entre esos dos eventos fue
confirmada por la habilidad de un transgene LEAFY expresado constitutivamente
para restaurar la floración en mutantes ga-1 en días cortos; en contraste a días
cortos, el deterioro de la biosíntesis de giberelina causó simplemente una reducción
de la expresión LEAFY cuando las plantas crecieron en días largos o con sacarosa
en la oscuridad.
El efecto de la giberelina y del ácido abscisico (ABA) sobre la muerte celular
fue estudiada por Bethke y col. (1999), en células de aleurona de cebada (cv.
Himalaya); los protoplastos de aleurona incubados en ABA permanecen viables en
cultivo por un mínimo de 3 semanas, pero expuestos a giberelina inician una serie de
eventos que resultan en muerte, más del 70% de todos los protoplastos murieron
entre los 4 y 8 días después de la incubación en giberelina. La muerte ocurre después
de que las células llegan a ser altamente vacuoladas, se manifestó por una
abrupta perdida de integridad en la membrana del plasma seguida por una rápida
contracción de la célula muerta. La hidrólisis del ADN inicia antes de la muerte y
ocurre cuando el protoplasto cesa la producción de a-amilasa; la degradación del
ADN no resulta en acumulación de fragmentos discretos de bajo peso molecular, la
degradación del ADN y la muerte celular fue evitada por LY83583, un inhibidor de
señalización de giberelina en aleurona de cebada; Bethke y col. (1999) concluyen
que la muerte celular en células de aleurona es hormonalmente regulada y esta es la
etapa final de un programa de desarrollo que fomenta el éxito en el establecimiento
de un semillero.
Cowiing y Harberd (1999) realizaron experimentos en donde probaron la
hipótesis que la giberelina regula el crecimiento del hipocotilo al alterar la extensión
de la elongación de la célula del hipocotilo; en estos estudios usaron mutantes de A.
thaliana (L.) Heyhn., deficientes en giberelina y de respuesta alterada a esta
hormona, demostraron que la giberelina regula la elongación, en hipocotilos que
crecieron en luz como en oscuridad, se influyo en el promedio y la extensión final de
la elongación celular, sin embargo, los hipocotilos que crecieron en luz y oscuridad
19
exhibieron marcadas diferencias en la relación de respuesta a la dosis de giberelina.
La longitud de los hipocotilos que crecieron en oscuridad no es afectada por la
giberelina exógena, mientras que la longitud de los hipocotilos que crecieron en luz es
significativamente incrementada por la giberelina exógena; además los análisis
sugieren que la longitud del hipocotilo en el control de giberelina es cerrada a
saturación en hipocotilos que crecieron en oscuridad, pero no en hipocotilos que
crecieron en luz. Los resultados muestran que un gran rango de longitudes del
hipocotilo se logra vía la dosis dependiente de alteraciones reguladas por giberelina
en el rango de elongación de células del hipocotilo individuales.
La difusión de ácido giberélico (AG1, y AG3) desde el embrión, y la declinación
en el contenido de ABA del endospermo, fue asociado con la inducción de la
expresión del gene a-amilasa (EC 3.2.1.1.) en aleurona de granos de trigo (Triticum
aestivum L. cv. Maris Huntsman) germinados a 25°C; el escutelo parece ser el
principal sitio para la biosíntesis del ácido giberélico basado en (1) la abundancia de
AG 20-oxidasa en trigo, (2) el incremento en el contenido de giberelinas en la ruta
metabólica temprana AG 13-hidroxilación, y (3) la acumulación de ent-kaureno en
granos embebidos en la presencia de un inhibidor ent-kaureno oxidasa; además, la
iniciación de la biosíntesis de giberelina en el escutelo fue asociada con la inducción
de la expresión del gene de a-amilasa en el epitelio del escutelo, aunque los dos
eventos pueden no estar casualmente ligados (Appleford y Lenton, 1997).
De las 121 giberelinas que han sido identificadas en plantas y hongos,
relativamente pocas son consideradas que poseen actividad biológica intrínseca, las
giberelinas bioactivas más importantes para el crecimiento vegetativo y desarrollo
probablemente son AG1, y AG4, las cuales difieren en la presencia o ausencia,
respectivamente, de un grupo hidroxil en C-13 (Hedden, 1999).
Las giberelinas son productos de la ruta metabólica diterpenoide y su
formación es iniciada por la ciclización del común C20 precursor pirofosfato de
geranilgeranilo (GGPP). Este intermediario es sintetizado en plastidios a partir del
20
compuesto difosfato de isopentenilo, recientemente demostrado que deriva en estos
organelos a partir de 3-fosfato gliceraldehido y piruvato, más bien que de ácido
mevalónico, como previamente se asumió (Lichtenthaler et al., 1997).
En cultivo de tejidos vegetales, la ciclización de GGPP ocurre en proplastidios
y resulta en la formación de un hidrocarbono, ent-kaureno, en dos etapas del proceso
que requiere la actividad de dos enzimas: CPS, la cual produce el compuesto
intermedio copa¡¡¡ difosfato, y ent-kaureno cintasa; GGPP es sólo el precursor de
carotenoides y es incorporado en la clorofila; el ent-kaureno es convertido a
giberelinas, bioactivo por una serie de reacciones de oxidación, catalizadas por dos
tipos de enzimas. Las reacciones son catalizadas por monooxigenasa dependiente
de CitP450 y, en los brotes de tejidos de la mayoría de las plantas, surge AG12 y su
análogo AG53 13-hidroxilado; estos compuestos intermedios son metabolizados
además por dioxígenasas solubles, la cual usa ácido 2-oxoglutárico como un
cosubstrato; dos dioxigenasas son requeridas para convertir AG12 y AG53 por rutas
metabólicas paralelas a los productos bioactivos AG4 y AG1, respectivamente
(Hedden y Proebsting, 1999).
La ruta biosintética de las giberelinas activas biológicamente requieren la
acción de diterpeno ciclasas, mono-oxigenaras dependiente de citocromo P450 y
dioxigenasas dependiente de 2-oxoglutarato. Las dioxigenasas incluye a AG 20
oxidasa, 3β-hidroxilasa y 2β-hidroxilasa; la primera catálisis elimina el carbono-20, la
segunda catálisis la etapa final en la producción de las hormonas de crecimiento
activo, la cuál puede ser desactivada por la 2(3-hidroxilasa. Como una enzima
reguladora, la AG 20 oxidasa está siendo investigada como blanco por manipulación
genética de biosíntesis de la giberelina; resultados con especies modelos indican que
cambios considerables en el contenido de giberelina y en la morfología de la planta,
pueden ser obtenidos por la sobre-expresión de genes de la AG 20 oxidasa o al
reducir su expresión por introducción de secuencias antisentido de ADN (Hedden,
1999).
21
La biosíntesis de las giberelinas puede ser separada dentro de tres etapas de
acuerdo a la naturaleza de las enzimas involucradas y la correspondiente
localización en la célula: las terpeno ciclasas actuan en protoplastidios,
monooxigenasas asociadas con el retículo endoplasmático y dioxigenasas
localizadas en el citosol (Rademacher, 2000). Este autor también menciona que
existen cuatro diferentes tipos de inhibidores de la biosíntesis de giberelina, éstos
son: (a) compuestos tipo onium, tales como cloruro de clormequat, cloruro de
mepiquat, clorfonium, y AMO-1618, los cuales bloquean las cíclasas copalil-difosfato
sintasa y ent-kaureno sintasa, involucrada en las etapas tempranas del metabolismo
de giberelina; (b) compuestos con un heterociclo que contiene nitrógeno, p.e.
ancimidol, flurprimidol, tetciclasis, paclobutrazol, uniconazol-P e inabenfido, estos
retardadores bloquean a las monooxigenasas dependientes del citocromo P450, así
inhiben la oxidación del ent-kaureno en el ácido ent-kaurenoico; (c) estructura
simulada de ácido 2-oxoglutárico, el cual es el co-substrato de dihidrogenasas que
cataliza las etapas tardías de formación de giberelina, acilciclohexanediones, p.e.
prohexadione-Ca y trinexapac-etil y daminozida, bloquea particularmente la 3(3-
hidroxilación; (d) 16,17-dihidro-AG5 y estructuras relacionadas que probablemente
simulan al substrato precursor de giberelina de la misma dioxigenasa.
En Arabidopsis se han detectado cinco mutantes originales que presentan
enanismo como consecuencia de la deficiencia de giberelina (ag1-ag5); en la
mayoría de los casos el crecimiento de los mutantes fue restaurado de manera
normal por la introducción del gene de las plantas del tipo silvestre, dando inequívoca
evidencia que el gene cionado corresponde al locus mutante (Hedden y Proebsting,
1999).
2.1.4. Otras hormonas y reguladores de crecimiento
En este apartado se analizan inhibidores, retardadores del crecimiento y
etileno. Los inhibidores son un grupo muy variado de compuestos que tienen
diferentes efectos biológicos en las plantas. Hay procesos como la germinación de la
22
semilla, la supresión del crecimiento de brotes y el letargo de las yemas que los
inhibidores controlan, al menos en parte. Entre éstos se encuentran sustancias
orgánicas aromáticas como fenoles, flavonoides fenólicos y ácidos benzoicos,
además el ABA, hormona inhibitoria muy difundida en el reino vegetal (Weaver,
1990).
El ABA es una hormona vegetal que naturalmente se acumula en las plantas
bajo condiciones de estrés por sequía (Zeevaart y Creelman, 1988), esta
acumulación de ABA inicia el cerrado de los estomas, así reduce la planta el uso de
agua bajo condiciones de restricción de agua disponible (Grossnickle y Folk, 1994),
induce la dormancia en semillas y yemas e inhibe la elongación de la raíz (Anderson
et al., 1994).
La presencia del ABA fue esencial para expresar la embriogénesis potencial de
Picea glauca (Attree et al., 1991; Misra et al., 1993), se aceptó que pudo inducir la
resistencia a la deshidratación en plantas, este fue el caso; el ABA fue un elemento
más para enfatizar la relación entre el agua y la embriogénesis somática (Linossier et
al., 1995).
Las características morfológicas y fisiológicas de las plantas micropropagadas
de Delphinium cv. Princess Caroline fueron estudiadas por Santamaría y col. (1993),
las hojas producidas in vitro mostraron un pobre control de la pérdida de agua, la
cuál parece resultar de la respuesta restrictiva por el estoma y no de un pobre
desarrollo cuticular. Los estomas de las hojas producidas in vitro fueron más grandes
y más frecuentes que los producidos durante la aclimatación; a pesar del hecho de
que el estoma aislado de la epidermis de las hojas producidas in vitro reduce su
apertura cuando se expone a tratamientos de reducción de la turgencia, ellos no
cierran completamente. Esto, junto con una alta frecuencia estomática
medianamente explica el pobre. control de la pérdida de agua demostrada por las
hojas intactas producidas en cultivo cuando se exponen a aire seco; mientras las
hojas de las plantas aclimatadas demostraron casi un cierre completo con ABA,
23
bajos potenciales de agua, oscuridad y CO2, los estomas de las hojas producidas in
vitro reducen su apertura cuando se exponen a esos factores, pero solo a un límite;
por eso, los estomas de las hojas cultivadas in vitro parecen ser parcialmente
funcionales, pero alguna alteración fisiológica o anatómica impide que ellos cierren
completamente; los estomas de las hojas producidas in vitro fueron particularmente
insensibles al ABA, lo cuál parece estar en parte asociado con la alta concentración
de citocininas en el medio de cultivo. En el largo plazo, esta insensibilidad estomátíca
al ABA medianamente contribuye a la perdida de planta cuando las plántulas
micropropagadas son transferidas a suelo.
Así podemos resumir que el ABA es una potente molécula que ciertamente
modifica el patrón estomático, la pérdida de agua por la planta y probablemente actúa
para modificar el crecimiento de las hojas; la hormona es sintetizada en las hojas y en
las raíces de la planta y se puede mover libremente de la planta al suelo y del suelo a
la planta; puede sólo moverse rápidamente por la planta en el xilema y el floema y
ordena la partición entre diferentes compartimentos en diversos tejidos como una
función del pH (Sauter et al., 2001).
Los retardadores del crecimiento de las plantas, son compuestos que retrasan
la prolongación de los tallos, incrementan el color verde de las hojas y afectan
indirectamente la floración sin provocar deformaciones; retrasan la actividad
meristemática subapical que es la responsable de la elongación de los tallos, entre
estos se tienen AMO-1618, Phosphon-D y cloromequat (CCC) (Weaver, 1990).
El etileno (C2H4) es producido por todas las plantas superiores y en trazas
interactúa con otras hormonas vegetales, especialmente auxina. El etileno influye en
la maduración de frutos, abscisión, rompimiento de la dormancia, floración y
modificación de la expresión del sexo (Beyer et al., 1984), provoca epinastia de las
hojas al promover el alargamiento de las células del lado superior e inhibe la
elongación de tallos y raíces en dicotiledóneas, induce la senescencia de las flores,
estimula fuertemente la formación de flores femeninas en plantas de cucurbitáceas y
24
en algunas especies interrumpe la latencia de las semillas; el desprendimiento de
hojas, flores y frutos implica interacciones entre auxinas, etileno y ácido abscísico,
sin embargo, la promoción del crecimiento, las etapas iniciales de la producción de
raíces adventicias y muchos otros efectos de las auxinas parecen ser independientes
de la producción de etileno (Salisbury y Ross, 1994).
2.2. Bases moleculares de la acción hormonal
En 1986, Theologis menciona que el mecanismo primario de acción de las
hormonas vegetales en general, y de auxinas en particular, tipificado por el AlA,
continua sin clarificar a los 55 años de investigación intensa después del
descubrimiento del AlA. En su artículo este mismo autor concluye que es evidente
que la auxina induce ARNm específico en tejido de chícharo y soya. Esta rápida
inducción de ARNm se considera que interviene en la secreción de H+ y en la
elongación celular, posteriormente el ARNm regulado indirectamente por auxina,
puede codificar para proteínas asociadas con el sistema al conjugar aspartil por
auxina, ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) sintetasa, celulasas y otras
hidrolasas, o polipéptidos necesarios para la división celular, diferenciación o
iniciación de meristemos adventicios (Theologis, 1986).
La mayoría de los trabajos pioneros sobre la acción de las hormonas utilizaron
acercamientos que involucraron: 1. Escisión de un órgano y substitución de éste con
alguna combinación de hormonas; 2. Escisión de un órgano o tejido y crecimiento in
vitro; y 3. Aplicación exógena de una hormona o inhibidor. Aunque las conclusiones de
estos estudios son correctas, el aprendizaje ha sido limitado. La aplicación
exógena de cualquier material biológico está sujeta a limitaciones de toma hacia
arriba, transporte, secuestro y metabolismo; además, es difícil cuantificar la cantidad
de material activo dentro del tejido, por estas razones ha sido difícil establecer una
relación directa entre una hormona y un proceso particular de desarrollo (Klee y
Estelle, 1991). Estos mismos autores indican que la biología molecular y la genética
desempeñan un papel importante en clarificar el conocimiento en la acción de las
25
hormonas, además de que el desarrollo de estudios moleculares para estudiar la
acción de las hormonas vegetales ha sido acompañado por un aumento en el uso de
mutantes para estudiar los procesos de las hormonas en plantas, los beneficios son
varios: primero, la caracterización fenotípica de mutantes de hormonas puede dar
información sobre el papel de las hormonas en la fisiología y desarrollo vegetal;
segundo, los mutantes pueden usarse para estudiar la bioquímica, biosíntesis y
acción de las hormonas; finalmente, en algunas especies mutantes vegetales pueden
utilizarse para aislar y caracterizar los genes requeridos por procesos hormonales .
La generación de un mutante está limitada a los medios para lograr
mutagénesis, a la viabilidad de los mutantes producidos y a un adecuado tamizado o
selección; actualmente, éstas no son restricciones obvias a la mutagénesis vegetal.
Los mutantes pueden ser creados por tratamiento con rayos X o etilmetanosulfonato
(EMS), o bien, un gene marcador o reportero puede ser transportado fuera con uno
u otro elemento de transporte o el T -ADN de Agrobacterium; la mutagénesis química
permite la creación de un gran número de mutantes independientes con relativa
facilidad, aunque los números de mutantes con gene etiquetado pueden ser
comúnmente limitados, ahí es la oportunidad de aislar y caracterizar el gene marcado
relativamente simple; las complicaciones inician con el tamizado para un fenotipo
mutante deseado y la viabilidad de los mutantes producidos (Miklashevichs y
Walden, 1997).
Un mecanismo de acción de las hormonas que fue referido para animales, pero que
recibió mucho apoyo por botánicos, es el que describen Salisbury y Ross
(1994), explican que se inicia con la unión de la hormona primaria a una proteína
receptora en la membrana plasmática de una célula blanco, enseguida, el complejo
hormona-receptor activa una enzima de membrana cercana denominada fosfolipasa
C, misma que hidroliza al 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol, entre el glicerol y el fosfato
unido al carbono 1 de la porción fosfatada del inositol, de tal forma que se libera
1,4,5-trifosfato de inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG), estos dos compuestos son
activos y pueden provocar una cascada de respuestas. El IP3 estimula la liberación
26
de Ca2+ vacuolar al citosol, que al incrementarse activa ciertas enzimas, se incluyen
varias proteína cinasas. El DAG no es soluble en agua (por los dos ácidos grasos
que aún contiene), por lo que realiza su función dentro de la membrana plasmática.
donde probablemente tiene gran movilidad; el DAG activa una enzima situada en la
membrana que se conoce como proteína cinasa C, enzima que utiliza ATP para
fosforilar ciertas enzimas que regulan diversas fases del metabolismo, la fosforilación
causa desactivación en algunas enzimas y activación en otras.
Rayen y col. (1999) indican que las hormonas interactúan con proteínas
específicas llamadas receptores, las cuales activan rutas de respuesta particulares.
Así las hormonas operan como señales químicas entre células, las células blanco
tienen mecanismos para (1) identificar la hormona específica, (2) medir la cantidad
que está presente, (3) transferir esta información vía rutas bioquímicas, y (4)
convertir la información en un conjunto complejo de cambios desarrollados. Las
células reconocen las hormonas vegetales al usar proteínas llamadas receptores de
hormonas; cada proteína receptora contiene un sitio de ligamiento de la hormona que
es específico para una hormona en particular. El ligamiento de la hormona al receptor
activa una ruta de respuesta en la célula y provoca un cambio en la
conformación de la proteína receptora; estos cambios permiten al receptor
interaccionar con otros componentes celulares, como algunas proteínas de
membrana, que pueden activar bombas de iones, o bien otras pueden actuar
abriendo canales de iones en la membrana.
Las bases moleculares de acción de las auxinas es un área de intenso estudio
(Harling et al., 1997), ya que evidencias bioquímicas y electrofisiológicas han
indicado que las auxinas pueden unir una variedad de proteínas vegetales (Jones,
1994), como la proteína 1 unida a auxina (ABP1) de maíz, que tiene las
características de ser un receptor que interviene en la hiperpolarización de la
membrana inducida por auxina. La hiperpolarización es un concepto que refleja la
estimulación de la expulsión de protón del citosol vía la H+-ATPasa y la acidificación
del apoplasto (Hager et al., 1991).
27
El ion calcio es importante en la acción de las hormonas, generalmente los
niveles en el citoplasma son muy bajos; sin embargo la estimulación hormonal de los
canales del ion calcio resulta en una elevación temporal de los niveles de calcio. El
ligamiento de calcio a los sitios de ligamiento-calcio de ciertas proteínas alteran la
actividad de esas proteínas, tanto como la actividad de las proteínas receptoras de
hormonas. Las proteínas cinasas son una clase de enzimas que pueden ser
activadas por calcio u otros "mensajeros secundarios" ; las proteínas cinasas pueden
modificar las proteínas "marcadas" al transferir grupos fosfatos en ciertos
aminoácidos de una proteína marcada y alterar su actividad (Rayen et al., 1999).
En relación a las hormonas en el control de genes específicos, los
investigadores anteriores mencionan que los mecanismos moleculares por los cuales
los genes individuales son encendidos y apagados en los núcleos eucarióticos no se
encuentran completamente entendidos, que un número de principios están
emergiendo, sin embargo, estos son comunes a vegetales y animales. Un gene
eucariótico está compuesto de una secuencia codificada, la cual específica la
secuencia de aminoácidos de los productos de proteína de genes, así como
secuencias reguladoras, las cuales son regiones de ADN que bordean la secuencia
codificada y juegan un papel regulador en la transcripción del gene. Las proteínas
llamadas factores reguladores de la transcripción pueden ligar directamente a
secuencias específicas de ADN dentro de una secuencia reguladora, al activar
(encender) o reprimir (apagar) un gene particular (Rayen et al., 1999).
La identificación del sitio celular de percepción de la hormona vegetal ha sido
problemático de demostrar, sin embargo, los reguladores de crecimiento vegetales
tales como el ácido giberélico (AG), ABA, y auxina son ácidos orgánicos pequeños
que pueden cruzar relativamente fácil las membranas biológicas en varias formas.
Cuando se adicionan al apoplasto, esas hormonas pueden rápidamente entrar a la
célula y podrían ser percibidas por receptores internos, al igual que las hormonas
esteroides de animales, ellas podrían sólo interactuar con receptores sobre la fase
externa de la membrana del plasma (Gilroy y Jones, 1994). Estos investigadores en
28
sus estudios con protoplastos aislados de capas de aleurona de cebada analizaron el
sitio de percepción de señal hormonal, en el cual los protoplastos respondieron a la
aplicación externa de AG3 con el incremento en la síntesis y secreción de a-amilasa,
expresión transitoria del gene reportero de la glucuronidasa encendido para los
elementos de respuesta a la hormona del promotor a-amilasa, y la vacuolación típica
de las células de aleurona tratadas con AG3. La aplicación externa de ABA podría
bloquear la estimulación de síntesis y secreción de a-amilasa, mientras la
microinyección arriba de 250 µM de ABA no fue efectiva para antagonizar el efecto
estimulatorio del AG3, resultados indicativos que el sitio de percepción del AG3 y ABA
en el protoplasto de aleurona de cebada es sobre la fase externa de la membrana del
plasma.
La senescencia de la hoja es un tipo de muerte celular programada que
constituye la fase final del desarrollo de la hoja, Gan y Amasino (1995) estudiaron
con plantas transgénicas de tabaco, que expresan el gene IPT, el desarrollo de un
sistema de inhibición de la senescencia; al controlar la expresión de IPT, un gene
que codifica la isopentenil transferasa (la enzima que cataliza la etapa limite-
promedio en la biosíntesis de la citocinina), con un promotor específico de la
senescencia, que resulta en la supresión de la senescencia de la hoja; las plantas
transgénicas que expresan este gen, no exhibieron el desarrollo anormal usualmente
asociado con la expresión IPT porque el sistema es autorregulado; debido a que es
producida suficiente citocinina para retardar la senescencia, la actividad del promotor
específico de senescencia es atenuada; las hojas con senescencia retardada
muestran una vida prolongada fotosintéticamente activas; este resultado demuestra
que de manera endógena se produce citocinina que regula la senescencia y
suministra un sistema para específicamente manipular el programa de senescencia.
Respecto a interacción entre hormonas, estudios sobre plantas enteras y
tejidos excisados han demostrado la existencia de sinergismo, antagonismo e
interacciones entre auxina y citocinina. En apoyo a la hipótesis que la auxina y
citocinina interactúan en múltiples planos, dos diferentes mutantes resistentes a
29
auxina de Arabidopsis, aux1 y axr1, los cuales sólo confieren la resistencia a
citocinina con respecto a la inhibición del crecimiento de la raíz, han demostrado que
operan en rutas de señalización separadas, esta evidencia genética sugiere que las
citocininas pueden interactuar con mínimo dos rutas independientes de señales de
transducción de auxina (Coenen y Lomax, 1997).
Las interacciones entre las hormonas vegetales auxina y citocinina por todas
las partes del desarrollo de la planta son complejas y las investigaciones genéticas de
la interdependencia de señalización de auxina y citocinina han sido limitadas
(Coenen y Lomax, 1998); estos investigadores caracterizaron la sensibilidad a la
citocinina en la mutante diageotrópica (dgt) de tomate (Lycopersicon esculentum
Mill.) en una amplitud de respuestas reguladas por auxina y citocinina. Las plántulas
dgt etioladas mostraron resistencia cruzada a citocinina con respecto a la elongación
de la raíz, pero los efectos de la citocinina sobre el crecimiento del hipocotilo y la
síntesis de etileno en esas plántulas no fue perjudicado por la mutación dgt, a las
siete semanas, el tipo silvestre verde y las plantas dgt fueron igualmente sensibles a
la citocinina con respecto al crecimiento de los brotes y la elongación de hipocotilo e
internudo; en la regeneración de órgano por cultivo de tejido de hipocotilo dgt los
explantes mostraron reducida sensibilidad a la auxina pero normal a la citocinina, y
los efectos de citocinina y la mutación fueron aditivos; sin embargo, aunque la
inducción de callos de hipocotilo dgt los explantes requirieron auxina y citocinina, el
callo dgt no mostró la típica concentración-dependiente de la estimulación del
crecimiento por auxina o citocinina observado en callo tipo silvestre; la resistencia
cruzada del mutante dgt a citocinina fue limitada a un pequeño subgrupo de procesos
de crecimiento regulados por auxina y citocinina afectado por la mutación dgt, se
indico que la auxina y citocinína regulan el crecimiento vegetal por medio de ambas
partes y rutas separadas de señalización.
En bioensayos con mezcla de BA y DPU (difenilurea) Christianson y
Hornbuckle (1999) no encontraron evidencia de competición para receptores de
citocinina; este resultado podría soportar las sugerencias que la citocinina fenilurea
30
actúa indirectamente, al alterar el metabolismo de la citocinina endógena, aunque
ellos favorecen otra interpretación, diferente u otros sistemas de respuesta a
citocinina. La inducción de yemas de los filamentos de protonema de musgo
involucra dos eventos mediados por citocinina, el número de yemas es controlado
por el segundo evento mediado por citocinina, si DPU fue pequeño o no afín por el
receptor al encender este segundo evento, tratamientos con DPU produce pocas o
ninguna yema, y el análisis cinético al usar número de yemas no encontró evidencias
por competición con BA, con base en sus resultados establecen la hipótesis que la
inducción de yemas en Funaria involucra dos receptores de citocinina químicamente
distintos.
Los elementos ocs son un grupo de elementos promotores que han sido
explotados por dos distintos grupos de patógenos de plantas, Agrobacterium y
ciertos virus, para expresar genes en plantas. Estos son una familia de secuencias de
ADN que relacionan 20-pb y son componentes importantes de los promotores de un
número de genes de Agrobacterium expresados en plantas, la expresión de dos
de esos genes, nopalína sintasa (nos) y manopina sintasa (mas), han mostrado ser
inducidos por la hormona auxina en plantas transgénicas (Zhang y Singh, 1994).
Los mecanismos moleculares de acción de las auxinas son pobremente
comprendidos, aunque avances recientes de estudios moleculares de genes
regulados por auxinas y acercamientos genéticos han contribuido para la
identificación de factores de transcripción, algunos con una función genética definida,
y en la demostración de la degradación de proteína regulada por la unión ubiquitin-
proteosoma, un papel clave en la acción de las auxinas (Leblanc et al., 1999). Dentro
de los últimos 10 años, acercamientos bioquímicos se han desarrollado con el
objetivo de identificar los receptores de auxinas, un número de compuestos solubles
y proteínas ligadas a auxinas en membranas asociadas han sido descritos, sin
embargo, en la mayoría de los casos su papel funcional en señalización, transporte,
o metabolismo de auxina no está claro (Jones, 1994; Venis y Napier, 1995). Aún la
31
función de la proteína ligada a la auxina más estudiada (ABP1) permanece difícil de
conseguir (Leblanc et al., 1999).
Para el mejor conocimiento del papel in vivo de la auxina endógena AIB, se
identificaron 14 mutantes de Arabidopsis que son resistentes a los efectos inhibitorios
de esta hormona sobre la elongación de la raíz, pero permanece sensible a la auxina
más abundante AlA. Estos mutantes tienen defectos en varias respuestas mediadas
a AIB, lo cual permitió agruparlas en cuatro clases de fenotipos. Para el desarrollo de
defectos en ausencia de sacarosa exógena se propone que algunos de estos
mutantes son perjudicados en el acortamiento de la cadena del ácido graso
peroxisomal e implican que la conversión de AIB a AlA es solo interrumpida (Zolman
et al., 2000).
La respuesta a la auxina incluye un crecimiento celular inicial rápido (dentro de
15 a 20 minutos) que puede involucrar cambios inducidos por auxina en pH y calcio y
una segunda fase que implica cambios inducidos por auxina en la expresión del gene;
los genes sensibles a auxina incluyen familias de genes de auxina (SAUR,
GH3 y Aux/IAA), los cuales tienen secuencias distintas conservadas de acción cis y
sus regiones promotoras, varios genes de la enzima glutation S-transferasa y un
gene para la ACC sintasa; la mayoría de las funciones en esos genes son
desconocidas (Eckardt, 2001).
En resumen, sobre señalización de las hormonas se menciona que éstas no
solamente controlan los principales aspectos del desarrollo, sino que también la
respuesta de las plantas al ambiente y que uno de los ensayos urgentes es sobre la
convergencia e interacción de varias rutas de hormonas (Bisseling y Weigel, 2001).
2.3. Micropropagación
El éxito de muchas técnicas in vitro en plantas superiores depende del éxito en
la regeneración de la planta, la aplicación de algunas técnicas, p. e. para el
32
aislamiento de mutantes y fusión de protoplastos in vitro, el cultivo de células está
limitado en muchas especies por la dificultad para regenerar plantas. La
regeneración de plantas es la piedra angular en la metodología del cultivo de tejidos,
sin ésta la hibridación de protoplastos, los estudios de crecimiento y diferenciación, la
generación de variabilidad genética, el cultivo de anteras, la donación comercial con
el propósito de una rápida multiplicación de especies deseables o difíciles de
propagar, la eliminación de enfermedades a través del cultivo de meristemos, y
muchos estudios de reguladores de crecimiento, serían imposibles de realizarse
(Tisserat, 1991).
También las dificultades de establecer cultivos asépticos de explantes maduros
de plantas leñosas está asociado con el necrosamiento de los explantes, la
contaminación microbiana y la oxidación fenólica, factores que limitan el progreso en
el desarrollo de la propagación in vitro de algunas especies (Guzmán y Gómez-Lim,
1997).
La "respuesta regeneradora" in vitro incluye la embriogénesis somática
(inducción de embriones somáticos) así como la organogénesis (formación de brotes
o raíces), procesos de morfogénesis que explantes in vitro seguirán para la
regeneración de una planta completa (Christianson y Warnick, 1988). La
organogénesis se origina por la formación inicial de meristemoides,
subsecuentemente primordios, brotes y finalmente la formación de raíces
adventicias; está se utiliza con mayor frecuencia debido a que se tiene un buen
conocimiento de su biología en un número considerable de especies (Vasil, 1994). La
embriogénesis somática es la formación de un embrión a partir de una célula, sin la
necesidad de la fusión de gametos (Zimmerman, 1993).
La regeneración de plantas a través del cultivo de tejidos puede establecerse
al usar uno de los tres métodos: cultivo de embriones, embriogénesis somática y
organogénesis; el cultivo de embriones es el cultivo aséptico de un embrión cigótico,
el embrión es obtenido de la semilla u óvulo y plantado sobre un ambiente substituto
33
del endospermo (por ejemplo, medio nutritivo); posteriormente el embrión desarrolla y
la germinación ocurre como debería ser desde la semilla (Tisserat, 1991).
El carácter totipotente de las células vegetales y tejidos puede ser expresado
por su habilidad para regenerar plantas vía embriogénesis u organogénesis, ambos
procesos conducen a la regeneración in vitro y son un prerrequisito para la
transformación genética. Sin embargo, la aplicación general de las técnicas de
transferencia de genes para el mejoramiento de cultivos puede no ser exitosamente
lograda si los procesos que dirigen la morfogénesis no son bien entendidos (Fortes y
Pais, 2000).
2.3.1. Organogénesis
La organogénesis consiste en un proceso morfológico secuencia) que se
traduce en la formación de órganos de novo, que se puede inducir reproduciblemente
a través de la manipulación química de los medios de cultivo (Villalobos, 1990; Pérez
et al., 1999)
En muchas ocasiones los explantes tienen la capacidad de desarrollar brotes,
raíces, o estructuras florales cuando se cultivan en un medio suplementado con sales
minerales, vitaminas, y una fuente de carbono pero sin hormonas vegetales. Este
proceso puede llamarse "organogénesis adventicia", la adición de hormonas
vegetales muchas veces puede facilitarlo, pero no son absolutamente requeridas. En
esta instancia, los precursores inmediatos de nuevos órganos son las células en el
explante mismo. El otro tipo de organogénesis es la no adventicia e involucra una
"desdiferenciación" del explante, formación de tejido calloso alrededor de la orilla del
corte del explante, y la inducción de órganos nuevos del tejido calloso recientemente
formado. El suplemento exógeno de fitohormonas no solamente controla los
procesos pero es necesario para que la organogénesis se presente (Christianson y
Warnick, 1988; Woodward, 1997).
34
Los primeros en demostrar que la organogénesis es controlada por el balance
entre auxinas y citocininas en el medio de cultivo fueron Skoog y Miller en 1957
(Minorsky, 2001). Un medio con mayor proporción de auxina en relación a citocinina
induce la formación de raíces, en tanto que en relación inversa se forman brotes y
con una relación intermedia auxina : citocinina se induce crecimiento desorganizado
como tejido calloso.
Frecuentemente es necesario eliminar las citocininas para el alargamiento y el
enraizamiento, según Von Arnold (1988) la capacidad de enraizamiento de las yemas
está altamente influenciada por la etapa juvenil de la planta madre y la fuente del
explante.
Los estudios de respuesta morfogenética in vitro se basan en combinaciones
diferentes de citocinína/auxina, p.e. al utilizar como explantes hojas de Duboisia
myoporoides y 65 combinaciones de citocinina/auxina se compararon los efectos
sobre la organogénesis; dos diferentes tipos de callos fueron inducidos dependiendo
de las combinaciones usadas para la inducción de callos; ningún brote con raíz fue
regenerado de los callos inducidos con 7 diferentes combinaciones citocinina/auxina
(Khanam et al., 2000).
2.3.1.1. Organogénesis en aguacate
Varios explantes de aguacate, desde embriones maduros e inmaduros,
meristemos y yemas axilares de plantas de vivero y árbol maduro, hoja, flor,
mesocarpo del fruto, pedúnculo, polen, cotiledón y protoplastos, han sido cultivados
in vitro. Sin embargo, los avances del cultivo de tejidos de aguacate está aún en
etapas tempranas (Pliego-Alfaro y Bergh, 1992; Mohamed-Yasseen, 1995a). Estos
investigadores señalan que promover la investigación en aguacate es una necesidad
para desarrollar sistemas de cultivo de tejidos con la ayuda de selección o
transferencia de algunos tratamientos deseables y la donación de las plantas
mejoradas. El cultivo de callos ha sido establecido en muchos explantes, pero la
35
formación de yemas adventicias de callos no fue lograda; la embriogénesis somática
fue obtenida de callo formado de embriones inmaduros (Skene y Barlass, 1983;
Money y Van -Staden, 1987; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988); en cuanto a brotes y
formación de plantas, fueron logradas con éxito al usar ejes embrionarios (Mohamed-
Yasseen et al., 1992), y yemas axilares (Schall, 1987); aunque se requiere una
considerable investigación para desarrollar un protocolo exitoso de regeneración in
vitro y propagación de aguacate.
Al igual que todas las especies leñosas, el aguacate ha presentado
dificultades en su propagación in vitro. En 1976, Schroeder con el objetivo de
desarrollar técnicas para obtener material clonal de aguacate por cultivo de
meristemos apicales para patrones u otros propósitos y basado en reportes previos,
indicaba que los tejidos de casi todas las partes de la planta de aguacate pueden ser
cultivados in vitro como masas de callo. El comportamiento general del material
tomado como "yemas intactas" cuando es cultivado en medio, con un amplio rango
de nutrimentos, origina la formación de callo en la superficie del corte o en la periferia
de éste; ocasionalmente algunas yemas presentan algún crecimiento longitudinal y
eventualmente una proliferación de callo a una distancia de 4-5 mm; finalmente, se
observa que la etiolación de plántulas o plantas injertadas y la posterior obtención de
tejido (yemas) no ha desarrollado ventaja alguna, excepto un mesurado crecimiento
longitudinal pero con un callo masivo en la base del explante (Schroeder, 1976).
Nel y col. (1982) obtuvieron brotes de 3-5 cm de plántulas de 1 año de P.
indica, de éstos sembró pequeñas yemas de 5 mm con uno y dos nudos en medio
MS (Murashige y Skoog, 1962) que contenía ácido ascórbico (25 mg/I), ácido
giberélico (1mg/l), vitaminas y otros componentes; para el cultivo inicial y
subsiguiente multiplicación fue añadido BA a una concentración de 2 mg/I; el
enraizamiento fue inducido con 2 mg/l de AIB adicionado al medio; con este
procedimiento obtuvieron plántulas de 6 cm de altura en 5 semanas, las mismas que
se dividieron en entrenudos y recultivaron, desarrollaron hasta 12 brotes que
enraizaron en 3 semanas. De las plántulas con raíz 50% sobrevivieron después del
36
trasplante al suelo; sin embargo, con el cultivar Duke 7 el cultivo de tejidos no fue
éxitoso.
El portainjerto Duke 7 resistente a P. cinnamomi es ampliamente usado en
Sur África, pero su propagación por métodos convencionales es baja. En ensayos
con 3 diferentes tipos (fuente y edad) de explantes, 4 medios básicos de cultivo in
vitro y 20 combinaciones de auxina y citocinina, no se presentó enraizamiento en
todos los tratamientos. Sin embargo, de moderado a un extensivo crecimiento de
callo basal ocurrió en algunos tratamientos de BA y AIB, así como el crecimiento de
algunos brotes (Bower et al., 1983).
Al establecer in vitro embriones inmaduros de aguacate (P. americana) de
árboles de 15 años de edad del cultivar Fuerte, Skene y Barlass (1983) en Australia,
encontraron que embriones menores a 6 semanas de edad rara vez produjeron brotes
viables, y aunque algunas veces las hojas se expandieron cuando el BA (0.5
mg/l) estuvo presente, los tallos no presentaron elongación (alargamiento). Para
embriones de más de 6 semanas, el desarrollo fue extremadamente bajo.
impredecible e independiente del tratamiento, a menos de que BA fuera incluido en el
medio; en este estudio también utilizaron ejes embrionarios de semillas maduras del
cultivar Fuerte, los que respondieron rápidamente en medio MS líquido a la mitad de
sus sales con BA (0.5 mg/I); después de 19 días de cultivo, los brotes principales de
cada eje, y cuatro a cinco laterales sufrieron elongación. Estos brotes fueron
cortados después de los 40 días de cultivo y más brotes fueron estimulados a
elongación sobre los ejes embrionarios. Aunque los brotes cortados fueron lentos
para enraizar, el tratamiento alcalino (aplicación a la base de cada brote con 1 N de
NaOH por 20 segundos) estimuló de 30 - 50% de brotes a formar raíces.
González y Salazar (1984) utilizaron segmentos de tallo de P. americana var.
americana raza antillana, cultivados a partir de semilla y pre-tratados bajo tres
condiciones de luz (parcial , total y oscuridad), se establecieron en medio MS con
diferentes concentraciones de AIB, sólo o en combinaciones con cinetina (K); el
37
crecimiento de yemas axilares de segmentos no etiolados fue observado en medio
conformado por 0.3 mg/1 de AIB y 0.1 mg/1 de K, la formación de raíz fue inducida en
condiciones de iluminación total en medio con 7.5 mg/1 y 10 mg/1 de AIB.
González y col. (1985) emplearon segmentos de tallo de P. schiedeana
cultivados a partir de semillas y pre-tratados bajo tres condiciones de luminosidad
(oscuridad, luz parcial y total) e incubados en medio MS con diferentes
concentraciones de AIB sólo o combinado con K, para establecer esta especie no fue
necesario que los explantes recibieran pre-tratamiento con oscuridad e iluminación
parcial y total, ni fue necesario añadir carbón activado al medio base; el crecimiento
de yemas axilares lo observaron en un medio conformado por 0.1, 1.0 y 0.01 mg/1 de
AIB, en tanto que el crecimiento de yemas con expansión de hojas fue logrado con 1
mg/l de AIB+ 0.3 mg/l de K, 3 mg/1 de AIB+1 mg/l de K y 3 mg/1 de AIB + 0.01 mg/l
de K; plántulas completas fueron generadas en un medio con 1 mg/1 de AIB y 1 mg/l
de K.
En Nueva Zelanda, Cooper (1987) utilizó para su establecimiento in vitro
segmentos nodales con yemas axilares de plantas de semilla de aguacate (P.
americana) de los cultivares Hopkins y Hass, que crecieron en invernadero bajo luz
natural y posteriormente se colocaron en un cuarto obscuro (a 20°C y 50% de
humedad relativa) para producir brotes etiolados; cuando los explantes se
sumergieron en etanol al 95% por 2 a 5 segundos, se obtuvo una reducción de la
contaminación a niveles aceptables (0-16%); se estimuló el crecimiento de las yemas
axilares (65-85% de brotación en 4 semanas) con 1 mg/1 de BA en medio basa) (MB)
formado con sales minerales de medio para plantas leñosas (WPM) (Lloyd y
McCown, 1980), vitaminas, sacarosa (30 g/I) y agar bacteriológico (Davis, 7 g/¡). El
medio de multiplicación consistió en MB, AIB (0.1 mg/I) y BA (0.3 mg/I) donde solo se
logró el enraizamiento en los brotes con hojas grandes bien formadas que estuvieron
6 semanas en medio de multiplicación, para esta etapa se probó el enraizamiento in
vivo e in vitro, se encontró en el primero menor formación de callo y un enraizamiento
rápido (en 4 semanas del 80 al 100%), este tratamiento consistió en colocar los
38
brotes en una solución acuosa con 3,000 mg/I de ANA por 1 segundo y establecidos
inmediatamente en sustrato de piedra pómez: suelo de turba (50:50 v/v) bajo un
pabellón de una alta humedad, temperatura de 26°C y neblina intermitente (2
segundos cada 30 minutos). En este estudio también se realizaron pruebas para la
micropropagación de material adulto de Duke 7 sin resultados exitosos.
En 1987, Schall experimentó la propagación in vitro de P. americana cv.
Fuerte, utilizó como explantes plantas injertadas, tallos cortos de 2 a 4 años de edad,
sembrados en medio MS, mezcla de vitaminas de Morel, FeEDTA (25 mg/I),
NaH2PO4 (170 mg/I), mioinositol (100 mg/I) y sacarosa (30 g/l); logró la proliferación,
crecimiento y enraizamiento de brotes. El uso de BA de 5-10 mg/I en el medio de
cultivo fomentó la formación de tallos jóvenes, sin embargo, problemas como
necrosis, oxidación de explantes, ligados con la producción de etileno, estuvieron
presentes, las plántulas fueron transferidas al invernadero con un 80% de éxito.
Pliego-Alfaro y col. (1987) reportan que la necrosis apical fue la causa
principal de muerte de los brotes cuando se multiplicó por cultivo de tejidos los
portainjertos de aguacate IV-8 y GA-13; el uso de medio de doble fase o recultivos
múltiples a intervalos cortos, previno el problema antes indicado; la vitrificación fue
otro problema serio, especialmente cuando se usaron técnicas de doble fase de
medio. Estos investigadores cortaron brotes de 15 a 25 cm de longitud, removieron
las hojas, mismos que fueron esterilizados por inmersión en hipoclorito de sodio al
0.5% durante 10 minutos, inmediatamente después fueron divididos en trozos de 1-
1.5 cm que contenían yemas laterales; el medio de doble fase contenía las sales MS,
pero con macroelementos al 50% y otros componentes en las siguientes
concentraciones en mg/I: sacarosa (30,000), inositol (100), tiamina HCI (0.4) y agar
(8,000), la concentración de BA fue 0.65 mg/1 en medio semisólido y 0.1 mg/I en
medio líquido. El medio final de desarrollo para multiplicación del GA-13 incluyó la
mezcla de macroelementos, N y K, los microelementos MS y las concentraciones en
mg/1 de sacarosa (30,000), mioinositol (100), tiamina HCI (0.4), BA (1) y bacto-agar
(8,000). La capacidad de enraizamiento se determinó con el uso de una secuencia
39
de dos etapas que incluye tres días de cultivo en medio basa) con macroelementos
MS diluido a 0.3 X y 1 mg/1 de AIB y la subsiguiente transferencia a medio similar de
AIB pero con 1 mg/1 de carbón activado; todos los cultivos fueron incubados a 25°C,
1500 lux y 8:16 h de obscuridad y luz.
Solórzano-Vega (1989) utilizó plantas de aguacate del cultivar Colin V-33 y
una selección adaptable a suelos salinos, mismas que ubicó en una cámara de
etiolación por un período de 30 días. Una vez etioladas fueron establecidas in vitro
en tubos con medio MS, metasulfato de potasio fue añadido para reforzar las
condiciones nutritivas del sustrato. Un control total de la oxidación fue logrado con la
aplicación de metasulfato de potasio, en tanto que el radio óptimo de reguladores fue
de 2 mg/1 de BA y GA3 en iguales cantidades, 25% de los explantes de Colín V-33
murieron debido a la presencia de bacterias.
Con base en los resultados obtenidos por Pliego Alfaro y col. (1987), sobretodo
en el medio de doble fase para la etapa de proliferación, Zirari y Lionakis
(1994) en Grecia tomaron explantes (puntas de brotes y segmentos nodales solos,
ambos cerca de 1.5 cm de longitud) de brotes de aguacate que crecieron
activamente después de la poda del tronco principal, en árboles de 19 años de edad
de los cultivares Topa-Topa, Hass y Fuerte. Dos clases de este material fueron
usados (brotes del año en curso después de la poda y brotes de 2 años de edad), el
material adulto de Duke (13 años de edad) fue también usado y éste obtenido de
brotes nuevos de varetas incubadas bajo luz continua a 25°C. El material etiolado fue
obtenido de nuevos brotes de varetas que crecieron bajo total oscuridad a 25°C. Los
resultados que obtuvieron señalan que los explantes puntas de brotes produjeron más
proliferación de brotes que los segmentos nodales; el cultivar Topa-Topa
produjo el más alto número de brotes axilares, seguido por Fuerte y Hass; el
tratamiento de etiolación mejoró significativamente la producción de brotes axilares,
la elongación y el número de hojas, especialmente de material del portainjerto Duke.
Las pruebas para enraizar microbrotes de aguacate no fueron exitosas, debido a la
severa necrosis del brote después de la transferencia a medio de enraizamiento.
40
Mohamed-Yasseen (1995b) describe un método para propagar in vitro
aguacate a partir de ejes embrionarios de semillas maduras de seis cultivares de
Florida (Dade, Maxima, Cataloina, Tower 2, Waldin y Choquette), los cuales cultivó
en medio MS suplementado con 100 mg/1 de mioinositol, 30 g/I de sacarosa, 8 g/I de
agar sin reguladores de crecimiento o con diferentes combinaciones de BA (1, 2, 3
mg/I) o TDZ (0.2, 1, 2 mg/I) y 0.1 mg/1 de ANA. Los explantes fueron incubados en la
oscuridad por 7 - 10 días para reducir la necrosis-oxidación y transferidos a un
fotoperiodo de 18 horas. Los ejes embrionarios respondieron a la adición de BA al
incrementar a 8 brotes por explante, cuando el medio MS fue usado solo (sin
reguladores de crecimiento) se formó un brote y pequeñas yemas laterales pero
abatidas por la dominancia apical del brote principal. Los brotes múltiples fueron
subcultivados para su multiplicación en medio MS fresco con BA, los brotes fueron
enraizados en MS con 2 mg/1 de AIB.
Embriones maduros de semillas de aguacate (P. americana cv. americana,
raza mexicana) fueron cultivados en medio MS suplementado con K y/o AIB a
25±2°C por 21, días en obscuridad seguido por 14 días de luz continua. La
germinación del embrión, producción de un brote y raíz de 0.5 cm de longitud
mínima, fue en el 100% de los embriones cultivados con 0.3 mg/1 de AIB y 0.1 a 0.3
mg/1 de K; concentraciones mayores a 0.3 mg/1 de AIB redujeron la germinación. El
mayor número de brotes adventicios fue obtenido con 3.0 mg/1 de AIB y 0.1 mg/1 de
K. La máxima longitud del brote (12.5 cm) fue alcanzada con la combinación de 1
mg/1 de AIB y 1 mg/1 de K. La máxima longitud de raíz (4.9 a 6.6 cm) fue obtenida con
AIB entre 0.3 y 1 mg/1 combinado con 0.1 a 1 mg/1 de K (Llano-Agudelo et al., 1995).
Entre los últimos reportes se encuentran los de Barceló-Muñoz y col. (1999)
quienes en España, desarrollaron un procedimiento para micropropagar la selección
IV-8, un portainjerto de aguacate adulto; el cultivo fue iniciado de brotes básales
obtenidos después de podar un árbol a nivel del suelo; las yemas brotaron en medio
sólido MS con los macroelementos a la mitad de la concentración de las sales (MS
41
0.5X) y 1.3 µM de BA; para inducir proliferación, los brotes fueron cultivados por 2
semanas en medio líquido en un agitador giratorio con la formulación de sales de
Gamborg (Gamborg, 1966) y 1.3 µM de BA, seguido por 6 semanas en condiciones
de doble fase (medio sólido con una capa de medio líquido arriba) al usar la misma
formulación de sales y dos diferentes dosis de BA, 2.8 µM en la fase sólida y 0.4 µM
en la fase líquida; el 90% de los brotes enraizaron después de 3 días de cultivo en
medio líquido en un agitador giratorio con macroelementos MS 0.3X y 4.9 µM de AIB,
seguido por la transferencia a medio sólido en ausencia de auxina pero con 1 g/l de
carbón activado; el promedio de supervivencia durante la aclimatación en el
invernadero fue del 70%.
En resumen, los esfuerzos para micropropagar el aguacate vía organogénesis
han sido enormes, se han estudiado con diferentes explantes (Mohamed-Yasseen,
1995a) y con tres especies de Persea y con varios portainjertos e injertos
sobresalientes. Sin embargo, falta el establecimiento de un sistema que garantice en
un 100% la propagación clonal, ésto porque al tomar como explantes ejes
embrionarios y embriones cigóticos no se tendría la certeza de estar propagando
idénticamente desde el punto de vista genético, el material de origen del explante.
Por otra parte se requiere que este sistema permita la micropropagación con material
de árboles adultos para la conservación in vitro de germoplasma, o sea evitar la
aplicación de podas del tallo principal y trabajar con rebrotes, o bien, con plántulas de
vivero propagadas por semilla; además que sea práctico y económico, es decir que
se manejen los componentes y dosis mínimas en los medios de cultivo, que su
preparación no implique complicación alguna y se evite la dependencia de equipo y
procedimientos sofisticados, que lo único que ocasionan es el incremento en los
costos de producción por planta.
Así, se demanda un sistema de micropropagación de aguacate vía
organogénesis que apoye una serie de aplicaciones futuras del cultivo de tejidos,
principalmente en la conservación in vitro, la regeneración de plantas a partir de
tejidos tratados con agentes mutagénicos, bien sean físicos o químicos, para la
42
producción de variantes y mutantes a evaluar ante factores biótícos y abióticos que
afectan al cultivo del aguacate, entre otros aspectos.
2.3.2. Embriogénesis somática
La embriogénesis somática es el proceso de iniciación y desarrollo de
embriones desde células que no son el producto directo de la fusión de gametos, es
un fenómeno natural en muchas especies in vivo (Janick, 1993). Los embriones
somáticos tienen, al igual que los cigóticos, la capacidad de formar una nueva planta
después de un proceso de germinación, con la diferencia de que la embriogénesis
somática es un proceso asexual por lo que la nueva planta será exactamente igual a
la donadora de la célula inicial. Aún no se conoce con exactitud el proceso de
inducción de ésta, pero se sabe que implica un cambio drástico en los patrones de
expresión genética mediante el cual las células pasan del patrón normal a uno
embriogénico. Existen dos tipos de embriogénesis somática in vitro, la directa y la
indirecta, en la primera los embriones aparecen directamente sobre el explante
original, en tanto que en la segunda es indispensable obtener un tejido calloso o bien
una suspensión celular embriogénica a partir de la cual se obtendrá la diferenciación
de los embriones somáticos (Tisserat, 1991; Pérez et al., 1999).
Debido a la totipotencia de las células vegetales, la embriogénesis somática
puede ser inducida de tejidos diferenciados y órganos de muchas especies, se
incluye polen, mesófilo, tallo, raíz y protoplastos aislados (Carman,1990).
La embriogénesis somática es un sistema ideal para investigar los procesos
completos de diferenciación de plantas, así como los mecanismos de expresión de
totipotencia en células vegetales, tiene muchas ventajas comparado con la
embriogénesis cigótica; por ejemplo, a) el proceso de embriogénesis es fácilmente
monitoreado, b) el ambiente del embrión puede ser controlado, y c) un gran número
de embriones puede fácilmente ser obtenido (Nomura y Komamine, 1999).
43
Los embriones somáticos son estructuras bipolares con un eje radical-apical y
carecen de conexión vascular con el tejido materno; estas estructuras bipolares son
capaces de crecer y formar plantas; este método es considerado el más eficiente
para la producción masiva de plantas “in vitro”, ya que se puede regenerar un gran
número de plantas por unidad de tiempo (Villalobos y Thorpe, 1991; Gómez, 1998);
Adicionalmente, al cultivar en medio líquido embriones somáticos con ayuda de un
biorreactor, se disminuye el costo de producción de una planta de laboratorio de
cultivo de tejidos, ya que en algunas especies, como por ejemplo en café (Coffea
arabica var. Catimor) se han alcanzado producciones de hasta 72,000 embriones
somáticos/1 de medio con más de un 80% de conversión (Jiménez y de Feria, 1998).
Se entiende por conversión como la supervivencia y desarrollo en fase de propágulo
en condiciones ambientales ex vitro o sea en suelo (Stuart y Strickland, 1984).
Parrot (1993) y Gómez (1998) mencionan que el desarrollo de un sistema
experimental para la regeneración de plantas vía embriogénesis somática incluye los
siguientes pasos: inducción de los embriones somáticos, desarrollo de los embriones
somáticos, proliferación, maduración, germinación y conversión en plantas. Pérez y
col. (1999) indican que consta de las etapas de:
a) Inducción. Proceso de conversión de una célula somática a una célula
proembriogénica, para que éste se presente son factores determinantes el genotipo, el
grado de diferenciación de las células del explante, las auxinas y el aislamiento
celular.
b) Histodiferenciación. Las masas de células proembriogénicas se diferencian
al formar embriones somáticos, mediante una división y diferenciación celular
simultáneas; se requiere la eliminación de las auxinas exógenas para que se detenga
la multiplicación y ocurra la diferenciación; en esta etapa los embriones somáticos
pasan por una serie de estadios intermedios muy similares a los que ocurren en la
embriogénesis cigótica; en las dicotiledóneas estos son: globular, de corazón y de
torpedo, mientras que en las monocoltiledóneas son: globular, coleoptilar y escutelar.
c) Maduración. Durante esta etapa ocurre una elongación celular sin división;
Bewley y Black (1985) mencionan que la maduración es el periodo en el desarrollo
44
del embrión somático en el cual ocurre la expansión de la célula y la acumulación de
sustancias de reserva, para la mayoría de las especies se sabe que los estímulos
que hacen posible la maduración de los embriones son la desecación y el ABA.
d) Germinación. Proceso de elongación y reactivación metabólica de un
embrión somático maduro para convertirse en una plántula; los estímulos requeridos
son tratamientos con frío, incubación en presencia de luz o aplicaciones de ácido
giberélico o citocininas.
De acuerdo con Lozoya (1990) los principales factores que intervienen en la
embriogénesis somática son:
a). Medios de cultivo. Se indica la adición de substancias al medio para
favorecer la embriogénesis, entre ellas se incluyen la tiamina, ácido nicotínico,
piridoxina, glicina, mio-inositol, adenina y auxinas.
b). Luz y temperatura. En zanahoria y cítricos, especies en donde los estudios
de embriogénesis han sido más profundos, se reporta que luz y temperatura son
determinantes para que ésta se presente; en general una intensidad lumínica de
1,000 a 3,000 lux y una temperatura de 25-28°C son adecuadas.
Aunado a lo anterior, la embriogénesis somática es también afectada por el
genotipo de la planta, el tipo y estado fisiológico del explante, los reguladores de
crecimiento y las condiciones de cultivo (Gómez, 1998). Aunque cambios en el pH
inducen la embriogénesis somática en zanahoria (Krikorian y Smith, 1992), en cultivo
de Picea abies, la inducción promedio fue más alta entre pH de 6.5 a 7.5 que entre
pH 5 a 6 (Von Arnold, 1987). En tanto que Rugkhla y Jones (1998) en Santalum
album y S. spicatum obtuvieron una alta frecuencia de inducción de embriogénesis
somática (100%) en medio MS con TDZ (1 o 2 µM) y pH ajustado a 5.8, para el
desarrollo, mantenimiento y multiplicación de los embriones somáticos emplearon
AlA (6 µM) y cinetina (1 µM), y en la germinación AG3 (6 µM).
Además de la multiplicación in vitro de los tejidos vía embriogénesis somática,
también puede aplicarse al callo embriogénico tratamientos mutagénicos y
45
recuperarse los embriones somáticos desarrollados de una sola célula mutada;
dichos embriones serían de mucho mayor valor puesto que no serían quimeras
(Zimmerman, 1988). Los usos de la embriogénesis somática pueden resumirse como
a continuación se anota: propagación clonal (micropropagación o producción de
semilla sintética), mejoramiento del cultivo (selección de células, rescate de
embriones, transformación, hibridación somática y producción de líneas
homocigóticas), producción de metabolitos, eliminación de enfermedades y
conservación de germoplasma (Janick, 1993).
En la actualidad existen varios reportes de estudios realizados en frutales
perennes y otras especies de cultivo para producir embriogénesis somática (Cuadro
1) entre los que se observa que el explante más frecuentemente utilizado es la
nucela y los embriones cigóticos inmaduros, cultivados sobre el medio de cultivo MS
con la auxina 2,4-D en combinación con citocininas como BA, KIN y 2iP. Sin
embargo, es señalado el papel del 2,4-D en la incidencia de la variación genética y
los cambios epigenéticos que aparecen en plantas obtenidas de embriones
somáticos, no obstante que en muy pocas especies de plantas se han realizado
estudios en campo durante varios años de poblaciones regeneradas vía
embriogénesis somática, uno de los ejemplos es en palma de aceite por más de 10
años (Merkle et al., 1996), quienes reportan 11 % más de productividad en las plantas
obtenidas mediante embriones somáticos en relación a las de semilla; además
mencionan que la variabilidad somaclonal es rara y que no existe relación entre el
tiempo de multiplicación in vitro de los embriones y el porcentaje de anormalidades.
2.3.2.1. Embriogénesis somática en aguacate
Mooney y Staden (1987) utilizaron embriones inmaduros obtenidos de frutos de
3 a 4 mm de longitud de los cultivares Fuerte y Duke-7 de P. americana, que fueron
establecidos sobre medio de inducción de callo, MS modificado de acuerdo con
Pliego-Alfaro (1981) y suplementado con sacarosa 30,000 mg/I, tiamina-HCI 0.4 mgll,
mioinositol 100 mg/I, picloram 0.1 mg/l y carbón activado 1,000;mg/l; obtuvieron
46
Cuadro 1. Embriogénesis somática en frutales perennes y otras especies de cultivos.
Reguladores de
crecimientod
Familia Especie Explanteb Medioc Auxina Citocinina Citado por
Anacardiaceae Mangifera indica N,E MS 2,4-D ----- Litz et al. (1984)
Caricaceae Carica papaya S MS AlA KIN Yie y Liaw (1977)
Juglandaceae Juglans regia C * AIB BA, KIN Tulecke y McGranahan (1985)
Lauraceae Persea americana E MS PIC Pliego-Alfaro y Murashige (1988)
Musaceae Musa (AAA, ABB) L,R MS Dicamba ZEA Novak et al. (1989)
Myrtaceae Feijoa sellowiana E MS 2,4-D KIN Cruz et al. (1990)
Myrciaria cauliflora N MS 2,4-D ----- Litz (1984)
Oleaceae Olea europaea E MS 2,4-D BA Rugini (1988)
Palmae Cocos nucifera Inf MS 2,4-D BA,2iP Branton y Blake (1983)
Phoenix dactylifera E MS 2,4-D 21P Reynolds y Murashige (1979)
P. dactylifera ST MS 2,4-D 2iP Tisserat (1979)
Rosaceae Eriobotrya japonica N MS 2,4-D BA Litz (1985)
E. japonica ST MS 2,4-D BA Ho et al. (1986)
E. japonica E MS 2,4-D BA Ho et al. (1986)
Malus x domestica
M. x domestica
Prunus persica
N
C,L
E
MS
N
MS
ANA
ANA
2,4-D
BA
BA
BA, KIN
Eicholtz et al. (1980)
Mehra y Sachdeva (1984)
Raj Bhansali et al. (1990)
Rubiaceae Coffea arabica L MS 2,4-D KIN Sondahi y Sharp (1977)
Coffea canephora S MS 2,4-D KIN Staritsky (1970)
47
Cuadro 1. (Continuación).
Reguladores de
crecimiento
Familia Especie Explanteb Medioc Auxina Citocinina Citado por
Rutaceae
Sterculiaceae
Vitaceae
Citrus liman
Citrus nobilis
Citrus paradisi
Citlus sinensis
Theobroma cacao
Vitis longii
Vitis vinifera
Vitis vinifera
Vitís sp.
N
N
N
N
E
O
N
E
S,L,P
MS
MT
MT
MS
MS
MS
N,MS
N
MS
-----
-----
-----
-----
ANA
2,4-D
NOA
NOA
2,4-D
-----
-----
-----
-----
-----
KIN
BA
BA
BA
Rangan et al. (1968)
Kochba et al. (1982)
Kochba et al. (1982)
Rangan et al. (1968)
Pence et al. (1979)
Gray y Mortensen (1987)
Mullins y Srinivasan (1976)
Stamp y Meredith (1988)
Krul y Worley (1977)
a Medio de inducción.
b C = cotiledón; E = embrión cigótico; Inf = inflorecencia; L = hoja; N = nucela; O = ovario; P = peciolo; R = raíz; S = tallo; ST =
meristemo.
c MS = Murashige y Skoog (1962); MT = Murashige y Tucker (1969); N = Nitsch (1969); * = formación específica.
d KIN = cinetina; PIC = picloram; ZEA = zeatina; AlA = ácido indol-3-acético; AIB = ácido indolbutírico; ANA = ácido
naftalenacético; NOA = ácido naftoxiacético; 2,4-D = ácido diclorofenoxiácetico; 2iP= 2, isopenteniladenina.
48
callo embriogénico el cual lo subcultivaron a intervalos de 2 a 3 semanas en medio
de Dixon y Fuller (1976) suplementado con 3 mg/1 de isopentiladenosina (IPA) y
ácido benzotiazol-2-oxiacético (BTOA); la regeneración de plantas fue lograda a
través del subcultivo de los proembriones globulares en las sales y vitaminas del
medio anterior, sin reguladores de crecimiento. En los estudios histológicos,
observaron que el callo se formó arriba del tejido normal parenquimatoso hacia el
centro de un grupo de células y numerosas células proembrionales en la periferia de
la masa de los callos; la embriogénesis inició en células individuales en la periferia de
los callos y desde células en la superficie de proembriones existentes; los embriones
iniciales pudieron ser reconocidos por su manifiesto contenido de almidón y por sus
paredes gruesas, las cuales carecen de plasmodesmo; las divisiones celulares
ocurren en células con paredes gruesas para dar origen a proembriones globulares;
los proembriones desarrollaron forma acorazonada, de torpedo y en embriones
cotiledonarios y finalmente hacia plantas completas.
Un procedimiento de cultivo de tejidos fue desarrollado para la regeneración de
embriones somáticos de callos cultivados de aguacate; embriones cigóticos
inmaduros de P. americana de 0.6 a 0.8 mm de longitud fueron utilizados como
explante original; el medio basa) contenía sales MS con sacarosa 30,000 mg/I,
tiamina-HCI 0.4 mg/l, mioinositol 100 mg/l y fue solidificado con 8% de agar, el pH fue
fijado a 5.7; la adición de 0.1 mg/1 de picloram al medio de cultivo parece ser crítica
para la iniciación de callos, concentraciones bajas (0.001 - 0.01 mg/I) o altas (1 mg/I)
fracasaron para inducir callos, el desarrollo de embriones fue establecido en las
concentraciones de 0.01 a 0.1 mI/I de picloram; unos pocos embriones bien
desarrollados produjeron brotes verdes; los ensayos para inducir una alta incidencia
de germinación fue desafortunada (Pliego Alfaro y Murashige, 1988).
Litz (1997) explica que el principal objetivo de las investigaciones que realiza en
Florida, USA, es una nueva generación de portainjertos de aguacate con alto nivel
de resistencia a Phytophthora pudrición de la raíz (PRR); en sus estudios tiene 3
objetivos: 1) la hibridación somática de aguacate con especies de Persea resistentes
49
a PRR por medio de la fusión de protoplastos, 2) la transformación genética de
portainjertos de aguacate con genes relacionados a la patogénesis y 3) el desarrollo
de un protocolo eficiente in vitro para micropropagación de los portainjertos actuales
y los futuros. También indica que muchos frutos tropicales y subtropicales pueden
reproducirse vegetativamente por la formación de nucelas, éste es un tejido ovular de
origen materno; así se debe tener la habilidad para demostrar la facilidad de regenerar
las selecciones de aguacate elite por inducción de embriogénesis somática
de nucelas, después de removerse de semillas jóvenes; los embriones nucelares de
aguacate pueden ser utilizados para propagar las selecciones de portainjertos
actuales, pero pueden también ser utilizadas en estudios de transformación genética
en orden para alterar un cultivar importante por un tratamiento, tales como el control
de la madurez de la fruta o PRR.
Se indujo el desarrollo de cultivo de callos a partir de peciolos de hojas, yemas
axilares y embriones cigóticos de nueve variedades de cinco especies de Persea (P.
cinerascens, P. borbonia, P. schiedeana var. G755, P. indica, P. americana cv. Topa
topa y cv. RCF Púrpura, y tres clones vegetativos de P. americana : VC6, VC51 y
VC66), con variación en su resistencia a la pudrición de la raíz del aguacate,
enfermedad causada por el hongo Phytophthora cinnamomi; fueron establecidos
procedimientos de desinfección de explantes y cultivos de callos y suspensiones;
fueron determinados parámetros de crecimiento comparativos para varios callos; la
yema axilar y el peciolo de hoja fueron los mejores explantes para la inducción de
callo en todas las variedades excepto para P. borbonia, la cual fue mejor inducida de
semillas maduras; un alto promedio de supervivencia (70%) de embriones somáticos
fue logrado de callo de aguacate (P. americana) en un medio con ácido abscísico 10
mg/I; brotes o brotes y raíces desarrollaron de embriones somáticos en un 12% y 1 %,
respectivamente, en un medio que contenía 0.1 mg/l de thidiazurón + 0.5 mg/I de
ácido giberélico; los cultivos de Persea se utilizaron para estudiar su respuesta a la
inoculación de P. cinnamomi y para una posible selección in vitro de nuevos clones
resistentes (Raviv et al., 1998).
50
Cruz (1998) a partir de embriones cigóticos inmaduros de aguacate induce la
formación de callo embriogénico en medio de cultivo basado en los
macronutrimentos minerales B5 (Gamborg et al., 1968) y micronutrimentos MS,
tiamina 4 mg/I, mioinositol 100 mg/I, picloram 0.1 mg/l, sacarosa 30 g/I y agar 8 g/I; el
mantenimiento de las masas proembriogénicas fue logrado en el mismo medio de
inducción con excepción de los macronutrimentos, en esta etapa y en las siguientes
usó MS; en la recuperación de embriones somáticos no utilizó reguladores de
crecimiento, en el desarrollo y maduración de embriones utilizó BA (0.1 mg/l) y
solamente en la última etapa empleó AG3 (0.1 M9/0
Un grupo de investigadores de Malaga, España (Perán-Quesada et al., 1999)
estudiaron el efecto del regulador de crecimiento ácido abscísico, la sacarosa y un
agente gelificante (gelrite), sobre la producción y maduración de embriones
somáticos de aguacate; partieron de callo embriogénico del cv. Anaheim, iniciaron
suspensiones en medio basa) MS suplementado con picloram 0.1 mg/l; filtraron las
suspensiones a través de una malla de 2 mm de diámetro y cultivaron la fracción más
pequeña en medio basa) B5 solidificado con 1.7 g/I de gelrite y suplementado
con: 88, 175, 263 mM de sacarosa o 1, 10 y 100 µM de ABA; en el experimento con
gelrite se utilizó medio basa) B5 solidificado con 1.7, 3.4 y 6.8 g/I de gelrite;
encontraron que la concentración del agente gelificante tuvo un efecto significativo
sobre la producción de embriones somáticos observándose que tanto el número de
embriones blanco-opacos, mayores y menores de 5 mm, como el porcentaje de
regeneración, fueron mayores en la concentración más alta de gelrite, 6.8 g/l; la
ytilizapión de elevadas concentraciones de sacarosa también tuvo un efecto positivo
sobre la formación de embriones somáticos blanco-opacos, en dosis de 175 mM de
sacarosa se obtuvo el mayor número de embriones, así como el mayor porcentaje de
regeneración a lo largo de tres subcultivos; los resultados obtenidos con el ABA no
fueron concluyentes.
En Florida, USA, Witjaksono y Litz (1999a) indujeron cultivo embriogénico de
embriones cigóticos inmaduros de aguacate (colectados entre las 3 semanas a 2
51
meses después de la polinización) representado por diferentes razas botánicas e
híbridos complejos; el medio de inducción óptimo consistió de macronutrimentos B5,
micronutrimentos MS, tiamina-HCI 0.4 mg/I, mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/I,
picloram 0.41 µM y agar TC 8 g/I; la embriogénesis somática se presentó directamente
de los explantes en medio de inducción, y proliferaron embriones secundarios y
masas proembriogénicas en medio de mantenimiento líquido y en sólido; el
mantenimiento del cultivo embriogénico fue optimizado en líquido, el medio MS
filtrado-esterilizado, se suplementó con sacarosa 30-50 mg/I, tiamina-HCI 4 mg/I y
picloram 0.41 µM; dos tipos de cultivo embriogénico se reconocieron: genotipos que
proliferaron como masas proembriogénicas (tipo-PEM) en presencia de auxina y
genotipos en los cuales la etapa de corazón y las etapas posteriores de embriones
somáticos (tipo-SE) desarrollaron en presencia de auxina; los cultivos embriogénicos
en suspensión llegaron a ser cada vez más desorganizados con el tiempo, y esto fue
asociado con una perdida progresiva del potencial embriogénico.
En otro estudio (Witjaksono y Litz, 199%) utilizaron masas proembriogénicas
de aguacate de cultivos en suspensión para establecer un protocolo en el desarrollo
y maduración de embriones somáticos; los embriones somáticos desarrollaron de
masas proembriogénicas tanto en medio líquido como en semisólido pero sólo los
últimos pudieron desarrollarse para maduración; el tamaño y el número de los
embriones somáticos opacos se afectó por la concentración del agente gelificante
(gel-gro gellan gum), con una óptima respuesta en medio suplementado con 6-7 g/l de
gel-gro; la concentración óptima de sacarosa para la recuperación de embriones
somáticos opacos fue 90 g/I; sin embargo, el desarrollo de los embriones fue
suprimido en esta concentración; consecuentemente, la recuperación de los
cotiledonarios, embriones somáticos opacos fue lograda en medio con 30 g/I de
sacarosa; los embriones somáticos desarrollaron de las masas proembriogénicas
desdiferenciadas requiriendo para ello de medio con un alto promedio de NO-3:NH+
4
(1:0 y 3:1) en comparación con la proporción estándar (2:1) de medio MS; la
germinación de los embriones somáticos fue esporádica.
52
Las investigaciones realizadas indican que el sistema de embriogénesis
somática resulta más rentable en comparación a la organogénesis, esto porque en
poco espacio es posible producir una gran cantidad de embriones somáticos para su
maduración y encapsulación, y así tener semillas sintéticas; además el sistema como
tal, tiene también otras aplicaciones de enorme importancia en el mejoramiento del
aguacate, no obstante que para recuperar los tejidos transformados, seleccionados o
aquellos que se conservaron in vitro se requiere el tener previamente la metodología
de multiplicación de brotes, el enraizamiento y la aclimatación de las plántulas
(organogénesís).
Específicamente en aguacate son pocos los estudios realizados para
determinar un sistema óptimo de embriogénesis somática, máximo cuando la mayor
parte de estos utilizaron embriones cigóticos inmaduros como explante en la
generación de callo embriogénico, situación en la cual no se garantiza la propagación
clonal, y establecen procedimientos imprácticos o compuestos de los medios de
cultivo en muchos casos demasiado costosos; además de que las investigaciones
reportan una germinación esporádica de los embriones maduros o con porcentajes
demasiado bajos. De ahí que se requiere un sistema vía embriogénesis somática
que garantice en primera instancia la propagación clonal, que sea práctico y
altamente eficiente.
2.4. Factores que intervienen en la morfogénesis in vitro
Abdelnour y Vicent (1993) destacan algunos de los factores importantes que
influyen en la inducción de la organogénesis y embriogénesis somática, estos son el
genotipo, edad de la planta, estado fisiológico de la planta al momento de tomar el
explante y condiciones del ambiente in vitro (factores físicos y químicos).
En un estudio en mora (Morus alba L. vars. Chinese white y Kokuso-27) se
encontró que la callogénesis fue dependiente de la naturaleza del explante usado, el
genotipo y los reguladores de crecimiento suplementados en el medio de cultivo; las
53
hojas fueron el mejor tipo de explante usado para inducción de callos (Bhau y Wakhlu,
2001).
2.4.1. Inóculo o explante
La elección del explante (órgano, tejido o fragmento de tejido, células, etc.
cortado u obtenido del material parental para iniciar el cultivo in vitro) adecuado,
constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos, éste variará de
acuerdo con el objetivo perseguido. Se ha demostrado que la edad fisiológica del
mácula es un factor importante en la formación de órganos, entre más joven y menos
diferenciado sea un tejido, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo in vitro
(Halperin, 1996). Esto por el transporte basipétalo de auxinas, al ocurrir una
acumulación en la base del explante, lo cual permite la formación de callo,
producción de raíces y/o inhibición del desarrollo de brotes en las yemas axilares
más cercanas (Lomax et al., 1995; Jensen et al., 1998).
2.4.2. Factores físicos
Entre éstos destacan el pH del medio de cultivo, intercambio gaseoso,
humedad, luz y temperatura.
pH. El grado de acidez o alcalinidad (pH) del medio de cultivo es importante y
específico para cada tipo de planta, al igual que ocurre en el suelo las especies
vegetales responden de manera diferente, por lo que se hace necesario ajustarlo a
los requerimientos de la especie en estudio. Sin embargo, el pH adecuado en medio
de cultivo se encuentra en un rango de 4.5 a 7 para las plantas, es el pH 5.7 el más
generalizado (Abdelnour y Vicent, 1993).
Intercambio gaseoso. Los gases más comunes son O2 (oxígeno), CO2
(dióxido de carbono) y C2H4 (etileno). En recipientes de cultivo cerrados
herméticamente se ha detectado una acumulación de gases (dióxido de carbono
54
CO2, etileno C2H4 y etano) y otras sustancias como etanol y acetaldehído que,
además de influir o controlar el crecimiento, también pueden afectar los procesos de
diferenciación y morfogénesis (Righetti et al., 1990).
En un estudio sobre dosificación de CO2 en nueve especies vegetales, se
observó que el crecimiento en dosis alta de este gas incrementó el número de
mitocondrias por unidad de área celular de 1.3-2.4 veces el número en plantas
control que crecieron en más bajo CO2 y produjeron un incremento significativo
estadísticamente en la cantidad de estroma del cloroplasto (sin presión), membranas
tilacoides, comparado con estos en tratamientos más bajos de CO2; no se
observaron cambios en el tamaño de la mitocondria; sin embargo, en contraste al
efecto del CO2 en el número de mitocondrias, altas dosis de CO2 promueve una
disminución en el promedio de masa basado en la respiración obscura; estos cambios
pueden reflejar un mayor cambio en el metabolismo vegetal y el balance de
energía que puede ayudar a explicar el incremento de la productividad de la planta
en respuesta a elevadas concentraciones de CO2 (Griffin et a/., 2001).
Humedad. En condiciones in vitro la humedad dentro de los recipientes es de
casi 100 %. Por eso la planta in vitro en general no desarrolla sistemas de regulación
hídrica tales como cera, estomas, cutícula, etc (Abdelnour y Vicent, 1993), de ahí que
se dificulte la aclimatación de las plantas micropropagadas.
Luz. Es conocido que la luz es una señal importante para el desarrollo de la
planta, influye en casi todos los aspectos del ciclo de la vida desde germinación
hasta floración (Campbell y Liscum, 2001).
En condiciones in vitro clásicas, la intensidad y calidad de la luz es muy baja
(10 W/m2 en comparación con las condiciones naturales donde la luz puede
presentar una intensidad hasta de 900 W/m2). La calidad de la luz también es muy
baja y se recomienda mezclar diferentes tipos de luz en una misma sala para tener
diferentes longitudes de onda. El espectro útil para los vegetales es de 400 a 700
55
nm. Dos fenómenos importantes dependientes de la luz son: fotosíntesis y
fotomorfogénesis (Abdelnour y Vicent, 1993).
La morfogénesis funciona con la presencia de pigmentos susceptibles a
radiación azul y roja. Las funciones más conocidas son las del pigmento susceptible al
rojo: fitocromo (rojo 660 nm y rojo lejano 730 nm); expansión foliar, elongación de
entrenudos, diferenciación de estomas, síntesis de clorofila, etc. La falta de CO2
disminuye los requerimientos lumínicos de los cultivos, es más importante su papel en
fotomorfogénesis que en fotosíntesis (Cañal et al., 1999).
Las respuestas diversas de las plantas requieren sofisticada sensibilidad de
intensidad, dirección, duración y longitud de onda de la luz; el espectro de acción de
respuesta de la luz tiene previsto pruebas para identificar tres fotorreceptores
absorbentes en el ultravioleta, azul/cercano a ultravioleta y rojo/rojo-lejano (R/FR); el
mejor grupo caracterizado de esos fotorreceptores es R/RF fitocromos absorbentes.
Los fitocromos controlan el desarrollo hasta el final del ciclo de vida de la planta, al
iniciar con la germinación de la semilla y de-etiolación de la plántula (la transición del
crecimiento en la oscuridad a luz), ellos sólo controlan la expansión de la hoja del
cotiledón y elongación del tallo por la regulación de la división celular y expansión;
los fitocromos permiten la percepción de plantas vecinas o la sombra, e influyen la
transición a floración (Neff et al., 2000).
2.4.3. Factores químicos
El medio de cultivo. Consiste en una mezcla de determinadas sustancias
sobre o dentro del cual crecen los explantes. Son combinaciones de sustancias
químicas que los investigadores han descrito después de numerosos experimentos y
que permiten que las plantas crezcan y se multipliquen in vitro. López (1990) indica
que en general los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes
compuestos:
56
1. Sales inorgánicas.
A) Macronutrimentos. Además del carbono, hidrógeno y oxígeno, los
elementos más demandados por las plantas son: nitrógeno, fósforo, potasio, calcio,
magnesio y azufre.
El nitrógeno tiene importancia porque forma parte de la estructura de las
moléculas proteicas, ácidos nucleicos, porfirinas que intervienen en la fotosíntesis, en
general es un elemento esencial porque determina en gran medida la tasa de
crecimiento del tejido; al comparar con el ion nitrato NO3- (es la forma más oxidada
del nitrógeno), el ión amonio, NH4+ es la forma más reducida; las plantas utilizan
nitrógeno reducido para su metabolismo, y dentro de la planta el nitrógeno existe casi
en su mayor parte en la forma reducida. El fósforo interviene en la estructura de
moléculas nucleicas y en la síntesis de compuestos de alta energía, además de que
participa en la activación de diversas enzimas; el fósforo es adsorbido por la planta en
forma de iones de fosfato por un proceso que requiere transporte activo con gasto
de energía. El potasio es necesario para la división celular normal, síntesis de
carbohidratos y clorofila y asimilación de nitrógeno, importante en la apertura y
cerrado de estomas, es un activador de enzimas en la síntesis de ciertos péptidos, de
proteínas y de CHOs; los iones de potasio son rápidamente transportados a
través de las membranas y dos de sus funciones más importantes son regular el pH
y el ambiente osmótico dentro de las células (George, 1993; Salgado, 1998).
El calcio es un constituyente de la pared celular en forma de pectato de calcio
y esta involucrado en la plasticidad de las células, ya que la remoción del calcio
incrementa la permeabilidad y la plasticidad de la membrana, entre otras funciones
también está la organización de cromatina en la mitosis, activador de enzimas
(fosfolipasa, arginina-cinasa, ADP fosfatasa y adonil cinasa), número de mitocondrias
y en la translocación de CHOs. El magnesio es importante en los procesos de
fotosíntesis y metabolismo de carbohidratos, es un constituyente de la clorofila,
activador de enzimas (biosíntesis de CHOs, síntesis de ADN y ARN, fijación de CO2 –
RUBISCO y PEP carboxilasa) y agente de unión de ribosomas (síntesis de
57
proteínas). El azufre está presente en algunas proteínas en forma de aminoácidos
azufrados y constituyente de vitaminas (tiamina y biotina), coenzima A, enzimas
(grupos sulfidrilos), síntesis de esteroles y lignina, importante en la fotosíntesis
(síntesis de ferrodoxina); el azufre es absorbido por la planta como S04-2 (George,
1993; Salgado-Garciglia et al., 1997; Pérez et al., 1999).
b) Micronutrimentos. Los más importantes son fierro, manganeso, zinc, boro,
cobre, cobalto y molibdeno, estos últimos cinco son fundamentales para la síntesis
de clorofila y la función de los cloroplastos (López, 1990). El fierro es requerido para
la formación de los precursores de la clorofila, tiene incorporación en citocromos y
ferrodoxina, y es componente de varias flavoproteínas (peroxidasas y catalasas). El
manganeso es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso
fotosintético (la actividad del fotosistema II es proporcional al contenido de
manganeso), esencial en los pasos de transferencia de electrones, activador de
enzimas en: ciclo de Krebs, reducción de nitratos y oxidación del ácido indolacético
(AIA). Cobre y zinc se requieren en la oxidación e hidroxilación de compuestos
fenólicos, el zinc además participa en la síntesis de AlA, a través de la síntesis de
triptofano (triptofano sintetasa). Molibdeno y fierro forman parte de las enzimas
nitrato reductasa y nitrogenasa. Cobalto es el metal componente de la vitamina B12,
la cual se involucra en la síntesis de ácidos nucleicos. Boro es necesario para el
mantenimiento de la actividad meristemática, está involucrado en la síntesis de
bases nitrogenadas, en particular uracilo, interviene en el transporte de CHOs dentro
de la planta y facilita transporte a través de membranas (George, 1993; Salgado,
1998).
2. Agentes quelatos. Son compuestos orgánicos que son capaces de formar
complejos con cationes metálicos, en los cuales el metal es sostenido por medio de
enlaces. Son moléculas que retienen un ión de metal con varias uniones químicas al
formar un complejo en forma linear o de anillo (EDTA= ácido etilendinitrotetra-
acético) (López, 1990; George, 1993).
58
3. Vitaminas. Se requieren en la realización de una serie de reacciones
catalíticas en los sistemas enzimáticos y se emplean en pequeñas cantidades. Las
más utilizadas son: tiamina (vitamina B1) es la única realmente esencial en casi todos
los tejidos vegetales, ácido nicotínico (niacina), piridoxina (vitamina B6), ácido
pantoténico ayuda en el crecimiento de ciertos tejidos, ácido fálico disminuye la
proliferación de tejido en la oscuridad, mientras que en la luz la aumenta, riboflavina
inhibidor del crecimiento de raíces, vitamina E ayuda a la formación de callos y en
cultivos en suspensión ayuda la viabilidad de las células y mioinositol no es
propiamente una vitamina sino un azúcar-alcohol que tiene efecto estimulante en la
morfogénesis y ayuda a la formación de varios constituyentes celulares como el
ácido ascórbico y la pectina, además de otros compuestos que intervienen en la
división celular (López, 1990; Salgado-Garciglia et al., 1997).
4. Aminoácidos. Se utilizan como fuente de nitrógeno; glicina es el único
aminoácido usado en medios de cultivo para células vegetales; caseína hidrolizada
se emplea para enriquecer en nitrógeno el medio de cultivo; otros arginina, L-
metionina, glutamina y asparagína (Salgado-Garciglia et al., 1997).
5. Reguladores decrecimiento. (Véase apartado 2.1.).
6. Carbohidratos. Se utilizan como fuente de energía y como reguladores
osmóticos. La sacarosa es la mejor fuente de carbono (George, 1993), y es el azúcar
más empleada, le siguen la glucosa, maltosa, rafinosa, fructosa y galactosa, manosa
y lactosa (López, 1990). Se adiciona usualmente en cantidades de 20 a 45 g/l; al
esterilizar el medio se obtiene la combinación de sacarosa, D-glucosa y D-fructosa
(Salgado-Garciglia et al., 1997).
7. Agentes gelificantes. El agar se ha empleado como soporte en los medios
sólidos y semisólidos, es un derivado de una alga marina; es un polisacárido con una
elevada masa molecular que tiene capacidad de gelificar los medios (Pierik, 1990).
Generalmente se emplea agar-agar a una concentración de 0.5 a 0.6%. Se ha
59
estudiado el efecto de la concentración y marca comercial de agar, los resultados
indican que no existe una correlación entre las características y el crecimiento de las
plantas (Cañal et al., 1999).
8. Agua. Es el compuesto más abundante (95%) del medio de cultivo, por lo
tanto la purificación es necesaria, misma que se lleva a cabo por destilación, por
intercambio de iones y por ósmosis inversa (George, 1993). Se utiliza agua
destilada, bidestilada y desionizada.
Por otra parte las tasas de crecimiento, desarrollo y muchas de las
características fisiológicas y morfológicas de las plantas formadas in vitro están
influenciadas por el ambiente físico, químico y gaseoso de los recipientes (Kozai et
al., 1992; Buddenford-Joosten y Woltering, 1994). Este mismo grupo de
investigadores hacen una clasificación de los factores que pueden afectar al
crecimiento y morfogénesis de las plantas ín vitro (Figura 1), mencionan que los
fenómenos que controlan los cambios ambientales en el interior de un recipiente de
cultivo son similares a los que ocurren en el interior de un invernadero, ya que de
hecho un recipiente de cultivo es, hasta cierto punto, un invernadero en miniatura
mantenido en condiciones asépticas. De manera concreta Cañal y col. (1999)
resumen algunas de las respuestas más habituales de los explantes introducidos en
cultivo, como resultado de la interacción que se produce entre los explantes y las
características ambientales descritas (Cuadro 2).
60
61
Cuadro 2. Respuesta al ambiente en la micropropagación convencional.
Tejidos Planta
1. Disminución o alteración del contenido
de ceras epicuticulares
1. Menor tasa de crecimiento
2. Funcionamiento estomático anormal 2. Crecimiento suculento
3. Disminución del contenido de clorofila 3. Desordenes fisiológicos y morfológicos
4. Menor peso seco final 4. Formación de pocas raíces secundarias
5. Disminución del área foliar 5. Elevada variabilidad en tamaño, forma
y estado de desarrollo
6. Disminución del número estomático 6. Mayor frecuencia de mutaciones
7. Menor desarrollo anatómico 7. Presencia de contaminaciones
Lo anterior explica las dificultades para aclimatar plantas cuando existen
problemas en la regulación estomática que provoca estrés hídrico y la existencia de
menor cantidad de ceras epicuticulares; de ahí que debido a las condiciones
anatómicas y fisiológicas de las plántulas que se desarrollaron in vitro, se requiere
mantener una alta humedad los primeros días después del transplante; para este
propósito un significativo número de laboratorios comerciales tienen sistemas de
nebulización o bien recurren al uso de antitranspirantes como Folicote (Preece y
Sutter, 1991).
62
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Localización del sitio de investigación
La presente investigación se desarrolló en los laboratorios de Biotecnología -
Cultivo de Tejidos Vegetales e invernadero del Campo Experimental Forestal y
Agropecuario Uruapan, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones
Forestales, Agrícolas y Pecuarias, ubicado en la ciudad de Uruapan, Michoacán, en
el Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas de la Universidad Michoacana de
San Nicólas de Hidalgo, Ciudad Universitaria Morelia, Michoacán y en el Centro de
Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional Unidad
Irapuato, Guanajuato.
3.2. Material biológico
Los explantes empleados en el sistema de organogénesis fueron yemas
axilares que se encontraban en el último crecimiento de las ramas laterales de un
árbol de aguacate criollo raza mexicana, Persea americana Mill. var. drymifolia, de 32
años de edad. En tanto que para el sistema de embriogénesis somática se utilizaron
nucelas obtenidas de frutos de 10 a 12 mm de diámetro, también de un solo árbol de
aguacate, P. americana cv. Hass, de 12 años de edad; ambos fueron seleccionados
en el área del Campo Experimental Uruapan.
3.3. Reactivos utilizados
Los diferentes medios de cultivo o soluciones que se emplearon en el estudio,
se prepararon con los reactivos que se anotan en el Anexo 1.
63
3.4. Organogénesis de aguacate criollo
3.4.1. Definición de las condiciones asépticas del explante
Las pruebas en desinfección del explante se llevaron a cabo en dos formas:
superficial o externa e interna. En la desinfección externa se realizaron 6 pruebas
con diferentes combinaciones en dosis del fungicida Benlate (benomilo, 1 y 2 g/I),
fungicida-bactericida Agrimicin 500 (sulfato de estreptomicina + clorhidrato de
oxitetraciclina + oxicloruro de cobre, 1 y 2 g/I) e hipoclorito de sodio comercial (20, 40
y 60%), además de probar diferentes tiempos de permanencia (10, 15 y 20 minutos)
del explante en el producto y realizar la desinfección en diferentes épocas del año.
Desinfección interna. Para eliminar los patógenos endógenos en el explante,
se llevaron a cabo cuatro pruebas: en la primera se probó la dosis de Benlate (0, 0.5,
1.0 y 2.0 g/l de medio de cultivo); además se evaluó si este producto se inactiva con
la esterilización. En cada tratamiento se utilizaron 6 frascos tipo Gerber® con 3
explantes por frasco en 20 ml de medio, preparado con las sales minerales
completas y vitaminas del medio MS (Murashige y Skoog, 1962) con BA 1 a 2 mg/l,
AIB 0.5 y 0.66 mg/I, azúcar 30 g/I, agar 7 g/I, pH 5.7 y ácido ascórbico 25 mg/l;
se midió el porcentaje de contaminación a los 4, 6 y 12 días después del
establecimiento y el porcentaje de necrosis únicamente a los 12 días.
En la segunda prueba se probaron dos factores, la interacción Benlate con
Agrimicin 500 (0 - 0, 1 - 0, 1 - 0.5, 1 - 1, 0.5 - 1 y 0 - 1 gll de medio de cultivo) y
tiempo de permanencia del explante en el medio con los productos anteriores
(permanencia continua, 7, 14 y 21 días), el medio empleado fue MS con la mitad de
sus sales minerales, suplementado con vitaminas MS, BA 1.0 mgll, AIB 0.5 mg/l,
azúcar 30 g/I, agar 7 g/I, pH 5.7 y ácido ascórbico 50 mg/I; en este medio se
incorporó el fungicida y el fungicida - bactericida en las dosis indicadas, se prepararon
54 tubos de ensaye con 10 ml de medio y se emplearon 3 tubos por
tiempo de permanencia en cada tratamiento, con una microestaca o yema axilar
64
establecida por tubo; la variable tomada fue solamente porcentaje de contaminación
a diferentes tiempos en cada tratamiento.
La tercera prueba contempló nuevamente la evaluación de dos factores, la
interacción Benlate con el bactericida Agrimicin 100 (1 -1, 1 - 0, 0 -1, 0.5 - 0.5 y 0 - 0
g/I de medio de cultivo) y tiempo de permanencia del explante en el medio con el
fungicida y bactericida (8, 16, 31 y 50 días), en cada tratamiento del primer factor se
emplearon 25 tubos de ensaye con 10 ml de medio de cultivo cada uno y en el
segundo factor se recultivaron 5 yemas axilares una por tubo después del período
de permanencia, el medio de cultivo fue preparado con sales MS a 1/5 parte de sus
macroelementos y microelementos, vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, BA 2 mg/I,
AIB 0.2 mg/l, azúcar 30 g/I, agar 6 g/l, pH 5.7 y ácido ascórbico 25 mg/I; se registró el
porcentaje de contaminación y el de necrosis a 8, 17, 24, 31, 41 y 53 días del
establecimiento o del recultivo a medio sin los pesticidas para determinar el mejor
tratamiento.
Por último y con la finalidad de observar la posibilidad de eliminar los
pesticidas del medio de cultivo y evitar la contaminación, se realizó la prueba de
tiempos de permanencia del explante en solución con Benlate y Agrimicin 100 en
dosis de 1 g/I de cada producto, los tratamientos evaluados fueron: 0, 24, 48 y 73
horas y posteriormente siembra en medio sin pesticidas, en contraste con siembra en
medio con Benlate 1 g/I; se establecieron 20 explantes por tratamiento en tubo de
ensaye y se obtuvo el porcentaje de contaminación.
3.4.2. Prevención de necrosis del explante
Se realizaron dos tipos de tratamientos para evitar la necrosis del tejido de las
microestacas de aguacate utilizadas como explante. Para lo anterior se dio un lavado
continuo al explante a chorro de agua; se probó tiempo de permanencia del explante
a chorro de agua (15, 30, 60 y 90 minutos). Posteriormente, de la desinfección de las
microestacas y previo a su establecimiento en el medio de cultivo se probaron en
65
solución acuosa, las dosis siguientes del antioxidante ácido ascórbico: 0, 100, 200,
300 y 400 mg/I, con una permanencia del explante en la solución de 30 y 60 minutos,
para su posterior establecimiento en el medio sin el antioxidante, en contraste con el
tratado a 100 mg/1 de ácido ascórbico durante 30 minutos y colocado en medio con
antioxidante. El medio de cultivo empleado fue MS a 1/5 parte de su concentración
complementado con vitaminas MS, mioinositol 100 mg/l, BA 2 mg/l, AIB 0.2 mg/I,
azúcar 30 g/I, agar 6 g/I y Benlate 1 g/I, a los 13 días se recultivaron todos los
explantes de los tratamientos al mismo medio, pero sin Benlate; se utilizaron 10
tubos de ensaye por tratamiento con un explante por tubo; las variables evaluadas
fueron: porcentaje de oxidación a los 30 días, y porcentaje de brotación a los 70 días.
3.4.3. Tipos y dosis de reguladores de crecimiento y otros compuestos del
medio de cultivo para lograr la organogénesis in vitro de aguacate criollo
3.4.3.1. Inducción de brotes
Se realizaron 8 pruebas preliminares con la finalidad de inducir la brotación in
vitro de las yemas axilares contenidas en microestacas de aguacate; en la primera se
evaluaron los medios de cultivo con los reguladores de crecimiento reportados por
Neel y col. (1982) en Persea indica, González y Salazar (1984) en P. americana raza
antillana, González y col. (1985) en P. schiedeana, Shall (1987) en P. americana cv.
Fuerte y el de Solórzano-Vega (1989) en P. americana cv. Colin V-33. Sin embargo,
las pruebas que aportaron resultados concluyentes fueron dos: a) concentración de
sales minerales MS, WPM y Mc Cown's, los tratamientos evaluados se presentan en
el Cuadro 3, y b) barrido de reguladores de crecimiento citocinina - auxina en sales
minerales MS, BA (0, 1, 2 y 3 mg/l) - AIB (0, 0.2, 0.5 y 1 mg/l), se formaron 16
tratamientos.
El medio de cultivo se complementó con vitaminas MS, mioinositol 100 mg/l,
BA 2 mg/I, AIB 0.2 mgll, azúcar 30 g/l, agar 6 g/I, pH 5.7, Benlate 1 g/I y ácido
ascórbico 50 mg/l, excepto el tratamiento 6 en el cual la dosis de reguladores fue de
66
2 mg/1 de BA y AIB. Se establecieron 25 yemas axilares por tratamiento y a los 16
días se recultivaron en medio sin fungicida. Se registró el porcentaje de brotación y
establecimiento a los 55, 100 y 127 días y el crecimiento del brote principal, para
obtener esta última variable se obtuvo la longitud promedio de los brotes en mm a los
72, 96, 100, 117 y 127 días.
En el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB el establecimiento
fue en 5 frascos por tratamiento con 4 yemas axilares por frasco, en medio base
MS al 40% de sales, vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, azúcar 30 g/l, pH 5.7, agar 5
g/l, Benlate 1 g/I y ácido ascórbico 50 mg/I; se recultivaron en medio sin Benlate a los
22 días. Se obtuvo el porcentaje de brotación y establecimiento a los 60, 96 y 110
días, así como la longitud del brote principal a los 96 y 110 días.
67
3.4.3.2. Multiplicación de brotes obtenidos in vitro
Con la finalidad de multiplicar in vitro los brotes de aguacate obtenidos de la
fase de iniciación se establecieron dos experimentos, en el primero se evaluó la
interacción BA - AIB (0 - 0, 0.5 - 0.05, 1 - 0.1, 1.5 - 0.15 y 2 - 0.2 mg/I) en sales
minerales modificadas completas (Cuadro 4) y a 1/2 de su concentración con
adenina 40 mg/I, se establecieron 10 frascos por tratamiento con tres explantes por
frasco; las variables obtenidas fueron: número y longitud de brotes a los 40 y 70 días.
En tanto que el segundo estudio y más concluyente, con sales MS completas y sin
adenina, se realizó un barrido de reguladores de crecimiento BA (0, 0.3, 0.6 y 0.9
mg/I) y AIB (0, 0.05, 0.1 mg/I), así se formaron 12 tratamientos con 10 frascos y tres
explantes por frasco en cada tratamiento; se consideraron las variables de: días a
brotación, color del brote, formación de callo y de brote, número de brotes laterales
por explante - frasco y longitud de los brotes.
3.4.3.3. Enraizamiento de brotes obtenidos in vitro
En dos experimentos se determinó el medio de cultivo óptimo para el
enraizamiento in vitro de brotes de aguacate; en el primero se probaron dos tipos de
sales minerales (MS y modificadas, Cuadro 4) y las auxinas: AIB (0, 0.5, 0.8, 1.1 y
1.4 mg/I), ANA (0, 0.3, 0.6, 0.9 y 1.2 mg/I) y la interacción AIB 0.5 mg/1 - ANA 0.3
mg/I. En el segundo experimento con sales minerales MS completas se estudiaron
dosis de AIB (0, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 y 1.2 mg/I) y la interacción AIB - AG3 en dosis de
0.6 - 0.125, 0.8 - 0.125, 1.0 - 0.125 y 1.0 - 0.25 mg/I; en los dos estudios la unidad
experimental fue el frasco con tres explantes y 10 frascos por tratamiento. Las
variables evaluadas fueron: inicio de emisión de raíces, número de raíces por frasco
- brote, porcentaje de brotes con raíz, promedio de raíces por brote y longitud de
raíz.
68
Cuadro 4. Composición de sales minerales MS y modificadas en macroelementos,utilizadas en las pruebas de multiplicación y enraizamiento in vitro debrotes de aguacate.
Cantidad (mg/1)
Compuesto MS Modificadas
NH4NO3 1,650 1,000
KNO3 1,900 800
CaCl2 2H2O 440 0
Ca(NO3)2 4H2O 0 1,250
MgSO4 7H2O 370 1,250
KH2PO4 170 382
3.4.4. Aclimatación de plántulas de aguacate obtenidas in vitro
Se probaron diferentes sustratos y procedimientos para aclimatar en el menor
tiempo y con alta supervivencia las plántulas de aguacate obtenidas in vítro, en total
se realizaron 9 pruebas (Cuadro 5) en donde las variables medidas fueron porcentaje
de supervivencia y altura de planta.
Debido a que en las primeras pruebas se obtuvieron resultados negativos, fue
necesaria la realización de estudios citológicos, esto para determinar con precisión el
estado de desarrollo de las células compañeras o estomáticas; se llevaron a cabo
observaciones de estomas y cutícula de hojas de plántulas obtenidas en laboratorio
por cultivo de tejidos en comparación con hojas de plantas de vivero y árbol adulto,
este estudio proporcionó información que sirvió en gran medida para dirigir los
tratamientos a las plántulas; los datos se obtuvieron al utilizar un microscopio de
fases con un ocular 10X, objetivo 40X y un micrómetro ocular en rejilla de 1 mm2, se
midió la frecuencia de estomas (FE), frecuencia de células no estomáticas (FCNE) e
índice estomático (IE) que se determinó con base en la siguiente formula
(Barrientos y Sánchez, 1987)
69
Cuadro 5. Tratamientos evaluados en las nueve pruebas de aclimatación de brotesde aguacate criollo obtenidos in vitro.
No. Descripción de prueba Tratamientos1 Protección de pérdida de humedad. 1. Entrada de aire.
Sustrato de turba tratado con benlate 1g/I y fertilizado con 2. Cierre total con bolsa de polietileno.30-10-101 g/1. 4 repeticiones por tratamiento.
2 Evaluación de sustratos. 1. Sustrato de turba 100%Sustratos tratados con benlate 1 g/I y fertilizados con 30- 2. Sustrato de turba 50% + arena 50%.10-10 1 gll.16 repeticiones por tratamiento.
3 Evaluación de sustratos. 1. Sustrato de turba 100%Sustratos tratados con captan 15 g/l + benlate 1 g/I yfertilizados con 30-10-101 g/l + raizal 5 g/I + ácido húmico 0.5 cc/I.2 repeticiones por tratamiento.
2. Tierra "topuri" 50% + arena 50%
4. Evaluación de sustratos. 1. Agrolita 100%Sustratos tratados con: a) captan 7.5 g/l + benlate 1 g/I y 2. Arena de "tezontle" 100%fertilizados con 30-10-10 3. Sustrato de turba 100%1 g/l + raizal 5 g/I + ácido húmico 0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I; 4. Tierra "topuri" 100%al momento del trasplante se aplico radix 1500 (1500 ppm 5. Arena + Sustrato de turba 50% c/ude AIB). 6. Arena + tierra 50% c/ub) captan 7.5 g/I + benlate 1 g/l y fertilizado con raizal 5 g/I 7. Corteza de pino 100%+ medio liquido MS 100% complementado con vitaminas 8. Arena + corteza 50% c/uMS, mioinositol, AIB 0.5 mg/l, AG3 0.25 mg/I, azúcar 3%, 9. Sustrato de turba+corteza 50% c/upH 5.7. Se establecieron 5 repeticiones por tratamiento 10. Tierra + corteza 50% c/u.
11. Sust. de turba 70% + agrolita 30%.5 Evaluación de intensidades de luz. 1. Intensidad de luz ±250 luxes
Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con ridomilcobre 8 g/1 + agrimicin 1005 g/l y se fertilizo con 30-10-10 1 g/l + 0.5 cc/l de ácidohúmico. 5 repeticiones por tratamiento.
2. Intensidad de luz ±4000 luxes
6 Evaluación de fertilización líquida y reguladores de 1. Fertilización MS 100% con vitaminascrecimiento. MS, mioinositol, BA 0.5, AIB 0.25Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, esterilizado en mg/I, AG3 0.25 mgll, azúcar 3%, pHautoclave y tratado con benlate 1 g/l. 15 repeticiones por 5.7. A 5 plantas se les aplicó ac.tratamiento. Acetilsalisilico (ASA) 500 mg/I y a 5
2. ac. Absicico (ABA) 4.4 mg/l.Fert. 30-10-10 1 g/I + ácido húmico0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I + raizal 2 g/I.
7 Evaluación de ASA y Folicote. 1. Aplicación de ASA 250 mgllSustrato arena 50% + turba 50%, tratado con benlate + 2. “ “ Folicote (49.46% agua,agrimicin 100 + ridomil 1 g/I de c/u y fertilizado con 30-10- 41.6% parafina y cera refinada, 4.5%10 1 g/I + raizal 5 g/l. 20 repeticiones por tratamiento. aceite mineral, 4.3% emulsificante y
0.14% preservativos), en dosis de 1parte en 20 de agua.
3. Control.8 Evaluación de Folicote. Dosis de Folicote
Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con 1. 1 parte en 20 de agua.benlate + agrimicin 100 + ridomil 1 g/l de c/u y se 2. 1.5 " " " "humedeció con medio líquido'/2 de MS con vitaminas MS 3. 2 " " " "y mioinositol, se ajustó el pH a 5.7. Con 10 repeticionespor tratamiento y 20 en el control.
4. Control.
9 Evaluación de tratamiento de preaclimatación. 1. Folicote 1 parte en 20 de agua.Sustrato de turba 70% + agrolita 30%, se trato con 2. Tratamiento de preaclimatación 25benlate + agrimicin 100 + ridomil 1 g/I de c/u y se días antes del trasplante, en mediohumedeció con medio líquido'/2 de MS con vitaminas MS de enraizamiento con tapa y filtroy mioinositol, se ajustó el pH a 5.7. Adicionalmente se uso bacteriológico.un promotor de enraizamiento Tri-raíz en dosis de 12.5 3. Control.cc/1. Con 10 repeticiones por tratamiento.
70
3.5. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass
3.5.1. Desinfección de frutos y procedimiento de extracción de la nucela
Los frutos fueron primeramente lavados con detergente y cepillo, se llevaron a
campana de flujo laminar, se enjuagaron con agua destilada - estéril y asperjados
con etanol, posteriormente se realizó un corte del fruto por la parte media, de cada
mitad se extrajo el tejido nucelar con pinzas, se eliminó con ayuda del bisturí el tejido
adyacente.
3.5.2. Productos y procedimientos para evitar la necrosis-oxidación de la
nucela
Basado en los resultados obtenidos en trabajos para evitar la necrosis in vitro
de yemas axilares de árbol adulto, en donde se realizaron tratamientos con ácido
ascórbico, se utilizó en este estudio con nucelas los productos y procedimientos que
a continuación se describen: 1) cisteína 0 (control) y 10 mg/l adicionada al medio de
cultivo, 2) inmersión antes de su establecimiento in vitro, en solución con 0 (control) y
400 mg/i de ácido ascórbico durante 5 segundos y 3) incubación bajo luz con
intensidad de 9.4 µEm-2s-1, con 16 horas de luz por 8 de oscuridad y oscuridad
completa (control) hasta la generación de callo embriogénico; en este experimento se
aplicaron ocho tratamientos en total, al interaccionar los dos niveles de cada factor
2 x 2 x 2 = 8. Se utilizaron 25 nucelas por tratamiento en dos repeticiones,
establecidas en tubos de ensaye de fondo plano de 95 x 25 mm, con medio de
generación de callo embriogénico, formado con: sales minerales MS a 1/2 de su
concentración, mioinositol 100 mg/l, ácido nicotínico 1 mg/I, píridoxina 1 mg/l, glicina
1 mg/l, tiamina 10 mg/l, caseína hidrolizada 200 mg/I, picloram 2 mg/I, sacarosa 30
g/I y agar-agar 4.4 g/l, se ajustó el pH a 5.7. La variable medida fue solamente
porcentaje de necrosis.
71
3.5.3. Tipo y dosis de reguladores de crecimiento, para lograr la embriogénesis
somática de aguacate cv. Hass
3.5.3.1. Generación de callo embriogénico
En esta fase del sistema se establecieron dos experimentos, en el primero se
utilizó la concentración completa de sales minerales MS y a 1/2, y dosis de las
auxinas 2,4-D (0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 mg/l) o picloram (0, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 mg/I).
El medio basa) tenía vitaminas MS, mioinositol 100 mg/I, tiamina 0.5 mgll, azúcar
comercial 30 g/l y phytagel 2 g/l, se ajustó el pH del medio a 5.7. En el segundo
experimento también se utilizaron sales MS completas y a 1/2, se aumento el
nitrógeno en forma orgánica en el tratamiento MS a 1/2, al adicionar 200 mg/l de
caseína hidrolizada y se incremento en la concentración completa de MS la dosis de
KN03 en un 25%; en cada uno de estos tratamientos se probaron diversas
combinaciones de picloram - AIB (0 - 0, 1 - 0.1, 2 - 0.2, 4 - 0.4 y 2 - 0 mg/l) y 2,4-
D - BA (0 - 0, 1 - 0, 2 - 2 y 4 - 2 mg/I), suplementados los medios de cultivo con
mioinositol 100 mgll, tiamina 10 mg/l, sacarosa 30 g/l y agar-agar 4.4 g/I.
Adicionalmente, en los medios con sales minerales MS a 1/2 se utilizó ácido
nicotínico, piridoxina y glicina en dosis de 1 mg/1 de cada compuesto y cisteína 10
mg/l; en tanto que en los medios con sales MS completas la dosis de cisteína
utilizada fue 7.5 mg/l. En el primer estudio se utilizaron de 7 a 12 nucelas por
tratamiento y en el segundo de 10 a 20, inoculadas en tubo de ensaye de 150 x 24
mm y en caja de petri de vidrio de 90 mm de diámetro. Las variables fueron:
porcentaje de formación de callo, diámetro en mm y color de callo.
3.5.3.2. Multiplicación y desarrollo de embriones somáticos
En el proceso de multiplicación y desarrollo de embriones somáticos se evaluó
medio sólido y líquido en nueve pruebas, al utilizar medio base MS suplementado
con tiamina 4 mg/l, mioinositol 100 mg/I, sacarosa 30 g/l, agar-agar en medio sólido 5
g/l y se ajustó el pH a 5.7, se probaron los reguladores BA (0.11 mg/l), AG3
(0.11mg/l) y picloram (0.1, 0.3, 0.6, 0.9 y 1 mg/I), así como el compuesto nitrogenado
72
orgánico caseína hidrolizada (0, 200, 400, 600, 800 y 1,000 mg/l) y el efecto de la luz
indirecta (9.4 µEm-2s-1) y de la oscuridad sobre la multiplicación y desarrollo de los
embriones; la siembra del inóculo en medio sólido se llevó a cabo en cajas de petri
de 90 mm de diámetro y en líquido en matraces Erlenmeyer de 125 ml, se utilizaron 2
g de inóculo en 12.5 y 25 ml de medio, mismos que después del establecimiento se
colocaron en un agitador orbital a 100 rpm, también para la multiplicación en medio
líquido se empleó un biorreactor de 2 litros de capacidad, aunque se preparó
solamente 1 litro de medio de cultivo y se establecieron 5.0363 mg/ml de masas
proembriogénicas y embriones somáticos globulares. Se contaron masas y
embriones, se determinó viabilidad por observación directa en microscopio de
epifluorescencia previa tinción con diacetato de fluoresceína (Widholm, 1972),
además se obtuvo la ganancia de peso del inóculo.
3.5.3.3. Maduración de embriones somáticos
Con base en los resultados de Cruz (1998) y de Witjaksono y Litz (1999b), al
tomar como medio base el empleo de sales MS complementadas con tiamina 4 mg/l,
mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/l, agar-agar 5 g/I y se ajustó el pH a 5.7, se
evaluó el efecto del ABA (0, 1, 2, 4 y 8 mg/l), sacarosa (30, 40, 50, 60, 70 y 90 g/I),
agar-agar (5, 6, 7, 8, 10, 11, 14, 20 y 30 g/I) y manitol (70, 90, 110 y 130 g/l) sobre la
maduración de los embriones somáticos, las pruebas realizadas (8) se establecieron
en caja de petri de 90 mm de diámetro con medio sólido y de 5 a 10 cajas por
tratamiento; se utilizó como explante embriones somáticos en fase globular, corazón y
torpedo; las variables evaluadas fueron: número promedio de embriones maduros
por caja y tamaño del embrión (ancho x largo en mm).
3.5.3.3.1. Análisis de almidón y glucosa de embriones somáticos maduros
Adicionalmente a los embriones somáticos maduros se les realizó un análisis
de almidón y glucosa; para determinar almidón se utilizó el método semicuantitativo
que consiste en: hacer cortes muy finos del tejido vegetal, colocar dichos cortes en
73
un portaobjetos, agregar de una a dos gotas de lugol (2 g de yoduro de potasio + 1 g
de yodo en 250 ml de agua) y esperar 5 minutos, después de ese tiempo observar
los cortes al microscopio de fases. En la determinación de glucosa se utilizó el
reactivo Glucosa (oxidasa) que es un método enzimático, colorimétrico, de punto final
(Hycel No. 70408 con Reg. No. 0930R87 S.S.A.); el procedimiento consistió en:
obtener el peso de 5 embriones somáticos maduros, disolver 2.142 g del reactivo
Glucosa (oxidasa) en 100 ml de agua destilada y de ahí se tomaron 2.5 ml a cada
tubo de ensaye (6), un blanco y cinco de problema; moler los embriones somáticos
en mortero, colocado este en hielo y agregar 1 ml de agua destilada; obtener el
embrión del mortero y colocar en un tubo Eppendorf y centrifugar a 3,000 rpm por 20
minutos; adicionar 0.02 ml de la solución superficial de cada tubo Eppendorf a los 2.5
ml de la solución con el reactivo que contenía por tubo de ensaye y se calentaron a
37°C por 30 minutos; se observó el cambio de color al dejar en reposo por 10
minutos; se tomó el porcentaje de transmitancia en espectrofotómetro a 520 nm; se
sacó el valor en curva de calibración (Glucosa mg/100 ml) y por último se obtuvo la
cantidad final de glucosa por mg de peso de cada embrión somático, basado en el
valor obtenido en la curva de calibración que es al peso inicial de cada embrión.
3.5.3.4. Germinación de embriones somáticos
Se probaron diferentes dosis de reguladores de crecimiento y procedimientos
para germinar embriones somáticos maduros; la interacción BA - AG3 (0.11 - 0.11,
0.11 - 0.24 y 0.11 - 0.36 mg/I en primera evaluación y 0 - 0, 0.5 - 0, 1.25 - 0, 0.2 - 0.1 y
0.1 - 0.1 mg/1 en la segunda ), el barrido de reguladores BA (0, 0.3, 0.6 y 0.9
mgll) - AIB (0, 0.03 y 0.06 mg/I), todo ésto en medio de cultivo sólido; siembra de los
embriones en sustrato de turba previamente esterilizado y humedecido con medio
líquido MS 1/2 de concentración, complementado con mioinositol 100 mg/l, vitaminas
MS, BA 2 mg/I y se ajustó el pH a 5.7; prueba de germinación en caja de petri con
papel filtro humedecido con medio líquido MS suplementado con mioinositol 100
mg/I, tiamina 4 mg/I, BA 0, 3 y 6 mg/I en primera evaluación bajo este sistema y en la
segunda BA 0, 0.5, 1 y 2 mg/l, TDZ 0.1, 0.5 y 1 mg/l, BA - AIB (2 - 0.2 mg/l),
74
sacarosa 30 g/I y pH 5.7; en caja de petri con medio sólido se evaluó
brasinoesteroides (0.1 mg/I) en interacción con BA (0.05 mg/I) - AG3 (0.1 mg/l) y con
agua de coco (200 ml/l) - carbón activado (50 mg/I) - glutamina (400 mg/l); en tubo
de ensaye con medio sólido se probó una dosis baja de carbón activado (5 mg/l) en
interacción con BA (0.1 mg/I) - AG3 (0.1 mg/I) y con BA - 2,4-D (0 - 0, 0.1 - 0.05, 0.1
- 0.1, 0.2 - 0.05 y 0.3 - 0.05 mg/l); en magenta con medio líquido MS 50%
complementado con vitaminas MS, BA 1 mg/l, sacarosa 30 g/I y pH 5.7, se estudió la
frecuencia de la inmersión temporal (12, 24, 48 horas e inmersión continua en
primera prueba y 24, 48 y 72 horas en segunda prueba); en magenta y basado en el
mismo medio anterior pero sin BA, se evaluaron las dosis de adenina 0, 25, 50 y 100
mg/l, con una frecuencia de inmersión de cada 24 horas; también se probaron las
mismas dosis pero en medio sólido en frasco. La última prueba fue el establecimiento
de los embriones somáticos maduros en medio de Anderson (1975) modificado en
nitratos (+ 25%) y su recultivo a los 90 días en medio MS con 0.3 mg/l de BA. En
relación a los datos tomados en esta fase, solamente se realizaron observaciones
sobre el tipo de crecimiento del tejido obtenido, el porcentaje de brotación, número y
longitud de brotes.
3.6. Condiciones de incubación de los explantes
En el estudio de organogénesis los diferentes explantes (yemas axilares en
mícroestacas procedentes de árbol adulto y yemas axilares de brotes obtenidos in
vitro), después de su establecimiento en el medio de cultivo se incubaron en un
cuarto de crecimiento a una temperatura de 25±2°C, fotoperiodo de 16 horas de luz,
con una intensidad de 110.58 µEm-2s-1; para los de embriogénesis somática, una vez
establecidas las nucelas in vitro se pusieron en oscuridad por 45 a 50 días, período
después del cual se colocaron a luz con una intensidad de 9.4 µEm-2 s-1, con 16
horas de luz y a la misma temperatura que en organogénesis.
75
3.7. Análisis estadístico
Los porcentajes se analizaron por comparación directa entre tratamientos;
generalmente la unidad experimental fue el frasco, el tubo de ensaye o la caja de
petri. Con los datos de las variables cuantitativas en organogénesis, tales como:
número de brotes laterales, longitud del brote y de raíz en mm, índice estomático,
frecuencia de estomas y frecuencia de células no estomáticas, se hizo un análisis
de varianza (ANDEVA) bajo el diseño experimental completamente al azar, tal como
lo sugiere Vera (1987).
En aquellos casos donde se encontró significancia en el análisis de varianza,
se corrió una prueba de comparación de medias Tukey, de acuerdo con el
procedimiento de Gómez (1996).
En embriogénesís somática, los datos de la variable porcentaje de oxidación
se transformaron a valores de arco seno √x se realizó análisis de varianza bajo
un diseño de bloques al azar con arreglo factorial A x B x C, al encontrar significancia
se aplicó la prueba de diferencia mínima significativa (DMS) para determinar el mejor
tratamiento.
En las fases de multiplicación y maduración de embriones somáticos, con las
variables número de: masas proembriogénicas, globulares, acorazonados, torpedos
y maduros se realizó ANDEVA con un diseño completamente al azar y pruebas de
comparación de medias DMS y Tukey.
76
IV. RESULTADOS
4.1. Organogénesis de aguacate criollo
El establecimiento in vitro de aguacate criollo (P. americana var. drymifolia),
se obtuvo por diversos procedimientos de asepsia, tratamientos con desinfección
externa e interna. En base de prueba y error se observaron aquellos con los menores
porcentajes tanto de contaminación como de necrosis, esta última debida al método
de desinfección.
4.1.1. Desinfección externa
El mejor método de desinfección externa se obtuvo al lavar los explantes con
detergente biológico y cepillo; cortar en segmentos de 2 a 4 cm con 1 a 2 yemas
axilares; tratar con Benlate (2 g/I, durante 15 a 20 minutos), con Agrimicin 500 (2 g/l,
también durante 15 a 20 minutos); enjuagar con agua destilada estéril; tratamiento
con hipoclorito de sodio 40-60% + tween 20 (2 gotas/I) de 15 a 20 minutos; y por
último, practicar tres enjuagues con agua destilada estéril en campana de flujo
laminar. El tiempo y la concentración varió de acuerdo a la madurez del tejido y a la
temporada en que se obtuvo el explante, para tejido muy maduro colectado en los
meses de junio - octubre, se utilizó la máxima concentración de hipoclorito y 20
minutos de permanencia en las soluciones.
4.1.2. Desinfección interna
En la primer prueba con dosis de Benlate, adicionado al medio de cultivo y
esterilizado e incorporado después de la esterilización en campana de flujo laminar,
se observó que la aplicación de Benlate sin esterilizar en autoclave, su acción fue
más efectiva (0% de contaminación a los 12 días), aunque se presentó un alto
porcentaje de necrosis en los dos medios de cultivo probados (88.8 y 66.7%), ésto
77
como consecuencia de la aplicación al explante de una desinfección superficial
severa. Al usar Benlate esterilizado en autoclave, la mejor dosis fue de 2 g/I de medio
de cultivo (Cuadro 6), se encontró de 0-22.2% de contaminación según el medio de
cultivo, con tan solo de un 50 a un 55.5% de necrosis.
Con estos resultados, es conveniente resaltar que la desinfección debe ser
ligera (40% de hipoclorito de sodio y 15 minutos de tiempo de permanencia del
explante en cada desinfectante) y cultivar los explantes en medio con Benlate
esterilizado (2 g/I), para evitar menor daño al tejido vegetal.
Cuadro 6. Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares de aguacatecriollo a los 12 días del establecimiento en dos medios de cultivo (A y B),en la prueba de dosis de Benlate.
Contaminación/Necrosis (%) a 12 díasTratamientos(Benlate g/I y tipo de
incorporación)A B
0 44.4/27.7 33.4/72.2
0.5 esterilizado 55.5/33.3 66.7/0
1.0 esterilizado 50/22.2 0/38.9
2.0 esterilizado 0/50 22.2/55.5
1.0 no esterilizado 0/88.8 0/66.7
A = BA 1 mg/I +AIB 0.5 mg/IB = BA 2 mg/I + AIB 0.66 mg/I
En la segunda y tercer prueba los plaguicidas se incorporaron en campana de
flujo laminar después de esterilizar el medio de cultivo; en el Cuadro 7 se observa
hasta un 100% de contaminación en el tratamiento control a los 7 días después de
su establecimiento, no así con el tratamiento con Benlate 1 g/I que en permanencia
continua hasta los 40 días no mostró contaminación, este mismo tratamiento en
permanencia de 7 días en medio con el producto y recultivo posterior a medio sin
Benlate hasta los 33 días presentó contaminación en 1/3 (33.33%) de los explantes.
78
Cuadro 7. Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacate criollo adiferentes días después del establecimiento por tratamiento parapermanencia continua y en etapas de recultivo a medio sin plaguicidas.
Tratamiento Contaminación (%)Benlate - Agrimicin Permanencia continua con plaguicidas a los:
500(g/1) 7 14 21 30 40 días48.6h14.3b
000
14.3h62.9h
---
025h0
39.3h---
---
0---0------
---
0---0------
Permanencia 7 días con plaguicidas14-0
33.3h33.3b100h33.3h
---
23-0
33.3h33.3b
---66.7h
---
33---
33.3h33.3h33.3b
---------
Permanencia 14 días con plaguicidas
50 días---
33.3h33.3h66.6b
---------
20h
0000
20h
7100h
00
66.7h0
100h
7100h
033.3h33.3b100h100h100h
16-
33.3h66.6h33.3b
---------
26días---
33.3h---
---------
Permanencia 21 días con plaguicidas
0-0
1-01-0.51-1
0.5-10 – 1
0-01-0
1-0.5
1 –10.5-10-1
0-01-0
1-0.5
1 - 10.5-10-1
1-01-0.51 -10.5-1
90
33.3h66.6h33.3h
190
66.6h100h33.3h
36 días0
66.6h---
66.6hh = hongo, b = bacteria, --- sin explantes, desechados por contaminación, necrosiso recultivados.
Cuando los explantes permanecieron 14 días en Benlate, a los 16 días del
recultivo se presentó la contaminación también en 1/3 y en permanencia de 21 días
no hubo contaminación alguna. La contaminación en algunos tratamientos de
79
permanencia, cuando se utilizó Benlate a 1 g/I, obedeció en gran medida a errores
en la manipulación del explante al realizar el recultivo (Cuadro 7).
También se observó que al aplicar Benlate en combinación con Agrimicin 500,
no se evitó la contaminación, ésto fue más evidente cuando permanecieron por 14
días, al obtener datos hasta del 100% en casi la totalidad de los tratamientos donde
interaccionan estos dos plaguicidas, lo que resulta en un marcado antagonismo de
los productos. Además, de manera general se apreció una dominancia de
contaminación por hongos, sobre los cuales no se observó la eficiencia del oxicloruro
de cobre del Agrimicin 500.
Al utilizar Benlate con Agrimicin 100 en dosis de 1 g/l de cada producto, se
logró un buen control de la contaminación del explante por hongos y bacterias,
presentándose 0% de contaminación, aunque la necrosis fue menor (20%) cuando
se utilizó solamente Benlate, éste fue el mejor tratamiento (Cuadro 8).
Cuadro 8. Porcentaje de contaminación y necrosis de yemas axilares de aguacatecriollo a diferentes días después del establecimiento por tratamiento parapermanencia continua con dos severidades de desinfección superficial yen etapas de recultivo a medio sin plaguicidas.
Contaminación/ Necrosis (%)Permanencia continua con plaguicidas
8 15 31 48 días
TratamientoBenlate -
Agrimicin100(g/l) DSL DSS DSL DSS DSL DSS DSL DSS1 - 1 0/0 0/0 010 0/0 0/40 0/50 0/40 0/601 - 0 010 0/0 0/0 0/0 0/0 0/40 0/0 0/400 - 0 26.7h 0/0 46.7h 0/0 46.7h 0/60 46.7h 0/60
6.7b/0 6.7b/0 6.7b/20 6.7b/40Permanencia 8 días con plaguicidas
8 24 41 53 días1 - 1 010 0/0 20b/20 20b/801 - 0 20b/0 40b/0 40b/0 40b/60
Permanencia 31 días con plaguicidas17 31 días
1 - 1 0/40 0/401 - 0 0/20 0/40
DSL = Desinfección superficial ligera, DSS = Desinfección superficial severa,b = bacteria, h = hongo.
80
En el estudio de pretratamiento de explantes en solución con Benlate y
Agrimicin 100, 1 g/I de cada uno (Cuadro 9), la contaminación se presentó a los 14
días de su establecimiento con un 93.3% en los tratamientos de 0, 24 y 48 horas, y del
100% en el de 73 horas; en tanto que en el testigo de siembra en medio de
cultivo con Benlate solamente se observó un 13.3% de contaminación, éste fue
nuevamente el mejor tratamiento.
Cuadro 9. Porcentaje de contaminación de yemas axilares de aguacate criollo a 7 y14 días del establecimiento, en estudio de pretratamiento de explantes ensolución con Benlate más Agrimicin 100 a diferentes tiempos depermanencia.
Contaminación (%)Tratamiento
Tiempo (horas) de permanenciaen solución (Benlate+Agrimicin100, 1 g/I de c/u)
Establecimiento en mediode cultivo
7 14 días
24 horas Sin Benlate 80 93.348 horas ” “ 80 93.373 horas ” “ 46.7 1000 horas ” “ 86.7 93.3
0 horas Con Benlate 1 g/I 0 13.3
4.1.3. Prevención de necrosis del explante
Se determinó que 30 minutos a chorro de agua era tiempo suficiente para que,
en combinación con el uso de antioxidante en la asepsia y en el medio de cultivo, se
evitara que el tejido expulsara fenoles al medio y por consecuencia se deteriorara el
explante.
Con la finalidad de eliminar el antioxidante del medio de cultivo y reducir la
necrosis, se estableció un estudio sobre el tratamiento previo al establecimiento del
explante con ácido ascórbico, se encontró que al emplear 400 mg/l durante 30
minutos, se redujo a los 30 días la necrosis al 10% y se obtuvo a los 70 días una
brotación del 90%, en tanto que cuando se realizó un tratamiento previo con ácido
81
ascórbico (100 mg/I) y el establecimiento en medio con 50 mg/l de este mismo
antioxidante, la necrosis fue del 70% y la brotación de 0%; también se encontró que
en dosis alta de ácido ascórbico (400 mg/l) combinado con un tiempo de permanencia
del explante de 60 minutos, el porcentaje de necrosis se incrementó hasta un 70% con
una brotación de 0%; igual comportamiento se tuvo al dejar el explante 30 minutos en
100 mg/l de ascórbico y establecerlo posteriormente en medio con 50 mg/l de
ascórbico, ésto nos indica que en exposición en alta concentración o continua del
explante en ácido ascórbico se origina necrosis o apardamiento al tejido vegetal
(Cuadro 10).
Cuadro 10. Porcentaje de necrosis y brotación de yemas axílares de aguacate criollopor tratamiento en el estudio de pretratamiento del explante con ácidoascórbico.
Tratamiento
Dosis deAc. ascórbico
(mg/1)
Tiempo depermanencia
(min.)
Tipo de establecimientoen medio de cultivo
Necrosis (%)a los 30 días
Brotación(%)
a los 70 días
100 30 Sin ascórbico 30 40
200 30 “ “ 40 50
300 30 “ “ 50 30
400 30 “ “ 10 90
100 60 “ “ 50 50
200 60 “ “ 60 60
300 60 “ “ 40 60
400 60 “ “ 70 0
100 30 Con “ 70 0
Por lo tanto, es recomendable para establecer yemas axilares de aguacate
criollo con bajo porcentaje de necrosis y evidentemente mejor índice de brotación,
tratar los explantes, previó a su establecimiento in vitro, con 400 mg/l de ácido
ascórbico durante 30 minutos.
82
4.1.4. Efecto de los reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio
de cultivo en la organogénesis in vitro de aguacate criollo
4.1.4.1. Iniciación o establecimiento in vitro de yemas axilares
De las 8 pruebas que se llevaron a cabo en esta fase, solamente se presentan
los resultados de 3, por considerar irrelevante la respuesta del explante en el resto
de éstas. Al evaluar los diferentes medios, tipos y dosis de reguladores de
crecimiento que reportaron Neel y col. (1982), González y Salazar (1984), González
y col. (1985), Shall (1987) y Solórzano-Vega (1989), no se observó brotación de las
yemas, solamente la formación de callo en un 10% en el medio de los últimos
investigadores anteriormente señalados.
En el estudio sobre concentración de tres sales minerales, la brotación de las
yemas axilares inició a los 35 días después del establecimiento in vitro, fue en el
tratamiento MS 20% donde se alcanzó el mayor porcentaje de brotación, con 76% a
los 55 días, se observó una disminución de este porcentaje a los 100 días y 127 días
de cultivo, debido a la contaminación de los explantes que ya habían brotado. En el
tratamiento McCown's 100%, se mostró el porcentaje más bajo de brotación, con
12% a los 55 días y un 20% a los 100 días (Cuadro 11).
La formación de brotes laterales pudo observarse en las yemas axilares
cultivadas en el tratamiento MS 20%, único tratamiento donde se formaron. Los
resultados mostraron que en un 50% de los explantes se encontraron entre 3 y 4
brotes laterales, en un 34% 1 y 2, en un 8% con 6 y en el otro 8% con 8 (Figura 2).
En cuanto al crecimiento en mm del brote principal se encontró la mayor longitud con
36.17 mm a los 127 días en el tratamiento MS 100%*; los que menos crecieron (5 y
11 mm, a los 117 días) fueron los de los tratamientos MS 80% y 20%,
respectivamente (Figura 3).
83
Cuadro 11. Porcentaje de brotación de yemas axilares de aguacate criollo adiferentes días por tratamiento en estudio sobre concentración de tressales minerales.
Brotacíón (%)
Tratamiento 55 días 100 días 127 días
1. MS 20% 76 72 64
2. MS 40% 24 36 36
3. MS 60% 48 40 28
4. MS 80% 16 4 0
5. MS 100% 63 12 8
6. MS 100%* 32 40 24
7. WPM 100% 16 12 8
8. WPM 50% 40 36 32
9. Me Cown's 100% 12 20 0
10. Me Cown's 50% 36 12
* Tratamiento con 2 mg/1 de BA y AIB.
84
Al observar los datos de crecimiento del brote principal en la Figura 3, el
tratamiento donde mayor crecimiento, promedio por día se logró (0.24 mm) fue el MS
100%*, mientras que en el MS 80% no se sobrepasó los 0.06 mm/día. Al realizar el
análisis de varianza, en longitud del brote principal, resultó altamente significativo en
127 días, la comparación de medias entre tratamientos indicó que no existen
diferencias estadísticas entre el MS 100%, WPM 100% y MS 100%*, y que éstos son
los mejores en relación a la variable longitud del brote (Cuadro 12).
Con la aplicación de las diferentes dosis de los reguladores de crecimiento en
la combinación BA AIB, la formación de brotes inició solamente en algunos
tratamientos a los 45 días, en tanto que otros ya presentaban brotes con 1 a 2 hojas
pequeñas, este es el caso de los tratamientos (1-0, 1-0.2, 2-0, 2-0.2, 3-0 y 3-0.2 mg/l
de BA AIB) con porcentaje de brotación entre 15 y 53%.
85
A los 96 días, se estabilizó la respuesta del tejido con los resultados
siguientes: en el tratamiento sin reguladores (0-0) y en los tratamientos sin BA y con 1
mg/l, combinados con 0.2, 0.5 y 1.0 mg/1 de AIB (0-0.2, 0-0.5, 0-1 y 1-0.5 mg/I de BA-
AIB), las yemas axilares no formaron brotes. Las yemas axilares que presentaron los
porcentajes más altos de brotación (50-65%) fueron las incubadas en los medios de
cultivo con diferentes dosis de BA-AIB, preferentemente con dosis altas de BA sin AIB
o con 1 mg/l de esta auxina (1 -0, 2-0, 3-0 y 3-1 mg/l de BA-AIB).
Los datos de la variable longitud del brote se procesaron en un análisis de
varíanza para un diseño completamente al azar, se encontró significancia a los 96 y
110 días, sin embargo, , al realizar la prueba de comparación de medias Tukey
(α=0.05), no se encontraron diferencias estadísticas significativas (Anexos 2 y 3).
4.1.4.2. Multiplicación de brotes
Con base en la respuesta de. las yemas exilares en la fase de iniciación, las
cuales mostraron una mayor longitud dei brote al cultivarlas en el medio MS al 100%,
en este mismo medio se probaron dos concentraciones de sales minerales
86
modificadas (completas y a 1 /2 de su concentración) con la interacción BA - AIB y
adenina 40 mg/l. Después de 70 días de su cultivo, el número de brotes por explante
más alto alcanzado fue de 1.93 para el tratamiento con 1 mg/1 de BA más 0.1 mg/1 de
AIB en MS a un 1/2 de la concentración de sales; y para el parametro de longitud del
brote, el valor mayor (17.6 mm) se obtuvo en el mismo tratamiento anterior de
reguladores de crecimiento, pero con la concentración completa de sales (MS 100%)
(Cuadro 13).
Cuadro 13. Número de brotes por explante y longitud del brote de aguacate criolloen los tratamientos de la interacción BA - AIB en sales modificadascompletas (MS 100%) y MS 112 de su concentración.
Tratamiento Número de brotes Longitud (mm)BA - AIB mg/1 Conc. sales
2-0.2 112 1.81 16.06
1.5-0.15 112 1.54 14.40
1-0.1 112 1.93 14.95
0.5-0.05 112 1.37 16.33
0-0 112 1.20 10.47
2-0.2 Completas 1.63 15.96
1.5-0.15 “ 1.85 14.54
1-0.1 “ 1.44 17.60
0.5-0.05 “ 1.92 14.72
0-0 “ 1.78 11.86
En este mismo cuadro se observa que en los tratamientos sin reguladores se
muestra la menor longitud del brote, esto indica qué la interacción de la citocinina con
la auxina (BA-AIB) promueve en gran medida el crecimiento promedio de los brotes.
No se detectó significancia en el análisis de varianza para el factor concentración de
sales respecto a la variable número de brotes promedio por frasco, situación similar
se presentó en la variable longitud de brote por explante.
87
En los tratamientos probados con la combinación BA AIB pero en el medio
de cultivo MS 100% sin adenina, las yemas respondieron entre los 12 y 15 días
después del establecimiento en la formación de brotes, sin que se notaran
diferencias entre un tratamiento y otro. Sin embargo, se observaron diferencias
claras en brotación según la posición del brote formado, en las yemas axilares y
apicales del explante se formaron los primeros brotes, en tanto que las de la base
fueron más retardadas en su brotación.
Al realizar el análisis de varianza con los datos de la variable número de
brotes por explante frasco a los 25 y 85 días (Anexos 4 y 5), se observó significancia
entre los tratamientos, no obstante que los coeficientes de variación resultaron altos,
43.3 y 49%, debido en gran medida a la variación del inóculo; es decir no fue posible
uniformizar la sección del brote empleado en los tratamientos, para ello se utilizaron
yemas apicales y axilares de los brotes obtenidos in vitro y se eligió al azar el
tratamiento.
La prueba de comparación de medias Tukey (α= 0.05) (Cuadro 14) a los 85
días reportó que el tratamiento 4 (BA 0.9 mg/l y 0 de AIB, Figura 4), se encuentra en
el primer grupo de significancia estadística, sin que existan diferencias con los
tratamientos 10, 3, 8, 6, 11, 12, 7 y 2; del análisis de los niveles de los reguladores
que componen los tratamientos anteriores se deduce que aparentemente no existió
efecto del AIB, puesto que no hay diferencia entre 0.0, 0.05 y 0.1 mg/l. Así como
tampoco hubo efecto del BA en dosis de 0.3, 0.6 y 0.9 mgll, pero sí son notables con
el testigo (0.0 - 0.0 mg/I de BA - AIB).
En esta misma prueba se realizó un análisis de varianza con el promedio de la
longitud en mm de los brotes producidos por tres explantes por frasco, a los 25 y 85
días de su establecimiento (Anexos 6 y 7); se detectó solamente significancia al nivel
de 0.05 e igualmente que en la variable anterior los coeficientes de variación fueron
altos, 41.66 y 43.19, esto debido a la heterogeneidad del inóculo utilizado.
88
Cuadro 14. Comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variable número debrotes promedio por frasco de aguacate criollo a los 25 y 85 días, entratamiento con reguladores BA-AIB.
Tratamientos Número de brotes por frasco
No. BA - AIB (mg/l) 25 días 85 días4 0.9-0.0 9.5 A 10.9 A
10 0.3-0.1 8.2 AB 8.4 AB
3 0.6-0.0 8.0 AB 9.0 AB
8 0.9-0,05 7.1 AB 8.3 AB
6 0.3-0.05 6.3 AB 6.4 AB
5 0.0-0.05 6.1 AB 4.9 B
11 0.6-0.1 6.0 AB 7.1 AB
12 0.9-0.1 5.8 AB 9.0 AB
7 0.6-0.05 5.6 AB 5.8 AB
9 0.0-0.1 5.1 B 4.8 B
2 0.3-0.0 4.8 B 6.9 AB
1 0.0-0.0 4.2 4.7 B
89
En la prueba de comparación de medias Tukey (α= 0.05) (Cuadro 15), a los 85
días se detectó dentro del primer grupo de significancia al tratamiento testigo (0 - 0
mg/l de BA - AIB, Figura 5), sin que existieran diferencias con el resto de los
tratamientos, excepto con el tratamiento 9 (0.0 - 0.1 mg/1 de BA - AIB) que se ubicó
en el grupo B con un promedio de 16.2 mm.
Cuadro 15. Comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variable longitud promediode brote de yemas axilares in vitro de aguacate criollo a los 85 días, entratamientos con reguladores de crecimiento (BA-AIB).
Tratamientos Significancia estadística Tukey
No. BA - AIB (mg/l) Media (mm)
2 0.3-0.0 28.5 AB
8 0.9-0.05 22.2 AB
7 0.6-0.05 26.1 AB
4 0.9-0.0 22.5 AB
1 0.0-0.0 31.9 A
3 0.6-0.0 24.2 AB
12 0.9-0.1 18.2 AB
6 03-0.05 23.2 AB
10 03-0.1 20.8 AB
11 0.6-0.1 18.5 AB
5 0.0-0.05 18.9 AB
9 0.0-0,1 16.2 B
Es indudable que no únicamente las características cuantitativas son
determinantes para decidir cuál es el mejor tratamiento, ya que para esto se requiere
el análisis de las características cualitativas de los brotes, respecto a lo cual se
encontró que a los 85 días de su establecimiento (Cuadro 16) solamente los
tratamientos 1 y 2 presentaron una coloración verde oscuro, en tanto que el resto
verde claro, cuando se indujo a la brotación con dosis altas de BA - AIB
90
Cuadro 16. Características cualitativas de los brotes in vitro de aguacate criolloen los diferentes tratamientos a tos 85 días del establecimiento, entratamientos con reguladores de crecimiento (BA-AIB).
TratamientoNo. BA - A)B (mgll)
Características de los brotes
Color % de necrosis % de callo Formación brote
1 0.0-0.0 Verde oscuro 0 10 Bien formados
2 0.3-0.0 Verde oscuro 0 10 Bien formados
3 0.6-0,0 Verde claro 0 55.56 Deformes
4 0.9-0.0 Verde claro 0 70 Deformes
5 0.0-0.05 Verde claro 0 3,7 Bien formados
6 0.3-0.05 Verde claro 0 36.67 Bien formados
7 0.6-0.05 Verde claro 0 73.3 Deformes
8 0.9-0.05 Verde claro 0 40 Deformes
9 0.0-0.1 Verde claro 0 0 Bien formados
10 0.3-0.1 Verde claro 6.7 40 Deformes
11 0.6-0.1 Verde amarillo 30 36,67 Deformes
12 0.9-0-1 Verde amarillo 50 40 Deformes
(tratamientos 10, 11 y 12) se observó un porcentaje alto de necrosis de los explantes,
91
50% el tratamiento 12; también en las dosis altas de reguladores de crecimiento se
presentó formación de callo en la base de los explantes; se obtuvieron brotes bien
formados y poca formación de callo en los tratamientos 1, 2, 5, 6 y 9, esto fue en los
tratamientos con dosis bajas o bien con 0 - 0 mg/1 de BA - AIB.
Al realizar una revisión de los resultados en las diferentes variables en esta
prueba, se obtuvo la mejor respuesta en las yemas axilares cultivadas en el medio
MS con 0.3 mg/l de BA (Tratamiento 2, Figura 6), debido a que se observó un
número de 2.3 brotes laterales por explante (6.9 promedio por frasco), una longitud
promedio de brote de 28.5 mm (a los 85 días del establecimiento), un color óptimo de
brote (verde oscuro), un bajo porcentaje de formación de callo en la base de los
explantes (10%) y una buena formación de brote. Aunque en el tratamiento sin
reguladores de crecimiento (Testigo), las yemas formaron brotes con la mayor
longitud promedio, bien formados y poca formación de callo, no es mejor que el resto
de los tratamientos debido a que resultó con el valor más bajo en número de brotes
promedio.
92
4.1.4.3. Enraizamiento de brotes
En la primer prueba se observó que la respuesta al enraizamiento se obtuvo
con AIB incorporado al medio de cultivo con sales modificadas, lográndose hasta un
25% de enraizamiento y un promedio de 2.3 raíces por brote, en el tratamiento con 0.8
mg/1 de AIB. Por otra parte, cuando se utilizó ANA generalmente no se obtuvo
formación de raíces, excepto en sales MS con 0.3 mg/I de ANA con un 16.67% de
enraizamiento y en sales modificadas en la interacción AIB 0.5 mg/l - ANA 0.3 mg/I,
con 8.33% de enraizamiento; el hecho de que en los brotes del tratamiento control se
formaran raíces es normal, ya que cuando no se utilizan reguladores en el medio de
cultivo se presenta enraizamiento, pero en una baja proporción, 1 de cada 10 brotes
(Anexo 8).
En la segunda prueba, el análisis de varianza para la longitud de raíz indicó
alta significancia a los 54 y 88 días de establecida (Anexos 9 y 10), al realizar la
prueba de comparación de medias Tukey (α=0.05) a los 54 días se obtuvo con la
mayor longitud y en el primer grupo de significancia al tratamiento control, sin que
existan diferencias estadísticas significativas con AIB 0.4 mg/l; a los 88 días
permaneció dentro del primer grupo de significancia el tratamiento control pero no
hay diferencias estadísticas significativas con los tratamientos 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 y 1.2
mg/l de AIB (Cuadro 17).
En el Cuadro 18 se observa en forma más precisa; que la mayor cantidad de
raíces por brote se obtuvieron en los brotes incubados en MS con 0.6 mg/l de AIB más
0.125 mg/l de AG3 con 4.69 y 4.08 raíces en el. Medio MS con 0.8 mg/l de AIB más
0.125 mg/l de AG3. Cabe mencionar ,.que en estos tratamientos, los brotes
mostraron alta formación de callo en la base.
93
Cuadro 17. Comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variable longitud de raíz porbrote de aguacate criollo a los 54 y 88 días, en prueba de enraizamiento debrotes in vitro con AIB e interacción AIB-AG3.
Tratamientos (mg/l) Longitud de raíz (mm)AIB AG3 54 días 88 días
0.8 0.125 7.5 11.81
0.6 0.125 6.9 B 10.78 B
0.4 0.0 16.8 AB 22.97 AB
1.0 0.25 10.1 B 13.85 B
1.2 0.0 12.0 B 16.77 AB
1.0 0.125 7.7 B 15.88 B
1.0 0.0 11.8 B 19.43 AB
0.0 0.0 26.2 A ' 31.83 A
0.8 0.0 6.8 B 20.78 AB
0.6 0.0 10.8 B 20.42 AB
Cuadro 18. Respuesta al enraizamiento de los brotes de aguacate criollo obtenidos in vitroa los 88 días del establecimiento, en prueba de dosis de AIB einteracción AIB-AG3,
Tratamiento(mg/l)
AIB AG3
Número deraíces totales por
brotes
Número de raícespromedio por brote
Enraizamiento(%)
Longitud deraíz (mm)
0.0 0.0 12 en 9 1.33 29.03 31.83
0.4 0.0 27 en 12 2.25 44.44 22.97
0.6 0.0 13 en 7 1.86 29.17 20.42
0.8 0.0 17 en 6 2.83 20.00 20.78
1.0 0.0 4 en 3 1.33 9.68 19.43
1.2 0.0 29 en 11 2.64 36.67 16.77
0.6 0.125 61 en 13 4.69 43.33 10.78
0.8 0.125 49 en 12 4.08 40.00 11.81
1.0 0.125 10 en 5 2 19.23 15.88
1.0 0.25 18 en 8 2.25 32.00 13.85
94
En el medio nutritivo con 0.4 mg/l de AIB a los 88 días, los brotes presentaron
un 44.4% de enraizamiento (Cuadro 18 y Figura 7), un número aceptable de raíces
por brote (2.25), sin formación de callo en la base del tallo y una longitud de raíz de
22.97 mm. Lo anterior presenta a este tratamiento como el óptimo para lograr el
desarrollo de plántulas aptas para el transplante. Es importante señalar que al
trasplantar para su aclimatación brotes con raíz y con callo, la supervivencia resultó
nula.
4.1.5. Aclimatación de plántulas de aguacate criollo obtenidas in vitro
En las tres primeras pruebas realizadas, aproximadamente a los 12 días de su
establecimiento, se observó muerte prematura de las plántulas. En la cuarta prueba
con sustratos y procedimientos de fertilización, a los 10 días la mezcla donde las
plántulas mostraron el mejor comportamiento, con un 100% de supervivencia y mejor
color de plántulas, fue el sustrato de turba 70% + agrolita 30% con fertilización de
95
medio líquido MS 100%, sin embargo las plántulas murieron antes de 20 días. En la
prueba sobre intensidades de luz las plántulas mostraron 0% de supervivencia a los
16 días. - En la prueba sobre sistemas de fertilización, el comportamiento de las
plántulas fue del 60% de supervivencia a los 18 días del establecimiento con
fertilización MS 100% y de 0% en el segundo tratamiento (fertilización con 30-10-10,
N-P-K 1 g/I + ácido húmico 0.5 cc/I + bayfolan 1 g/I + raizal 2 g/I), por otra parte, en
esta misma prueba no se observó respuesta al aplicar los tratamientos con ASA y
ABA en las plántulas del tratamiento 1, ya que a los 10 días de la aplicación todas
tomaron una coloración café clara por efecto de la pérdida de agua o deshidratación
de los tejidos y posteriormente cambiaron a café oscura con muerte de las plántulas.
En la prueba 7 sobre aplicación de 250 mg/1 de ASA en comparación con el
uso de Folicote en dosis de 1 parte en 20 de agua, a los 20 días se obtuvieron los
siguientes resultados: 20% de supervivencia en Folicote, 0% en ASA y 25% en el
control, pero a los 42 días el porcentaje de supervivencia disminuyó al 5% en el
control y el mismo valor en Folicote; a los 100 días sobrevivió solamente un 5% de
las plántulas con Folícote y presentaron éstas una altura promedio de 5 cm.
La prueba 8 sobre dosis de Folicote reportó el siguiente comportamiento de las
plántulas: a los 20 días una supervivencia de 90% en la dosis de 1 parte en 20 y
0% en el control (Figura 8), a los 30 días se quitó la tapa transparente a la charola
96
y se observó una disminución en la supervivencia, muerte de las plántulas por
deshidratación, el tratamiento 1.5 partes en 20 muestra el porcentaje más alto con
30% (Cuadro 19); la altura promedio de las plántulas del tratamiento 1 fue de 3.5 cm a
los 60 días y de 4.2 cm a, los 75 días.
Cuadro 19. Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en el estudio dedosis de Folicote.
Tratamiento Supervivencia (%)20d 30d 40d 60d 75 días
1. Folicote 1 parte en 20 de agua. 90 10 10 10 102. “ 1.5 “ “ “ “ “ 60 50 30 0 03. “ 2 “ “ “ “ “ 60 0 0 0 04. Control 0 0 0 0 0
En la última prueba (9), a los 45 días se obtuvo una supervivencia del 10% en
el tratamiento tapa con filtro bacteriológico y del 40% con Folicote, a los 110 días se
estabilizó el. porcentaje de supervivencia superando la aplicación de Folicote,
producto que cumple satisfactoriamente en la protección de la plántula contra la
pérdida de agua. La disminución del porcentaje de supervivencia se debió en gran
medida a la eliminación prematura de la bolsa de plástico, al exponer drásticamente
a las plántulas a muerte. por deshidratación (Cuadro 20); a los 110 días se tuvieron
plantas con un promedio de 6 cm de altura.
Cuadro 20. Porcentaje de supervivencia de plántulas de aguacate en el estudio depreaclímatación con filtro bacteriológico en comparación a Folicote.
Tratamiento Porcentaje de supervivencia
15d 30d 45 d 100 d 110 días
1. Folicote 1 parte en 20 de agua. 100 90 40 20 20
2. Preaclimatación tapa con filtro. 90 40 10 10 10
3. Control 100 70 30 5 5
En la validación del tratamiento con Folicote en dosis de 1 parte en 20 de
agua, con 60 plántulas de aguacate criollo obtenidas in vitro , se obtuvieron
97
porcentajes de supervivencia hasta del 100% a los 100 días del trasplante, al evitar
eliminar la bolsa de plástico o la cubierta de las plántulas durante los 80 primeros
días, o sea hasta que ésta forme sus primeras dos hojas en la fase de aclimatación.
En los estudios citológicos al realizar el análisis de varianza, se obtuvo
significancia únicamente en la variable frecuencia de estomas, con un coeficiente de
variación aceptable (Anexo 11). En el Cuadro 21 se presenta la prueba de
comparación de medias Tukey (α= 0.05), en éste se detecta que el número de
células estomáticas en hojas de plántulas ín vitro fue menor y significativamente
diferente a las hojas de plantas de vivero, no así con el árbol adulto (Figura 9).
Cuadro 21. Prueba de comparación de medias Tukey (α=0.05) en la variablefrecuencia de estomas en hojas de aguacate criollo.
Tratamiento Media Signif. Tukey (a=0.05)
Arbol adulto 5.96 AB
Invernadero 6.46 A
Plántulas in vitro 4.56 B
98
En relación a los valores de las variables FCNE e IE, se tiene que el mayor
valor.con 17.82 de FCNE y el menor IE (5.83) se presentó en el tratamiento de
plántulas in vitro e inverso con 13.96 de FCNE y 7.39 en lE en las hojas de árbol
adulto (Anexo 12). Adicionalmente se presentó malformación de las células
estomáticas en las hojas de las plántulas in vitro; con relación a la cutícula los tejidos
de árbol adulto, éstos mostraron una cutícula gruesa cerosa, en tanto que en las
plántulas in vitro se observó muy delgada y con ausencia de ceras.
4.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass
4.2.1. Efecto del ácido ascórbico, cisteína y luz en la necrosis del tejido nucelar
Únicamente se observó efecto positivo dei ácido ascórbico en la reducción de
la necrosis del tejido nucelar, en donde este antioxidante en una concentración de
400 mg/l evitó la presencia de necrosis en todos los explantes (Figura 10). Los
porcentajes de necrosis promedio por factor de variación para cada tratamiento se
presentan en el Cuadro 22, con los cuales es notable que tanto en luz como en
oscuridad, el ácido ascórbico reduce a 0% la necrosis del tejido; sin antioxidantes, el
porcentaje de necrosis es de 87.5% en oscuridad y del 100% en la luz; además de
que la cisteína prácticamente no tiene efecto en impedir este fenómeno de oxidación.
Con el análisis estadístico realizado, se encontró que la significancia estadística fue
alta solamente en el factor de variación B (ácido ascórbico, Anexo 13); ésto se
corroboró al aplicar una DMS al promedio de valores de arco seno √x de los
tratamientos.
Estos resultados sugieren que para evitar la necrosis de las nucelas de
aguacate, antes de su establecimiento in vitro deben de sumergirse en una solución
de ácido ascórbico en dosis de 400 mg/1 por 5 segundos, y posteriormente incubarlas
en oscuridad o bien a intensidades de luz de 9.4 µEm-2s-1, con un fotoperiodo de 16
horas de luz por 8 de oscuridad y a una temperatura de 25±2°C.
99
Cuadro 22. Porcentaje de necrosis en tejido nucelar de aguacate cv. Hass endiferentes tratamientos de antioxidantes e intensidad de luz.
Necrosis (%)Tratamientos Oscuridad Luz
Sin antioxidantes 87.5 100Cisteína 91.5 79.16
Acido ascórbico 0 0Cisteína - Ac. ascórbico 4.15 3.84
100
4.2.2. Efecto de los; reguladores de crecimientó y otros Componentes del medio
de cultivo en la embriogénesis somática
4.2.2.1. Inducción de callo embrigénico
En el medio de cultivo in vitro, las sales minerales y;. otros componentes del
medio de cultivo así los reguladores de crecimiento, son también
fundamentales en la. indo -Ion de formación de callo embr1 gén ico. El tejido nucelar
respondió de diferente manera al incubarse en los diferentes tratamientos de la
primera prueba, donde se varió la concentración de nutrimentos del medio nutritivo
MS y el tipo y dosis de auxinas. La mejor formación de callo se indujo en el medio
MS con la mitad de sus componentes (MS 1/2) suplementado con 0.01 mg/l de 2,4-
D, en un 28.57% de los explantes. Un valor de tan solo un 8.3% de las nucelas con
callo embriogénico se obtuvo en el mismo medio MS 1/2 pero con 0.5 mg/l de
picloram.
Con el propósito de aumentar estos porcentajes de explantes con formación
de callo embriogénico, el tejido nucelar de aguacate fue incubado bajo otras dosis de
auxinas, observado un inicio de crecimiento de callo entre los 25 a 40 días después
del establecimiento de las nucelas en el medio de cultivo, aunque los porcentajes de
nucelas con callo no aumentó considerablemente, si fue posible lograrlo en varios
tratamientos; se logró un 20% de formación de callo embriogénico en el medio MS 1/2
con 1 mg/1 de 2,4-D; un 17.8% en el tratamiento MS 1/2 con 4 mg/l de picloram más
0.4 mg/1 de AIB; y un 10% al adicionar al medio de cultivo 2 mg/1 de picloram en
concentración completa de MS (Figura 11), igual porcentaje se obtuvo con la dosis
de 2 mg/l de picloram más 0.2 mg/l de AIB (Cuadro 23).
Generalmente los callos presentaron un color blanco crema, amarillento o
cristalino, mismos que con el transcurrir del tiempo cambiaron de color a café claro y
oscuro (Figura 12); el diámetro que alcanzaron entre los 60 y 70 días fue de 8 a 13
mm (Cuadro 23).
101
Cuadro 23. Porcentaje de formación de callo embriogénico en tejido nucelar deaguacate cv. Hass, color y diámetro en los tratamientos donde seformaron las estructuras embriogénicas.
Concentraciónde MS
Tipo y dosis dereguladores de
crecimiento (mg/1)
Porcentajede formación
callo
Color deCallo
Diámetro deCallo (mm)
1/2
1/2
Completas
"
Picioram-AIB 4 - 0.4
2,4-D 1
Picioram-AIB 2 - 0.2
Picioram 2
17.8
20
10
10
Blanco crema
“
Café claro
“
13
Irregular
13
8
102
4.2.2.2. Multiplicación y desarrollo de embriones somáticos
En la prueba del efecto de reguladores de crecimiento sobre el desarrollo de
los embriones somáticos de aguacate, pudo observarse que en la totalidad de los
tratamientos se presentó un mejor crecimiento del callo embriogénico cuando se
mantenía el explante a luz indirecta, a los 30 días de su cultivo; sin embargo, al
comparar de manera preliminar el número de embriones, cuando se utilizó BA (0.11
mg/I), la combinación BA-AG3 (0.11 mg/I de cada uno) y sin reguladores, no se
observó significancia estadística en el ANDEVA. Situación similar a la anterior se
presentó al evaluar otros tratamientos con reguladores de crecimiento, ya que con
picloram (0.1 mg/l) y sin reguladores, no existen diferencias estadísticas en el
número de: masas proembríogénicas (MPE), estructuras globulares (EG),
acorazonados (EA), torpedos (ET) y embriones somáticos maduros (ESM).
103
Al utilizar dosis mayores de picloram (0.3, 0.6, 0.9 y 1 mg/I) y el testigo (0
mg/I), también no se detectaron diferencias estadísticas significativas en las
diferentes fases de los embriones somáticos. La ausencia de acción alguna de los
reguladores de crecimiento BA (0.2 mg/I) y picloram (0.3 mg/l), sobre la multiplicación
de masas proembriogénicas en medio sólido se confirmó en la cuarta y quinta
prueba; sin embargo quedaba la duda del tipo de tejido más adecuado para propagar
las diferentes fases de embriones somáticos, para lo cual se establecieron en los tres
diferentes medios (BA, picloram y sin reguladores), dos tipos de tejidos a utilizar:
masas proembriogénicas y globulares (Figura 13).
Lo anterior dio como resultado que a los 14 días se observara una
multiplicación óptima en el número de estructuras embrionarias, a partir del tejido con
masas proembriogénicas (Anexo 14), pero no así en los otros tejidos, donde no se
observaron diferencias.
104
Al utilizar diferentes dosis de caseína hidrolizada, en otro de los experimentos,
se encontraron diferencias entre los tratamientos solamente en embriones globulares
y acorazonados a los 20 días del cultivo (Cuadro 24), no así en masas
proembriogénicas, embriones en fase de torpedo (Figura 14) y maduros. En una
concentración de 400 mg/l, el efecto fue positivo en el aumento del número de
estructuras globulares y acorazonados. En el cuadro 24 se observa la relación
directa entre la concentración de la caseína hidrolizada adicionada al' medio de
cultivo y el número de estructuras de estos tipos: sin este compuesto y en
concentraciones altas (1,000 mg/l), no se induce el desarrollo de los embriones
somáticos de aguacate.
Al evaluar otras dosis más bajas de caseína hidrolizada (100, 200 y 300 mg/l),
a los 19 días no se reportó significancia en el ANDEVA en las diferentes fases de
crecimiento y desarrollo de los embriones somáticos.
Cuadro 24. Número de estructuras embrionarias (globulares y acorazonados) encallos de aguacate cv. Hass a los 20 días del establecimiento.Significancia estadística (Tukey α= 0.01).
Tratamientos Número de estructuras embrionarias
(Dosis caseína, mg/1) Globulares Acorazonados
400 5.68 A 2.54 A
800 5.02 A 2.08 AB
600 4.58 AB 1.04 BC
0 4.20 AB 1.36 B
200 3.44 AB 1.72 AB
1,000 0.88 B 0.2 C
105
Al cultivar las estructuras embrionarias en medio líquido, en donde se
evaluaron diferentes dosis de picloram (0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7 y 1 mg/I), incubándolas
en agitación orbital (100 rpm), se observó la presencia de necrosis en el tejido entre
los 15 y 20 días, situación que no se presentó al cultivarse en medio sólido, en donde
después de los 25 a 30 días se empieza a deteriorar el tejido; sin embargo, pudo
constatarse que hubo un mayor número de estructuras embrionarias con altos
porcentajes de viabilidad (85%) en el medio sin picloram, a los 20 días del cultivo:
se encontraron 29.5 masas proembriogénicas, 12.5 estructuras globulares, 4
estructuras en forma de corazón y 4.5 estructuras torpedo, por cada 10 mi de medio
(Cuadro 25).
Además, en este último tratamiento se observó la formación de embriones
somáticos maduros completos, disgregados y de color amarillo claro, en tanto que en
el tratamiento con la dosis más alta de picloram, lo embriones se presentaron en
agregados, de color café claro a oscuro y sin llegar a la maduración.
106
Cuadro 25. Número y porcentajes de viabilidad de estructuras embrionarias deaguacate cv. Hass en sus diferentes fases, por cada 10 ml demedio, a los 20 días de cultivo.
Número de estructuras embrionariasTratamientoDosis de picloram
(m9/1)MPE EG EA. ET
Viabilidad(%)
0 29.5 12.5 4 4.5' 85
0.1 13.5 12 2 1.5 80
0.3 6.5 6 1.5 0.5 35
0.5 13 10 4 0 45
0.7 8.5 8.5 2 > 0:5 55
1.0 6.5 10 2.5 0.5 17.5
Asimismo, al evaluar la ganancia de peso del cultivo de masas
proembriogénicas en medio líquido, se encontró la mayor ganancia (0.85 g) en el
tratamiento sin picloram y la menor (0.63 g) en el tratamiento con 0.7 mgll de
picloram, a los 20 días por cada 12.5 ml de muestra.
Con el fin de obtener un cultivo masivo de masas proembriogénicas o de
embriones somáticos de aguacate, se establecieron cultivos de masas
proembriogénicas y embriones somáticos en fase globular en un biorreactor.
Previamente se verificó que la viabilidad de estas estructuras fuera del 100%. Se
inoculó con 5.0363 mg/ml de masas proembriogénicas, se encontró .a los 25 días .un
incremento en el peso de la muestra por ml del 200%, al obtener 15.5 mg/ml; cabe
señalar que el medio de cultivo se preparó con 0.3 mg/l de picloram.
4.2.2.3. Maduración de embriones somáticos
Con la adición al medio de cultivo de los diferentes reguladores de crecimiento
en varias dosis para inducir la maduración de los embriones y conseguir un número
óptimo de embriones somáticos maduros (ESM), fue posible observar el efecto de
estas sustancias.
107
En los medios de cultivo con BA (0.11 mg/l) y ABA (1 y 2 mg/I), a los 22 días
del establecimiento se generaron ESM con un promedio por caja de petri (con 5
explantes) de 0.48, 0.66 y 0.76 respectivamente, es decir a mayor cantidad de ABA
el promedio fue, mayor, no obstante no se encontró significancia en el ANDEVA
(Anexo 15). Al aumentar los niveles de BA (1 mg/l) y ABA (2, 4 y 8 mg/l), en dosis de
sacarosa de 30 y 60 g/l, también se obtuvieron ESM, se aumentó el promedio de
éstos al incubarse en MS con 8 mg/l de ABA (0.64 ESM), con un valor promedio
máximo de 0.88 en MS con 60 g/I de sacarosa, aunque no se encontró significancia
estadística en el ANDEVA (Anexo 16).
Con base en los resultados anteriores y de acuerdo a los trabajos de
Witjaksono y Litz (1999b), se decidió probar en el medio de cultivo diferentes dosis de
agar (5, 6, 7, 8 y 10 g/I), sin encontrar valores más altos de ESM que en el
experimento anterior, y sin diferencias significativas entre los tratamientos. En el
medio de cultivo utilizado como control (MS con 5 g/l de agar), no se. observaron
ESM. El promedio máximo de ESM por caja de petri (con 5 explantes) fue de 0.6 en
MS con 7 g/I de agar y el mínimo de 0.13 al incubarlos en medio nutritivo con 6 g/l.
Debido a esto, se incrementaron las dosis de altar hasta una concentración máxima
de 20 g/l (8, 11, 14 y 20 g/l), observándose la formación de ESM a los 36 días en
todos los tratamientos, con valores máximos de 0.9750 en presencia de 20 g/I de
agar, seguido de los valores promedio de EM de 0.5429 y 0.4889 en los tratamientos
con 14 y 11 g/I de agar, respectivamente (Cuadro 26).
Se obtuvo una alta significancia en los valores del factor de variación
tratamientos (Anexo 17), al realizar el ANDEVA con el promedio de embriones por
caja de petri (con 7 explantes), por consiguiente se aplicó la prueba de comparación
de medias Tukey (α=0.01), se eliminó el tratamiento testigo que presentó 0
embriones maduros. En el último grupo de significancia se ubicó el tratamiento de 8
g/l de agar (Cuadro 26).
108
Cuadro 26. Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv. Hass porcaja de petri, a los 36 días. Significancia estadística Tukey (a=0.01).
Tratamientos Media Significancia estadística
Dosis de agar (g/I) Tukey
20 0.9750 A
14 . 0.5429 B
11 0.4889 B
8 0.0857 C
En otro experimento, donde se probaron 10, 20 y 30 g/I de agar, con la
finalidad de confirmar el efecto del agar sobre la maduración de los embriones
somáticos de aguacate, a los 23 días del cultivo se detectó un promedio de ESM por
caja de petri hasta de 1.96 en 20 g/I de agar (Figura 15A), 1.88 en 30 g/I y 0.24 en 10
g/l. No hubo diferencias estadísticas entre los tratamientos de 20 y 30 g/I, pero sí con
el de 10 g/I (Tukey, α= 0.01) (Cuadro 27).
Cuadro 27. Promedio de embriones somáticos maduros de aguacate cv. Hass porcaja de petri a los 23 días. Significancia estadística Tukey (a= 0.01).
TratamientosDosis de agar (g/l)
Media
20 1.96 A
30 1.88 A
10 0.24 B
Además, para conseguir la maduración de embriones somáticos de aguacate,
se estudió el efecto de diferentes dosis de sacarosa (30, 50, 70 y 90 g/I) y manitol (7,
9, 11 y 13%) para observar la consecuencia del aumento de la presión osmótica del
medio de cultivo. En los medios de cultivo con la variación en la concentración de
sacarosa, se generaron ESM en un promedio máximo por caja de petri de 0.37 con
50 g/l, pero no existieron diferencias entre los tratamientos probados (Anexo 18); se
repitió la prueba anterior, se encontró solamente formación de ESM en el tratamiento
90 g/I de sacarosa con un promedio de 0.22. Al cultivar las estructuras embrionarias
109
en medios con manitol, no se presentó la maduración de embriones somáticos y se
detectó un alto porcentaje de necrosis en los tejidos incubados (90%).
La maduración de los embriones somáticos de aguacate se percibe por los
cambios de coloración, formación de nuevo tejido y por el tamaño de éstos. Ya se ha
indicado que el color de los ESM cambia de amarillo cremoso a blanco, al observar
la formación de un tejido envolvente rígido (Figura 15A). El tamaño de los ESM llega
a alcanzar los 5 x 3 mm (Figura 15B), aunque esto depende del medio y condiciones
de cultivo. Generalmente los resultados confirman que el tamaño de los ESM se
comporta inversamente proporcional al número de éstos por caja de petri, con la
110
dosis más alta de agar se encontraron los embriones más pequeños con un
promedio de 2 x 1 mm, la siguiente de 2 x 2, 4 x 3 y en la dosis más baja, ESM de 5 x
3 mm.
4.2.2.3.1. Análisis de almidón y glucosa de embriones somáticos maduros
Se analizó la presencia de almidón y glucosa en los ESM de aguacate
obtenidos en esta investigación para verificar la integridad de éstos y relacionar el
contenido con la respuesta de germinación. Cortes de tejido de los ESM fueron
sometidos a tinción con una solución de fugo¡ (2 g de yoduro de potasio + 1 g de
yodo en 250 ml de agua), y fueron observados en el microscopio de fases. Las
células no mostraron el color azul característico de la presencia de gránulos de
almidón, se concluye que no había almidón en los ESM. En la cuantificación de
glucosa, los ESM presentaron un contenido de 6.026 x 10-4 mg a 13.779 x 10-4 mg
por cada mg de ESM.
4.2.2.4. Germinación de embriones somáticos maduros
Con las diferentes pruebas realizadas sobre reguladores de crecimiento,
interacción BA-AG3 BA-AIB, BA-2,4-D y brasinoesteroides- BA-AG3 en medio sólido,
dosis de BA, TDZ e interacción, BA-AIB en medio líquido con papel filtro o en
magenta en diferentes tiempos de inmersión o con diferentes dosis de adenina
(Figura 16), no se obtuvieron porcentajes aceptables de germinación, ya que
solamente en algunos tratamientos se observaron indicios de emisión de brotes o
formación de raíces (Figura 17).
De manera general, con niveles altos de reguladores se generó nuevamente
callo embriogénico, es decir que los tejidos sufrieron de nuevo desdiferenciación
celular. No obstante a lo anterior, al establecer los embriones somáticos en medio de
cultivo con sales de Anderson (1975) modificada en nitratos (+25%), sin reguladores
de crecimiento y recultivar éstos a los 90 días a medio MS con BA 0.3 mg/l, se
111
obtuvo un porcentaje del 10% de germinación a los 118 días de su establecimiento
(Figura 18).
112
113
V. DISCUSIÓN
5.1. Organogénesis de aguacate criollo
5.1.1. Condiciones óptimas de asepsia para el establecimiento in vitro de yemas
axilares de aguacate
En los cultivos in vitro encaminados a la obtención de procesos
morfogenéticos, como la organogénesis, uno de los principales problemas es la
enorme dificultad para establecer los explantes en condiciones asépticas y lograr
excelente brotación, debido a la alta incidencia de contaminación por hongos y a la
necrosis apical (Pliego-Alfaro et al., 1987). Para establecer óptimamente un sistema
in vitro, existen métodos rutinarios de asepsia que involucra el uso de compuestos
detergentes y tóxicos a microorganismos, así como el uso de plaguicidas y
antibióticos usados directamente sobre el explante o adicionados al medio de cultivo
(McClelland y Smith, 1993).
En las yemas de aguacate, el uso de plaguicidas para eliminar los patógenos
del explante fue más eficiente cuando se incorporaron al medio de cultivo, esto
probablemente porque su absorción es lenta y en determinada forma dosificada por
la misma entrada de los compuestos nutritivos a los tejidos del explante. Uno de los
mejores tratamientos para eliminar la presencia de hongos, fue la incorporación al
medio de cultivo de solamente 1 g/I de benomilo, con una permanencia del explante
que no excedió los 15 días, ya que con los resultados obtenidos, se observó que
estos explantes soportaron hasta los 48 días sin mostrar síntomas de necrosamiento
o fitotoxicidad.
114
5.1.2. Prevención de necrosis de yemas axilares de aguacate
Al preparar los explantes para su establecimiento in vitro se dañan los tejidos y
los compuestos fenólicos que están acumulados en grandes cantidades en las
vacuolas se mezclan con el contenido de los plastidios y otros orgánulos donde están
confinadas las polifenoloxidasas y aparece la coloración negra o marrón como
consecuencia del proceso de oxidación (Jiménez,1998). El tratamiento que resultó
más favorable para eliminar el necrosamiento de las yemas axilares de aguacate in
vitro, fue la inmersión del explante en ácido ascórbico (400 mg/I) durante 30 minutos
previo a su establecimiento en el medio de cultivo. Este resultado elimina el problema
de manera más práctica y económica que la obtenida por Pliego-Alfaro y col. (1987)
y Barceló-Muñoz y col. (1999), ya que el primer grupo de investigadores proponen la
técnica de cultivo de doble fase o recultivos múltiples a intervalos cortos, condiciones
que inducen hiperhidricidad e hinchamiento de las yemas las cuales mostraron un
lento crecimiento. El segundo grupo indica que para vencer el problema anterior se
deben cultivar las yemas apicales o laterales en medio líquido en un agitador
giratorio por un periodo de 2 semanas. Todo lo anterior incrementó los costos y
tiempo.
5.1.3. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio de cultivo en
la organogénesis in vitro de aguacate
La composición de un medio de cultivo es determinante en el crecimiento y
desarrollo del explante, las sales minerales y los reguladores de crecimiento son
importantes. Los resultados obtenidos en la brotación in vitro de yemas axilares de
árbol adulto de aguacate criollo, indican que en las sales minerales MS 20% con BA
2 mg/l y AIB 0.2 mg/I, se produce el mayor porcentaje de brotación (76% a los 55
días del establecimiento del explante) y el mayor número de brotes laterales (3.41),
aunque la mayor longitud del brote principal (32.17 mm a los 127 días) se obtuvo con
MS 100% y 2 mg/I de BA y AIB; sin embargo, no se observaron diferencias
115
estadísticas significativas cuando se empleó MS o WPM al 100% con BA 2 mg/I y
AIB 0.2 mg/l. De manera general, la brotación fue mayor (43.16%) en los medios de
cultivo preparados con sales minerales MS, en tanto que en sales WPM fue de 28%
y en Mc Cown's del 24%.
En la fase de establecimiento de un explante in vitro se requiere obtener la
máxima brotación, brotes bien formados, de una longitud aceptable y con la mayor
cantidad de yemas axilares, situación que en parte se logró en aguacate criollo al
utilizar el medio de cultivo con sales MS 20%, en tanto que Pliego-Alfaro y col. (1987)
con el portainjerto IV-8 muestran que la reducción de macroelementos MS a la mitad
de su concentración fue benéfico para el desarrollo de brotes; una reducción del
porcentaje de sales conlleva a obtener una buena brotación, pero reducida longitud
de éstos y por consecuencia menor cantidad de yemas axilares potenciales a
recultivar en la fase de multiplicación. De estos resultados se observa que existe una
relación directa entre menos sales (MS 20%), mayor brotación y menor longitud de
los brotes, y más sales (MS al 100%), menor brotación y mayor longitud de los
brotes.
Con relación al barrido de reguladores de crecimiento realizado en la fase de
iniciación, resulta notable que la falta de la citocinina en el medio de cultivo es
determinante para lograr la brotación y que precisamente los tratamientos que
mostraron las mayores brotaciones fue con BA, situación que coincide con lo
señalado por Davies (1995), Cline (1996) y Brandstatter y Kieber (1998), en donde
para obtener morfogénesis, iniciación y crecimiento de brotes se requiere la
presencia de citocinina.
En resumen, el efecto de las sales minerales MS es mejor que las del WPM y
Mc Cown's para la brotación de yemas axilares de aguacate criollo (P. americana
var. drymifolia), varios investigadores reportan su uso (Nel et al, 1982; González y
Salazar, 1984; González et al., 1985; Shall, 1987; Pliego et al., 1987; Solórzano-
Vega, 1989; Mohamed-Yasseen, 1995b y Barceló-Muñoz et al., 1999), pero no
116
coinciden los resultados que se obtuvieron con los de estos investigadores, en
cuanto a la concentración de las sales minerales, y en el tipo y dosis de los
reguladores de crecimiento, ya que en sus estudios emplearon germoplasma
diferente de aguacate, como P. indica, P. americana raza antillana, P. schiedeana, P.
americana cv. Fuerte entre otros, y por el tipo de explante que utilizaron para
regenerar plántulas in vitro: brotes de 3-5 cm de plántulas de 1 año, segmentos de
tallo obtenidos a partir de semilla, ejes embrionarios de semillas maduras y brotes
básales obtenidos después de podar el árbol a nivel de suelo.
En la multiplicación de brotes in vitro se observó que las yemas axilares y
apicales brotaron primero (12 días), en tanto que las yemas de la base del explante
brotaron posteriormente. Lo anterior es una respuesta normal, debido a que los
tejidos jóvenes inician más rápido el crecimiento en condiciones in vitro, que coincide
con lo señalado por Halperin (1996) quien demostró que la edad fisiológica del inóculo
influye en la formación de órganos.
Por otra parte, resulta evidente que en la prueba de brotación múltiple o
multiplicación de brotes, los valores más altos en cuanto a número de brotes
promedio por frasco (10.9 y 9 a los 85 días) se obtuvieron con dosis altas de
citocinina (0.9 y 0.6 mg/l de BA, y 0.9-0.1 mg/l de BA-AIB), sin embargo estos
tratamientos formaron callo abundante en la base del explante (70, 55.56 y 40%
respectivamente); indudablemente que con sólo 0.3 mg/l de BA se observó poca
formación de callo, un número aceptable de brotes promedio por frasco (6.9), buena
longitud promedio de los brotes (28.48 mm) y de color verde oscuro, crecimiento
uniforme y vigoroso. Estos resultados no coinciden con la dosis de reguladores de
crecimiento reportada por Nel y col. (1982) quienes trabajaron con P. indica y que
en la fase de establecimiento así como en las subsecuentes multiplicaciones
agregaron al medio 2 mg/l de BA; tampoco coincide con lo obtenido por González y
Salazar (1984) quienes observaron crecimiento de yemas axilares en P. americana
raza antillana en un medio con mayor proporción de auxina que de citocinina (0.3
mg/I de AIB y 0.1 mg/l de K); también difieren con Shall (1987) que utilizó P.
117
americana cv. Fuerte, en donde fomentó la formación de brotes con 5 y 10 mg/I de
BA; probablemente esto sea un reflejo de la diferencia endógena de las citocininas
en estas especies de Persea, ya que en la especie y variedad de estudio se requiere
una cantidad mínima de citocinina (0.3 mg/I de BA) para la multiplicación de los
brotes.
En la prueba anterior también se observó que cuando no se utilizan
reguladores de crecimiento se obtiene una buena longitud del brote, pero sin que
éste multiplique, en algunas especies esta etapa es necesaria para desarrollar el
brote, antes de la inducción de raíces o de la aclimatación. Lo antes mencionado
coincide con Von Amold (1988) quien señala que frecuentemente es necesario
eliminar las citocininas para el alargamiento y el enraizamiento de los brotes.
En la fase de enraizamiento in vitro de brotes de aguacate criollo se reportan
porcentajes de formación de raíces hasta del 44.44%, con un promedio de raíces por
brote de 2.25, aceptable en plantas leñosas como el aguacate, aunque este valor es
menor al alcanzado por Barceló-Muñoz y col. (1999) con brotes del portainjerto
selección IV-8, no obstante que para lograr estos resultados usaron dos tipos de
medio, primero establecieron los brotes en medio líquido en un agitador giratorio con
macroelementos MS 0.3X y 4.9 µM de AIB y posteriormente los transfirieron a medio
sólido en ausencia de auxina pero con 1 g/I de carbón activado, procedimiento que es
impráctico y costoso. En cuanto a la dosis de la auxina que se encontró como
mejor respuesta, 0.4 mg/I de AIB, no coincide con el nivel obtenido por Nel y col.
(1982), González y Salazar (1984) y Mohamed-Yasseen (1995b) en germoplasma de
aguacate diferente, investigadores que sugieren dosis de 2 hasta 10 mg/1 de AIB.
La fase de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro es fundamental y
crítica, por la deshidratación y la intensidad de luz a que se expone, porque en
general una plántula in vitro no desarrolla sistemas de regulación hídrica tales como
cera, estomas, cutícula, etc. (Preece y Sutter, 1991) y la intensidad de luz puede ser
hasta 9 veces más (900 W/m2) (Abdeinour y Vicent, 1993); de ahí que la protección
118
del tejido con Folicote (ceras y parafinas refinadas) en cámara húmeda resultó
favorable y coincide con la sugerencia de Preece y Sutter (1991). La aplicación de
Folicote en dosis de 1 parte en 20 de agua y la cubierta plástica durante 80 días o
hasta que la plántula forme dos hojas más, incrementó la supervivencia hasta el
100%, estos resultados difieren con los obtenidos por Nel y col. (1982) quienes
alcanzaron tan sólo un 50% de supervivencia, Schall (1987) un 80% y Barceló-
Muñoz y col. (1999) un 70%.
En los estudios citológicos de las hojas de las plántulas producidas in vitro se
observaron células estomáticas deformes, cutícula delgada y ausencia de ceras,
aspectos coincidentes con los señalamientos de Cañal y col. (1999) que en
respuesta al ambiente en micropropagación se presentan: a) En los tejidos.-
disminución del área foliar, en el contenido de clorofila y del número estomático,
menor desarrollo anatómico y peso seco, disminución o alteración del contenido de
ceras, funcionamiento estomático anormal y b) En la planta.- menor tasa de
crecimiento, crecimiento suculento, desórdenes fisiológicos y morfológicos, formación
de pocas raíces secundarias, elevada variabilidad en tamaño y forma, mayor
frecuencia de mutaciones y presencia de contaminaciones.
Al integrar de manera conjunta los mejores tratamientos, con base a los
resultados obtenidos, en cada una de las fases del sistema de micropropagación vía
organogénesis, se encontró que este sistema resulta práctico, rentable, confiable y
asegura la producción clonal de plantas libres de enfermedades, además que en
corto tiempo se puede producir una alta cantidad de plantas. De una yema axilar de
árbol adulto de aguacate criollo, establecida in vitro en la fase de iniciación, a los 100
días se obtienen 5 yemas axilares, mismas que se establecen en medio de cultivo en
la fase de multiplicación y que a los 70 días generan 11:5 brotes con 5 yemas cada
uno, o sea en multiplicación se logran 57.5 yemas que se cultivan en medio inductor
de raíces, se obtiene un 44% de brotes con raíz (25.5 brotes), los cuales a los 6
meses de cultivo en invernadero se encuentran listos para su establecimiento en
campo, o bien para recibir el injerto. En cada una de las fases de laboratorio se utilizó
119
solamente un tipo de medio de cultivo y una cámara de crecimiento con temperatura
constante de 25±2°C y fotoperiodo de 16 horas de luz, a diferencia de algunos
protocolos que requieren para brotación, subsecuentes multiplicaciones y
enraizamiento, equipo especial tal como un agitador giratorio o bien condiciones de
doble fase (medio líquido - sólido o sólido - líquido) para poder lograr el propósito.
5.2. Embriogénesis somática de aguacate cv. Hass
La embriogénesis somática es una vía ideal para investigar los procesos
completos de diferenciación de plantas, así como los mecanismos de expresión de
totipotencia en células vegetales (Nomura y Komamine, 1999), mejoramiento del
cultivo, eliminación de enfermedades, conservación de germoplasma y propagar
clonalmente plántulas sobresalientes (Janick, 1993), de manera más práctica y
económica en comparación a la organogénesis, siempre y cuando para esto último
se inicie el proceso con tejido somático (nucelas) y no con embriones cigóticos
inmaduros. Numerosas investigaciones en diferentes especies vegetales indican la
utilización de tejido nucelar en la generación de callo embriogénico (Rangan et al.,
1968; Lítz, 1984a; Litz, 1984b), específicamente en aguacate se ha generado la
embriogénesis somática, pero con embriones cigóticos inmaduros (Mooney y Van
Staden, 1987; Pliego-Alfaro y Murashige, 1988; Raviv et al., 1998; Witjaksono y Litz,
1999a).
5.2.1. Prevención de necrosis de tejido nucelar de aguacate
Una etapa importante en la embriogénesis es el establecimiento in vitro de
tejido nucelar que genere callo embriogénico, al evitar la contaminación y oxidación
del tejido; en este estudio se encontró una reducción total de la necrosis en las
nucelas de aguacate (P. americana cv. Hass) por efecto del ácido ascórbico (400
mgll durante 5 segundos), antes de su colocación en medio de cultivo. El factor
oscuridad (etiolación del tejido) y el compuesto cisteína que en algunos explantes
120
han reducido la necrosis-oxidación (Zirari y Lionakis, 1994; Mohamed-Yasseen,
1995b; Llano-Agudelo et a/., 1995; Jiménez, 1998), en tejido nucelar de aguacate no
mostraron un efecto positivo, probablemente por la gran cantidad de fenoles que
existen en esta especie.
5.2.2. Reguladores de crecimiento y otros compuestos del medio de cultivo en
la embriogénesis somática de aguacate
En las pruebas realizadas con tejido nucelar de aguacate cv. Hass se obtuvo
formación de callo en 28.57% de los explantes con sales MS a 1/2 de su
concentración más 0.01 mg/1 de 2,4-D y 17.8% con las mismas sales anteriores pero
con 4 mgll de pictoram más 0.4 mgfl de AIB; se corroboró así el papel esencial que
juegan las auxinas en la inducción de la embriogénesis (Hobbie et a/., 1994; Davis,
1995; Macdonald, 1997). En base a los resultados anteriores y a los señalamientos
de Gómez (1998), en relación al papel que desempeña el 2,4-D en la incidencia de la
variación genética y los cambios epigenéticos que aparecen en plantas obtenidas de
embriones somáticos para la generación de callo embriogénico, es más conveniente
la utilización de las auxinas picloram (4 mg/l) y AIB (0.4mg/I), esto indudablemente en
una concentración de sales minerales MS 1/2 suplementadas con vitaminas, caseína
hidrolizada, sacarosa, agar-agar (Sigma) y ajustar el pH a 5.7. Las dosis de
reguladores de crecimiento difieren en gran medida con las encontradas por Mooney
y Staden (1987), Pliego-Alfaro y Murashige (1988) y Witjaksono y Litz (1999a) con
embriones cigóticos inmaduros, quienes determinaron que en la generación de callo
embriogénico se utilice solamente 0.1 mg/1 de picloram, debido principalmente a lo
anteriormente descrito, por la concentración endógena diferente de los explantes.
En las pruebas sobre multiplicación de masas proembriogénicas y desarrollo
de embriones somáticos en medio sólido y líquido con uso del agitador, no se detectó
respuesta al picloram y fue claro que al incrementar la dosis de esta auxina en medio
líquido se disminuyó la viabilidad de los embriones hasta el 17.5% con 1 mg/l de
picloram, además de la disminución en un 80% de la formación de masas
proembriogénicas. Estos resultados no coinciden con lo reportado por Mooney y
121
Staden (1987) y Witjaksono y Litz (1999a) investigadores que subcultivaron el callo
embriogénico en medio con auxinas, utilizaron ácido benzotiazol-2-oxiacético (BTOA
o BOA) los primeros y picloram los segundos, aunque si coincide en los periodos
para recultivar el callo sin esperar a que se deteriore el tejido. El hecho de la falta de
respuesta del tejido vegetal a la auxina es debido a que la permanencia continua en
medio de cultivo con auxina, además de perderse la capacidad de morfogénesis,
también se pierde la formación de masas proembriogénicas (Halperin, 1996); por lo
anterior, es conveniente cultivar el callo embriogénico de aguacate cv. Hass en
medio sin auxinas.
Con relación al tipo y desarrollo de embriones somáticos que se multiplicaron
en medio de cultivo sólido o líquido, se encontró que no obstante que en medio
líquido la multiplicación es de 5 a 7 días más rápida que en medio sólido, los
embriones estuvieron mejor formados en medio sólido.
Los resultados obtenidos en la maduración de embriones somáticos son
coincidentes a los obtenidos por Perán-Quesada y col. (1999) en cuanto al efecto del
agente gelificante, ellos encontraron un efecto significativo de éste sobre el número
de embriones blanco-opacos, mayores y menores de 5 mm, fue mayor con la
concentración de 6.8 g/I de gelrite, mientras que en éste estudio el mayor promedio de
embriones somáticos maduros se obtuvo con 20 g/I de agar-agar (Sigma). Sin
embargo, no coinciden en cuanto a que elevadas concentraciones de sacarosa
tienen un efecto positivo en la formación de embriones maduros. Witjaksono y Litz
(1999b) también reportan el efecto de la concentración del agente gelificante en el
tamaño y número de embriones somáticos opacos, con una óptima respuesta a 6-7
g/I de gel-gro, cabe señalar que tanto el gelrite como gel-gro son agentes
gelificantes, de los cuales normalmente se utiliza entre 1.5 y 2 g/I de medio de
cultivo.
Al endurecer el medio de cultivo con agar-agar se provocó una reducción en la
humedad relativa dentro de la caja de petri, ambiente que propició una desecación
122
lenta de los embriones somáticos y una condición de estrés que aceleró la
maduración de éstos, no obstante que a mayor concentración del agente gelificante
el diámetro de los embriones somáticos fue menor, respuesta similar a la observado
por Witjaksono y Litz (1 999b).
En los análisis de los embriones somáticos maduros no se encontró la
presencia de almidón, solamente glucosa, aunque en cantidades muy pequeñas,
algunas de estas moléculas de glucosa se oxidan por completo en las células
embrionarias hasta la producción de H2O y CO2; otras moléculas de glucosa se
convierten en moléculas de sacarosa y son transportadas a las células que inician el
crecimiento de la raíz y tallo, donde algunas son consumidas por completo en la
respiración y otras se destinan a materiales de la pared celular, proteínas y otras
sustancias necesarias para el crecimiento del brote (Salisbury y Ross, 1994).
Se obtuvo hasta un 10% de germinación en los embriones somáticos de
aguacate cv. Hass, con el solo hecho de usar sales minerales de Anderson (1975)
modificadas en nitratos, sin reguladores y recultivar éstos en medio óptimo, para
multiplicar brotes de aguacate, cabe señalar que en este último medio de cultivo la
presencia de la citocinina (BA) fue determinante para inducir la germinación. Las
investigaciones realizadas al respecto con otro germoplasma, mencionan porcentajes
de 12% para emisión de brotes y de 1 % en formación de brotes-raíces en un medio
con 0.1 mg/l de la citocinina TDZ más 0.5 mg/l de AG3 (Raviv et al., 1998) o bien ésta
ha sido esporádica (Witjaksono y Litz, 1999b).
Al poner 90 días los embriones somáticos maduros de aguacate en un medio
de cultivo bajo en nitratos, como fueron las sales de Anderson modificadas, fue un
estimulo para que los embriones después de este período iniciaran la germinación al
encontrarse en un medio con alrededor de 3 veces más el contenido de NH4NO3 y de
6 veces el de KNO3 más el regulador de crecimiento BA.
123
El sistema de embriogénesis somática que con las diferentes pruebas se
determinó, permitió en primer lugar asegurar la propagación clonal del aguacate,
debido a que en principio se parte de tejido nucelar y no de embriones cigóticos
como hasta la fecha lo indican los reportes realizados por varios investigadores. De
manera práctica se encontró que para generar callo embriogénico de aguacate cv.
Hass se debe utilizar nucelas obtenidas de frutos pequeños 10 a 12 mm de diámetro y
previo tratamiento con ácido ascórbico, proceder a su establecimiento in vitro en
medio MS a 1/2 de su concentración de sales, complementado con vitaminas,
caseína hidrolizada, las auxinas picloram (4 mg/l) y AIB (0.4 mgll), sacarosa, agar-
agar y ajustar el pH a 5.7. En la multiplicación y desarrollo de los embriones
somáticos se empleó como explante masas proembriogénicas en un medio MS
suplementado con tiamina 4 mg/l, mioinositol 100 mg/l, caseína hidrolizada 400 mg/l,
sacarosa 3011 y agar-agar 5 g/l. Mientras que para madurar los embriones somáticos
se empleó el mismo medio anterior, solamente se incrementó la cantidad de agar-
agar a 20 g/I de medio y eliminar la caseína. El porcentaje de germinación obtenido
(10%) aunque es bajo, indica la tendencia para incrementarlo, al modificar la
concentración de las sales minerales y evitar el uso de reguladores de crecimiento en
el medio de cultivo durante los primeros meses.
En esta investigación, pudo determinarse el efecto de la aplicación exógena de
los reguladores de crecimiento, al corroborar en algunos casos la función de éstos
sobre el papel de la morfogénesis in vitro. La combinación de una citocinina con
auxina en una relación de 10:1 fue efectiva para la inducción de brotes a partir de
yemas axilares de aguacate criollo y su multiplicación fue contundente con la
supresión de auxina y una dosis baja de citocinina. La función de la auxina endógena
fue importante para provocar un enraizamiento óptimo, con sólo aplicar de manera
exógena una cantidad mínima de auxina.
Las auxinas durante el proceso de la embriogénesis somática, al implicar la
inducción, la multiplicación de masas proembriogénicas y la germinación de los
embriones somáticos de aguacate cv. Hass, fueron importantes ya que se requirieron
124
en dosis relativamente altas para la inducción, la eliminación de éstas en la
multiplicación de las masas proembriogénicas, desarrollo de las estructuras
embrionarias y en la germinación. Para este último proceso la adición de una
citocinina fue relevante.
Los sistemas de organogénesis y embriogénesis somática determinados en
esta investigación son de enorme utilidad, porque sientan las bases para futuros
estudios sobre la conservación de germoplasma in vitro, selección de variantes y
mutantes (variación somacional), rescate de embriones, transformación y la
hibridación somática; además de que con estos sistemas es posible propagar
clonalmente plantas libres de enfermedades y la producción de semilla sintética.
125
VI. CONCLUSIONES
Se establecieron cultivos in vitro de yemas axilares de árbol adulto de
aguacate criollo y tejido nucelar de aguacate cv. Hass, se logró evitar la
contaminación de los explantes mediante la desinfección superficial e interna con el
uso de plaguicidas como el Benlate y Agrimicin 500, y el desinfectante hipoclorito de
sodio. Así mismo, la necrosis tanto de las yemas axilares y de las nucelas se previno
con un tratamiento de inmersión en solución con ácido ascórbico.
Se determinaron las dosis y tipos de reguladores de crecimiento para
conseguir la organogénesis en yemas axilares de aguacate criollo, y la
embríogénesis somática por el cultivo de tejido nucelar de aguacate cv. Hass.
Con la aplicación de la citocinina BA o la auxína AIB en una relación
adecuada, se logró la inducción, multiplicación y enraizamiento de los brotes hasta la
formación de plantas completas.
La formación de masas proembriogénicas se obtuvo por el efecto principal de
las auxinas picloram y AIB, y después no fueron requeridas para la multiplicación y
desarrollo de las estructuras embrionarias (globulares, acorazonados, torpedos y
maduros). La germinación de los embriones somáticos de aguacate cv. Hass se
consiguió en porcentajes relativamente bajos, en un cultivo de dos fases: primero en
un medio con baja cantidad de nitratos y sin reguladores de crecimiento; y después
en presencia de la citocinina BA, en donde se obtuvieron plantas completas.
Las plantas regeneradas de aguacate pudieron ser óptimamente
transplantadas y aclimatadas, al evitar el estrés hídrico de la plántula y mantenerla
en un microambiente especial hasta la formación de nuevo tejido (2 hojas).
126
VII. LITERATURA CITADA
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141
ANEXOS
Anexo 1.
Reactivos empleados en los diferentes medios de cultivo o soluciones.
Reactivo Fórmula Marca
Macroelementos
Nitrato de amonio
Nitrato de potasio
Cloruro de calcio 2 hidratado
Nitrato de calcio 4 hidratado
Sulfato de magnesio 7 hidratado
Fosfato de potasio monobásico
Sulfato de potasio
Fosfato de sodio
Microelementos
Acido bórico
NH4NO3
KNO3
CaCI2.2H2O
Ca (NO3)2 4H2O
MgSO4.7H2O
KH2PO4
K2SO4
NaH2PO4
H3BO3
Sigma
"
Sigma ®
"
J.T. Baker®
"
Merck®
Sigma ®
Sigma ®
Sulfato de manganeso monohidratado MnSO4.H2O "
Sulfato de zinc 7 hidratado ZnSO4.7H2O J.T. Baker®
Yoduro de potasio KI Sigma ®
Molibdato de sodio 2 hidratado Na2Mo04.2H2O Aldrich ®
Sulfato cúprico 5 hidratado , CuSO4.5H2O Merck®
Cloruro de cobalto 6 hidratado CoCl2.6H2O Sigma ®
Solución de fierro
Acido etilendinitrilotetraacético C10H16N2O8 Sigma ®
Sulfato ferroso 7 hidratado FeSO4.7H2O "
Vitaminas MS
Biotina (Vitamina H) C10H16N2O3S Sigma ®
Piridoxina (Vitamina B6) C8H11NO3 HCI "
Tiamina (Vitamina B1) C12H17CIN4OS.HCL- “
Acido nicotínico (Niacina) C6H5NO2 "
142
Reactivo Fórmula Marca
Reguladores de crecimiento
Bencilaminopurina (BA) C12H11N5 Sigma
Cinetina (K) C10H9N5O "
Thidiazuron (TDZ) C9H8N4OS "
Acido indolbutírico (AIB) C12H13NO2 "
Acido Naftalenacétíco (ANA) C12H10O2 "
2,4-D C8H6C12O3 Sigma ®
Picloram C6H3C13N2O2 "
Acido giberélico (AG3) C19H22O6 "
Acido abscisico (ABA) C15H20O4 "
Otros compuestos
Yodo l2 Sigma ®
Pantotenato de calcio C18H32CaN2O10 "
Glicina C2H5NO2 "
Mioinositol C6H12O6 "
Glutamina C5H10N2O3 "
Hemisulfato de adenina C5H5N51/2 H2SO4 "
Azúcar refinada comercial
Sacarosa C12H22O11 "
Manitol C6H14O6 "
Glucosa (oxidasa) Hycel®
Agar-agar Sigma ®
Phytagel "
Acido ascórbico C6H6O6 "
Cisteína C3H7NO2S "
Carbón activado Merck
Caseína hidrolizada Sigma ®
Diacetato de fluoresceína C24H16O7 "
143
Reactivo Fórmula Marca
Acido clorhídrico HCI J.T. Baker®
Hidróxido de calcio NaOH "
Polioxietilensorbitan Monolaurado
(Tween 20)
Sigma®
Anexo 2.
Valores de F para la variable longitud del brote principal en barrido de reguladores de
crecimiento con BA-AIB fase de iniciación.
Valor de
Ft
Factor
de
variación
Días después
del
establecimiento
F calc.
0.05 0.01
Tratamientos 60 2.17 2.22 3.05
96 2.19 1.97 2.59
110 2.49 2.07 2.76
144
Anexo 3.
Prueba de comparación de medias Tukey (0.05) a los 96 y 110 días delestablecimiento en la variable longitud del brote principal (mm) del estudio barrido dereguladores de crecimiento con BA-AIB fase de iniciación.
Tratamiento
No. BA-AIB mg/I
Media (mm)
a 96 días Significancia
Media (mm) a
110 días Significancia
10 2-0.2 22.5 A 22.5 A
13 3-0.0 21.6 A 25.4 A
15 3-0.5 21.5 A 24.3 A
9 2-0.0 16.8 A 22.0 A
5 1-0.0 16.5 A 19.7 A
6 1-0.2 16.0 A 17.8 A
14 3-0.2 15.3 A
8 1-1.0 15.0 A 17.3 A
16 3-1.0 14.7 A 20.7 A
11 2-0.5 13.6 A 16.2 A
12 2-1.0 13.1 A 15.0 A
Anexo 4.
Análisis de varianza en la variable número de brotes por frasco, a 25 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 260.257 23.659 3.093 2.44 1.89
Error 108 826.108 7.649
Total 119 1086.366
C.V. 43.3%
145
Anexo 5.
Análisis de varianza en la variable número de brotes por frasco, a 85 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 399.311 36.301 2.9406 2.44 1.89
Error 100 1234.466 12.345
Total 111 1633.777
C.V. 49%
Anexo 6.
Análisis de varianza en la variable longitud promedio de brotes (mm), a los 25 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 606.22 55.11 2.314 2.44 1.89
Error 107 2547.84 23.81
Total 118 3154.06
C.V. 41.66%
Anexo 7.
Análisis de varianza en la variable longitud promedio de brotes (mm), a los 85 días delestablecimiento, en el barrido de reguladores de crecimiento BA - AIB con sales MScompletas y sin adenina.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 11 2173.88 197.63 2.0722 2.44 1.89
Error 100 9536.92 95.37
Total 111 11710.80
C.V. 43.19%
146
Anexo 8.
Respuesta al enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro de aguacate criollo a los71 días del establecimiento, en prueba de dosis de AIB, ANA e interacción AIB -ANA en dos tipos de sales minerales.
Tratamiento
Dosis de
reguladores (mg/I)
Tipo de sales
minerales
Número de
raíces
Enraizamiento
(%)
Longitud
de raíz
(mm)
AIB 0.5 MS 100% 11 en 2 brotes 16.67 10.3
AIB 0.8 “ 0 0 0
AIB 1.1 “ 4 en 2 brotes 16.67 9.0
AIB 1.4 “ 4 en 1 brote 8.33 17.3
AIB 0.5 + ANA 0.3 “ 0 0 0
ANA 0.3 “ 5 en 2 brotes 16.67 24.9
ANA 0.6 “ 0 0 0
ANA 0.9 “ 0 0 0
ANA 1.2 “ 0 0 0
0 “ 2 en 1 brote 8.33 16
AIB 0.5 Modificadas 7 en 2 brotes 16.67 25.3
AIB 0.8 “ 7 en 3 brotes 25 20.6
AIB 1.1 “ 8 en 2 brotes 16.67 22.1
AIB 1.4 “ 2 en 1 brote 8.33 25
AIB 0.5 + ANA 0.3 “ 5 en 1 brote 8.33 39.4
ANA 0.3 “ 0 0 0
ANA 0.6 “ 0 0 0
ANA 0.9 “ 0 0 0
ANA 1.2 “ 0 0 0
0 “ 1 en 1 brote 11.11 20
147
Anexo 9.
Análisis de varianza en la variable longitud de raíz por brote, a 54 días delestablecimiento, en prueba de dosis de AIB e interacción AIB -AG3.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 9 1674.43 186.05 4.19 3.0 2.13
Error 40 1775.81 44.40
Total 49 3450.23
C.V.= 57.58%
Anexo 10.
Análisis de varianza en la variable longitud de raíz por brote, a 88 días delestablecimiento, en prueba de dosis de AIB e interacción AIB -AG3.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 9 2290.20 254.47 3.85 2.76 2.07
Error 54 3568.99 66.09
Total 63 5859.20
C.V.= 44.92%
Anexo 11.
Valores de F y significancia estadística para cada una de las variables evaluadas enobservaciones citológicas de hojas de aguacate criollo.
FVariableCalc. Tab.(0.05)
Coeficiente devariación (%)
Indice estomático 2.235 3.35 25.54Frecuencia de estomas 5.201 3.35 24.13
Frecuencia de células no estomáticas
2.479 3.35 24.41
148
Anexo 12.
Frecuencia de células no estomáticas e índice estomático de los diferentestratamientos del estudio sobre observaciones citológicas de hojas de aguacatecriollo.
Tratamiento Frecuencia de células no Indice estomático (JE)
estomáticas (FCNE)
Hojas de árbol adulto 13.96 7.39
Hojas de plantas invernad. 16.38 7.02
Hojas de plántulas in vitro 17.82 5.83
Anexo 13.
Significancia estadística en el análisis de varianza de los datos de oxidación
transformados a arco seno √x, en prueba sobre antioxidantes e intensidad de luz.
Factor de Grados Suma de Cuadrado Valor de F Valor de
variación de cuadrados medio calculada P>F
libertad
Cisteína (A) 1 15.2480 15.2480 0.1315 0.726
Ac. ascórbico
(B)
1 20929.4121 20929.4121 180.5106 0.000
Intens. de luz
(C)
1 0.0097 0.0097 0.0001 0.989
A x B 1 413.3066 413.3066 3.5647 0.099
A x C 1 228.0097 228.0097 1.9665 0.202
B x C 1 0.0410 0.0410 0.0004 0.983
A x B x C 1 218.5996 218.5996 1.8854 0.211
Error 7 811.6191 115.9455
Total 15 22838.2558
C.V. = 26.73%
149
Anexo 14.
Significancia estadística DMS (0.01) en la variable tipo de explante (masasproembriogénicas y globulares) para la multiplicación de masas proembriogénicas alos 14 días.
Tratamientos Media
Masas proembriogénicas 2.95 A
Globulares 2.10 B
Anexo 15.
Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 22 días del establecimiento, en la primer prueba de ABA.
F tabuladaFuente de
variación
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio
F calculada
0.01 0.05
Tratamientos 2 0.201334 0.100667 0.2449 3.88 6.93
Error 12 4.9320 0.411000
Total 14 5.1333
Anexo 16.
Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 44 días del establecimiento, en la segunda prueba de ABA y dosis de sacarosa.
F tabuladaFuente de
variación
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio
F calculada
0.01 0.05
Tratamientos 6 13.896187 2.316031 1.5996 2.49 3.63
Error 25 36.195999 1.447840
Total 31 50.092186
150
Anexo 17.
Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 36 días del establecimiento, en prueba de dosis de agar.
Fuente de Grados de Suma de Cuadrado F calculada F tabulada
variación libertad cuadrados medio 0.01 0.05
Tratamientos 3 2.981367 0.993789 34.8651 2.96 4.60
Error 27 0.769603 0.028504
Total 30 3.750970
C.V. = 31.53%
Anexo 18.
Análisis de varianza en la variable promedio de embriones maduros por caja de petri,a los 30 días del establecimiento, en prueba de dosis de sacarosa.
F tabuladaFuente de
variación
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrado
medio
F calculada
0.01 0.05
Tratamientos 3 0.375428 0.125143 0.8928 2.95 4.57
Error 28 3.924572 0.140163
Total 31 4.30000
UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SANUNIVERSIDAD MICHOACANA DE SANNICOLÁS DE HIDALGONICOLÁS DE HIDALGO
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES QUÍMICO-BIOLÓGICAS
Lab. De Biotecnología de Plantas Edificio B-3, Ciudad Universitariasalgaciglia@hotmail com 58030, Morelia, Mico. MEXICO.
Tel-Fax: (443) 3 265788
DR. ALFONSO PESCADOR RUBIOCOORDINADOR ACADÉMICOPICAF-UNIV. DE COLIMAPRESENTE.
La presente es con el fin de comunicarle que he revisado el documento final del trabajo detesis "Efecto de los reguladores de crecimiento en los procesos de organogénesis yembríogénesis somática de aguacate (Persea americana Mill.)" del Ing. Ignacio VidalesFernández, estudiante inscrito al programa de doctorado en ciencias del posgrado PICAFque usted coordina, el cual ha sido corregido después de la revisión de un servidor y de losdemás asesores externos (Dr. Miguel A. Gómez Lim y Dr. Joel E. López Meza) que integranel comité tutorial.
Por lo anterior, como tutor de esta tesis, autorizo para que el Ing. Vidales Fernández envíe eldocumento para su última revisión por parte de Ud. y el Dr. Roberto Lezama Gutiérrez, y deesta manera continúe con los trámites correspondiente al examen de grado.
Sin más por el momento y agradeciendo de antemano su atención, reciba un cordial saludo.
A t e n t a m e n t e
C.c.p. Ing. Ignacio Vidales Femández.
135
CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL LPNUNIDAD IRAPUATO
KM. 9.6 LIBRAMIENTO NORTE CARRETERA IRAPUATO - LEONAPDO. POSTAL 629, C.P 36500, IRAPUATO, GTO. MEXICO
Tels. : Conmutador (4) 6 23 96 00, Dirección 6 24 59 09, Fax Administración 6 24 58 46Compras 6 24 56 57, Biotecnología 6 24 59 96, Ingeniería Genética 6 24 58 49, Coordinación Recursos Materiales 6 23 96 91
Dr. Alfonso Pescador Rubio
Coordinador del PICAF
PRESENTE 9 de Octubre de 2002
De mi mayor consideración:
Por este conducto me permito informar que he revisado el trabajo de tesis titulado del Ing.
IGNACIO VIDALES FERNANDEZ titulado "Efecto de los reguladores del crecimiento en
los procesos de organogénesis y embriogénesis somática de aguacate (Persea americana,
Mill.)" y lo he encontrado enteramente satisfactorio. Por ello, por este medio doy mi visto
bueno para que puedan continuar los trámites de titulación.
Atentamente
136
Morelia, Mich. 9 de octubre de 2002.
DR. ALFONSO PESCADOR RUBIOCOORDINADOR DEL PICAF ENLA UNIVERSIDAD DE COLIMAPRESENTE.
Por este conducto hago de su conocimiento que la tesis intitulada EFECTO
DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN LOS PROCESOS DE
ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA DE AGUACATE (Persea
americana MILL.) presentada por el C. IGNACIO VIDALES FERNANDEZ ha sido
revisada y aprobada por un servidor. Asimismo, aprovecho la oportunidad para
comentarle que no existe inconveniente de mi parte para que el C. Vidales siga
con los tramites correspondientes para la presentación de su examen de Grado.
Sin otro particular por el momento, me despido de Usted enviándole un
cordial saludo.
Km 9.5, Carretera Morelia-Zinapécuaro, La Palma, Tarímbaro, Mich.Tel. y Fax: (443) 295-80-29
137
UNIVERSIDAD DE COLIMACENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F. C. R. A.
PR E SENTE.
En atención a que. el M. C. IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZ, alumno egresado
del Doctorado en Ciencias, área de ciencias agrícolas y forestales, ha realizado todas, las correcciones al
manuscrito de tesis que presentó para su revisión, me dirijo respetuosamente a usted para informarle
que el documento titulado "Efecto de los reguladores de crecimiento en los procesos de. organogénesis
y embriogénesis somática de aguacate (Pernea americana Mi1I.)", reúne todas las características
necesarias para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF,UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARIT.C.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO.
A PR/Angélica*
138
UNIVERSIDAD DF COLIMACENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTICACION Y
DESARROLLO AGROPECUARIO
Oficio No. 072/02
ING. RODOLFO MORENTIN DELGADO
DIRECTOR DE LA F- C. B. A.
PRESENTE.
En atención a que el M. C. IGNACIO VIDALES FERNÁNDEZ, alumno egresado
del Doctorado en Ciencias, área de ciencias agrícolas y forestales, ha realizado todas las correcciones al
manuscrito de tesis que presentó para su revisión, me dirijo respetuosamente a usted para informarle
que el documento titulado "Efecto de los reguladores de crecí lento en tos procesos de organogénesís
y embriogénesis somática de aguacate (Persia americana Mill.)", reúne todas las características
necesarias para obtener el grado de Doctor en Ciencias.
Sin otro particular aprovecho la oportunidad para enviarle un cordial saludo.
C.C.P. DR. ROBERTO GOMEZ AGUILAR, SECRETARIO TÉCNICO DEL PICAF,UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NAYARITC.C.P. EXPEDIENTE CORRESPONDIENTE.C.C.P. ARCHIVO.
APR/Angélica*