Determinación de patógenos en
Alimentos por Biología Molecular
Hugo Mingo Agilent Technologies
Jesús García Microbial System
Introducción a la PCR
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Se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas
Las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína,,
Polimerasas de m.o
Thermus aquaticus (polimerasaTaq) Pyrococcus furiosus (Pfu) Thermococcus litoralis (Vent) Thermus termophilus (Tth).
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Introducción a la PCR
Los 7 componentes de una PCR: http://genomics.agilent.com/ 1-Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN. 2-Dos cebadores o iniciadores (primers), oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 6 y 40 nucleotidos. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia ,definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.
-Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción. -La proporción entre bases púricas y pirimidínicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas. -Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.
http://eu.idtdna.com/Home/Home.aspx 3-Se suele usar magnesio (Mg2+) Cofactores de la polimerasa. 4-Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. 5-ADN polimerasa 6- ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar. 7-Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.
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PCR; 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 3 pasos a diferentes temperaturas.
Inicio 94-96 °C 1-9 minutos Desnaturalización(94-95 °C) 60 seg La temperatura depende: de la proporción de G+C y longitud de la hebra Alineamiento40-68 °C durante 20-40 segundos El cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde.. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde.. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. Elongación El tiempo de extensión depende + ADN polimerasa +Longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. **A la temperatura óptima la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto…… polimerasa Taq 75-80 °C Elongación final 70-74 °C 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR.
-Electroforesis en gel de agarosa……fragmentos grandes -Gel de acrilamida……………………...fragmentos pequeños *Marcador de peso molecular
Introducción a la PCR
PCR a tiempo real: introducción
Técnica de alta sensibilidad que permite la detección y cuantificación de un producto de PCR en tiempo real.
Amplio rango de aplicaciones: análisis de expresión génica, determinación de carga viral, determinación de GMOs, genotipado de SNPs
Basada en el uso de fluoróforos (termociclador)
light light
SYBR Green I™,
EvaGreen,
LCGreen, SYTO9
TaqMan®
Molecular Beacons
Sondas FRET
Colorantes que se unen al ADN
Sondas específicas marcadas
Taq
Taq
Real-time PCR Detección de productos
SYBR Green: Se une al surco menor del ADN de doble cadena
Fluorescencia muy baja cuando no está unido
1000x cuando se une al ADN
Ventaja: analizar muchos genes Desventaja: poca especificidad
Real-time PCR Colorantes – SYBR Green
unbound probe free in solution
Light emission
Light
energy transfer
Taq
Reporterdye
Acceptordye (Quencher)
Taq
Light emission Light
Sondas específica con fluoróforo y quencher . Desventaja: diseñar una sonda para cada target Ventajas: alta especificidad Permite multiplex: varios target en la misma reacción
Real-time PCR Sondas específicas – Taqman
Estructura de pinza Fluorescencia cuando anilla con el molde
Real-time PCR Sondas específicas – Molecular Beacons
Dos sondas que hibridan próximas Suelen llevar fluoróforos compatibles solo con algunos equipos
Real-time PCR Sondas específicas – Sondas FRET fluorescence resonance energy transfer
Fluoróforo donante
Fluoróforo aceptor
Excitación Emisión Transferencia
Real-time PCR Resumen fluoróforos
Fluoróforo Excitación máxima (nm)
Emisión máxima (nm)
Oregon Green 492 517
FAM 494 518
SYBR Green 494 521
TET 521 538
JOE 520 548
VIC 538 552
HEX 535 553
Cy3 552 570
ROX 587 607
Cy5 643 667
Texas Red 596 615
Amplia variedad de fluoróforos, permite multiplex Compatibles con el equipo y espectros de emisión distintos
Real-time PCR Términos básicos
Línea base: nivel de ruido de los primero ciclos donde no hay incremento detectable de la fluorescencia. Treshold: determinado valor de fluorescencia en la región exponencial de la curva de amplificación Treshold cycle (Ct): ciclo en el que la curva de amplificación alcanza el treshold. Permite calcular el material inicial de partida Señal reporter: señal fluorescente generada por el fluoróforo durante la reacción. Señal normalizada (Rn): intensidad la señal reporter dividida entre la señal del colorante de referencia pasivo
June, 2008 Page 14
Real-time PCR Métodos
Múltiples aplicaciones:
• Partiendo de ARN (valorar niveles de expresión, carga viral…) El ARN se transcribe a cADN RT-PCR en 2 pasos RT-PCR en 1 paso Varias PCRs a partir de una RT Manipulación más simple Flexibilidad en los primer para la RT Rápido Almacenamiento de cADN Bajo riesgo contaminación
•Partiendo de ADN (detección de patógenos, GMOs, genotipado SNPs)
Real-time PCR Tipos de cuantificación
PCR convencional: la mayoría de reacciones habrán alcanzado la fase de plato de la amplificación. Real-time PCR nos asegura estar en la fase exponencial. Tipos de cuantificación: Absoluta: determinamos la cantidad total del gen de interés, expresado en valores de número de copia o concentración Relativa: determinaremos una relación entre la cantidad del gen de interés respecto a un gen endógeno de referencia.
Real-time PCR Cuantificación absoluta
Standard curve
R2 = 0.999
Slope = -3.366
Amplification efficiency = 98.2%
Real-time PCR Cuantificación relativa
Gen endógeno de referencia: su expresión no varía entre las distintas condiciones experimentales (genes housekeeping: β-actina, 18s RNA…)
Método ∆∆Ct de cuantificación relativa: ∆Ct (muestra problema)= Ct gen target- Ct gen referencia ∆Ct (calibrador)= Ct gen target- Ct gen referencia ∆∆Ct= ∆Ct (muestra problema)- ∆Ct (calibrador) Nivel de expresión= 2 ∆∆Ct
The Stratagene Mx Platform es una plataforma flexible, tanto a nivel de fluoróforos con de aplicaciones.
Real-time PCR Instrumentos
Hardware Specifications • Quartz tungsten-halogen lamp
• 1 PMT detector
• 2 customizable filter wheels
• 350-750nm excitation
• 350-700nm emission
• 14” (33cm) W x 20” (46) D x 18” (43) H
• 45 pounds (20.4 kilograms)
Thermal system
Hot top
Tungsten/Halogen Lamp
Emission filter wheel
Excitation filter wheel
Fiber optic cable and scanning arm
Real-time PCR Instrumentos
Mx3000P/Mx3005P
Real-time PCR Instrumentation
Más de 10 años de experiencia en instrumentos de real-time QPCR
Posibilidad de elegir la configuración de filtros que necesitas.
Sistema de excitación: lámpara halógena Sistema óptica que escanea pocillo a pocillo
Placa de 96 pocillos
4 colores (Mx3000P™) or 5 colores (Mx3005P™) Sistema de detección: PMT
Recuperación de datos en caso de fallo en el ordenador
Real-time PCR Instrumentos – Sistema térmico
• Uniformidad de temperatura:
(+/- 0.25°C @ 72°C).
• Sistema térmico Peltier
• Rampa de temperatura: hasta 2.5°C/s
• Hot Top.
Mx3005
others
Variation of amplicon Tm Herrmann et al., Clin. Chem. 52 (2006) and 53 (2007)
Real-time PCR Instrumentos - Óptica
Halogen lamp Excitation range 350-750 nm
Excitation filter wheel 4 or 5 filters
Fibre optics cable
Emission filter wheel 4 or 5 filters
Photomultiplier Highly sensitive detection of fluorescence
Optics • Excitation
–Quartz-tungsten halogen
–Range of 350-750nM
– 4 or 5 filter sets
• Emission
– Photomultiplier tube (PMT)
–Range of 350-700nm detection
– Filters before the PMT blocks cross-talk
hν
e-
Asynchronous (scanning)
Constant intensity (No positional effects)
Simultaneous (CCD)
Intensity depends on well position
Lamp
Higher intensity
lower intensity
3.5 s scanning time per dye
Escaneado vs. iluminación y detección
Alx350 FAM
TET HEX
JOE ROX Cy5 Cy3
TAM TxRd
Excitation range: 350 to 750 nm Emission range: 350 to 700 nm
Standard filter set on Mx3000P® Standard filter set on Mx3005P®
Elige la combinación de filtros que necesites!
Atto425
Real-time PCR Instrumentos – Fluoróforos detectados
• Software para el manejo del equipo y
tratamiento y análisis de datos.
• Intuitivo, fácil de usar, incluso para
nuevos usuarios de QPCR.
• Se pueden ver y analizar datos en
tiempo real.
• Se pueden exportar gráficos a Excel &
PowerPoint, en formato de texto y
también las imágenes
• MEA Multiple experiment análisis:
analizar varias carreras en un único
proyecto.
MxPro™ QPCR Software
Utilization of the Stratagene Mx3000P QPCR System for the Detection and
Quantification of Mycotoxigenic Fungi
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Standard curves generated for Aspergillus, Penicillium,
and Fusarium.
A mixture of DNA from A. flavus, P. chrysogenum, and F. verticilliodes
was serially diluted 10-fold and analyzed by the genus-specific multiplex
real-time PCR. The initial DNA concentration was 10 ng/μl for A. flavus,
P. chrysogenum, and F. verticillioides.
Analysis of stored distiller’s grain (DG) by multiplex real-time qPCR assay.
Fish Identification Methods
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• Objective results
• More resistant to sample processing
• Easy to perform
• High specificity/sensitivity
DNA-based methods
Sequencing High initial investment (> 100K $)
High maintenance costs
Not usable with mixed samples
Method of choice for new species
PCR-RFLP Discrimination of highly
related species
Works with mixtures
Low initial setup costs