CROMATOGRAFÍACROMATOGRAFÍALa cromatografía es una técnica que permite separar, La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla. aislar e identificar los componentes de una mezcla.
Debe existir una fase estacionaria y una fase móvil, Debe existir una fase estacionaria y una fase móvil, la muestra se distribuye en ambas fases y sus la muestra se distribuye en ambas fases y sus
componentes son retenidos selectivamente por la componentes son retenidos selectivamente por la fase estacionariafase estacionaria
La fase estacionariaLa fase estacionaria puede ser un sólido poroso, un puede ser un sólido poroso, un líquido en un soporte sólidolíquido en un soporte sólido
Las fases móvilesLas fases móviles pueden ser líquidos o gases pueden ser líquidos o gases y y fluidos supercriticosfluidos supercriticos
CLASIFICACIÓNCLASIFICACIÓNSegún la fase móvil : • Líquida• Gas, • Fluidos supercríticos
Según la técnica: • Papel• Capa fina• Columna
Según la muestra : Preparativa y Analítica
CromatogramaCromatograma
DEFINICIONESDEFINICIONES• Tiempo de retención (tr). • Tiempo muerto (tm)• Tiempo de retención corregido (tr)• Factor de capacidad o retención móvil, es
adimensional y se define como: K• Factor o Coeficiente de distribución o Reparto
(K). Es K = Kx Siendo la relación de fases, = ml de la fase móvil / ml de la fase estacionaria• Número de platos teóricos N = 16(tr/w)2 • Altura equivalente de plato teórico AEPT= L/N
tm
tmtrK
Cromatografía en papelCromatografía en papel
Cromatografía capa finaCromatografía capa fina
CROMATOGRAFIA LIQUIDA CROMATOGRAFIA LIQUIDA ALTA RESOLUCIÓN HPLCALTA RESOLUCIÓN HPLC
FASE MOVILFASE MOVIL• Disponible comercialmente• Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos
con productos de calidad de pureza cromatográfica• Disolver la muestra No degradar la fase
estacionaria y No reaccionar con ella• Miscible con otros solventes para formar mezclas
útiles • Tener baja viscosidad para reducir las caídas de
presión • Ser compatible con el detector utilizado.
FASES MÓVILESFASES MÓVILES
Fase MWBP[°C]
R.I. [nm] UV [nm]Viscos.
[cP]µ[Debye]
Acetonitrile 41 82 1.341 195 .358 3.37
Dioxane 88 101 1.421 215 1.26 0.45
Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68
Methanol 32 65 1.326 205 .584 1.66
Isopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68
Tetrahydrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70
Water 18 100 1.333 185 1.00 1.84
Métodos de Filtración de Solventes en Métodos de Filtración de Solventes en HPLCHPLC
Filtro a la Entrada del Solvente
Filtración al Vacío
Filtración en Línea
Métodos de Desgasificación de Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLCSolventes en HPLC
• Sonificación
• Burbujear Helio
• Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo
Válvula de InyecciónVálvula de Inyección
Loop de inyección en dos posiciones
SISTEMA DE INYECCIONSISTEMA DE INYECCION
Este sistema debe cumplir:• Introducir volúmenes pequeños y
reproducibles de muestra. • Originar la menor dispersión física
posible a fin de evitar ensanchamiento de picos.
• No debe interrumpir el flujo, y no debe variar momentáneamente la presión y el caudal.
SISTEMAS DE BOMBEOSISTEMAS DE BOMBEO
• Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
• Mantener el flujo libre de pulsaciones • Generar intervalos de caudales de flujo
(0,1 a 10 ml/min) • Control y reproducibilidad del flujo de
solvente • Componentes de la bomba resistentes a
la corrosión
Sistemas de BombeoSistemas de Bombeo
Mecánico:
• Reciprocantes (Pistón) generan altas presiones 500 a 5000 psi .
• Desplazamiento continuo
Neumático.
EMPAQUEEMPAQUESS
• Sólido: Sílica Polímero AmorfoPolímero cargadoAzúcares
• Líquido enlazado: ResinaGlicól.
• Quimicamente enlazada: Grupos SilanolesC8, C18, CN, NH.
FORMA DEL EMPAQUE.FORMA DEL EMPAQUE.
Micropartículas Esféricas menores de 10 micras
Macropartículas Esféricas mayores de 10 micras
Películas de Esferas recubiertas de micropartículas
SISTEMA DE DETECCIÓNSISTEMA DE DETECCIÓN• Todas las técnicas instrumentales que
sean compatibles con el sistema cromatográfico, las más utilizadas son:
• UV-VIS• Indice de refracción• Conductimetria• IR• RMN• Fluorescencia
Sistema de RegistroSistema de Registro
• Generalmente proporcionan una carta en función de la señal vs tiempo de elución.
• Además reportan tr área del pico, % del área A total.
• Parámetros a fijar en la carta • Velocidad de la carta• Atenuación• Supresión• Punto inicial de inyección• Marcas de pico.
FenómenosFenómenos
• Adsorción
• Reparto
• Intercambio iónico
• Filtración por tamaños moleculares
Cromatografía LíquidaCromatografía Líquida• Partición normal FM es menos polar que FE
• Partición en fase reversa FM es más polar que FE
• Adsorción. Competencia de las moléculas de la muestra y de la fase móvil por los sitios activos del sólido.
• La actividad superficial del sólido se ve afectada por la retención de ciertas moléculas de alta polaridad.
• Intercambio iónico Aniónica• Catiónica• Cromatografía liq. de exclusión por tamaños.
Cromatografía de permeación o filtración según tamaños de las moléculas
OptimizarOptimizar
• Buena Resolución R cerca de 1,5
• Mínimo cambio de Presión
• Tiempo de Análisis Corto
• Alta eficiencia
Orden para optimizarOrden para optimizar
Cambio de polaridad de la fase móvil
Cambio de flujo
Cambios de pH, salinidad, T, viscosidad
Cambiar columna
Efecto tipo de columnaEfecto tipo de columna