Universidad de La Salle Universidad de La Salle
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Maestría en Ciencias Veterinarias Facultad de Ciencias Agropecuarias
1-1-2017
Detección molecular y serológica del virus de la leucosis bovina Detección molecular y serológica del virus de la leucosis bovina
enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté, enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté,
Cundinamarca Cundinamarca
Néstor Arturo Quintero Castro Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Quintero Castro, N. A. (2017). Detección molecular y serológica del virus de la leucosis bovina enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté, Cundinamarca. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/maest_ciencias_veterinarias/74
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Universidad de La Salle
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Maestría en Ciencias Veterinarias
DETECCIÓN MOLECULAR Y SEROLÓGICA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA
ENZOÓTICA EN UNA FINCA LECHERA DEL MUNICIPIO DE SIBATÉ, CUNDINAMARCA
Preparado por
NÉSTOR ARTURO QUINTERO CASTRO
Código
76141215
Bogotá D.C., Noviembre
2017
ii
Universidad de La Salle
Facultad de Ciencias Agropecuarias
Maestría en Ciencias Agropecuarias
DETECCIÓN MOLECULAR Y SEROLÓGICA DEL VIRUS DE LA LEUCOSIS BOVINA
ENZOÓTICA EN UNA FINCA LECHERA DEL MUNICIPIO DE SIBATÉ, CUNDINAMARCA
Proyecto de investigación
Néstor Arturo Quintero Castro
76141215
Director
Clara Stefany Romero Hurtado, M.V., M.Sc.
Bogotá D.C., Noviembre
2017
iii
Resumen
La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE) es una enfermedad producida por un vírus de la familia
retroviridae, que afecta los linfocitos B y tiene la capacidad de integrarse al genoma del hospedero. El
virus de la LBE tiene distribución mundial aunque los índices de prevalencia varían ampliamente entre
países y continentes, siendo una enfermedad de presentación esporádica en Asia, África y Oceanía,
contrario a lo que ocurre en América y Europa, donde la enfermedad es enzoótica y con particular
predilección por sistemas productivos lácteos intensivos.
El objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de la LBE, mediante las técnicas
diagnósticas PCR y ELISA de bloqueo, y establecer su relación desde los resultados de ambas pruebas
con el conteo de linfocitos, y así determinar si existe diferencia entre cada una de las técnicas a la hora de
determinar los animales positivos y negativos. Se trabajó con 50 animales de edades entre los 3 y los 11
años en una finca lechera ubicada en el municipio de Sibaté Cundinamarca. La prueba ELISA de bloqueo
arrojó que 12 de los 50 animales muestreados presentaron anticuerpos elevados específicos contra LBE
que corresponde a un 24%, de otro lado 7 de los 50 animales muestreados fueron positivos mediante PCR
anidado lo que corresponde a 14% a través de esta prueba, y 8 de los 12 animales positivos a ELISA de
bloqueo tienen conteo de linfocitos aumentado en relación con los conteos normales para ese grupo etario.
Palabras clave: Leucosis bovina enzoótica, linfocitos, PCR, Elisa
iv
Abstract
Enzootic Bovine Leukosis (LBE) is a disease caused by a virus of the retroviridae family, which affects B
lymphocytes and has the ability to integrate into the host genome. The LBE virus has a global distribution,
although prevalence rates vary widely between countries and continents, being a sporadic disease in Asia,
Africa and Oceania, contrary to what happens in America and Europe, where the disease is enzootic and
particular preference for intensive dairy production systems.
The objective of the present study was to determine the presence of enzootic bovine leukosis by means of
various diagnostic techniques, such as PCR, blocking ELISA, and lymphocyte counts, thus determining if
there is a difference between each of the techniques in determining the positive and negative. We worked
with 50 animals aged between 3 and 11 years in a dairy farm located in the municipality of sibate
Cundinamarca. The ELISA blocking test showed that 12 out of the 50 animals sampled had elevated
specific antibodies against Bovine Enzootic Leukosis which corresponded to 24%; on the other hand 7 of
the 50 animals sampled were positive by nested PCR, and 8 of the 12 animals which are positive to block
ELISA have increased lymphocyte counts relative to normal counts for that age group.
Keywords: Bovine Enzootic Leukosis, lymphocytes, PCR, ELISA
v
TABLA DE CONTENIDO
1. Introducción….…………………………………….…………………….…………………… 1
2. Revisión de literatura………..………..…….……. ...….……………….……………………. 3
2.1 Reseña………………………………….…..………..………………….………………... 3
2.2 Etiología ….………..……………….…………..………………….………...................... 4
2.3 Transmisión.…………… ……………….…………..……………….……….................. 7
2.4 Etiopatogenia…………….……………….…………..…………………........................... 8
2.5 Manifestaciones clínicas……..………………………………….……………..…………. 10
2.6 Lesiones...…………………….……………………….………………….......................... 12
2.7 Diagnóstico…. ………………………………………………………..…………………... 13
2.8 Prevalencia ……………………………………………………………………………….. 15
2.9 Impacto Económico………………………………………………………………………... 17
3. Materiales y métodos ………………………………………………………………………...... 18
3.1 Población…………………………………………………………………………………… 18
3.2 Muestra ………………………………………………………………………………….. 18
3.3 Procedimientos realizados ………………………………………………………………. 20
3.3.1 Cuadro Hemático…………………………………………………………………..….... 20
3.3.2 Elisa de bloqueo ………………………………………………………………………. 20
3.3.3 PCR ……………………………………………………………………………………. 22
4. Resultados …………………………………………………………………………………… 24
5. Discusión ………………………………………………………………………………….. 28
6. Conclusiones y recomendaciones …………………………………………………………. 33
7. Bibliografía ………………………………………………………………………………. 34
vi
8. Anexos …………………………………………………………………………………… 42
vii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Distribución de muestras procesadas y porcentaje de positividad a LBE, por
departamento y número de municipios que enviaron muestras. Colombia 2005-2009.……… 16
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura genética de los retrovirus …………………………………………........... 5
Figura 2. Estructura del virus de la Leucosis Bovina Enzoótica ………………………......... 6
Figura 3. Mecanismo de transmisión de la Leucosis Bovina Enzoótica …………….……..… 8
Figura 4. Seroprevalencia de la Leucosis Bovina Enzoótica en una finca en Sibaté ………….. 25
Figura 5. Conteo de linfocitos en animales seropositivos…………………………….…........... 25
Figura 6. Producto del PCR amplificado ……………………………………………………... 26
Figura 7. Prevalencia de PCR para Leucosis Bovina Enzoótica …………………………….... 27
Figura 8. Comparación resultados ELISA de bloqueo contra resultados PCR anidada …….. . 27
1
1. INTRODUCCIÓN
La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE), es una enfermedad infecciosa crónica ocasionada por un
virus de la familia retroviridae, sub familia orthoretrovirinae dentro del género deltaretrovirus tipo
C (Felmer R, Zúñiga J, Recabal M 2006). La enfermedad se caracteriza por afectar principalmente
a las células linfocíticas tipo B, aunque también tiene la capacidad de afectar las células tipo T y los
monocitos. (Schwartz & Lévy, 1994).
La transmisión de la Leucosis Bovina Enzoótica se puede dar de forma horizontal como
vertical, siendo la forma horizontal la de mayor importancia en las producciones lecheras, lo que
frecuentemente ocurre por el uso inadecuado de instrumental veterinario, el uso de agujas
desechables en varios animales, por insectos hematófagos, entre otros. Por otro lado, la transmisión
vertical ocurre porque el virus se encuentra en la leche y calostro de animales infectados y puede ser
transmitido a las crías en cualquier periodo de la lactancia; la vía transplacentaría también
constituye un mecanismo de infección con un 5% en terneros vivos nacidos de madres portadoras
(González et al., 2001).
La enfermedad puede tener varias presentaciones, una de ellas se caracteriza por la ausencia
de signos clínicos y otra donde los animales desarrollan linfoma maligno, con la subsecuente
presentación de signos de acuerdo a la afección orgánica desarrollada y los órganos afectados,
dichos signos varían y pueden ser, por ejemplo: anorexia, pérdida progresiva de la condición
corporal, disminución de la producción en vacas lecheras, aumento de tamaño de algunos ganglios y
alteraciones en la temperatura corporal de acuerdo al desarrollo del proceso neoplásico (Cadavid,
2012).
La LBE es una patología que se presenta con mayor frecuencia en ganaderías lecheras en
relación con las ganaderías de carne, en Colombia se han realizado varios estudios donde las
prevalencias para ganaderías de leche son 24.9 % para la región andina, 15.3% para el pie de monte
llanero y 14.4% para la región caribe (Romero et al. 1999). Otros estudios realizados en
2
Cundinamarca demuestran una prevalencia mayor como el reportado por Villegas, (2015) donde
encontró una prevalencia del 64% en el municipio de Ubaté en vacas Holstein, así mismo Alfonso,
Almansa y Barrera (1998) encontraron una seroprevalencia del 45.28% en vacas de leche en la
Sabana de Bogotá, Valle de Ubaté y Chiquinquirá
Esta enfermedad es considerada de importancia económica a nivel mundial, si bien en
Colombia no han sido estimadas las pérdidas monetarias, en países como Estados Unidos, se señala
que las mismas se encuentran en el orden de los $ 86 millones de dólares para la industria láctea
(Mohammadabadi et al., 2011); así mismo el 89% de los hatos lecheros en este mismo país tiene
una pérdida económica anual de $525 millones de dólares por disminución de la producción de
leche (Florins et al., 2007; Kobayashi et al., 2010). Por otra parte la patología presenta bloqueos en
comercialización mundial de semen y otros productos que procedan de animales positivos, esto trae
como consecuencia la imposibilidad de exportación y adquisición desde mercados extranjeros (OIE,
2014).
Para el diagnóstico de la LBE, se utiliza con frecuencia la prueba de ELISA indirecta, la cual
detecta anticuerpos del virus (OIE, 2014); sin embargo no su presencia. En este proyecto de
investigación, además de realizar el diagnóstico mediante la técnica de Elisa indirecta se busca
obtener resultados a través de la técnica molecular de PCR, e identificar más allá de los anticuerpos
la presencia del virus en un sistema productivo del municipio de Sibaté, lo que representaría el
primer reporte del virus de la LBE en esta zona específica del departamento de Cundinamarca.
3
2. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Reseña
La Leucosis Bovina Enzoótica (LBE) es una enfermedad que afecta fuertemente la
línea linfocitaria, en la que es posible la presentación de procesos neoplásicos mortales, se
caracteriza por la aparición de acúmulos linfocitarios neoplásicos en casi cualquier órgano del
bovino, lo que genera una multiplicidad de signos clínicos; de esta manera las manifestaciones
dependerán del órgano u órganos que estén directamente involucrados, con frecuencia corresponden
a bazo, corazón, riñón y abomaso (Blood & Radostits 1992; Cadavid G. 2012). Se han descrito tres
formas desde el punto de vista clínico-patológico de la enfermedad:
Infección permanente con anticuerpos detectables los cuales son conocidos como
portadores asintomáticos.
Linfocitosis persistente (LP), que es un proceso linfoproliferativo (Blood & Radostits,
1992; Cadavid G. 2012), definido como “un incremento en el número absoluto de linfocitos
de tres o más desviaciones estándar sobre la media normal determinada para cada raza y
grupo etario Esta definición y concepto para tener validez debe ser aplicado al incremento
de linfocitos que persistan por más de tres meses realizando conteos seriados” (Chamizo,
2005).
Linfoma maligno (Blood & Radostits 1992).
La LBE fue advertida por primera vez en Alemania proveniente de un hato del oeste del rio Elba
y se remonta al año de 1861, se describe la aparición de nódulos con superficie lisa, color
amarillo y diferentes tamaños en un bovino adulto con afección principal del bazo (Cadavid
G. 2012; Villegas V, 2015). Para el año de 1906 en los Estados Unidos se reportarían dos
casos de linfosarcoma bovino los cuales presentaban conteos de linfocitos superiores a
50.000 células por mm3. La introducción del término “Leucosis” se da por primera vez
4
hacia el año de 1916 cuando Dobberstein realizó una descripción especializada de la
enfermedad, en este mismo año Knuth y Volkmann, asociaron el incremento en el número
de leucocitos sanguíneos a una forma tumoral de presentación de la enfermedad, y
determinan que se trataba de una enfermedad infecciosa, comprobando la presencia del
virus a través de microscopia electrónica, posteriormente hacia el año de 1954 la cantidad
de linfocitos circulantes toma gran importancia como método diagnóstico de la patología
(Cadavid G. 2012; Villegas V, 2015). La LBE llegó por primera vez a América en la
primera parte del siglo XX, y el primer reporte en Colombia se realizó en 1957. Desde ese
momento, el número de casos, de reportes y de prevalencias ha ido aumentando, con más
intensidad en las ganaderías especializadas en producción de leche (Alfonso, Almansa, &
Barrera, 1998; Galdino de Lima. 1999).
2.2. Etiología
La (LBE) es causada por un virus de la familia retroviridae, subfamilia orthoretrovirinae,
del género Delta retrovirus tipo- C. Se clasifica como tipo C dado que tiene una nucleocápside
central dentro de un virón maduro. Los retrovirus tienen la capacidad de producir una
transformación neoplásica a la célula hospedadora y posteriormente linfoma, leucemia o ambas
(Vélez, 2006). Como ocurre en otros virus de la misma familia, está constituido por proteínas
glicosiladas y no glicosiladas, Ácido ribonucleico (RNA) y una enzima conocida como polimerasa-
RNA dependiente o Trascriptasa Reversa (Leite et al., 2004; Varmus, 1998). El genoma viral
comprende una molécula de RNA de 9 kilo bases (kb) donde se incluyen los genes pol, env gag,
(Figura 1). El virus infecta principalmente linfocitos B, pero también tiene la capacidad de infectar
linfocitos T y monocitos (Vélez, 2006).
El genoma de los retrovirus contiene tres genes importantes gag, pol y env, junto a ellos se
deben tener en cuenta dos regiones reguladoras en los extremos 3' y 5'. El gen gag codifica tres
5
proteínas: de matriz (MA), de nucleocápside (NC) y de cápside (CA), siendo la cápside el
componente proteico más importante del virus codificando cuatro proteínas p10, p12, p15 y p24. El
gen pol codifica a su vez tres enzimas: la transcriptasa inversa (RT), ribonucleasa (PR) y la
integrasa (IN) y el gen env codifica una proteína de superficie gp51 por el gen env que interactúa
con la célula huésped y una proteína transmembrana gp30 (Forti et al., 2014).
Estrictamente en su orden, la estructura del virus está formada por dos moléculas de RNA
estabilizadas por las nucleoproteína p10 y p12 que a su vez forman la nucleocápside, la
nocleocapside y el RNA se encuentran rodeados por una cápside formada por la proteína p24, esta
cápside está constituida por la proteínas p24 y se encuentra rodeada por un envoltorio formado por
la proteína matriz p15, inmediatamente después de esta estructura (matriz) aparece una malla de
glicoproteínas transmembrana constituida por la gp30 que se unen estrechamente con la
glicoproteína de superficie gp51. De acuerdo con lo mencionado anteriormente podemos decir que
la estructura del virus desde el interior al exterior corresponde a, RNA genómico, p12
(nucleocápside), p24 (cápside), p15 (proteína matriz), membrana celular, gp30 (transmembrana) y
gp51 (glicoproteína de superficie) (Figura 2). La glicoproteína de superficie por ser la estructura
viral más externa, es la molécula censada por el sistema inmune para el desarrollo y la producción
de anticuerpos, de igual manera es la encargada del tropismo y adhesión a la membrana los
linfocitos B, quienes en su superficie expresan la Inmunoglobulina M (IgM) y establecen contacto
directo con la glicoproteína de superficie viral gp51 (Kerkhofs, Heremans, Burny, Kettmann, &
Willems, 1998).
Figura 1: Estructura genética de los Retrovirus.
(Andújar, 2004).
6
Las regiones reguladoras tienen un papel importante en el ciclo vital del virus puesto que
son responsables de la expresión génica del virus y son necesarias para la integración viral en el
genoma celular. Las regiones reguladoras se dividen en tres regiones: U3, R y U5. A la región U3
se unen una serie de cooperadores para ayudar a regular los niveles de expresión génica del
provirus. Los cooperadores de origen celular hacen que muchos retrovirus sean específicos para
diferentes especies. Entre 5' de la región reguladora y el codón de iniciación del gen gag hay una
secuencia líder donde se encuentran tres locus importantes como son, el lugar de unión del cebador
donde tiene lugar la unión de un ARNt que sirve de cebador para la transcriptasa inversa; el
segundo locus es env relacionado con los transcritos del gen env y el último locus es de secuencias
de empaquetamiento que permite al ARN viral ser reconocido por las proteínas gag y poder ser
incorporado al virión y ser expulsado de la célula.
Figura 2: Estructura del virus de la Leucosis Bovina Enzoótica.
(Andújar, 2004).
7
2.3. Transmisión.
La transmisión del virus puede ocurrir tanto en forma vertical como en forma horizontal. La
transmisión vertical (hasta un 15%), sucede por diferentes mecanismos como, el consumo de leche
y calostro o por el paso transplacentario de madres infectadas (Hopkins, DiGiacomo, 1997). La
transmisión horizontal es considerada la más importante y ocurre por diferentes factores
tales como, contacto con sangre contaminada, insectos hematófagos, agujas hipodérmicas,
guantes ginecológicos, instrumental quirúrgico, transfusiones sanguíneas de animales
contaminados (Figura 3) (Sota, 2004).
La enfermedad presenta mayor prevalencia e incidencia en los hatos manejados de forma
intensiva, lo que generalmente ocurre en hatos lecheros, debido a que se incrementa el contacto
estrecho entre las vacas, y la manipulación de los animales, lo que permite el paso de linfocitos
contaminados durante procedimientos donde se realiza mayor intervención humana (Johnson &
Kaneene, 1991). Algunos de los materiales que son posibles fuentes de transmisión y que han sido
estudiados se encuentran: la sangre, la saliva, el calostro, la leche, las secreciones nasales, los
lavados bronco-alveolares, la orina, las heces, el semen, los lavados intrauterinos y los embriones.
(Johnson & Kaneene, 1991). El virus no se encuentra en secreciones y excreciones del ganado
bovino infectado, sin embargo si dichas secreciones se ponen en contacto con sangre,
específicamente con linfocitos, o presentan una fracción celular, puede ser fuente de transmisión
(OIE, 2004).
Frecuentemente ocurren procesos de infección debido a la introducción de nuevos animales
infectados asintomáticos a las ganaderías lo que provoca un aumento considerable del virus en los
hatos tomando características enzoóticas (González, et al., 2001).
8
Figura 3. Mecanismo de transmisión de la Leucosis Bovina Enzoótica
(Cadavid G. 2012).
2.4.Etiopatogenia
En un hospedador, la presencia del Virus de LBE tiene afinidad por los linfocitos en especial
por los linfocitos B CD5+ (Aida, et al, 1989). En la primera fase el DNA codificado (provirus),
puede producir viriones verdaderos y escapar de las células hospedadoras para infectar otras que se
encuentras a su alrededor. Pasados 10 a 12 días de la infección existe una respuesta inmune tanto
celular como humoral que aumenta los anticuerpos contra las proteínas estructurales de la cápsula
viral, las cuales controlan la replicación del virus (Leite et al 2004). La respuesta inmune eliminaría
las células virales activas permitiendo solo la replicación mitótica de las células portadoras del
ADN viral. Si bien los mecanismos fisiopatológicos exactos no se han determinado, es posible
sugerir un mecanismo de la siguiente manera: el virus ingresa al nuevo hospedero a través de
algunas secreciones de individuos infectados (leche, semen, sangre). Se estima que 1 ml de fluidos
o secreciones de un animal infectado con un recuento leucocitario de 10.000 por mm3
puede tener
9
hasta 5.000 dosis infectantes. El tropismo inicial será especialmente por linfocitos B CD5+, pero
este virus también puede afectar a los linfocitos T y los monocitos, particularmente cuando el virus
migra o llega a placas de Peyer. En los linfocitos B se producen de 1 a 5 partículas provirales, esto
significa que el genoma del virus se ha integrado con el DNA del hospedero, en este caso al DNA
de la célula linfoide, y estas células serán las encargadas de infectar a otros linfocitos.
Posteriormente el genoma celular sufre modificaciones, que conducen a la proliferación de células
con carácter neoplásico (Baruta et al., 2011; Orjuela, Navarrete, Betancourt, 1991).
Desde la infección viral los bovinos pueden mantenerse asintomáticos (65% de animales
infectados) hasta los 2 a 5 años, e incluso esta fase asintomática se puede mantener de por vida
(Cockrell & Reyes, 2000; Willems et al. 2000 citado por Rama G 2011). De los animales
infectados, aproximadamente el 30% desarrolla linfocitosis persistente en un periodo de 2 a 3 años
post infección (Schwartz & Levy, 1994). El Comité Internacional de la Leucosis define la
linfocitosis persistente (LP) como “un incremento absoluto de linfocitos de tres o más desviaciones
estándar sobre la media normal determinada para cada raza y grupo etario” (Gatti 2007; Cadavid.,
2012).
Dentro de la evolución de la enfermedad algunos animales infectados desarrollan un proceso
neoplásico linfoma maligno que puede afectar principalmente ganglios linfáticos, corazón, bazo,
abomaso, intestino, hígado, riñón, pulmones y útero (Cadavid., 2012). Esto ocurre de 3 a 8 años
después de la infección y aproximadamente entre el 1 al 5% de los animales infectados (Kettman, et
al. 1994; Trono K, et al. 2001).
Las manifestaciones clínicas, cuando se presentan, suelen aparecer después de los dos años de
edad. Sin embargo, diferentes estudios reportan que el período de mayor frecuencia de presentación
es de 5 a 8 años de edad (Elpidio G, 2005). La signología varia en diferentes animales teniendo en
cuenta el lugar de presentación del agente tumoral y el grado de afectación que tenga el órgano,
para posteriormente llevar al animal a la muerte entre 1 y 6 meses después de la aparición de los
10
signos clínicos (Florins, et al 2007). Algunos de los signos que permiten identificar la enfermedad
con mayor probabilidad es el aumento bilateral más o menos simétrico de los ganglios linfáticos
explorables, la pérdida progresiva de peso y condición corporal (Johnson, R & Kaneene, J. 1992)
Así mismo el virus de la LBE tiene un periodo de incubación aproximado de cuatro a cinco
años, generando una Linfocitosis Persistente (LP) antes de las manifestaciones clínicas, y raramente
produciéndose antes de los dos años de edad. Muchas animales se encuentran en la fase preclínica
de la enfermedad durante la etapa productiva de su vida, incluso sin aparentes disminuciones en su
rendimiento o producción, y aunque los animales se pueden infectar a cualquier edad, la fase
clínica, los linfomas o tumores suelen aparecer después de los tres años de vida (Kahn, et al.,
2007).
Algunos autores proponen que dentro de la fase clínica de la enfermedad existen tres cursos en
cuanto al tiempo de presentación de los signos clínicos y la posterior muerte (Florins, et al., 2007).
Un curso híper-agudo donde los animales mueren súbitamente sin aparentes muestras previas de
enfermedad, proceso que sucede a un 5% al 10% de los animales; casos clínicos de curso subagudo
donde los animales presentan hemorragias internas de tamaño variable y se presenta hasta por siete
días, y casos crónicos donde los animales infectados presentan pérdida de peso progresiva con la
consecuente pérdida de la condición corporal, anorexia, palidez, baja considerable en la producción
y debilidad muscular (Cadavid L,. 2012). La temperatura puede ser normal y se ve afectada
únicamente cuando el desarrollo tumoral es acelerado. Luego de ser detectado el tumor y los
diferentes signos clínicos la muerte del animal se acelera y sucede dos a tres semanas después
(Blood & Radostis., 1992).
2.5 Manifestaciones clínicas
La LBE genera múltiples casos de linfomas multicéntricos en bovinos adultos, los cuales se pueden
desarrollar fácil y rápidamente en varios lugares del cuerpo y por tanto la variación en las
11
manifestaciones clínicas que se puedan presentar; esta forma de presentación de la enfermedad es la
más severa y se conoce como la forma tumoral de la patología. Otra de las formas de presentación
de la patología se da por la presencia de linfocitosis persistente, esta no cursa con signos clínicos y
generalmente aparece antes de las manifestaciones tumorales (cuando estas se dan), pero aparece
después de los dos años. Muchas vacas infectadas permanecen con linfocitosis persistente durante
gran parte de su vida, casi durante todo su periodo productivo, sin cambios aparentes en la salud ni
en la producción del animal y algunas de ellas nunca desarrollan la etapa tumoral; sin embargo
cuando la etapa tumoral se desarrolla se da en animales mayores de 3 años de edad. (Kahn, et al.,
2007). Con gran frecuencia la enfermedad se da en forma subclínica, aunque algunos estudios han
demostrado que la linfocitosis persistente se puede encontrar entre un 30 – 70% de los animales
infectados y la etapa tumoral se puede encontrar entre el 0.1 al 10% de los animales infectados.
Los signos son variables y pueden incluir: desórdenes digestivos, anorexia, pérdida progresiva
de peso y de condición corporal, debilidad general y tumefacción de ganglios a la palpación
superficial. Los órganos más afectados por la LBE son la aurícula derecha, omaso y abomaso,
pulmones, hígado, bazo, intestinos, útero, riñón (Chamizo., 2005). Casos clínicos de curso híper-
agudo se presentan entre un 5% a un 10% donde los animales infectados mueren súbitamente sin
manifestaciones previas de enfermedad. La ruptura de una úlcera abomasal, la afección de los
ganglios o el daño a nivel del bazo, adicional a una hemorragia interna son algunas causas
conocidas dentro del cuadro sub agudo que puede tardar hasta siete días, como también se deben
tener en cuenta en el cuadro crónico que puede demorar meses. Los animales afectados empiezan a
perder condición corporal inexplicablemente, anorexia, debilidad muscular, palidez y en vacas
lecheras la producción puede disminuir drásticamente. Una vez que los signos clínicos y el
desarrollo del tumor sean detectables la muerte del animal es inminente y puede suceder de dos a
tres semanas (Cadavid., 2012).
12
En el caso de evolucionar como linfoma, los ganglios linfáticos aumentan de tamaño en el 75-
90% de los casos siendo un aumento mayormente simétrico; esto es con frecuencia un hallazgo
clínico precoz (Hernández-Herrera et al 2011). La exoftalmia junto con el aumento de tamaño más
o menos simétrico de los ganglios linfáticos explorables constituye el signo más evidente de la
presentación de la enfermedad. Sin embargo, lesiones periféricas se pueden presentar así como
pueden estar completamente ausentes en muchos casos con afectación visceral avanzada. El
aumento de tamaño de nódulos linfáticos viscerales es frecuente, normalmente subclínico, se
pueden observar signos clínicos cuando el aumento de tamaño de estos nódulos compriman otros
órganos de importancia como los intestinos o nervios. Los ganglios que se ven comprometidos son
de consistencia dura y lisa; en las vacas lecheras, se observan con facilidad cuando estos se
presentan y normalmente se encuentran edematizados, en algunos casos toda la superficie corporal
está cubierta con masas subcutáneas de 5 -11 cm de diámetro. (Kahn, et al., 2007; Cadavid.,
2012).
2.6 Lesiones
Las lesiones más comunes son tumores en los ganglios linfáticos, los más frecuentemente
afectados son los iliacos (65 a 83%), mesentéricos (66%), intratorácicos (62 a 74%), y los
superficiales (pre escapulares, pre crurales y de la región cervical) (41 a 62%). Estos se muestran
casi siempre sin adherencias a tejidos circundantes, lisos o con nódulos, de consistencia blanda y
edematosa o firme, turgente y friable. En la superficie de corte los detalles de la estructura
anatómica del órgano se pierden por la invasión de tejido tumoral lardáceo, húmedo y de color
blanco grisáceo o blanco amarillento (Cadavid., 2012). Cuando la medula ósea es afectada, aparece
un tejido blanco-gris o blanco remplazando el color rojo que se observa en la médula hemopoyética
normal. La afección tumoral de la médula ósea implica la presencia de leucemia, o sea, la aparición
de células tumorales en la sangre (Cañibano, 2011).
13
2.7 Diagnóstico
El diagnóstico de LBE puede ser determinado por un lado teniendo en cuenta que
aproximadamente el 30% de animales infectados cursan con linfocitosis persistente, mientras que
tan solo entre el 1% y el 5% desarrollan linfoma; de este modo se puede realizar una aproximación
diagnóstica con base en la sintomatología clínica y los hallazgos de laboratorio. Los signos clínicos
pueden variar dependiendo del sistema u órgano afectado presentándose algunos desórdenes
circulatorios, digestivos, respiratorios, reproductivos y locomotores. En animales con mayor edad la
sintomatología cursa con un proceso caquéctico. Se realiza examen clínico para diagnosticar el
linfoma que puede ser confirmado por histopatología en biopsias de los tumores. La linfocitosis
persistente se diagnostica mediante exámenes hematológicos realizados en una forma periódica
(Giraudo, 2010).
El diagnóstico de animales con linfocitosis persistente y animales infectados sin signos
clínicos requieren de pruebas de laboratorio (Cañibano, 2011). Algunos de los estudios realizados
son: Inmunodifusión en gel de agar (IDGA), Radioinmunoensayo (RIA), Seroneutralización (SN),
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), Western Blot (WB) y Reacción en Cadena
de Polimerasa (PCR); La PCR es una prueba útil para detectar DNA proviral en muestras de sangre,
siendo un método sensible que permite un diagnóstico rápido y temprano (González et al., 2001).
Diferentes estudios realizados para la enfermedad indican diagnósticos moleculares y
serológicos, donde se pueden identificar genes del virus como anticuerpos para el virus
respectivamente, algunos estudios recientes señalan que el diagnóstico preciso corresponde a la
detección de los genes del virus gp51-env, gag-p25 y pol por pruebas moleculares específicamente
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en sus diferentes formas diagnosticas (PCR-RT,
nested PCR, PCR duplex, PCR-EIA y PCR-ISH) de células procedentes de muestras de sangre,
testículo, ganglios linfáticos, abomaso, corazón u otros órganos afectados. La Reacción en cadena
de la Polimerasa tiene algunas ventajas las cuales permiten detectar animales infectados antes de
que estos desarrollen una respuesta inmunológica, animales cursando un período prolongado de
14
latencia, así como la detección del virus en terneros infectados que pudieran ser falsos positivos con
otras pruebas debido al consumo reciente de calostro, detectar el provirus en animales
inmunotolerantes que son serológicamente negativos, y detectar el provirus en vacas seronegativas
en periodo de periparto debido a la inmunodepresión generada por la gestación como tal y a la
cantidad de inmunoglobulinas dispuestas para el calostro (Monti et al., 2005), estudios realizados
en hembras gestantes han demostrado que en el periparto (30 días antes y hasta 30 días después del
parto) la actividad del sistema inmune esta considerablemente disminuido, por lo cual algunos
animales pueden aparecer como falsos negativos con pruebas diagnósticas basadas en la detección
de anticuerpos, puesto que la capacidad de los linfocitos para responder y la producción de
anticuerpos están significativamente bajos. Igualmente existe una disminución significativa de la
IgG y la IgM en las 8 semanas previas al parto y hasta 4 semanas posteriores al parto (Meikle, et al.,
2012).
Además de la PCR y de las pruebas serológicas de ELISA es posible realizar diagnóstico
por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia de tejidos donde se sospeche de la presencia de la
partícula viral. Sin embargo es importante tener en cuenta que tanto para las pruebas moleculares
como para la inmunohistoquimica e inmunofluorescencia la detección del virus resulta difícil
porque depende de la carga proviral que posee el animal, es decir del número de células infectadas y
depende igualmente de la eficiencia del método de extracción del RNA, (Ott, Johnson, & Wells,
2003 citado por Villegas 2015).
El recuento de linfocitos si bien no es una prueba diagnóstica contundente, puede ser
relacionado con pruebas diagnósticas más precisas o avaladas para el diagnóstico médico, puesto
que se ha demostrado que el 92% de animales con LBE seronegativos presentan valores normales
de estas células, mientras que el 66% de animales seropositivos presentan niveles de linfocitos
superiores de los reportados como normales para la especie que para el caso de bovinos está
estipulado como normal entre 2200 a 9000 cel/ul (Rama, 2011).
15
Teniendo en cuenta los diferentes métodos diagnósticos, las pruebas más comunes para el
diagnóstico de LBE son inmunodifusión en gel agar (AGID) y la prueba de ELISA (Enzyme-
Linked ImmunoSorbent), que arrojan resultados relacionados con la cantidad de anticuerpos
presente en el huésped, la prueba de ELISA reconoce anticuerpos séricos contra las proteínas
estructurales gp51 y p24 y estos persisten durante toda la vida, es por esto que la Organización
Mundial de la Salud Animal OIE, reconoce a la AGID y al ELISA como métodos diagnósticos para
la LBE y recomienda a los gobiernos el uso de la prueba de ELISA como método oficial de
diagnóstico de la enfermedad (Ferrer Piper, Abt, & Marshak, 1977; Agresti et al., 1993).
2.8 Prevalencia
La mayor prevalencia se presenta en ganaderías especializadas en la producción de leche
entre un 15% y un 49% en diferentes países (Martín et al., 2000; Morris et al., 2001) esto
concuerda con diferentes estudios realizado en la Florida en donde reportan una prevalencia de
48% en ganaderías lecheras (Chamiso., 2005).
En algunos países de américa los reportes son los siguientes: Costa Rica 18,4%, Chile
35,9%, Uruguay en 60 ganaderías de 3 departamentos mediante la técnica de ELISA encontraron
una seroprevalencia del 77%, 72% y 57%, en Brasil se encontraron prevalencias del 4% hasta unas
mayores al 70% en hatos, y en otros estudios en chiles en diferente estudios encontraron
prevalencias del 21% al 59% y en Estados Unidos de América 23%, (Galdino de lima, 1999; Grau
& Monti, 2010). Otros continentes reportan prevalencia similares en algunos países específicos
como: Nueva Zelanda 36%, Israel 25%, 30% en Australia,
En Colombia, los primeros estudios de prevalencia serológica para la enfermedad se
realizaron en la sabana de Bogotá en 1980 obteniendo una seroprevalencia de 36,4 (+/- 5,2%).
Posteriormente dos años después, (Parra et al., 1982) reportaron una cercana al 30% para la zona
Andina. En este sentido se encontraron prevalencias en ganado de leche de 24.9 % para la región
16
Andina, 14.4 % para la región Caribe y 15.3 % para el Piedemonte Llanero (Romero et al. 1999;
Cadavid G. 2012).
La Federación Colombiana de Ganaderos entre los años 2005 y 2009 realizó una
recopilación de todos los datos de LBE de todo el país, encontraron que los laboratorios del ICA y
otros de referencia reportan una prevalencia del 25% en un total de 20.910 muestras procesadas en
búsqueda de la enfermedad y su prevalencia en todo el país. En la tabla 1 se encuentran
relacionados los departamentos que enviaron muestras, así como el número de municipios por
departamento, cantidad de muestras enviadas por cada municipio y cantidad de muestras positivas
con su respectivo porcentaje de prevalencia para cada municipio.
La elevada incidencia de la LBE en los hatos lecheros se relaciona con las diferentes
exigencias que requieren estos sistemas de producción que se caracterizan por producción intensiva
o semi-intensiva donde el confinamiento de los animales es mayor, el contacto directo entre
animales es alto, lo que aumenta la facilidad de infección de un animal sano por parte de uno
infectado, la intervención del veterinario en diferentes procesos quirúrgicos y de sanidad en hatos
lecheros también es mayor en ganaderías lecheras que en ganaderías de carne las cuales en su
mayoría son producciones extensivas; por tanto la prevalencia en hatos lecheros es mayor que en
hatos especializados en carne, donde se alcanza una prevalencia apenas del 7 % (Cadavid., 2012).
Tabla 1: Distribución de muestras procesadas y porcentaje de positividad a Leucosis Viral Bovina,
por departamento y número de municipios que enviaron muestras. Colombia 2005 – 2009 (Cadavid
G. 2012).
DEPARTAMENTO LEUCOSIS MUNICIPIOS QUE
ENVIARON MUESTRAS % MUESTRAS POSITIVO
S %
Antioquia 46 37 2.122 591 28
Arauca 4 57 113 2 2
Atlántico 6 26 201 33 16
Bolivar 2 4 4 1 25
Boyacá 20 16 376 171 45
Caldas 14 52 618 224 36
Caquetá 11 69 189 15 8
Casanare 4 21 17 5 29
17
Cauca 8 20 78 46 59
Cesar 16 64 7.099 778 11
Córdoba 11 39 1.400 668 48
Cundinamarca 44 38 1.543 480 31
Guaviare 0 0 0 0 0
Huila 7 19 113 47 42
La Guajira 0 0 0 0 0
Magdalena 3 10 10 0 0
Meta 16 55 171 42 25
Nariño 6 9 111 35 32
Norte de santander 9 23 253 28 11
Putumayo 4 31 171 73 43
Quindio 10 83 1.249 397 32
Risaralda 9 64 494 125 25
Santander 26 30 1.052 342 33
Sucre 3 12 102 47 46
Tolima 12 26 112 35 31
Valle del Cauca 33 79 3.310 1.056 32
Vichada 1 25 2 0 0
TOTAL 325 31 20.910 5.241 25
(Cadavid G., 2012).
2.9 Impacto Económico
La LBE causa disminuciones en la producción, así lo demuestra un estudio realizado en
lecherías especializadas donde se presentaba la patología. En estas ganaderías se observó una
disminución en la producción del 2.5% al 3% en la totalidad del ordeño y un aumento en las
pérdidas selectivas, como también se logró demostrar que aumentaba la susceptibilidad a la
presentación de otras enfermedades del origen infeccioso tales como mastitis, neumonía y diarrea
(OIE., 2004).
Las pérdidas económicas ocasionadas por la LBE aumentan por la mortalidad causada por
la patología tumoral, la alteración del sistema inmune del ganado afectado y restricciones para la
exportación de semen, embriones y ganado en pie de animales que padecen la patología (Rama,
2009). Otras perdidas económicas de gran importancia en que se incurre por la presentación es la
inversión que requiere para realizar un correcto diagnóstico, y la pérdida de canales que llegan a
matadero (DiGiacomo., 1992).
18
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Población
Corresponde a bovinos de raza Holstein. Se seleccionaron hembras de edades entre 3 a 11
años, completamente al azar; estas edades se determinaron teniendo en cuenta que es la edad
estimada como productiva para la raza y el rango etario con mayor presentación de LBE. Los
animales fueron seleccionados en una finca del municipio de Sibaté, dedicada a la producción
especializada en leche, donde según la literatura se encuentra mayor prevalencia de la enfermedad.
La finca seleccionada para este estudio, cuentan con producción de leche por animales de
raza Holstein de alta producción. La finca cuenta con ordeño mecánico, higiene adecuada dentro del
ordeño y buenas prácticas de ordeño; los animales se encuentran en pastoreo, en praderas con Ray
Grass Italiano y Pasto Kikuyo y a la hora del ordeño son suplementados con concentrado y papa
picada. En esta finca se realizan dos (2) ordeños al día, siendo realizados a las 3 A.M. y a las 3
P.M. Los animales seleccionados no poseían signos clínicos aparentes para la enfermedad en el
momento de la toma de las muestras.
3.2 Muestra
El cálculo de la muestra se realiza con base en la totalidad de la población presente en el
sistema productivo, la cual corresponde a 59 bovinos. De acuerdo con lo anterior se estimó el
número de ejemplares para estudio, según la fórmula matemática:
Dónde:
n = número de animales para construir la muestra representativa de estudio
k = constante dependiente del nivel de confianza (nivel de confianza del 90%) k = 1,65
19
p = proporción de individuos que tiene la característica en estudio (animales seropositivos y con
presencia del virus de LBE) 50% de la población (0.5)
q = proporción de individuos que no tiene la característica en estudio (animales seropositivos y con
presencia del virus de LBE) 50% de la población (0.5)
e = error muestral deseado del 5%
Así:
N = 61
K = 1,65
e = 5
p = 0,5
q = 0,5
En este sentido el número de animales para la obtención de resultados estadísticamente
significativos correspondió a 50. Estudios similares en la detección del virus de la leucosis estiman
una muestra similar a la del presente trabajo de investigación (Betancur & Rodas 2008; Hernández-
Herrera, Posso-Terranova, Benavides, et al., 2011; Úsuga-Monroy, Echeverri, & López-Herrera,
2015)
La muestra para detección de anticuerpos, virus y linfocitos fue de tipo biológica y
correspondió a sangre, la cual se obtuvo por punción de la vena coccígea, teniendo en cuenta el
procedimiento establecido por (Nava et al 2011). El procedimiento consistió en realizar una
limpieza antiséptica en la región ventral de las primeras vértebras coccígeas, para posteriormente
ingresar a la luz del vaso sanguíneo con un Vacutainer® calibre 21, estando en la luz del vaso se
procedió a recolectar las muestras en 2 tubos tapa lila para las muestras de hemograma y PCR, y en
un tubo tapa roja para el procedimiento de ELISA.
3.3 Procedimientos realizados
3.3.1 Cuadro hemático
20
Para llevar a cabo el cuadro hemático, se tomó una muestra de sangre en tubo tapa lila con
anticoagulante (EDTA), cada una de las muestras iba siendo depositada en la cava de transporte con
pilas de gel refrigerado a 4 grados centígrados para así el mismo día ser almacenadas en nevera a 4
grados centígrados. Al día siguiente a la toma de las muestras fueron llevadas al laboratorio donde
fueron procesadas y se obtuvieron los resultados correspondientes.
La importancia de realizar el cuadro hemático, radica en la posibilidad de establecer la
cantidad de leucocitos, y específicamente de linfocitos. Para relacionar estas células con la
enfermedad es necesario realizar el recuento celular que consiste en determinar la cantidad de
células linfoides en sangre por unidad de volumen microlitro (μL), milímetro cúbico (mm3) o litro
(L). Teniendo en cuenta lo anterior se obtienen resultados del conteo de leucocitos para cada
individuo, en valores de cantidad de leucocitos por microlitro de sangre (leu/μL), se utilizaron
valores de referencia para la especie y grupo etario de 4.000 a 12.000 leucocitos/microlitro; luego se
realiza el recuento diferencial o porcentual de cada línea leucocitaria y de esta manera la
determinación total de los linfocitos, con la siguiente ecuación:
Cantidad de leucocitos x % linfocitos / 100 = X
3.3.2 Elisa de bloqueo
Para el diagnóstico de LBE se tomaron muestras de sangre de vena coccígea según el
procedimiento en el numeral 3.2. Las muestras fueron recolectadas en tubos tapa roja; para obtener
suero sanguíneo con mayor facilidad, las muestras se refrigeraron a una temperatura de 4°C en una
cava para posteriormente llevarlas al laboratorio el mismo día del muestreo para realizar la prueba
de Elisa de bloqueo, donde se realizó la técnica de ELISA de bloqueo a cada una de las muestras y
se obtienen los resultados de Positivo o Negativo según corresponda para cada muestra.
21
La Elisa de bloqueo es una prueba serológica útil para el diagnóstico de diferentes
enfermedades mediante el uso de anticuerpo antígenos, la técnica de ELISA se basa en el uso de
anticuerpos o antígenos marcados con una enzima, así los conjugados resultantes tengan actividad
tanto inmunológica como enzimática. Marcado uno de los dos componentes antígeno o anticuerpo,
con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-
anticuerpo quedará inmovilizada, de esta forma será fácilmente revelada mediante la adición de un
substrato especifico que al actuar la enzima producirá un cambio color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
La prueba consta de las siguientes etapas:
Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar.
Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma
que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno), reaccionará
específicamente con los anticuerpos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no
fijados.
Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente
de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los
cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados sin reacción.
Adición del substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
detener la reacción en este punto si se desea.
Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
22
3.3.3 Reacción en cadena de la polimerasa PCR
PCR Anidada
Para la extracción de ARN se utilizó el kit de extracción comercial RNeasy Mini Kit® de
laboratorios Qiagen®; el ARN de la muestra fue recuperado a partir de 200 µl de sangre entera
siguiendo las indicaciones del fabricante y almacenado a -70 °C. Para la primera reacción se utilizó
un volumen final de 25 µl teniendo en cuenta el siguiente protocolo: 2.5 µl de primer externo con
oligonucleótidos (F-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA y R-
AACAACAACCTCTGGGAAGGGT), 12.5 µl de Dream Taq Green PCR master mix (2x), 2 µl
DNAc y 8 µl de agua libre de DNAasas, la PCR se realizó en un termociclador Bio Rad C1000TM
Thermal Cycler ® utilizando el siguiente perfil térmico: 5 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de
30 segundos a 94 °C, 60 segundos a 59.3 °C y 60 segundos a 72°C seguido de 1 ciclo de 10 minutos
a 72°C.
En la segunda reacción se utilizó como DNA 2 μl del producto resultante de la PCR de la primera
amplificación, las mismas concentraciones de los demás reactivos y los oligonucleótidos (F-
CCCACAAGGGCGGCGCCGGTTT y R-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG). Posteriormente
se realiza el siguiente perfil térmico: 2 minutos a 95 °C, seguido de 36 ciclos de 30 segundos a 95
°C, 30 segundos a 56 °C y 30 segundos a 72°C seguido de 1 ciclo de 5 minutos a 72°C. Los
productos obtenidos se llevaron a realizar electroforesis en BIO-RAD PowerPac ® HV y el
resultado fue visualizado en gel de agarosa al 1,5 % en TBE y teñidos con SYBR Green.
23
3.4 Procedimiento estadístico
Con los resultados obtenidos para cuadro hemático, PCR y la prueba de Elisa se realizó
estadística descriptiva de modo que fue posible la obtención de media, moda y desviación estándar
para los datos igualmente se realizaron gráficas de acuerdo a las metodologías descritas por Villegas
(2015), así mismo se realizó la prueba t de student de acuerdo al procedimiento referenciado por
Martinez y Martinez (1997), para identificar la correlación de los resultados obtenidos para
linfocitos, y los positivos obtenidos por las pruebas de PCR y ELISA
24
4. RESULTADOS
A continuación se muestran los resultados obtenidos para las pruebas de Cuadro hemático,
ELISA de bloqueo y PCR, que permiten dar análisis y discusión de lo obtenido con relación a otros
resultados reportados en la literatura para la enfermedad.
Resultados del cuadro hemático: de la prueba de conteo celular es posible mencionar que el
promedio de conteo de glóbulos blancos para la muestra utilizada es de 13371,6 Leu/ µl, el
número promedio de linfocitos es de 7895,46 Linf/ µl. Los resultados de cuadro hemático también
nos arrojan valores a tener en cuenta como el promedio de Hematocrito para los 50 animales
muestreados que corresponde a 34,34 %, un promedio de hemoglobina de 10,53 g/dl, un recuento
de glóbulos rojos promedio de 7,25 x 106/µl y un recuento de plaquetas promedio de 185,25 x10
3/
µl, valores que concuerdan con los reportados por Villegas V (2015).
El conteo de linfocitos para cada animal según el coeficiente de correlación t de student, se
relaciona con el resultado de la prueba de Elisa de bloqueo, puesto que 11 de los 12 animales
positivos a ELISA (91,66 %) presentan valores por encima de los parámetros normales, mientras
que 1 de los 12 animales positivos, que corresponde a un 8,33% siendo seropositivo, presenta
conteo de linfocitos dentro de los valores normales para este grupo etario.
Resultados ELISA de bloqueo: Teniendo en cuenta los resultados obtenidos mediante la técnica
ELISA de bloqueo, podemos decir que la presencia de la enfermedad en la muestra del presente
estudio corresponde al 24% lo anterior de acuerdo con la fórmula utilizada por Villegas V. (2015)
que corresponde a prevelencia = número de casos existentes/número total de población * 100; de
esta manera de acuerdo a lo obtenido la prevalencia en el sistema productivo analizado es 24% en
tanto, prevalencia puntual = 12/50 * 100 = 24.
25
Figura 5: Seroprevalencia de la Leucosis Bovina Enzootica en una finca en Sibaté.
Figura 6: Conteo de linfocitos en animales seropositivos
De los animales seropositivos (12), 11 (91,66%) presentan conteo de linfocitos por encima
del rango normal teniendo en cuenta los parámetros establecidos por el laboratorio para esta zona y
grupo etario (4.000-12.000 leu/µl de los cuales los linfocitos deben ser 45-75%).
De los animales seropositivos, 1 (8,33 %) presentan conteo de los linfocitos establecidos
como normales para animales de este grupo etario.
En cuanto a los resultados para la prueba de PCR anidada que se realizó, se obtienen 7
animales positivos, que corresponde al 14 %, estos 7 animales encontrados positivos con PCR
también son positivos a la técnica de ELISA de bloqueo, por lo cual se confirma el diagnóstico para
estos animales.
24%
76%
SEROPOSITIVOS (elisa de bloqueo)
positivos
negativos
92%
8%
ANIMALES SEROPOSITIVOS (12)
Linfocitos por
encima del valor
de referencia
26
Figura 7: Producto del PCR amplificado. carril 1: Marcador de peso molecular 100 bp; carril 2:
animal negativo a la presencia del provirus; carril 3: animal positivo a la presencia del provirus;
carril 4: animal negativo a la presencia del provirus; carril 5: animal positivo a la presencia del
provirus; carril 6: animal negativo a la presencia del provirus; carril 7: animal positivo a la
presencia del provirus; carriles 8 y 9: animales negativos a la presencia del provirus; carriles 10 al
13: animales positivos a la presencia del provirus; carril 14: control negativo; carril 15: control
positivo.
Figura 8: Prevalencia de PCR para Leucosis Bovina Enzoótica
14%
86%
PCR ANIDADA
POSITIVOS NEGATIVOS
27
Figura 9: Comparación resultados ELISA de bloqueo contra resultados PCR anidada.
12 7
38 43
ELISA PCR
ELISA VS PCR
POSITIVOS NEGATIVOS
28
5. DISCUSION
El presente estudio evaluó el uso de un método de PCR anidado, el método de ELISA de
bloqueo y conteo de linfocitos como prueba indirecta para la detección del Virus de la Leucosis
Bovina Enzoótica en una finca lechera en el municipio de Sibaté Cundinamarca. De acuerdo a
nuestros resultados, la técnica de ELISA de bloqueo en suero detectó un mayor número de
animales positivos (10%) con respecto a la técnica de PCR anidada en sangre. Todas las muestras
negativas a ELISA de bloqueo en suero, fueron también negativas a PCR, Sin embargo, cinco (5)
muestras negativas a PCR fueron positivas a ELISA de bloqueo, situación que de acuerdo a Felmer
(2006) se podría explicar por la ausencia del provirus en linfocitos sanguíneos, una infección
restringida a órganos linfoides o algunas variaciones de la secuencia nucleotídica de algunos
aislados del virus, que podrían inducir a errores en la hibridación de los oligonucleótidos utilizados
como cebadores, disminuyendo consecuentemente la sensibilidad del PCR.
Este estudio detectó la presencia de anticuerpos específicos contra Leucosis Bovina
Enzoótica en 12 de los 50 animales objeto de estudio, lo que corresponde a un 24%, por la técnica
de ELISA de bloqueo, mientras que la técnica de PCR anidada arrojo que 7 de los 50 animales
objeto de estudio son positivos lo que corresponde a un 14 % de presencia del virus. El conteo total
de linfocitos realizado mediante el cuadro hemático para cada uno de los animales, esta aumentado
en 11 de los 12 animales positivos con la técnica de Elisa de bloqueo, que corresponde a un 91.66
%, situación concordante al estudio realizado por Gonzalo Rama en el 2011 donde indica que el
66% de los animales seropositivos por ELISA indirecta presentan niveles superiores de linfocitos a
los establecidos para la especie, pero que a su vez difiere con el estudio realizado por Villegas 2015
donde encontró que solo el 28% de los animales positivos a Elisa indirecta presentaban aumento en
el conteo de linfocitos para ese grupo etario, teniendo en cuenta que la OIE estima como linfocitosis
persistente al aumento en el número total de linfocitos de 3 o más desviaciones estándar para una
grupo etario especifico (Villegas, 2015).
29
De los animales negativos para la prueba de Elisa de Bloqueo (38), el 36,84 %
correspondiente a 14 animales, presenta un aumento en el conteo de leucocitos determinados como
normales por el laboratorio para este grupo etario, situación que se puede atribuir a la presencia de
otra enfermedad viral (Herr et al.,2011; Meikle et al.,2012). De igual manera el promedio arrojado
por la estadística descriptiva para el numero de linfocitos es de 7895,96 Linf/ µl situación que está
en el límite del máximo permitido como normal para esta raza y grupo etario, esto pudiéndose
atribuir a que algunos de los animales positivos a Elisa y a PCR anidada presentan un aumento del
conteo de linfocitos de hasta 23.454 Linf/ µl lo que aumenta el promedio general para el grupo
objeto de estudio.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, este estudio concuerda con algunos autores tanto
nacionales como internacionales donde la presencia de LBE por las técnicas de ELISA es similar en
algunos países como por ejemplo: en Canadá y Turkía del 23%, Brasil del 28,7 al 52 %, Estados
Unidos de América 23% de los animales y 69,6% de los hatos, Costa Rica 18,4 de los animales y
51 % de los hatos, Israel 25 % (Cadavid G, 2012).
En la sabana de Bogotá, los primeros estudios epidemiológicos determinaron una prevalencia
serológica de 36,4 + o - 5,2% en 1980 (Cadavid G., 2012); posteriormente en 1982 (Parra et al.,
1982) reportaron una prevalencia de 25,9% para la zona Andina. Teniendo en cuenta estos estudios
se encontraron prevalencias en ganado de leche de 24.9 % para la región Andina, 14.4 % para la
región Caribe y 15.3 % para el Piedemonte Llanero (Romero et al. 1999), datos que concuerdan con
este estudio. Así mismo la Federación Colombiana de Ganaderos entre los años 2005 y 2009 realizó
una recopilación de todos los datos de LBE de todo el país, encontraron que los laboratorios del
ICA y otros de referencia reportan una prevalencia del 25% en un total de 20.910 muestras
procesadas en búsqueda de la enfermedad y su prevalencia en todo el país, situación que similar
con el 24% de seroprevalencia reportado en este estudio.
30
De otra parte estudios más recientes difieren un poco de éste puesto que presentaron resultados de
entre el 50 y hasta el 90 % de presencia de la enfermedad, ya sea por técnicas serológicas y/o
moleculares; de esta manera (Villegas , 2015) reporta una prevalencia del 64% en una finca lechera
del municipio de Ubaté Cundinamarca, estudio realizado con la técnica de Elisa indirecta y donde
para dicho estudio también se realiza conteo de linfocitos que según resultados reportados por el
autor no se relaciona la linfocitosis persistente con la seropositividad, circunstancia que también
difiere de este estudio; En otro estudio realizado en Santander para ganado lechero se reporta una
seroprevalencia del 73% con una población estudio de 360 animales (Carrero. R, Arévalo M,
Tarazona y Cepeda., 2008); en el año 2012 (Cadavid G. 2012) señala una prevalencia de 77,8%
utilizando la técnica de PCR anidada en 9 hatos de lechería especializada y con 194 animales en
estudio en el departamento de Córdoba; más recientemente en el año 2016 en una investigación
realizada por conglomerados con detección molecular (Meza B, Sanjuanelo C, Gallego M, 2016)
reportan una presencia del virus de 22,6%; identificando para la zona centro (Cundinamarca y
Boyacá) una presencia del virus de 50,7% donde los animales muestreados son de especialidad
lechera, mientras que para la zona sur en los departamentos del Huila y Tolima se reportó un 5,1%
de presencia del virus de animales de producción de carne. Teniendo en cuenta estos datos es
posible identificar una tendencia al aumento de la prevalencia y presencia del virus en
explotaciones ganaderas especializadas en leche, tanto de la zona de influencia de este estudio como
para el resto del país. Diferentes estudios revelan la alta presencia del virus en hatos destinados a la
producción de leche en comparación con los bajos porcentajes descritos para animales de afinidad
cárnica, situación que se atribuye en gran medida a las prácticas de manejo, puesto que en
ganaderías lecheras se facilita la transmisión entre animales clínicamente sanos, por diferentes
procesos tales como la alta y permanente manipulación por técnicos en el ordeño, incremento en los
procesos de diagnóstico necesarios dentro del hato tanto productivos como reproductivo y/o
clínicos, falta de higiene o precauciones al realizar inseminaciones, utilización de las mismas
agujas en varios bovinos, mal uso de guantes y demás elementos contaminados con sangre;
31
igualmente la producción intensiva en ganaderías lecheras y mayor contacto entre animales
favorece la propagación del virus por moscas e insectos hematófagos (Rama G, 2012; Cadavid G
2012; Villegas 2015). Cada una de estas acciones genera un efecto negativo en las ganaderías en
general, afectando no solo la producción de leche, sino también los índices reproductivos y el
favorecimiento de la presentación de enfermedades secundarias que conllevan a pérdidas
económicas y así la dificultad en el sostenimiento en las ganaderías especializadas (Murakami et
al., 2011; Betancur & Rodas, 2008; Visbal, 1997; Chamizo, 2005).
La baja presencia de LBE encontrada en este estudio (24% para Elisa y 14 % para PCR)
comparada con los resultados de otras investigaciones, donde se encuentran prevalencias de entre
el 50 al 80 % (Cadavid G, 2012; Villegas 2015; Meza B, Sanjuanelo C, Gallego M, 2016) dadas
para ganaderías especializadas en leche, se atribuye en gran medida a que la propietaria de la finca
es una Médica Veterinaria que conoce la enfermedad y entiende la importancia de poner en práctica
los métodos de prevención y control en su finca, como son un solo uso de las agujas desechables,
una manga de palpación por animal, la completa desinfección tanto de instalaciones como de
material de ordeño y quirúrgico, acompañando estos procesos con la capacitación a sus trabajadores
y operarios para de esta forma evitar la propagación descontrolada de la enfermedad, igualmente la
entrada de nuevos animales a la finca procedentes de otros hatos es controlada situación que
favorece el ingreso de animales portadores del virus.
Cabe mencionar que la dinámica de detección serológica de LBE puede ser alterada por diferente
procesos como lo son los periodos de gestación, específicamente el periparto (un mes antes y hasta
un mes después) este mecanismo se da porque durante las últimas semanas de gestación los
anticuerpos van con mayor proporción al calostro y puede existir una inmunodepresión en la
gestante, puesto que por un efecto depresor de la progesterona sobre la actividad linfocitaria dada
por la proteína inmunomoduladora conocida como PIBF o Factor Bloqueador Inducido por la
Progesterona, el cual es capaz de suprimir la diferenciación celular de linfocitos, de tal manera que
32
una prueba serológica de una animal positivo podría resultar negativa, así mismo las
concentraciones de células linfocitarias pueden estar disminuidas durante este mismo periodo; de
igual forma en terneros jóvenes menores de 6 meses, podemos encontrar animales serológicamente
positivos debido al calostro obtenido a través de la madre y que puede poseer lo anticuerpos para
generar un resultado falso positivo ( Cadavid G., 2012; Rama G., 2012; Villegas 2015; Meza B,
Sanjuanelo C, Gallego M, 2016).
33
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La presencia de Leucosis Bovina Enzoótica en una finca lechera del municipio de Sibaté
Cundinamarca es de 24% para la técnica de Elisa de Bloqueo y de 14 % para la técnica
molecular de PCR anidada.
El conteo de leucocitos y de linfocitos se puede relacionar directamente con la presentación de
la enfermedad puesto que, en este estudio, el 91,66% de los animales positivos presentaron
aumento en el conteo total de leucocitos y específicamente de linfocitos. Para comprobar esto,
se sugieren estudios que descarten otras causas de linfocitosis y/o se corrobore que es
persistente.
El resultado obtenido en este estudio de seropositividad 24% y 14 % para la técnica de PCR
anidada, determina una presencia baja de la infección, comparado con otros estudios en la zona
para ganaderías de leche, situación que puede estar determinada por el conocimiento de la
enfermedad por parte de la propietaria y de los operarios de la finca, de esta forma se evitan las
malas prácticas de manejo disminuyendo la transmisión de la enfermedad al interior de la
lechería. De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, es necesario esclarecer, en
estudios posteriores, si se trata de falsos positivos por ELISA o de falsos negativos por PCR.
Es posible concluir que la técnica de Elisa resulta eficiente para el diagnóstico de LBE, la
técnicas moleculares como la PCR anidada al ser costosa puede resultar conveniente en ciertas
situaciones, donde la técnica de Elisa puede arrojar errores, como es el caso de terneros
menores de 6 meses puesto que con la técnica de Elisa pueden resultar falsos positivos debido
al consumo de calostro de una madre infectada, o el caso de vacas gestantes en el periodo de
periparto, que pueden resultar falsos negativos debido a la inmunodepresión que se genera. Por
esta razón, se recomienda este mismo tipo de estudios comparativos en vacas gestantes, para
establecer el porcentaje de posibles falsos negativos a ELISA en el periparto.
34
Se recomienda capacitar a los operarios de las fincas a cerca de la enfermedad para de esta
forma evitar las diferentes formas de transmisión y disminuir la presencia de la enfermedad en
las finca.
35
7. BIBLIOGRAFÍA
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43
8. ANEXOS
# ID ht Hb Leuco % Linf # linf
G. rojos x10"6/ul
Plaquet x10"3/ul S/N% ELISA PCR
1 525 34 10,2 9900 54 5346 6,86 260 3,8 POSITIVO NEGATIVO
2 462 32 9,6 12380 52 6438 7,82 160 86,9 NEGATIVO NEGATIVO
3 532 33 9,8 28640 75 21480 8,04 135 2 POSITIVO NEGATIVO
4 524 32 9,6 9920 49 4860 7,17 57 107 NEGATIVO NEGATIVO
5 413 34 10,4 8920 51 4549 6,54 132 91,7 NEGATIVO NEGATIVO
6 505 32 9,4 16330 65 10614 7,85 172 81,3 NEGATIVO NEGATIVO
7 427 33 9,7 13240 78 10327 6,52 224 5,63 POSITIVO NEGATIVO
8 1228 38 12 12080 74 8939 6,12 89 87,2 NEGATIVO NEGATIVO
9 183 32 9,8 15840 82 12988 7,1 180 2,7 POSITIVO NEGATIVO
10 395 34 10 8240 55 4532 6,43 181 94 NEGATIVO NEGATIVO
11 540 34 10,4 8480 48 4070 7,3 146 106 NEGATIVO NEGATIVO
12 533 36 10,7 8610 49 4218 7,31 337 87,3 NEGATIVO NEGATIVO
13 513 36 10,6 12420 58 7203 6,34 188 84,8 NEGATIVO NEGATIVO
14 438 28 9,2 21210 27 5726 6,57 158 88,7 NEGATIVO NEGATIVO
15 526 34 10,2 16280 52 8465 7,82 186 90,5 NEGATIVO NEGATIVO
16 491 38 11,8 7710 53 4086 8,25 115 85,1 NEGATIVO NEGATIVO
17 536 32 9,6 12800 58 7424 6,36 188 78,8 NEGATIVO NEGATIVO
18 367 33 9,6 5930 40 2372 6,94 279 77,9 NEGATIVO NEGATIVO
19 1213 34 10,7 20940 75 15705 6,24 96 3,7 POSITIVO NEGATIVO
20 1164 32 9,8 14620 48 7017 7,45 198 92,5 NEGATIVO NEGATIVO
21 1119 30 9,6 12870 65 8366 6,79 317 81 NEGATIVO NEGATIVO
22 551 40 12,6 10230 59 6035 7,29 122 81,1 NEGATIVO NEGATIVO
23 999 39 12 20700 59 12213 7,85 156 2 POSITIVO POSITIVO
24 1216 38 12,2 8060 56 4513 8,4 156 97,8 NEGATIVO NEGATIVO
25 9563 33 10,2 10440 58 6055 7,34 93 91,2 NEGATIVO NEGATIVO
26 593 35 10,6 16260 41 6666 8,44 431 89,8 NEGATIVO NEGATIVO
27 490 38 12 11240 56 6294 6,82 268 90,4 NEGATIVO NEGATIVO
28 1255 37 11,1 21990 73 16052 8,18 119 4 POSITIVO POSITIVO
29 553 33 9,6 10220 49 5007 7,28 286 96,5 NEGATIVO NEGATIVO
30 1167 34 10,7 14200 52 7384 7,17 138 76,2 NEGATIVO NEGATIVO
31 488 32 9,8 22340 54 12063 6,28 134 2,3 POSITIVO POSITIVO
32 567 33 10,1 10430 58 6049 7,2 210 82,2 NEGATIVO NEGATIVO
33 530 34 10,6 13240 63 8341 6,78 192 88,7 NEGATIVO NEGATIVO
34 563 36 11,1 15160 55 8338 8,03 191 93,6 NEGATIVO NEGATIVO
35 566 39 12,7 12730 55 7001 8,42 189 81,3 NEGATIVO NEGATIVO
36 511 40 12,4 6420 42 2696 7,2 212 80,2 NEGATIVO NEGATIVO
37 1200 35 10,6 15670 84 13162 6,95 188 3,14 POSITIVO POSITIVO
38 561 30 9,8 6480 60 3888 7,25 212 87,5 NEGATIVO NEGATIVO
39 333 35 10,4 18420 40 7368 6,72 196 86,4 NEGATIVO NEGATIVO
44
40 1254 37 11,7 12090 73 8825 7,44 212 89,3 NEGATIVO NEGATIVO
41 370 32 9,7 10620 48 5097 6,54 138 87,6 NEGATIVO NEGATIVO
42 9595 33 9,9 12860 80 10288 7,58 258 7,86 POSITIVO POSITIVO
43 589 34 10,9 15950 67 10686 8,25 224 81,5 NEGATIVO NEGATIVO
44 9592 34 10,5 30460 77 23454 7,22 225 2,35 POSITIVO POSITIVO
45 74 35 10,4 12590 50 6295 7,03 149 88,7 NEGATIVO NEGATIVO
46 510 34 10,7 8640 55 4752 8,16 120 91,4 NEGATIVO NEGATIVO
47 570 34 10,6 10240 53 5427 8,3 180 88,8 NEGATIVO NEGATIVO
48 473 37 11,3 12920 42 5426 7,18 142 91,7 NEGATIVO NEGATIVO
49 576 33 10,3 9700 56 5432 6,54 135 2,57 POSITIVO POSITIVO
50 572 32 9,5 10920 48 5241 6,95 190 98,8 NEGATIVO NEGATIVO
ESTADISTICA REALIZADA
Statistix 8.0 datos leucosis, 30/10/2017,
8:13:53
Descriptive Statistics
Hematocri Hemoglobi globblan gr plaqueta
N 50 50 50 50 50
Mean 34.340 10.534 13372 7.2522 185.28
SD 2.6156 0.9138 5274.3 0.6572 68.216
Variance 6.8412 0.8349 2.782E+07 0.4320 4653.4
SE Mean 0.3699 0.1292 745.90 0.0929 9.6472
C.V. 7.6167 8.6743 39.444 9.0625 36.818
Minimum 28.000 9.2000 5930.0 6.1200 57.000
Maximum 40.000 12.700 30460 8.4400 431.00
porlin
N 50
Mean 57.420
SD 12.271
Variance 150.58
SE Mean 1.7354
C.V. 21.370
Minimum 27.000
Maximum 84.000
Statistix 8.0 datos leucosis, 30/10/2017,
8:14:27
Descriptive Statistics for ELISA = NEGATIVO
Hematocri Hemoglobi globblan gr plaqueta
N 38 38 38 38 38
Mean 34.421 10.587 11745 7.2961 188.26
SD 2.7864 0.9785 3426.9 0.6548 72.184
Variance 7.7639 0.9574 1.174E+07 0.4288 5210.5
45
SE Mean 0.4520 0.1587 555.92 0.1062 11.710
C.V. 8.0950 9.2423 29.178 8.9747 38.342
Minimum 28.000 9.2000 5930.0 6.1200 57.000
Maximum 40.000 12.700 21210 8.4400 431.00
porlin
N 38
Mean 53.263
SD 9.3076
Variance 86.632
SE Mean 1.5099
C.V. 17.475
Minimum 27.000
Maximum 74.000
Descriptive Statistics for ELISA = POSITIVO
Hematocri Hemoglobi globblan gr plaqueta
N 12 12 12 12 12
Mean 34.083 10.367 18523 7.1133 175.83
SD 2.0652 0.6773 6806.0 0.6740 55.448
Variance 4.2652 0.4588 4.632E+07 0.4543 3074.5
SE Mean 0.5962 0.1955 1964.7 0.1946 16.007
C.V. 6.0593 6.5338 36.743 9.4754 31.535
Minimum 32.000 9.7000 9700.0 6.2400 96.000
Maximum 39.000 12.000 30460 8.1800 260.00
porlin
N 12
Mean 70.583
SD 11.429
Variance 130.63
SE Mean 3.2994
C.V. 16.193
Minimum 54.000
Maximum 84.000
Statistix 8.0 datos leucosis, 30/10/2017,
8:15:21
Descriptive Statistics for PCR = NEGATIVO
Hematocri Hemoglobi globblan gr plaqueta
N 43 43 43 43 43
Mean 34.279 10.523 12439 7.2560 187.19
SD 2.6577 0.9441 4381.3 0.6600 70.808
Variance 7.0631 0.8914 1.920E+07 0.4356 5013.8
SE Mean 0.4053 0.1440 668.14 0.1006 10.798
C.V. 7.7530 8.9717 35.223 9.0958 37.828
Minimum 28.000 9.2000 5930.0 6.1200 57.000
Maximum 40.000 12.700 28640 8.4400 431.00
porlin
N 43
Mean 55.535
46
SD 11.304
Variance 127.78
SE Mean 1.7238
C.V. 20.355
Minimum 27.000
Maximum 82.000
Descriptive Statistics for PCR = POSITIVO
Hematocri Hemoglobi globblan gr plaqueta
N 7 7 7 7 7
Mean 34.714 10.600 19103 7.2286 173.57
SD 2.4976 0.7572 6946.5 0.6912 52.156
Variance 6.2381 0.5733 4.825E+07 0.4777 2720.3
SE Mean 0.9440 0.2862 2625.5 0.2612 19.713
C.V. 7.1948 7.1433 36.364 9.5620 30.049
Minimum 32.000 9.8000 9700.0 6.2800 119.00
Maximum 39.000 12.000 30460 8.1800 258.00
porlin
N 7
Mean 69.000
SD 12.383
Variance 153.33
SE Mean 4.6803
C.V. 17.946
Minimum 54.000
Maximum 84.000
Statistix 8.0 datos leucosis, 30/10/2017,
8:16:46
Two-Sample T Tests for Hematocri by ELISA
ELISA Mean N SD SE
NEGATIVO 34.421 38 2.7864 0.4520
POSITIVO 34.083 12 2.0652 0.5962
Difference 0.3377
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances 0.39 48 0.7008 -1.4190 2.0945
Unequal Variances 0.45 24.8 0.6556 -1.2036 1.8791
Test for Equality F DF P
of Variances 1.82 37,11 0.1439
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for Hemoglobi by ELISA
ELISA Mean N SD SE
47
NEGATIVO 10.587 38 0.9785 0.1587
POSITIVO 10.367 12 0.6773 0.1955
Difference 0.2202
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances 0.72 48 0.4725 -0.3912 0.8315
Unequal Variances 0.87 26.8 0.3897 -0.2967 0.7371
Test for Equality F DF P
of Variances 2.09 37,11 0.0957
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for globblan by ELISA
ELISA Mean N SD SE
NEGATIVO 11745 38 3426.9 555.92
POSITIVO 18523 12 6806.0 1964.7
Difference -6778.6
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances -4.62 48 0.0000 -9731.3 -3825.9
Unequal Variances -3.32 12.8 0.0056 -11197 -2360.7
Test for Equality F DF P
of Variances 3.94 11,37 0.0008
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for gr by ELISA
ELISA Mean N SD SE
NEGATIVO 7.2961 38 0.6548 0.1062
POSITIVO 7.1133 12 0.6740 0.1946
Difference 0.1827
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances 0.84 48 0.4067 -0.2562 0.6216
Unequal Variances 0.82 18.1 0.4205 -0.2829 0.6483
Test for Equality F DF P
of Variances 1.06 11,37 0.4182
Cases Included 50 Missing Cases 0
48
Two-Sample T Tests for numlif by ELISA
ELISA Mean N SD SE
NEGATIVO 6217.4 38 1961.4 318.19
POSITIVO 13209 12 5470.5 1579.2
Difference -6991.7
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances -6.74 48 0.0000 -9078.5 -4905.0
Unequal Variances -4.34 11.9 0.0010 -10505 -3478.7
Test for Equality F DF P
of Variances 7.78 11,37 0.0000
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for plaqueta by ELISA
ELISA Mean N SD SE
NEGATIVO 188.26 38 72.184 11.710
POSITIVO 175.83 12 55.448 16.007
Difference 12.430
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances 0.55 48 0.5874 -33.316 58.176
Unequal Variances 0.63 23.9 0.5368 -28.512 53.372
Test for Equality F DF P
of Variances 1.69 37,11 0.1755
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for porlin by ELISA
ELISA Mean N SD SE
NEGATIVO 53.263 38 9.3076 1.5099
POSITIVO 70.583 12 11.429 3.2994
Difference -17.320
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances -5.32 48 0.0000 -23.868 -10.773
Unequal Variances -4.77 15.9 0.0002 -25.017 -9.6236
Test for Equality F DF P
of Variances 1.51 11,37 0.1702
49
Cases Included 50 Missing Cases 0
Statistix 8.0 datos leucosis, 30/10/2017,
8:18:19
Two-Sample T Tests for Hematocri by PCR
PCR Mean N SD SE
NEGATIVO 34.279 43 2.6577 0.4053
POSITIVO 34.714 7 2.4976 0.9440
Difference -0.4352
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances -0.40 48 0.6875 -2.5971 1.7267
Unequal Variances -0.42 8.4 0.6825 -2.7859 1.9155
Test for Equality F DF P
of Variances 1.13 42,6 0.4844
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for Hemoglobi by PCR
PCR Mean N SD SE
NEGATIVO 10.523 43 0.9441 0.1440
POSITIVO 10.600 7 0.7572 0.2862
Difference -0.0767
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances -0.20 48 0.8392 -0.8330 0.6795
Unequal Variances -0.24 9.3 0.8159 -0.7975 0.6440
Test for Equality F DF P
of Variances 1.55 42,6 0.3049
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for globblan by PCR
PCR Mean N SD SE
NEGATIVO 12439 43 4381.3 668.14
POSITIVO 19103 7 6946.5 2625.5
Difference -6664.3
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
50
Equal Variances -3.42 48 0.0013 -10580 -2748.9
Unequal Variances -2.46 6.8 0.0445 -13109 -219.24
Test for Equality F DF P
of Variances 2.51 6,42 0.0361
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for gr by PCR
PCR Mean N SD SE
NEGATIVO 7.2560 43 0.6600 0.1006
POSITIVO 7.2286 7 0.6912 0.2612
Difference 0.0275
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances 0.10 48 0.9196 -0.5166 0.5716
Unequal Variances 0.10 7.9 0.9243 -0.6197 0.6747
Test for Equality F DF P
of Variances 1.10 6,42 0.3803
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for numlif by PCR
PCR Mean N SD SE
NEGATIVO 7025.8 43 3452.7 526.54
POSITIVO 13238 7 5543.1 2095.1
Difference -6211.9
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances -4.03 48 0.0002 -9307.8 -3116.1
Unequal Variances -2.88 6.8 0.0247 -11354 -1069.6
Test for Equality F DF P
of Variances 2.58 6,42 0.0323
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for plaqueta by PCR
PCR Mean N SD SE
NEGATIVO 187.19 43 70.808 10.798
POSITIVO 173.57 7 52.156 19.713
Difference 13.615
Null Hypothesis: difference = 0
51
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances 0.49 48 0.6293 -42.728 69.957
Unequal Variances 0.61 10.0 0.5582 -36.459 63.688
Test for Equality F DF P
of Variances 1.84 42,6 0.2272
Cases Included 50 Missing Cases 0
Two-Sample T Tests for porlin by PCR
PCR Mean N SD SE
NEGATIVO 55.535 43 11.304 1.7238
POSITIVO 69.000 7 12.383 4.6803
Difference -13.465
Null Hypothesis: difference = 0
Alternative Hyp: difference <> 0
95% CI for Difference
Assumption T DF P Lower Upper
Equal Variances -2.89 48 0.0058 -22.843 -4.0868
Unequal Variances -2.70 7.7 0.0280 -25.040 -1.8901
Test for Equality F DF P
of Variances 1.20 6,42 0.3252
Cases Included 50 Missing Cases 0
PCR