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CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN
1.1 Formulación del problema
Hasta la fecha son escasos los estudios sobre cianobacterias
heterocísticas fijadoras de nitrógeno en el país (Santamaría y Koch, 1990;
Freiberg y Koch, 1999) y ninguno sobre la taxonomía de este tipo de
microorganismos ligados a Polylepis pauta. Considerando la necesidad de
nombrar a las especies adecuadamente en tratados ecológicos o
experimentales y la importancia del rol que tienen las cianobacterias fijadoras
de nitrógeno, se analizaron las características morfológicas de tres cianofíceas
precedentes de esta especie leñosa cuya población se está deteriorando,
comprometiendo así a la microbiota que mantiene ligada; la determinación de
estos organismos en condiciones naturales es generalmente complicada; sin
embargo, al mismo tiempo, en la era moderna de la taxonomía molecular, es
indispensable tener un germoplasma bien caracterizado basado en atributos
morfológicos y fisiológicos que pueda servir como un punto de partida para
proyectos de secuenciación de genoma. Es así que la necesidad de la
taxonomía basada en la combinación de datos morfológicos y moleculares se
ha hecho mayor en los últimos años (Pereira et al., 2005; Nayak et al., 2007).
El manejo de cultivos microalgales demanda de ciertos parámetros
clave a considerarse (Abalde, 1995), las ventajas que se tiene al trabajar con
especies endémicas contempla la facilidad del suministro de condiciones
ambientales y una producción sostenible, sin embargo el desconocimiento del
manejo apropiado de estos microorganismos dificulta la apropiada explotación
de su gran variedad de metabolitos, que podrían aprovecharse en países en
desarrollo como el nuestro donde la desnutrición y la accesibilidad a los
alimentos representa un grave problema y las opciones para conseguir y
producir proteína a bajo costo son limitadas por varias circunstancias.
La composición proteínica de las cianobacterias podría utilizarse en la
industria alimenticia, en la acuicultura, en la alimentación de ganado bovino e
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industria farmacéutica (Olaizola, 2003). Es por esto precisamente que es de
gran importancia establecer las condiciones a nivel de laboratorio para la
producción adecuada de microalgas con perspectivas a un escalamiento.
1.2 Justificación del problema:
Las cianobacterias son microorganismos fotosintéticos con una gran
variabilidad morfológica y estructural, debido a que han desarrollado
estrategias ecofisiológicas de adaptación a diferentes condiciones ambientales
de temperatura, humedad, salinidad, irradiación solar y pH (Houmar, 1994;
Mann, 1994; Whitton y Potts, 2000). De igual manera, estas características
implican su amplia versatilidad metabólica; por lo cual le confieren interés en
biotecnología como productoras de metabolitos de interés comercial (Guerrero,
1992; Otero et al., 1997; Fábregas et al., 1998).
El presente trabajo realiza un aporte al escaso inventario de la
microbiota ligada al páramo de Papallacta, además pretende crear una
referencia para cultivar estas cianobacterias con un equilibrado aporte de
nutrientes y condiciones de luz necesarias para que estas puedan desarrollarse
y aprovecharse de forma rentable en la industria.
Las cianobacterias son utilizadas en la alimentación humana y animal,
obtención de metabolitos primarios y secundarios de alta calidad,
biorremediación de suelos y aguas residuales, absorción de metales pesados e
hidrocarburos, entre otras aplicaciones (Kosaric et al., 1974; Fabregas et al.,
1984; Lau et al., 1995). Varios géneros representantes de las cianobacterias
son una fuente rica en proteínas, aminoácidos, vitaminas, minerales y otros
nutrientes por lo que uno de sus principales usos es como suplemento
alimenticio en diferentes presentaciones (Sasson, 1997; Laboratorios Almar,
2004).
En general, la mayoría de los sistemas de cultivo masivo son limitados
por la luz (Yun y Park 2001). Por lo tanto, comprender la dependencia de la luz
en la actividad metabólica de microalgas y cianobacterias es de gran
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importancia para la producción de estos microorganismos (Marsh y Weinstein
1966).
Con el fin de mejorar la eficiencia en cuanto a la producción de
pigmentos, proteínas o de metabolitos con actividad biológica, es preciso
optimizar el crecimiento de las cianobacterias en función de ciertos parámetros
importantes como la temperatura, irradiancia, salinidad, agitación,
concentración y naturaleza de nutrientes en condiciones de laboratorio, se ha
considerado necesario analizar aspectos fundamentales como el tiempo de
generación y producción proteica bajo diferentes condiciones de nitrógeno e
irradiancia, factores de gran interés tanto en la industria acuícola, de nutrición y
dietética.
Para el estudio se utilizarán tres cianobacterias obtenidas del Proyecto
“Aislamiento, purificación y caracterización de cianobacterias procedentes de
bosques nativos de Polylepis pauta para su aplicación en reforestación,
recuperación de suelos y extracción de metabolitos primarios y secundarios”
financiados por la Escuela Politécnica del Ejército.
El presente trabajo reporta las características morfológicas mediante
clave microscópica de tres cianobacterias procedentes de la filósfera de
bosques nativos de Polylepis pauta del páramo de Papallacta y el efecto de la
concentración de nitrato, de la irradiancia y de dos tipos de medio de cultivo
sobre su crecimiento y producción de proteína total, bajo las condiciones de los
laboratorios de la Carrera de Ingeniería en Biotecnología, estableciendo de
esta manera un precedente para un cultivo industrialmente rentable.
1.3 Objetivos de la investigación.
1.3.1 Objetivo General
Caracterizar tres cianobacterias aisladas del área foliar de Polylepis
pauta del páramo de Papallacta mediante clave microscópica, tiempo de
generación y producción de proteína total según fuente de nitrógeno, luz y
medio de cultivo.
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1.3.2 Objetivos Específicos 1.3.2.1 Cultivar biomasa suficiente de cada una de las tres cianobacterias para
llevar a cabo la experimentación. 1.3.2.2 Caracterizar microscópicamente a las tres cianobacterias mediante la
clave de Bergey’s, Anagnóstidis & Komárek y Desikachary. 1.3.2.3 Determinar el crecimiento de las tres cianobacterias mediante curvas
de cinética. 1.3.2.4 Establecer un medio de cultivo recomendable, la concentración óptima
de nitratos y luminiscencia para la generación de proteína total (µg/mL)
de las tres cianobacterias.
1.4 Marco Teórico
1.4.1 Introducción a las cianobacterias
La aseveración de que las algas verde-azules (cianobacterias) son
bacterias y no algas ha llevado a conceptos alternativos para los dos últimos
términos. Bacteria es ahora frecuentemente utilizado para designar el reino
procariote que incluye las algas verde-azules, mientras que en otros contextos
representa específicamente a aquellos procariotes que no son verde-azules. El
término alga, no tienen implicación biosistemática; abarca muchos linajes
filogenéticamente independientes caracterizados por la evolución de la
fotosíntesis oxigénica (Stanier & Cohen-Bazire, 1977; Sanders, 2004).
En el primer volumen de la segunda edición del manual de Bergey’s se
trata al dominio Archaea, y a las bacterias fototróficas como las Cianobacterias.
Las propiedades empleadas para la diferenciación son: características
morfológicas microscópicas, morfología de las colonias y pigmentación,
condiciones de crecimiento y nutrición, fisiología y metabolismo, características
genéticas, plásmidos y bacteriófagos, estructura antigénica, patogenicidad y
ecología.
Los procariotes fotosintéticos oxigénicos comprenden una taxonomía
simple y un grupo filogenético, cuya característica principal que los define es la
presencia de dos fotosistemas (PSII y PSI) además del uso del agua como
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fotoreductor en la fotosíntesis, aunque la quimio y fotoheterotrofía facultativa
puede ocurrir en algunas especies o cepas, todos los miembros conocidos son
fotoautótrofos, capaces de utilizar el CO2 como la principal fuente de carbono
celular (Boone and Castenholz, 2001).
1.4.1.1 Diferencias entre las cianobacterias y las microalgas En un sentido amplio y desde el punto de vista biotecnológico, el
término microalga se refiere a aquellos microorganismos que contienen clorofila
a y otros pigmentos fotosintéticos, capaces de realizar fotosíntesis oxigénica.
El término microalga no tiene sentido taxonómico aunque el término alga
alguna vez pudo haberlo tenido. Fuentes modernas han enfatizado mucho que
alga denota un grado ecológico estructural y no una entidad biosistemática, el
término alga no tiene implicaciones filogenéticas y dentro del mismo se
incluyen organismos con dos tipos celulares distintos: cianobacterias que
tienen estructura celular procariota, y las restantes microalgas con estructura
celular eucariota (Abalde, 1995; Sanders, 2004).
Las microalgas son un grupo extremadamente heterogéneo de
organismos. Para ser llamado microalga, el organismo necesita ser pequeño
(usualmente microscópico), unicelular (pero puede formar colonias con una
pequeña o sin diferenciación de células), con mucho color (debido a los
pigmentos fotosintéticos y accesorios), aparecer frecuentemente en el agua
(pero no necesariamente) y más probablemente ser fotoautotrófico (pero no
necesariamente todo el tiempo). Filogenéticamente, las microalgas pueden ser
procariotas o eucariotas. Esta gran diversidad hace de las microalgas, como
grupo, una fuente potencialmente rica en una inmensa serie de metabolitos
(Olaizola, 2003).
1.4.2 Clasificación y filogenia
Los sistemas taxonómicos para organismos biológicos son jerárquicos.
La unidad más inclusiva de clasificación es el dominio, después el reino,
seguido del phylum (o división), clase, orden, familia, género, especie y
subespecie. Un rango adicional bajo el nivel de subespecie es el patotipo,
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serotipo o biotipo que se añade cuando se desea distinguir una cepa de un
carácter especial que esta posee (Glazer and Hiroshi, 2007).
El taxón género es una categoría taxonómica que se ubica entre la
familia y la especie; es un grupo que reúne a varias especies emparentadas.
Varios géneros pueden agruparse en Supergéneros; y también los individuos
de un género pueden organizarse en Subgéneros. Estos, a su vez, pueden
organizarse en Infragéneros (Sanders, 2004).
El taxón especie se constitute por todos los individuos con
características estructurales, funcionales, genéticas y comportamentales
semejantes, se reproducen entre ellos y origina una descendencia fértil y que
tienen una misma ascendencia (Sanders, 2004).
Para la delimitación de los géneros de cianobacterias, los especialistas
han seguido dos caminos: (a) Conservar géneros “pequeños” (Anagnóstidis y
Komárek, 1985), (b) Juntar muchas especies dentro de pocos géneros
(Bourrelly, 1985). Al parecer la primera opción es la más práctica, sin embargo,
la información sobre las características genéticas y de cultivo son insuficientes
para seguir este camino.
Estos géneros grandes tienen la intención de servir como vehículos
temporales para varios grupos de especies, ecotipos o cepas (Boone and
Castenholz, 2001). En el siguiente cuadro (Cuadro 1.1) se muestran algunos
géneros de cianobacterias agrupados en unicelulares y filamentosas con sus
principales características y lugares de procedencia.
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Cuadro 1.1. Grupos morfológicos y géneros representativos de cianobacterias
planctónicas marinas, con sus características (Modificado de Whitton y Potts,
2000). lógicos y géneros res planctónicas marinas, fijadoras de nitrógeno con sus
caracterís
GRUPOS GÉNEROS FIJADORAS DE N2 CARACTERÍSTICAS
Unicelulares
(Solitarias) Synechococcus Prochlorococcus
La mayoría (-)
Solitaria, común en océanos oligotróficos, pueden formar
“blooms” en aguas hipersalinas.
Solitarias
Synechosystis (-) Solitarias, formando “blooms” en lagunas y bahías hipersalinas
Aphanothece Algunas (+)
Solitarias, ficocoplanctónicas, oligoalinas
(Coloniales) Merismopedia (-) ? Prefieren aguas enriquecidas con nutrientes
Filamentosas
(no heterocísticas)
Lyngbya Algunas (+)
Agregados, frecuentemente asociados con protistas, metazoos.
Oscillatoria Algunas (+)
Unas pocas reportadas en “blooms”, algunas asociadas con macroalgas y plantas superiores
Phormidium (-) Solitarias, y asociadas con otros protistas.
Spirulina (-) Solitaria, hipersalina y agua enriquecida con nutrientes
Trichodesmium (+) Agregadas forman “blooms” en aguas tropicales y subtropicales asociadas con protistas.
(heterocísticas)
Anabaena (+) Solitaria, en lagunas y bahías.
Aphanizomenon (+) Agregados formadores de “blooms” en aguas enriquecidas con nutrientes.
Nodularia (+) Formadores de “blooms” en las costas, aguas enriquecidas con nutrientes.
Richelia (+) Endosimbionte en las diatomeas Rizostenia y Hemiaulus en aguas tropicales y subtropicales.
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1.4.3 Sistemas de clasificación de las cianobacterias.
En primer lugar, el sistema más simple, basado casi por completo en el
limitado número de cianobacterias en cultivo es el de Rippka et al., 1979. Los
criterios para la clasificación incluyen: morfología, modo de reproducción,
ultraestructura, fisiología, química y a veces genética (Boone and Castenholz,
2001). El aislamiento, base de datos e historial de la mayor parte de cepas
incluidas en el Manual de Bergey’s se encuentran en Rippka et al.,1979.
Rippka divide a las cianobacterias en cinco secciones, las dos primeras
secciones, I y II, como "unicelulares”, las células aisladas o formando
agregados coloniales unidas por otras capas de la pared exterior de la célula.
Sus otras tres secciones, de la III a V, son descritas como "filamentosas”,
formadas por tricomas (cadenas de células) que crecen por división intercalar
de las células. La sección I (unicelulares) agrupa cianobacterias que se
reproducen por fisión binaria o por gemación y pueden ser células cilíndricas u
ovoides. En la sección II las cianobacterias unicelulares que se reproducen
solamente por fisión múltiple, la sección III (filamentosas) son cianobacterias
filamentosas no heterocísticas que se dividen en un solo plano, en la sección IV
(filamentosas) cianobacterias heterocísticas que se dividen en un solo plano y
su reproducción se da por la rotura de tricomas al azar, algunas germinan de
acinetos; tricomas vegetativos. La sección V (filamentosas) contiene
cianobacterias heterocísticas filamentosas que se dividen en más de un plano
por la rotura de tricomas al azar, por la formación de hormogonios y (si se
producen) por la germinación de acinetos (Rippka et al.,1979).
En segundo lugar, el simple pero inapropiado sistema de Drouet
(Drouet, 1981) se basa en la morfología de especímenes de herbario, rara vez
utilizadas hoy en día.
Por otro lado, el sistema “Geitlerian” es complejo y se basa casi por
completo en características morfológicas de los especímenes colectados
(Geitler, 1932).
Existe una reevaluación crítica del género “Geitlerian” que aun se basa
en características morfológicas y reproductivas primarias (Bourrelly,1985).
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Además una reciente, extensiva y compleja modificación del sistema
“Geitlerian”, utilizando morfología, ultraestructura, modos de reproducción,
variación y otros criterios de especímenes colectados y cultivados por
Anagnostidis y Komárek con una definición más estrecha de género que en el
sistema de Rippka.
Es demasiado pronto para caracterizar y catalogar especies de
cianobacterias, aunque esto ha sido hecho por autores que continúan utilizando
principalmente características fenotípicas (e.g, Komárek y Anagnóstidis, 1998).
Todas estas clasificaciones tendrán que ser revisadas casi completamente
cuando las comparaciones genéticas estén disponibles (Boone and
Castenholz, 2001).
Debe ser entendido que solamente un número pequeño de géneros de
cianobacterias están representados en cultivos axénicos y/o clonales y muchos
todavía no han sido estudiados con la extensividad suficiente para ser
utilizados en una caracterización; el grado de detalle en las descripciones
genéricas variará considerablemente, dependiendo de la totalidad de los
estudios recientes. El sistema de clasificación y los géneros incluidos aquí
continuarán bajo un largo proceso de revisión y expansión (Boone and
Castenholz, 2001).
Por lo pronto, según la información que se encuentra disponible
actualmente en el Catálogo de Vida 2009 (Bisby et al., 2009) el reino Bacteria
reúne nueve Phyla (Cuadro 1.2), siendo uno de estos el Phylum Cyanobacteria,
esta jerarquía no tiene una clase asignada y contiene siete órdenes, de las
cuales una no ha sido nombrada.
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Cuadro 1.2: Clasificación del Reino Bacteria y del Phylum Cianobacteria
(Catalogue of life: 2009 Annual Checklist on line). Cuadro 1Cuadro 1.2:
Clasificación del Reino Bacteria y del Phylum Cianobacteria
Dentro del Orden de las Chroococcales se encuentran once familias
que se anotan en el Cuadro 1.3
Cuadro 1.3: Clasificación del Orden de las Chroococcales
(Catalogue of life: 2009 Annual Checklist on line). Cuadro 2Cuadro 1.3: Clasificación del Orden de las Chroococcales
Order Chroococcales Family Chamaesiphonaceae
Family Chroococcaceae
Family Dermocarpellaceae
Family Entophysalidaceae
Family Gloeobacteraceae
Family Hydrococcaceae
Family Hyellaceae
Family Merismopediaceae
Family Microcystaceae
Family Synechococcaceae
Family Xenococcaceae
Bacteria Phylum Acidobacteria
Phylum Actinobacteria
Phylum Aquificae
Phylum Bacteroidetes
Phylum Chlamydiae
Phylum Chlorobi
Phylum Chloroflexi
Phylum Chrysiogenetes
Phylum Cyanobacteria No asignada a una clase
Order Beggiatoales
Order Chroococcales
Order Nostocales
Order Oscillatoriales
Order Prochlorales
Order Stigonematales
No asignada a un orden
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Family Entophysalidaceae
Genus Chlorogloea Genus Chlorogloeaopsis Genus Cyanoarbor Genus Entophysalis Genus Lithocapsa Genus Paracapsa Genus Siphononema
La orden de las Nostocales se subdivide en cuatro familias, tal como se
ve en el Cuadro 1.4.
Cuadro 1.4: Clasificación del Orden de las Chroococcales
(Catalogue of life: 2009 Annual Checklist on line). Cuadro 3Clasificación del Orden de las Chroococcales
A continuación los géneros que se encuentran dentro de la familia
Entophysalidaceae, entre ellos Chlorogloeopsis (Chlorogloea) (Cuadro 1.5): Cuadro 4Clasificación de la familia Entophysalidaceae
Cuadro 1.5 Clasificación de la familia Entophysalidaceae
(Catalogue of life: 2009 Annual Checklist on line).
Los géneros que se han asignado dentro de la familia Nostocaceae en esta
clasificación son 18, entre ellos Nostoc, Anabaena, Cylindrospermum,
Nodularia, Richelia, Trichormus (Cuadro 1.6).
Order Nostocales
Family Microchaetaceae
Family Nostocaceae
Family Rivulariaceae
Family Scytonemataceae
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Cuadro 1.6 Clasificación de la familia Entophysalidaceae
(Catalogue of life: 2009 Annual Checklist on line).
Cuadro 5Clasificación de la familia Entophysalidaceae
1.4.4 Características generales de las cianobacterias. La estructura fina de las cianobacterias es bien conocida. Son
organismos fotoautótrofos, que realizan la fotosíntesis con liberación de
oxígeno, presentan clorofila a como pigmento fotosintético primario y
ficobiliproteínas como pigmentos auxiliares (Bryantt, 1986; Whitton y Potts,
2000). Las cianobacterias poseen características únicas que se describen
brevemente a continuación:
1.4.4.1 Envoltura celular. La pared celular en las cianobacterias es del tipo Gram negativo, pero
la capa de peptidoglicano es usualmente más gruesa que en las
proteobacterias Gram negativas, casi siempre entre 1 y 10 nm de grosor. Un
gran número de cianobacterias unicelulares, coloniales y filamentosas poseen
una envoltura en el exterior de la membrana externa, a esta se le conoce como
Family Nostocaceae
Genus Anabaena
Genus Anabaenopsis
Genus Aphanizomenon
Genus Aulosira
Genus Chlorogloeopsis
Genus Cylindrospermopsis
Genus Cylindrospermum
Genus Heterocyanococcus
Genus Hormothamnion
Genus Isocystis
Genus Nodularia
Genus Nostoc
Genus Pseudonostoc
Genus Raphidiopsis
Genus Richelia
Genus Sphaerozyga
Genus Trichormus
Genus Wollea
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matriz, glicocálix o cápsula, o dependiendo de la consistencia como gel,
mucílago o baba y así mismo para cada cepa la composición puede variar en
polisacáridos y polipéptidos (Boone and Castenholz, 2001).
1.4.4.2 División celular La mayoría de las cianobacterias son unicelulares, coloniales y algunas
formas filamentosas se reproducen por fisión binaria, en formas unicelulares y
pseudofilamentosas, la reproducción ocurre por fisiones múltiples internas,
frecuentemente adicional a la fisión binaria en algunas células vegetativas. Las
células que resultan de estas fisiones múltiples se conocen como endosporas.
Dependiendo del resultado de la división celular, se pueden observar
poblaciones unicelulares, si es en más planos y permanecen unidas en la
matriz, se tienen colonias de varias células, si la fisión ocurre en un solo plano
y la separación es incompleta, acontecen cadenas cortas o largas conocidas
como tricomas. Los tricomas incluidos en una matriz, se conocen como
filamentos. Adicionalmente los tricomas se presentan como uniseriados o
multiseriados, si se trata del segundo caso se puede observar ramificaciones
falsas o verdaderas dependiendo del origen de la ramificación (Boone and
Castenholz, 2001; Komárek & Anagnostidis, 1989).
1.4.4.3 Exterior de la célula y motilidad Las fimbrias o pilis aparecen frecuentemente en varias cianobacterias,
aunque los flagelos procarióticos nunca han sido demostrados en ellas. Se ha
descrito motilidad natatoria en tipos unicelulares pequeños según Waterbury et
al., 1985. No se han identificado organelos de propulsión, pero en muchas
formas filamentosas se conoce una motilidad suave (Boone and Castenholz,
2001).
1.4.4.4 Interior de la Célula Aunque no todos los tilacoides en las cianobacterias parecen ser
invaginaciones de la membrana citoplasmática, existen “puntos de adhesión” o
“centros tilacoidales” asociados con la periferie del citoplasma o la membrana
citoplasmática. La mayoría de las cianobacterias poseen ficobilisomas
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hemisféricos o hemidiscoidales, los cuales son complejos agregados de
proteína y pigmentos, estos constan de la mayor parte del complejo de
captación de luz de la mayoría de cianobacterias, los pigmentos que se pueden
encontrar en su interior son: aloficocianina, clorofila a, ficocianina,
ficoeritrocianina y ficoeritrina.
Otros componentes o inclusiones del citoplasma incluyen: gránulos de
glicógeno, de cinanoficina, carboxisomas, polifosfatos, vacuolas de gas y la
región nucleoide (Boone and Castenholz, 2001).
1.4.4.5 Células de especialización y de diferenciación. 1.4.4.5.1 Heterocistos
Las cianobacterias de las subsecciones IV y V producen heterocistos
en los tricomas, en los intervalos o en su término a través de la diferenciación
de las células vegetativas, usualmente aparecen solo después de que la
concentración de nitrógeno inorgánico combinado presente en el medio que
las rodea ha decrecido considerablemente, se definen como células
especializadas que actúan en la fijación de nitrógeno (Boone and Castenholz,
2001).
1.4.4.5.2 Acinetos También conocidos como esporas, son producidos por muchas
cianobacterias de la subsección IV. Muchos, pero no todos los heterocistos de
las cianobacterias producen acinetos, particularmente bajo condiciones de
deficiencia de nutrientes y/o limitaciones de luz, se trata de células vegetativas
diferenciadas, crecen y adquieren una pared gruesa que rodea a la pared
vieja, acumulan cianoficina, glicógeno, lípidos y carotenoides, pero los
polifosfatos desaparecen (Boone and Castenholz, 2001).
.
1.4.4.5.3 Hormogonios Frecuentemente se definen como cadenas cortas de 5-15 células con
diámetros menores a los de las células vegetativas de los tricomas, donde
generalmente ocurre la flotación. La formación y liberación de los hormogonios
15
parece ser un proceso medido en el tiempo asociado con las condiciones
ambientales o con etapas particulares del ciclo morfogenético (Boone and
Castenholz, 2001).
1.4.4.5.4 Terminaciones En algunas bacterias filamentosas, las células terminales pueden ser
altamente diferenciadas en varias formas de estrechamientos o
enganchamientos (Boone and Castenholz, 2001).
1.4.5 Clasificación morfológica. Una correcta tarea de identificación de las cianofíceas es esencial para
hacer frente a cualquier diagnóstico de situación, tarea preventiva, acción de
control o masificación con fines productivos. La identificación clásica de los
representantes del orden Nostocales está basada principalmente en la
morfología de los acinetos y de células vegetativas y en el grado de curvatura
de los tricomas (Komárek, 1958; Desikachary, 1959; Komárek & Anagnostidis,
1989; Baker, 1991; Baker & Fabro, 1999). Sin embargo, algunos de estos
caracteres morfológicos pueden no aparecer definidos o constantes en algunas
poblaciones, debido a la influencia del ambiente en el cual se desarrollan los
tricomas (Argañaraz et al., 2005).
La morfología de las cianobacterias ha sido frecuentemente reportada
como bastante inestable. Las cepas cultivadas de las mismas especies
(morfoespecies) frecuentemente difieren una de otra y muestran una elevada
variabilidad en su morfología, reflejando condiciones de crecimiento diversas
como lo reportan varios autores (Anand, 1988; Lyra et al,. 2001; Nalewajko and
Murphy, 2001; Gugger et al., 2002; Gupta and Agrawal 2006a,b, 2007) en
Zapomělová, 2008.
Komárek & Anagnostidis (1989) han estimado que las características de
más del 50% de las cepas en las colecciones no corresponden a los
diagnósticos en la taxonomía a la cual han sido asignadas, además se sabe
que los registros que tratan cambios morfológicos de las cianobacterias en
16
cultivo son normalmente casuales. Hay sólo unos pocos estudios que tratan
sistemáticamente el efecto de condiciones de crecimiento en la morfología
(Stulp, 1982; Stulp and Stam, 1984).
Aún se consideran varias características morfológicas como estables y
por consiguiente tienen la importancia taxonómica más alta. En el grupo de las
cianobacterias nostocales, están la anchura y la simetría de los tricomas, la
ocurrencia y morfología de los tricomas ramificados, dimensiones y formas de
los acinetos, y posición de los acinetos con respecto a los heterocistos. La
presencia y regularidad del enrollamiento del tricoma son considerados rasgos
específicos de las especies en el género Anabaena (Geitler, 1932; Starmach
1966; Komárek, 1996).
Los principales criterios intergenéricos dentro de la familia Nostocaceae
(Cuadro 1.7) son la posición de los heterocistos (terminales o intercalares) y la
forma de su origen o ausencia; la morfología (simetría) de los filamentos, la
cual depende de la posición de los heterocistos (y a veces también de los
acinetos) en el tricoma, la presencia de tricomas simétricos, subsimétricos o
metaméricos; la posición de los acinetos, el desarrollo paraheterocítico o
apoheterocíticos (Ver glosario de términos Anexo I).
Los mecanismos de control de la formación de los acinetos son más o
menos dependientes de la posición de los heterocistos. Los acinetos
apoheterocíticos se desarrollan principalmente a partir de formas solitarias de
células vegetativas; los acinetos de tipo parahetericítico son normalmente
varias veces más grandes. El tipo de simetría de los tricomas representa un
buen criterio para distinguir el género dentro de la familia Nostocaceae, así
como la polaridad de los tricomas. El tipo de falsa ramificación es
tradicionalmente utilizado para la caracterización de las familias dentro del
orden de las nostocales y los datos experimentales no contradicen estos
criterios (Komárek y Anagnostidis, 1989; Rippka et al., 1979).
17
Cuadro 1.7 Revisión de las principales características diacríticas entre
Anabaena y Nostoc (Komárek y Anagnostidis, 1989). adro 6 Revisión de las
principales características diacríticas entre Anabaena y Nost Característica Anabaena Nostoc.
Origen y posición de los heterocistes Intercalar Intercalar
Estructura de los tricomas Metamérico o subsimétrico Metamérico
Tipo de acineto desarrollado
Paraheterocítico o paraheterocítico distante Apoheterocítico
Características adicionales diacríticas
Mucílago difluyente tricomas solitarios o en
colonias Ciclo de vida especial
1.4.6 Necesidades de cultivo de las cianobacterias. Las cianobacterias requieren condiciones y parámetros básicos para
desarrollarse masivamente, se conoce además que estos parámetros pueden
estar relacionados entre sí modificando la respuesta del metabolismo
microalgal. En sistemas naturales, cuando una microalga tiene éxito en un
ecosistema significa que es suficientemente flexible en sus requerimientos e
interacciones y esta cualidad es muy conveniente cuando se trata de sistemas
de cultivo masivos de una especie de interés (Darley, 1987; Vonshak, 1986).
Según Abalde, para conseguir un cultivo de microalgas en crecimiento
activo se necesita: un inóculo viable de tamaño mínimo, un buen suministro de
nutrientes y microelementos, adecuadas condiciones físico químicas como pH,
temperatura, energía, luz, agitación entre otras.
El hecho de poder fijar las condiciones óptimas para el crecimiento de
una especie de cianobacteria de interés constituye un importante avance para
poder masificar el cultivo y mejor aún si esas condiciones suponen un mínimo
de inversión, ya que en términos de rentabilidad los costos son lo que
realmente interesan.
1.4.7 Influencia del nitrógeno en el desarrollo de cianobacterias. Muchas de las cianobacterias fijan nitrógeno atmosférico como se
había explicado anteriormente, un gran número de ellas lo hacen en
18
condiciones aerobias. Debido a la nitrogenasa, el sistema enzimático complejo
encargado de la fijación de nitrógeno, es extremadamente sensible al oxígeno,
muchas cianobacterias separan ya sea espacial o temporalmente, los procesos
fotosintéticos oxigénicos y la fijación de nitrógeno. Mientras que algunas de las
cianobacterias filamentosas (por ejemplo, de los géneros de Anabaena y
Nostoc) confinan la nitrogenasa a los heterocistos, algunas otras, unicelulares
como filamentosas, expresan la actividad de la nitrogenasa en los períodos de
oscuridad, en los ciclos de crecimiento luz-oscuridad (Herrero et al., 2001;
Capone, 1997).
El nitrato es la fuente más abundante de nitrógeno combinado en
muchos ambientes. Las cianobacterias más investigadas tienen la capacidad
de utilizar esta fuente (Flores et al., 2003). Sin embargo, las cepas marinas del
género Prochlorococcus no pueden utilizar el nitrato (Rocap et al., 2003).
Aunque aparentemente esta es una contradicción debido a que el nitrato es la
mayor fuente de nitrógeno en las aguas profundas de los océanos donde
Prochlorococcus abunda, la limitada irradiación y el elevado costo energético
para su reducción a amonio hace del nitrato una fuente inconveniente para
Prochlorococcus en el fondo del mar (García-Fernández et al., 2004).
1.4.8 Principales vías de asimilación de nitrógeno en las cianobacterias Generalmente la utilización del nitrato requiere que su absorción esté
seguida por una reducción intracelular con la nitrato reductasa (NR) y la nitrito
reductasa (NiR) para producir amonio, el cual luego entra en el ciclo GS-
GOGAT (Anexo J).
La utilización del nitrito procede de una forma similar, excepto que no
se requiere de la actividad de NR. El donador fisiológico de electrones para NR
y NiR, es Fdxred (Flores et al., 2005). Bajo condiciones de crecimiento
fotoautótrofo, la reducción de nitrato y nitrito está acoplada a la evolución
fotosintética del oxígeno in vivo y así puede ser considerado un proceso
fotosintético genuino (Herrero y Flores, 2008).
19
En la Figura 1.1 se esquematizan que las fuentes de nitrógeno
combinado son captados a través de permeasas y metabolizados hasta
amonio, que se incorpora a esqueletos de carbono a través de la glutamina
sintetasa vía glutamato sintasa.
El nitrógeno se distribuye de la glutamina o el glutamato a otros
compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. La reacción de la ureasa libera
dos moléculas de amonio (NH4+) y una molécula de dióxido de carbono (CO2)
por cada molécula de urea degradada (no indicado en la Fig.1.1) la nitrogenasa
(NifHDK) y la ferredoxina específica de heterocistos (FdxH) están en un cuadro
para señalar que en algunas filamentosas la fijación de nitrógeno en las
cianobacterias se realiza en los heterocistos (Flores y Herrero, 2005).
Figura 1Figura 1.1:
Principales vías de asimilació
Figura 1.1: Principales vías de asimilación de nitrógeno en las cianobacterias. NRT, Permeasas tipo ABC transportadoras de nitrito /nitrato;
Urt, tipo ABC - transportador de úrea; Amt, permeasa de amonio; Nar, nitrato
reductasa, Nir, nitrito reductasa; NifHDK, complejo nitrogenasa; FdxH,
ferredoxina específica de heterocistos; PEP carboxilasa, fosfoenolpiruvato
carboxilasa; 2-OG, 2-oxoglutarato; GS, glutamina sintetasa; GOGAT, glutamato
sintasa. (Modificado de Flores & Herrero, 2005).
20
1.4.8.1 Cianoficina La cianoficina es un polipéptido que consiste en aspartato y residuos
de arginina que sólo se encuentra en cianobacterias donde sirve como una
reserva de nitrógeno presente en los heterocistos (Figura 1.2).
La cianoficina normalmente se acumula durante la fase estacionaria
inducida por una falta de nutrientes aparte del nitrógeno, y desaparece
cuando el crecimiento se equilibra (Allen, 1984; Simón, 1987) también se
acumula cuando las células carentes o repletas de nitrógeno tienen acceso a
una fuente de nitrógeno utilizable (Allen & Hutchison, 1980; Lawry & Simon,
1982).ra 2Figura 1.2 Rol de los heterosistes en la fijación de nitrógeno y en la
formación de cianoficina
Figura 1.2 Rol de los heterosistes en la fijación de nitrógeno y en la formación
de cianoficina , modificado de Lawry & Simon, 1982.
En células carentes de nitrógeno a las que se les proporcionó una fuente
nitrogenada, la cianoficina aumentó temporalmente y el crecimiento no
recomenzó hasta que la cianoficina se degradó de nuevo (Allen & Hutchison,
1980). Esto demostró que la cianoficina tiene un metabolismo dinámico bajo
algunas condiciones y simplemente no se metaboliza durante el exponencial a
la transición de la fase estacionaria.
La cianoficina tiene un metabolismo dinámico durante las transiciones
entre los estados metabólicos de deficiencia de nitrógeno, la reposición de
nitrógeno y viceversa. En estudios realizados con A. cylindrica o Synechocystis
21
6308 se sugieren que la cianoficina sirve como un reservorio dinámico que
separa la disponibilidad de nitrógeno ambiental del nitrógeno fijado por la
demanda metabólica celular, que proporciona un mecanismo que permite a las
cianobacterias maximizar su cuota de nitrógeno fijo disponible. Esto daría a las
cianobacterias una ventaja competitiva sobre otros organismos (Mackerras,
1990).
1.4.9 Influencia de la luz en el crecimiento de cianobacterias. Al tratarse de microorganismos fotoautótrofos, la luz que se suministre
a un cultivo de microalgas ya sea a escala de laboratorio o de campo es un
factor determinante a considerar.
Se conoce que la intensidad de la luz tiene un efecto proporcional en el
crecimiento de las microalgas como prueban los estudios realizados por López-
Muñoz et al., 1990. En P. tricornutum, igualmente en los estudios presentados
por Allen y Aron (1955), se indica que bajo buenas condiciones de nutrientes
minerales y con un adecuado suministro de N2 y CO2, Anabaena puede crecer
bien a elevadas intensidades luminosas, y la producción celular se incrementa
con intensidades luminosas más altas, hasta los 16 Kluxes.
La cuestión que se discute es más bien si las microalgas bajo
condiciones de laboratorio controladas crecen mejor cuando se les proporciona
un periodo luz/oscuridad diario, o si el máximo crecimiento por unidad de
tiempo se obtiene cuando las células son iluminadas continuamente. Kaixian,
1993 y Yongmanitchai (1992) han observado mejor crecimiento bajo luz
continua que bajo ciclos de luz oscuridad en cultivos discontinuos, tal como los
cita Fábregas (1995). No obstante, las máximas tasas de crecimiento bajo
iluminación continua no es mucho mayor que la máxima tasa de crecimiento
mantenida en el sistema semicontinuo (Fábregas, 1995).
Sin embargo, con respecto a este punto, en Abalde (1995), se explica
que las células cultivadas bajo periodos de luz oscuridad muestran
características propias para la adaptación a bajas intensidades de luz y mayor
22
eficiencia en la absorción lumínica, si se comparan con células cultivadas bajo
luz continua a la misma intensidad.
Otro dato interesante que se ha descubierto en trabajos donde se ha
empleado bajas intensidades lumínicas en cultivos microalgales a nivel de
laboratorio, es que las microalgas tienden a incrementar hasta diez veces más
la producción de clorofila con el fin de aprovechar de mejor manera la cantidad
de luz que reciben, incrementando así, la eficiencia del sistema; sin embargo
estas células crecen más lentamente (Dubinsky et al., 1986). Se puede
considerar la utilización de diferentes medios tróficos de cultivo para evitar el
suministro parcial o total de luz, como se conoce por trabajos realizados con
Anabaena variabilis ATCC 29413 (Mannan and Pakrasi, 1993). Se comprobó
su crecimiento en completa oscuridad en cultivo heterotrófico, resultando un
notable incremento en el contenido de ficobilina y de unidades del fotosistema
II (PSII).
Así mismo, cuando se cultivó Nostoc flageliforme en medio fototrófico,
mixotrófico y heterotrófico, se obtuvo la mayor cantidad de biomasa (1.67 g/L)
en el cultivo mixotrófico en donde se utilizó glucosa, esta fuente de carbono
cambió la respuesta de las células a la luz. La tasa de fotosíntesis máxima y la
tasa de respiración en la oscuridad fueron mayores que en los medios
fotoautotróficos y heterotróficos; estos resultados apuntan a que los procesos
fotosintéticos en el crecimiento fotoautótrofo y el metabolismo oxidativo de la
glucosa en el crecimiento heterótrofo tienen interacción en el crecimiento
mixotrófico de las células de N. flageliforme (Yu et al., 2008).
1.4.10 Las toxinas procedentes de cianobacterias Los ensayos nutricionales no son suficientes para evaluar una nueva
fuente proteínica, por eso es necesario completar la información con análisis
toxicológicos que garanticen su seguridad. Antes de que un producto pueda ser
comercializado y recomendado para su consumo es necesario que pase una
serie de pruebas toxicológicas minuciosos que comprueben su inocuidad, esto
se aplica en especial a fuentes no convencionales de proteínas, tal como es el
23
caso de las microalgas, en el Anexo A. se indican algunas de las toxinas y sus
propiedades, presentes en varios géneros de cianobacterias (Abalde, 1995). 1.4.11 Metabolitos extraídos de cianobacterias con potencial comercial.
Las microalgas pueden ser utilizadas como una fuente de productos de
elevado valor agregado tales como pigmentos, exopolisacáridos, ácidos
grasos y proteínas. Además, las microalgas son utilizadas en la acuacultura
como fuente de proteínas y ácidos grasos para el cultivo de camarones, los
cultivos axénicos de microalgas con elevadas densidades pueden ser
utilizados para la nutrición de larvas de moluscos (Volkman et al., 1989;
Coutteau et al., 1994; Fábregas et al., 1997).
Hoy en día, el mayor consumidor de astaxantina (pigmento), es la
industria de alimento para salmón, en los 80 y 90`s se identificó a
Haematococcus como un organismo que podía ser cultivado como una rica
fuente de astaxantina con un mercado prontamente identificado (Lorenz, 2000;
Olaizola, 2000; Olaizola 2003).
Se conoce que muchas cianobacterias son capaces de sintetizar una
capa externa viscosa y excretar, al medio de cultivo, material polisacárido
durante el crecimiento celular. Los polisacáridos, fácilmente recuperables del
medio de cultivo, están atrayendo mucho interés, en vista de sus posibles usos
en varias aplicaciones industriales. En términos de la producción de diferentes
polisacáridos, la respuesta de las cianobacterias a los cambios de las
condiciones de cultivo, parecen ser dependientes de la cepa utilizada (De
Philippis y Vincenzini, 1998).
Recientemente, las cianobacterias se han vuelto una fuente atractiva
de clases innovadoras de compuestos farmacológicamente activos mostrando
actividades biológicas que van desde los antibióticos, inmunosupresores,
anticancerígenos, antivirales, antiinflamatorios hasta agentes inhibitorios de
proteinasas.
24
1.4.12 Las cianobacterias en la industria Las microalgas son una fuente rica potencialmente de una vasta lista
de productos químicos, con aplicaciones en la industria alimenticia, cosmética,
farmacéutica y hasta la industria de los combustibles (Olaizola, 2003).
En la universidad de Hawaii, se trabaja en el desarrollo de nuevos
fármacos a partir de una colección de cerca de dos mil cepas de cianobacterias
con una producción de más de cien moléculas bioactivas (Olaizola, 2003). Se
considera que las cianobacterias son una fuente rica de metabolitos de gran
importancia desde un punto de vista biotecnológico e industrial. Algunos de
estos metabolitos secundarios exhiben efectos tóxicos en los organismos
vivientes. Un diverso rango de estas cianotoxinas desempeñan papeles
ecológicos como aleloquímicos y podrían emplearse para el desarrollo
comercial de compuestos con aplicaciones tales como alguicidas, herbicidas e
insecticidas (Rajesh et al., 2009).
Las cianobacterias tienen la capacidad de superar la toxicidad de la
radiación ultravioleta (UVR) por medio de sus compuestos de absorción UV,
como aquellos del tipo de los aminoácidos micosporina y sytonemina (Rajesh
et al., 2009). Éstos metabolitos secundarios son considerados 'multiuso' y
fotoreactantes naturales. En este sentido, ellos pueden ser
biotecnológicamente aprovechados por la industria cosmética, agrícola y
farmacéutica; sin embargo, el desarrollo de los sistemas de producción
microalgal requiere de la solución de muchos problemas fisiológicos y de
bioingeniería (Rajesh et al., 2009; Abalde, 1995).
1.4.13 Proteínas a partir de microalgas. Se consideró a la biomasa microalgal como una alternativa para la
obtención de proteínas que no fuesen de origen animal o vegetal para que
sean consumidas por el ganado o el hombre una vez que concluyó la II Guerra
Mundial; antes el interés se centraba en la masificación para la obtención de
lípidos (Abalde, 1995). Con sus trabajos Spoehr y Milner (1949) en el Carnegie
25
Institute mostraron que la composición de Chlorella, sobre todo su contenido de
grasa y proteína, podía ser manipulada modificando las condiciones de cultivo.
En el mismo trabajo se sugiere que el uso de este tipo de proteínas
podría ayudar a evitar en parte la deficiencia proteica global. Se basan en que
las microalgas tienen un contenido de proteínas en materia bruta de
aproximadamente el 50% y una productividad de 25 Tm/Ha/año.
Durante siglos, en algunas partes del mundo se han utilizado como
alimento humano microalgas producidas con una tecnología primitiva, y se han
establecido apropiadas tecnologías para la producción a gran escala tanto de
microalgas verdes como cianobacterias. Spirulina máxima fue empleada por los
aztecas en alimentación, en forma de bizcochos que se denominaban
“tecuitlatt”, el contenido proteico es asombrosamente alto, llegando al 70% del
peso seco (Abalde, 1995; Olaizola, 2003).
Las aplicaciones microalgales en la acuacultura, industria de alimentos,
y en aplicaciones químicas y ambientales continúan siendo revisadas (Bhrens,
1999; Benemann, 2002).
1.4.14 Cianobacterias de interés industrial.
1.4.15.1 Nostoc. Este tipo de cianobacteria exhibe propiedades estructurales que son
similares a los miembros de Anabaena, (los esquemas de este género se
indican en el Anexo B) los miembros típicos los hormogonios son rectos; los
heterocistos terminales están diferenciados en ambos finales de los
hormogonios maduros; subsecuentemente, el desarrollo da lugar al crecimiento
de tricomas que contienen heterocistos predominantemente intercalados. La
producción de un mucílago o matriz es típica en muchos de sus miembros. Su
reproducción ocurre por fisión binaria; con algunas excepciones, los miembros
de Nostoc están caracterizados por un ciclo de desarrollo.
26
Espíndola (2009) reporta los cambios en la morfología durante el
desarrollo de la cianobacteria con la que trabajó (C15) donde se ve claramente
los enrollamientos que presenta con el pasar de los días. La formación de
acinetos es siempre de forma equidistante entre dos heterocistos. También se
conoce que representantes de Nostoc son los más comúnmente encontrados
formando parte de asociaciones endo o exo simbióticas con ascomicetes (para
formar líquenes); briofitas, pteridofitas, cicadias (Boone and Castenholz, 2001).
1.4.15.2 Anabaena Las especies más representativas pertenecientes a este género, tienen
células en forma cilíndrica o de barril (Anexo B), de dimensiones relativamente
pequeñas (diámetro de 3 a 6 µm). No se halla una matriz firme pero la
producción de mucílago puede ser abundante (Rippka, 2001). El género
Anabaena se estableció por Bory en 1922. Geitler (1932) en su Tratado de
Taxonomía Algal de las verde azules describió 57 especies europeas de
Anabaena, mientras Desikachary (1959) designó 25 especies. En la más
reciente clasificación, el género Anabaena ha sido clasificado bajo la
subdivisión de la familia IV, pero ciertas cepas muestran un alto grado de
similitud de su ADN-ADN con Nostoc y se transfirieron a este género. También,
se transfirieron varias especies de Anabaena a un nuevo género Trichormus
(Komárek y Anagnostidis 1989; Rippka et al. 2001). A pesar de las
características distintivas atribuidas a este género, ciertos caracteres se
solapan con Nostoc, lo que da énfasis a la necesidad por desarrollar sistemas
inequívocos de taxonomía de las cianobacterias basados en el uso de cultivos
clonales axénicos, los cuales también son considerados en diversas bases de
datos incluyendo atributos morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares
(Nayak, 2007).
1.4.15.3 Chlorogloea Las células se disponen irregularmente en un mucílago común, pero a
veces formando (particularmente en las partes marginales) filas cortas e
irregulares de células, que normalmente se orientan de forma radial (Anexo B);
las filas a veces aparecen perpendiculares al sustrato. Las células esféricas u
27
ovales, en colonias viejas pueden aparecer redondeadas poligonales, con o
sin imprecisiones difluyendo, delimitadas por envolturas firmes mucilaginosas
con un contenido fino granular de coloración azul verdoso, amarillento, rojizo,
grisáceo o pálido (Komárek & Anagnostidis, 1998).
La capacidad para fijar nitrógeno entre las algas verde azules parecía
invariablemente estar asociada con la habilidad de formar el heterocistos, los
mismos que no son producidos por algas verde azules unicelulares, con la
excepción de Chlorogloea fritschii, como ya ha sido reportado en otros estudios
(Whitton, 1967; Fay, 1965) un organismo cuya asignación a las Chroococcales
es polémico (Fay, 1964a,b).
Se han tenido reportes en Chlorogloeopsis (Chlorogloea) fritschii. Que
al igual que otras cianobacterias, puede existir en más de una forma
morfológicamente reconocible, los dos principales ejemplos son una forma
filamentosa y una forma aseriada con grupos irregulares de células (Evans et
al., 1976).
1.5 Sistema de hipótesis.
Las tres cianobacterias procedentes de la filósfera de bosques nativos
de Polylepis pauta presentan diferentes patrones de crecimiento y producción
de proteínas totales frente a diferentes concentraciones de nitrato de sodio,
intensidades lumínicas y medio de cultivo.
28
CAPÍTULO 2: MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Participantes.
Con el financiamiento de la Escuela Politécnica del Ejército se ejecutó el
proyecto “Aislamiento, purificación y caracterización de cianobacterias
procedentes de bosques nativos de Polylepis pauta para su aplicación en
reforestación, recuperación de suelos y extracción de metabolitos primarios y
secundarios (2007-2008)”; siendo esta tesis parte de este proyecto en el Centro
de Investigaciones Científicas de la ESPE; donde se llevaron a cabo los
ensayos.
En el Laboratorio de Microorganismos Fotosintéticos de la Facultad de
Ciencias de la Universidad del Zulia en la ciudad de Maracaibo Venezuela se
desarrolló parte de la identificación mediante clave microscópica.
Como directora de tesis y del proyecto, del que este trabajo forma parte
está la Lic. Biol. Alma Koch MSc., de igual manera se contó con el aporte de la
Dra. Blanca Naranjo, co-directora de la tesis.
El Dr. Ever Morales, jefe del laboratorio de Microorganismos
Fotosintéticos de la Facultad de Ciencias de la Universidad del Zulia, el Lic.
Néstor Rosales MSc. aportaron en la caracterización mediante clave
microscópica de las cianobacterias estudiadas.
El Dr. Alexis Debut, docente de la carrera de biotecnología colaboró con
sus conocimientos en microscopía electrónica que se utilizaron para la
caracterización de las tres cinaobacterias de este estudio.
La Srta. Saskia Carrera proporcionó su colaboración en calidad de
pasante en la ejecución de la presente tesis.
29
2.2 Zona de estudio
Las cianobacterias que se utilizaron en este trabajo de tesis se aislaron
de las hojas de Polylepis pauta del páramo de Papallacta, zona localizada en la
provincia de Napo, Ecuador.
Los estudios de laboratorio se llevaron a cabo en el laboratorio de
Microbiología de la Escuela Politécnica del Ejército campus Sangolquí,
Pichincha, Ecuador y en el laboratorio de Microorganismos Fotosintéticos de la
Facultad de Ciencias de la Universidad del Zulia en la ciudad de Maracaibo
Venezuela.
2.3 Período del Tiempo de Investigación
El presente tuvo una duración de 11 meses.
2.4 Diseño
2.4.1 Identificación mediante clave microscópica, determinación de la concentración de proteína total y cinética de crecimiento.
Los resultados que se reportan en este trabajo son de tipo cualitativo
para la identificación mediante clave microscópica y cuantitativo para la
determinación de proteína total así como para las curvas de cinética de
crecimiento, para las tres cianobacterias.
2.4.2 Diseño Experimental Utilizado
Tanto para la determinación de proteína total como para las curvas de
cinética de crecimiento se utilizó un arreglo con 4 factores AxBxCxD para cada
una de las cianobacterias dispuesto en un diseño completamente al azar con
tres repeticiones por tratamiento. Los factores con sus respectivos niveles se
indican en la Tabla 2.1.
Para cada una de las tres cianobacterias se aplicó el mismo diseño
experimental.
30
Tabla 2.1 Diseño Experimental propuesto para cada cianobacteria. Tabla 0.1Tabla 2.1 Diseño Experimental propuesto para cada cianobacteria.
Factores Niveles N
Nitrato de Sodio, en milimoles
1 0 mM 162 2 4 mM 162 3 8 mM 162
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes)
1 5 kluxes 162 2 8 kluxes 162 3 11 kluxes 162
Medio de Cultivo
1 BG11 243
2 Agua de Vertiente 243
Tiempo 1 Día 6 54 en días 2 Día 9 54 3 Día 12 54 4 Día 15 54 5 Día 18 54 6 Día 21 54 7 Día 24 54 8 Día 27 54 9 Día 30 54
Se determinó la diferencia entre tratamientos del modelo factorial para el
crecimiento y la producción de proteínas de cada cianobacteria los cuales se
organizaron con la combinación de los niveles de cada factor. Las lecturas se
tomaron a partir del sexto día cada tres días durante treinta días.
El análisis de los resultados de esta investigación se realizó con el programa
SPSS 15.0. Se llevaron a cabo análisis de varianzas, comparaciones entre
tratamientos con gráficas de perfil además de la estadística descriptiva. El
análisis de significancia y el establecimiento de rangos se realizaron mediante
el método de Tukey con una significancia del 5%.
31
2.5 Procedimientos
2.5.1 Caracterización mediante clave microscópica.
Se tomaron del cepario del laboratorio de Microbiología de la ESPE las
tres cianobacterias de interés (Figura 2.3) y se procedió a subcultivarlas en
medio BG11 líquido y sólido, se utilizó medio normal y sin nitrato de sodio
hasta obtener biomasa suficiente para su observación.
Figura 2.1 Cianobacterias utilizadas para la tesis en medio BG11 sin nitrato de
sodio codificadas en el cepario: a. C10; b. C15; c. C37. 3o de en el cepario
Obtenida la cantidad suficiente de biomasa (Figura 2.4) se realizaron
observaciones periódicas del aspecto de las macrocolonias, de los cultivos
tanto en medio líquido como sólido. Para la observación microscópica se utilizó
un microscopio cabezal trinocular marca Olympus modelo CX-31, las placas se
prepararon directamente del medio de cultivo de forma periódica y se
registraron las características sobresalientes en una base de fotomicrografías
que sirvió para la selección de las imágenes más representativas. Mediante las
claves del manual de Bergey’s, Desickachary, 1959; Komarek y Anagnóstidis,
1989, se establecieron las particularidades de cada una de las cianobacterias y
se les asignó a diferentes géneros.
La identificación de estos géneros se basó en las características
morfológicas tales como la morfología de los filamentos, células vegetativas,
presencia de heterocistos y acinetos, la forma de la colonia, forma de las
células terminales, presencia de matriz mucilaginosa, así como el ciclo de vida
a b c
32
como característica adicional para la identificación de las cianobacterias dentro
de cada género según las claves mencionadas
Figura 2.2 Subcultivos en medio BG11 sólido y líquido, y masificación por
escalamiento de las tres cianobacterias. Figura 4 Figura 2.3 Subcultivos en medio BG11 sólido y líquido, y masificación por escalamiento de las tres
cianobacterias.
2.5.1.1 Determinación cualitativa de la envoltura celular. Se preparó placas con alícuotas de las tres cianobacterias cultivadas
en medio BG11 sin nitrato de sodio (medio diferencial) y se les fijó con azul de
Alcian para observar la matriz mucilaginosa como se describe en Reddy et al.,
(1996).
2.5.1.2 Microscopía electrónica de barrido Para la observación mediante microscopía electrónica de barrido se
siguió el procedimiento descrito por Bozzola (2007), y modificado de acuerdo a
las condiciones del laboratorio por el Dr. Alexis Debut, la colección de muestras
se realizó por centrifugación sin homogenización previa.
33
2.5.2 Condiciones de cultivo y masificación de los tres microorganismos para llevar a cabo la experimentación
Se cultivaron tres cianobacterias aisladas de la filósfera de bosques
nativos de Polylepis pauta del páramo de Papallacta, del cepario de
Microbiología de la ESPE, se las subcultivó y masificó (Figura 2.1) en medio de
cultivo BG11 descrito por Rippka et al. 1979 (Anexo C) sin nitrato de sodio, a
una intensidad de luz de 1000 luxes, aireación constante, fotoperiodo de 16
horas de luz y 8 de oscuridad y temperatura ambiente (22º ± 2ºC) (Koch et al,
2008).
Figura 2.3 Cultivos de las tres cianobacterias en medio BG11 sin nitrato de
sodio en medio líquido. Figura 5Figura 2.1 Cultivos de las tres cianobacterias en medio BG11 sin nitrato de sodio en medio líquido.
Se mantuvo a los micoorganismos bajo las condiciones indicadas hasta
alcanzar suficiente biomasa para inocular en los frascos a utilizar es decir, un
aproximado de 5*106 cel/mL. Las unidades experimentales fueron frascos de
vidrio claro de 500 mL con 400 mL de medio de cultivo estéril BG11 y agua de
vertiente con una composición de minerales natural (Anexo D) con tres
concentraciones de nitrato de sodio (0, 4 y 8 mM,), ajustado a pH 7.8 Se agitó
y aireó el medio de cultivo mediante la inyección de aire comprimido.
2.5.3.1 Disposición de las unidades experimentales
Para la determinación de la concentración de nitrato de sodio,
irradiancia y medio de cultivo óptimos para el crecimiento y producción de
34
proteína total de las tres cianobacterias, se utilizó una cámara de cultivo (Figura
2.2) construida específicamente para suministrar aireación y la cantidad de luz
establecidas; mediante iluminación con un panel de luz fluorescente a tres
intensidades de luz: 5000, 8000 y 11000 luxes, fotoperiodo unilateral de 16
horas de luz y 8 de oscuridad y temperatura ambiente (28º±2ºC) en donde se
colocaron las unidades experimentales por triplicado, los frascos se dispusieron
en hileras de seis unidades en la cámara de cultivo de acuerdo a la intensidad
de luz que se requeridas por los tratamientos.
Figura 2.4 Cámara de cultivo (Chico, 2009).
Figura 6 Figura 2.2 Cámara de cultivo
2.5.5 Análisis de Biomasa A partir de los datos tomados para el crecimiento de cada una de las
tres cianobacterias mediante turbidez y recuento celular, se estableció un
modelo de cuantificación de células por mililitro, mediante la correlación de los
dos grupos de datos (Anexo E). A partir de los datos de concentración celular
obtenidos, se procedió al análisis estadístico con relación a la biomasa (cel/mL)
obtenida a lo largo de la medición.
35
2.5.5.1 Cinética de crecimiento mediante turbidez El crecimiento de las tres cianobacterias se cuantificó mediante
espectrofotométría en un equipo Genesys 10UV Scanning Thermo Scientific a
una longitud de onda de 750 nm cada 3 días (Pattnaik et al., 1978; Loreto et al.,
2003). Previa homogenización del medio de cultivo de cada unidad
experimental, se tomó 2 mL del medio de cultivo en un eppendorf limpio y se
midió la absorbancia.
2.5.5.2 Recuento Celular
Se determinó el número de células/mL mediante conteo directo en
cámara de Neubauer (Marienfeld 0,1mm x 0,0025 mm2) con un microscopio
cabezal trinocular marca Olympus modelo CX-31. Con la misma muestra
utilizada para medir la turbidez, se llenó la cámara a una velocidad
homogénea, evitando una mala distribución de las células en la preparación y
la formación de burbujas. Para las muestras muy concentradas se utilizó un
factor de dilución. Se realizó el conteo de las células en la cuadrícula de 25
cuadrados, para calcular las células. mL-1, se utilizó la fórmula:
Cel.mL-1 = C x 104 x fd. (C= Promedio de células contadas en la cuadrícula de
25 cuadrados, fd= Factor de dilución) como se describe en Mundt et al. (2001)
y Loreto (2003).
2.5.2.4 Cuantificación de proteína.
2.5.2.4.1 Elaboración de una curva estándar
Para la cuantificación de las proteínas se utilizó como estándar una
solución de seroalbúmina bovina (BSA). A partir de una concentración de 1 mg
mL-1, se prepararon diferentes concentraciones. Se tomaron diez tubos de
vidrio en los que se colocaron distintas cantidades de solución de BSA y luego
se llevaron los tubos al mismo volumen final con agua destilada. Siguiendo el
protocolo de cuantificación de proteínas de Lowry (1951) se obtuvo la curva
patrón. Los resultados obtenidos de las absorbancias se ajustaron por mínimos
cuadrados a una ecuación de segundo grado, las concentraciones utilizadas en
36
la elaboración de la curva estándar fueron 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300,
500, 800 µg/mL de BSA.
2.5.6 Determinación de la concentración de Proteína.
Mediante el método de Lowry (1951) modificado por Herbert et al.
(1971), se determinó la concentración de proteína total (μg/mL) cada tres días.
Se congeló 2 mL del medio de cultivo con la biomasa a -10ºC, se añadió 2 mL
de NaOH 1N y luego a baño María durante una hora a una temperatura de 95 a
100°C. Las muestras frías se clarificaron por centrifugación a 12000 rpm
durante 4 min 0,3 mL del sobrenadante se colocó en cada microtubo con tapa
rosca, con 1,5 mL de la Solución 1.
La solución 1 estuvo compuesta de carbonato de sodio (5%) preparado
con hidróxido de sodio (0,1 N) y sulfato de cobre (II) pentahidratado (0.5%) con
tartrato de potasio (1%), en una relación 25:1 Los microtubos fueron agitados
en el vórtex durante 10 s y luego de 10 min se agregó 0,15 mL de una mezcla
50:50 v/v de reactivo Folin-Ciocalteau 2N (Sigma) con agua destilada, se dejó
reposar durante 30 min a temperatura ambiente y se midió las absorbancias en
el espectrofotómetro Thermocientific Genesis 10 UV Scannig a una longitud de
onda de 750 nm (DO750). Los valores de proteínas se calcularon por
interpolación en la curva estándar.
2.6 Análisis de Datos. Los datos obtenidos se analizaron mediante el software estadístico
SPSS versión 15.0 para el diseño experimental propuesto, se aplicó pruebas
de Tukey con el 95% de confianza para las variables independientes.
Se aplicó la prueba de Levene para contrastar la hipótesis de que los grupos
definidos por los factores que son objeto de este estudio en cada una de las
tres cianobacterias, proceden de poblaciones con la misma varianza (Anexo F)
y considerando la robustez de la prueba ANOVA, se dio paso a considerar los
resultados que originó.
37
CAPÍTULO 3: RESULTADOS
3.1 Caracterización mediante clave microscópica.
A partir de los cultivos en el medio diferencial líquido se pudo observar la
formación de flóculos de las tres cianobacterias (Figura 3.1).
Figura 3.1 Formación de flóculos en medio BG11 sin nitrato de sodio.
a. Las tres cianobacterias en tubos de escalado b. Apariencia de los flóculos en
las unidades experimentales. Figura 7 Figura 3.1 Formación de flóculos en medio BG11 sin nitrato de sodio.
En medio sólido (Figura 3.2) se aprecia diferentes aspectos de las
colonias de cianobacterias, C10 con un color verde pardo y colonias
irregulares, C15 presenta colonias verde oliva amarillenta que se expanden
homogéneamente en todo la superficie del agar, C37 muestra colonias
esféricas verrugosas que se denotan dentro un contorno color verde pálido.
Figura 3.2 Crecimiento de las cianobacterias en medio sólido, en la parte
superior en BG11 sin nitrato de sodio. En la parte inferior en medio BG11
normal.a. C10 b. C15 c. C37 Figura 8 Figura 3.2 Crecimiento de las cianobacterias en medio sólido, en la parte superior en BG11 sin nitrato de sodio. En la parte inferior en medio BG11 normal.
1 cm 1 cm
1 cm
38
Cuando se cultivó las tres cianobacterias en medio BG11 con nitrato de
sodio a una concentración 4mM se observó crecimiento de células
independientes con escasos heterocistos (Fig. 3.3). La coloración del medio es
de un verde intenso bastante homogéneo.
Figura 3.3 Vista al microscopio óptico de las tres cianobacterias cultivadas en
medio líquido BG11 con nitrato de Sodio con el lente de 40x. a. C10; b. C15; c.C37 9
3.1.1 Determinación cualitativa de la envoltura celular.
Además se realizaron placas de las tres cianobacterias cultivadas en
BG11 sin nitrato de sodio utilizando la técnica de tinción con azul de Alcian que
reacciona con los polisacáridos ácidos, propios de cianobacterias (Reddy et al.,
1996), En C10 se resaltó la presencia y espesura de la capa mucilaginosa
(Figura 3.4).
Figura 3.4 a. Vista de C10 bajo el lente 40x. a. Placa de C10 sin tinción b. C10
con su envoltura celular teñida con azul de alcian las flechas indican la
envoltura mucilaginosa.
39
Las colonias en C10 se encontraron formando una masa gelatinosa grande que
contenía microcolonias de color verde oliva pálido
Para C15 la matriz mucilaginosa que envuelve a los tallos se hace
visible únicamente después de la tinción con el colorante, en condiciones
normales solo se distingue en la periferia (Figura 3.5)10
Figura 3.5 Vista de C15 bajo el lente 40x a. Placa de C10 sin tinción b. C15
con su envoltura celular teñida con azul de alcian las flechas indican la
envoltura mucilaginosa. Figura 11 roscopio óptico bajo el lente de 40x.
En C37, se comprobó que la matriz mucilaginosa es difluente y se halla
incrustada entre los tricomas, este tipo de matriz o envoltura sirvió como
referente para su aproximación taxonómica (Fig.3.6).
Figura 3.6 Vista de C37 bajo el lente 40x a. Placa de C37 sin tinción b. C3 con
su envoltura celular teñida con azul de alcian las flechas indican la envoltura
mucilaginosa.Figura 12 Figura 3.10. a. Vista d e una imagen de C37 bajo el lente de 40x.
3.1
má
sub
irre
me
des
pse
var
en
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40
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día 20. 13 jo el lente 40x.
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8).
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(Fig.3.7),
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e 40x. a. S
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de
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o,
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de
as
de
s,
da
os
41
Fotografías captadas en claboración con el Dr. Ever Morales
Fotografías: Dr. Alexis Debut.
Figura 3.8 Cianobacteria C10 bajo el lente de 40x. Los heterocistos se señalan
con flechas encerrados en círculos. a. Presencia de heterocistos (H) en medio
de la colonia formada por células vegetativas CV b. en el centro de la imagen
un heterociste, se diferencia del resto de células de los alrededores por su
pared celular más gruesa. 14
Al microscopio electrónico se obtuvieron micrografías que permitieron
obtener las medidas específicas del diámetro de las células vegetativas (2,25
µm), en la Figura 3.9 se observan las variaciones en la morfología de C10,
formas pseudofilamentosas, y agrupaciones irregulares de grupos celulares, en
la periferia de la parte inferior una célula diferente al resto, probablemente un
heterocisto.
Figura 3.9 Micrografías electrónicas de la cianobacteria C10.
a. El extremo de un pseudofilamento con cuatro células vegetativas (CV)
ovaladas de 2,25 µm de largo a una magnificación X 24000. b. Una colonia de
células, en la parte inferior del centro resalta un heterocisto (H), a una
magnificación x 11000. 15
H
H
42
3.1.3 Observación cianobacteria C15. Filamentos agrupados en tallos ligeramente enredados envueltos en una
matriz delicada y mucilaginosa ligeramente difluente con heterocistos
terminales en ambos extremos de la cadena de células vegetativas ovoides, de
coloración verde oliva. Los tallos son subglobosos y flexibles, y su
conformación interna densamente enredada le da una estructura que los
mantiene firmes y a los filamentos inmóviles (Figura 3.10).
Figura 3.10 Cianobacteria C15. a. Imagen bajo el lente de 100x heterocistos
(H) en un extremo del tallo globoso que contiene células vegetativas CV y con
una estrangulación (Est.) en el otro extremo b. Bajo el lente 40x formas
globosas intercaladas con estrangulamientos y heterocistos, en el extremo del
tallo. Figura 16 Figura 3.6 Cianobacteria C15, los heterocistos se señalan con flechas encerrados en círculos.
Nostoc tiene un ciclo de vida especial, durante el cual se presentan varias
formas con características particulares. Lo que se hizo evidente en C15 y
permitió establecer contrastes con Anabaena. Los hormogonios se
desarrollaron en una fase específica del ciclo de vida (Figura 3.11) en hileras
cortas de células (no sobrepasan 15 células vegetativas).
43
Figura 3.11 Hormogonios de C15 a. Bajo el lente 40x, un hormogonio
ligeramente curvado de C15, con un heterociste en el extremo, en la parte de
abajo un tallo formado por un grupo enredado de células vegetativas envueltas
en una matriz. b. Bajo el lente de 20x varios hormogonios combinados con
tallos globosos. Figura 17 Figura 3.7. Hormogonios de C15
La micrografía (Figura 3.12) reflejó la estructura tridimensional de una
microcolonia celular, se aprecia un filamento enredado y difuso en medio de la
envoltura mucilaginosa que lo recubre pareciendo un arreglo globoso
desinflado, la turbidez de la masa celular indicó el volumen de la matriz que la
contenía. 18
Figura 3.12 Micrografía electrónica de C15 a una magnificación de 3636 X.
Se ve una parte del tallo globoso tridimensional, destaca un filamento de 30 µm
en medio de una matriz mucilaginosa espesa.
44
3.1.4 Observación de la cianobacteria C37. En C37, se aprecian filamentos flexibles de color opaco, curvados y
enredados; la matriz es generalmente difluente, de células hendidas de forma
de barril; los heterocistos se hacen evidentes en ambos lados de los
hormogonios antecedidos de notorias contracciones, los hormogonios maduros
se ven de forma intercalada y metamérica; los acinetos aparecen entre la mitad
del intervalo heterocístico (Fig 3.13).
Figura 3.13 Filamentos de C37 a. Células Vegetativas (CV), heterocistos (H)
bajo el lente 10x. b. Acinetos (AC) en el intervalo de los heterocistos (H), bajo
el lente de 40X. Figura 19 Figura 3.9 Filamentos de C37 a. Células Vegetativas (CV), heterocistos (H) bajo el lente 10x.
C37 presentan vainas alrededor de sus tricomas, pero por lo general sólo
visibles en la periferia de la colonia o en colonias jóvenes, de consistencia
mucilaginosa, sus tricomas son iso-polares, metaméricos, sus acinetos nacen
de forma apoheterocitica, de forma oval un poco más grande que las células
vegetativas (Fig. 3.14)
45
Figura 3.14. Filamentos de C37. a. se aprecia bajo el lente 10x la imagen
expandida con filamentos ligeramente enredados con heterocistes (H) y
acinetos (AC) intercalados. b. Bajo el lente 40x se aprecia el tamaño de los
heterocistes en relación al resto de células vegetativas. Figura 20 Figura 3.10. Filamentos de C37.
La micrografías confirmaron la morfología de la cianobacteria C37
(Figura 3.15), con tricomas ligeramente enrollados conformados por células
vegetativas de 2 µm de ancho y 3,2 µm de largo de forma de barril, se notó una
delicada matriz mucosa recubriendo a los filamentos, en la Figura 3.15 c. se
nota la matriz de mucosa difluente que envuelve los filamentos, normalmente
hialina pero en concentraciones elevadas de biomasa se apreció capas de
constitución babosa que concentra las células de las microcolonias.
21
Figura 3.15 Filamentos de C37 y matriz mucilaginosa. a. Se aprecia un tricoma
ligeramente enrollado cubierto con una delicada matriz de mucílago a una
magnificación de 6692 X. b. Un hormogonio (8 células vegetativas) en posición
lineal probablemente con vacuolas de gas en su interior a una magnificación de
10000 X. c. Matriz de mucílago difluente de C37 a una magnificación de 4000X.
a b
a b c
46
Identificadas las características más sobresalientes de las tres
cianobacterias, se les asignó a un género determinado (Tabla 3.1) con las
claves del manual de Bergey’s, Desickachary (1959), Komárek & Anagnostidis
(1998) (Ver Anexo G).
Tabla 3.1 Resultados de la identificación de las cianobacterias mediante clave
microscópica Chico (2010). Tabla 0.2Tabla 3.1 Resultados de la identificación de las cianobactemediante clave microscópica.
Codificación de las cianobacterias estudiadas
Género asignado
C10 Chlorogloea
C15 Nostoc
C37 Nostoc
47
3.2 Análisis de Biomasa
3.2.1 Cinética de crecimiento de Chlorogloea (C10). La cinética de crecimiento para Chlorogloea (C10) a partir del sexto día en
medio de cultivo BG11, con una concentración 4mM de nitrato de sodio y a una
intensidad luminosa de 8 Kluxes, se indica en la Figura 3.16. Su máxima
concentración celular fue un aproximado de 14x106 cel /mL en el día 24.
Figura 3.16 Cinética de crecimiento de Chlorogloea (C10) en medio BG11 con
Nitrato de sodio 4mM. Figura 22 Figura 3.8 Cinética de crecimiento de Chlorogloea (C10) en medio BG11 con Nitrato de sodio 4mM.
3.2.2 Análisis estadístico de la concentración celular de Chlorogloea
(C10). La concentración celular (cel/mL) alcanzó los promedios más altos
cuando se cultivó en medio BG11 en los días 21, 24 y 27, en la gráfica (Figura
3.17) el promedio de la concentración celular (representado en las barras)
siguió una tendencia que representa el crecimiento celular; la Tabla 3.3
constata estadísticamente que los factores con mayor significancia fueron:
medio de cultivo (medio BG11 y agua de vertiente), Tiempo (en días) y las
interacciones entre estos dos.
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
1,20E+07
1,40E+07
1,60E+07
Días
Células/mL
6 9 12 15 18 21 24 27 30
48
Figura 3.17 Promedio de la producción de biomasa de Chlorogloea (C10), 23
en células por mililitro con respecto al tiempo y al medio de cultivo,
Figura 3.9 Promedio de la producción de biomasa de Chlorogloea (C10)
En la gráfica de perfil (Figura 3.18), el promedio mayor de la concentración
celular fue para la concentración 4 mM de nitrato de sodio en medio BG11,
mientras que con agua de vertiente, la media marginal de la concentración
celular fue menor.
Figura 3.18 Gráfica de perfil para la interacción de los factores: medio de
cultivo con nitrato de sodio. Figura 24
Realizado el análisis de varianza, ANOVA, para el diseño factorial, se concluye
que existe significancia para todas las fuentes de variabilidad, con excepción
del factor irradiancia, lo que indica que los grupos definidos por esta variable
producen células por mililitro significativamente iguales en todos sus niveles, no
Nitrato de Sodio, en milimoles8 mM4 mM0 mM
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
120.000
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
Tiempo, en díasDía 30Día 27Día 24Día 21Día 18Día 15Día 12Día 9Día 6
Med
ia C
élul
as/m
L
12,000,000
10,000,000
8,000,000
6,000,000
4,000,000
2,000,000
0
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
49
así para el resto de variables que inciden significativamente en la concentración
de células por mililitro (Tabla 3.2).
Tabla 3.2 Análisis de varianza para la variable células/mL de la cianobacteria
Chlorogloea (C10). Tabla 0.3 Tabla 3.2
Fuente Suma de cuadrados tipo III
gl Media cuadrática
F Significación
Modelo corregido 4,24074E+15a 161 2,63E+13 173,35 0,00 Intersección 1,09E+16 1 1,09E+16 71530,01 0,00 Nitrato 2,82E+14 2 1,41E+14 927,16 0,00 Irradiancia 3,80E+11 2 1,90E+11 1,25 0,29 MCultivo 1,48E+15 1 1,48E+15 9755,80 0,00 Nitrato * Luz 1,38E+14 4 3,44E+13 226,56 0,00 Nitrato * MCultivo 1,71E+14 2 8,56E+13 563,67 0,00 Luz * MCultivo 1,85E+13 2 9,25E+12 60,85 0,00 Nitrato * Luz * MCultivo 9,83E+13 4 2,46E+13 161,69 0,00 Nitrato * Tiempo 9,75E+13 16 6,09E+12 40,10 0,00 Luz * Tiempo 7,43E+13 16 4,64E+12 30,56 0,00 Nitrato * Luz * Tiempo 1,79E+14 32 5,58E+12 36,75 0,00 MCultivo * Tiempo 6,66E+14 8 8,33E+13 548,03 0,00 Nitrato * MCultivo * Tiempo 6,50E+13 16 4,06E+12 26,73 0,00 Luz * MCultivo * Tiempo 7,58E+13 16 4,74E+12 31,18 0,00 Nitrato * Luz * MCultivo * Tiempo 1,39E+14 32 4,33E+12 28,51 0,00 Error 4,92E+13 324 1,52E+11 Total 1,52E+16 486
Total corregida 4,29E+15 485
a R cuadrado = 0,989 (R cuadrado corregida = 0,983)
La prueba de Tukey realizada para el factor Nitrato de sodio (Tabla 3.3)
muestra tres subconjuntos de datos, donde el nivel de 4mM tiene el mejor
promedio y se sitúa en el primer subconjunto.
Tabla 3.3 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Nitrato de
sodio (0 mM, 4 mM y 8 mM).Tabla 0.4Tabla 3.3 Prueba de DHS de Tukeya,b
Nitrato de Sodio, en milimoles N
Subconjunto 2 3 1
0 mM 162 3675537,04 8 mM 162 5062592,59 4 mM 162 5448827,16
Significación 1,000 1,000 1,000 Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos.a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162
50
Con respecto al factor Tiempo en todos sus niveles, la prueba de Tukey indica
que para el día 24, 27 y 21 se tuvieron los promedios más altos de la
concentración celular y se ubican en el subconjunto 1 (Tabla 3.4).
Tabla 0.5Tabla 3.2
Tabla 3.4 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Tiempo en
días. DHS de Tukeya,b
Tiempo, en días
N Subconjunto
1 2 3 4 5 6 1 Día 6 54 2411055,56 Día 9 54 2908518,52 Día 12 54 4031111,11 Día 15 54 4770925,93 Día 30 54 5405740,74 Día 18 54 5502592,59 Día 21 54 5762962,96Día 27 54 5848888,89Día 24 54 5919074,07
Significación 1,000 1,000 1,000 1,000 0,933 0,488Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 54 3.2.3 Cinética Crecimiento de Nostoc (C15).
La cinética de crecimiento para Nostoc (C15) a partir del sexto día con
medio de cultivo BG11, con una concentración 4mM de nitrato de sodio a una
intensidad luminosa de 8 Kluxes se indica en la Figura 3.19 con una
concentración celular aproximada de 8x106 cel /mL en el día 30.
Figura 3.19 Cinética de crecimiento de Nostoc (C15) en medio BG11 con
nitrato de sodio 4mM.25
0,00E+001,00E+062,00E+063,00E+064,00E+065,00E+066,00E+067,00E+068,00E+069,00E+06
Días
Células/mL
6 9 12 15 18 21 24 27 30
51
Nitrato de Sodio8 mM4 mM0 mM
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
4000000
3000000
2000000
1000000
0
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
3.2.4 Análisis estadístico de la concentración celular de Nostoc (C15). La concentración celular (cel/mL) alcanzó los promedios más altos
cuando se cultivó en medio BG11 en el día 30, como se puede observar en la
Figura 3.20 en azul medio BG11 y en verde para agua de vertiente. 26 F
Figura 3.20 Promedio de la producción de biomasa de Nostoc (C15) en células
por mililitro con respecto al tiempo y al medio de cultivo.
La gráfica de perfil (Figura 3.21), con respecto a los factores nitrato de
sodio y medio de cultivo indica el promedio más alto de la concentración celular
para la concentración 4 mM de nitrato de sodio en medio BG11, mientras que
con agua de vertiente, la media marginal de la concentración celular es menor
y el mayor crecimiento celular con nitrato de sodio 8 mM.
Figura 3.21 Gráfica de Perfil para la interacción de los factores Medio de
cultivo con nitrato de sodio. Figura 27 Figura 3.13 Gráfica de Perfil para la interacción de los factores Medio de cultivo con nitrato de
sodio.
Tiempo, en díasDía 30Día 27Día 24Día 21Día 18Día 15Día 12Día 9Día 6
Med
ia C
élul
as/m
L
8,000,000
6,000,000
4,000,000
2,000,000
0
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
52
Mediante el análisis de varianza (ANOVA) se observó que para todas
las fuentes de variabilidad estudiadas existe significancia estadística, lo que
indica que para los grupos definidos por todas las variables, se produjo una
concentración de células por mililitro significativamente diferente (Tabla 3.5). Tabla 0.6Tabla 3.5 Análisis de varianza para la variable Células/mL de la cianobacteria Nostoc (C15).
Tabla 3.5 Análisis de varianza para la variable Células/mL de la cianobacteria
Nostoc (C15).
Variable dependiente: Células/mL
Fuente Suma de
cuadrados tipo III
gl Media cuadrática F Significación
Modelo corregido 2,30E+15a 161 1,43E+13 24,901 0,00 Intersección 1,99E+15 1 1,99E+15 3473,361 0,00 Nitrato 4,85E+12 2 2,43E+12 4,233 0,02 Luz 1,75E+13 2 8,77E+12 15,296 0,00 MCultivo 8,21E+14 1 8,21E+14 1431,744 0,00 Tiempo 6,53E+14 8 8,16E+13 142,359 0,00 Nitrato * Luz 6,54E+13 4 1,63E+13 28,509 0,00 Nitrato * MCultivo 1,38E+13 2 6,90E+12 12,042 0,00 Luz * MCultivo 2,96E+13 2 1,48E+13 25,787 0,00 Nitrato * Luz * MCultivo 3,76E+13 4 9,40E+12 16,398 0,00 Nitrato * Tiempo 2,01E+13 16 1,26E+12 2,19 0,01 Luz * Tiempo 3,30E+13 16 2,06E+12 3,599 0,00 Nitrato * Luz * Tiempo 5,02E+13 32 1,57E+12 2,738 0,00 MCultivo * Tiempo 4,32E+14 8 5,41E+13 94,302 0,00 Nitrato * MCultivo * Tiempo 3,13E+13 16 1,96E+12 3,418 0,00 Luz * MCultivo * Tiempo 4,22E+13 16 2,64E+12 4,602 0,00 Nitrato * Luz * MCultivo * Tiempo 4,65E+13 32 1,45E+12 2,537 0,00 Error 1,86E+14 324 5,73E+11 Total 4,47E+15 486 Total corregida 2,48E+15 485 a R cuadrado = 0,925 (R cuadrado corregida = 0,888)
La prueba de Tukey realizada para el factor nitrato de sodio (Tabla 3.6)
muestra dos subconjuntos de datos, donde el nivel de 4mM tiene el mejor
promedio y se sitúa en el primer subconjunto compartido con la concentración
8mM, con el que no existe diferencia estadísticamente significativa.
53
Tabla 3.6 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor nitrato de
sodio en milimoles. DHS de Tukey
Nitrato de Sodio
N Subconjunto 1 2 1
0 mM 162 1905545,74 8 mM 162 2016245,74 2016245,74 4 mM 162 2149945,74
Significación 0,387 0,252
Tabla 0.7Tabla 3.6 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Nitrato de Sodio en milimoles.
La prueba de Tukey realizada para el factor irradiancia (Tabla 3.7)
muestra tres subconjuntos de datos, donde el nivel de 4Kluxes tiene el mejor
promedio de células por mililitro y se sitúa en el primer subconjunto, que le
diferencia significativamente de las medias conseguidas con 5Kluxes y 8
Kluxes en el segundo y tercer subconjunto respectivamente. Tabla 0.8Tabla 3.7 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Irradiancia en Kluxes.
Tabla 3.7 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Irradiancia en
Kluxes.
DHS de Tukey
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes)
N Subconjunto
1 2 3 1 5 kluxes 162 1781971,67 11 kluxes 162 2043819,81 8 kluxes 162 2245945,74 Significación 1,000 1,000 1,000
En la prueba de Tukey para el factor tiempo (Tabla 3.8) se muestran
cinco subconjuntos de datos, en donde se aprecia que las medias más altas de
concentración celular fueron en los días 27 y 30, ubicados dentro del mismo
grupo sin diferencia estadística.
54
Tabla 3.8 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Tiempo en
días. DHS de Tukey
Tiempo, en días N Subconjunto
2 3 4 5 1 Día 6 54 480749,44 Día 9 54 543482,78 Día 12 54 880705,00 Día 15 54 1477593,89 Día 18 54 2156427,22 Día 21 54 2570682,78 Día 24 54 3096560,56 Día 27 54 3334105,00 3334105,00Día 30 54 3674905,00Significación ,136 1,000 0,107 0,787 0,322
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 54 b Alfa = 0,05.
Tabla 0.9Tabla 3.8 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Tiempo en días.
55
3.2.5 Cinética de crecimiento de Nostoc (C37). La cinética de crecimiento para Nostoc (C37) a partir del sexto día con
medio de cultivo BG11 con una concentración 4mM de nitrato de sodio a una
intensidad luminosa de 11 Kluxes, se indica en la Figura 3.22 con una
concentración celular aproximada de 10x106 cel /mL en el día 24.
Figura 3.22. Cinética de crecimiento de Nostoc (C37) en medio BG11 con
nitrato de sodio 4mM a 11Kluxes. 28
La concentración celular (cel/mL) alcanzó los promedios más altos al
cultivarla en medio BG11 en los días 21, 24 y 27, se puede observar en la
Figura 3.23 que el promedio de la concentración en cel/mL sigue una tendencia
que representa el crecimiento celular; las barras en azul medio BG11 y en
verde para agua de vertiente.
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
1,20E+07
Días
Células/mL
6 9 12 15 18 21 24 27 30
56
Figura 3.23. Promedio de la producción de biomasa de Nostoc (C37) en
células por mililitro con respecto al tiempo y al medio de cultivo. Figura 29 Figura 3.15. Promedio de la producción de biomasa de Nostoc (C37)
La gráfica de perfil (Figura 3.24) con respecto a los factores nitrato de
sodio y medio de cultivo muestra el promedio más alto de la concentración
celular para la concentración 4 mM de nitrato de sodio en medio BG11. Con
agua de vertiente, a media marginal de la concentración celular es menor pero
el crecimiento es ligeramente mayor con una concentración 4mM de nitrato de
sodio.
Figura 3.24 Gráfica de Perfil para la interacción de los factores medio de
cultivo y nitrato de sodio. Figura 30 Figura 3.16 Gráfica de Perfil para la interacción de los factores medio de cultivo y nitrato de sodio.
Tiempo, en díasDía 30Día 27Día 24Día 21Día 18Día 15Día 12Día 9Día 6
Med
ia C
élu
las/
mL
6,000,000
4,000,000
2,000,000
0
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
Nitrato de Sodio, en milimoles8 mM4 mM0 mM
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
57
En el análisis de varianza, ANOVA, para el diseño factorial, se concluye
que para todas las fuentes de variabilidad estudiadas existe significancia
estadística, lo que indica que los grupos definidos por todas y cada una de las
variables produce una concentración de células por mililitro significativamente
diferente (Tabla 3.9).
Tabla 0.10Tabla 3.9. Análisis de varianza para la variable Células/mL de la cianobacteria Nostoc (C37).
Tabla 3.9. Análisis de varianza para la variable Células/mL de la cianobacteria
Nostoc (C37).
Fuente Suma de
cuadrados tipo III
gl Media cuadrática F Significación
Modelo corregido 2,92E+15 161 1,82E+13 54,01 0,00 Intersección 2,11E+15 1 2,11E+15 6284,99 0,00Nitrato 4,24E+14 2 2,12E+14 631,22 0,00 Luz 1,15E+13 2 5,76E+12 17,14 0,00 MCultivo 8,26E+14 1 8,26E+14 2456,69 0,00 Tiempo 6,03E+14 8 7,54E+13 224,31 0,00 Nitrato * Luz 2,19E+13 4 5,48E+12 16,31 0,00Nitrato * MCultivo 2,38E+14 2 1,19E+14 354,12 0,00 Luz * MCultivo 1,66E+13 2 8,32E+12 24,75 0,00 Nitrato * Luz * MCultivo 2,10E+13 4 5,25E+12 15,62 0,00 Nitrato * Tiempo 1,36E+14 16 8,52E+12 25,35 0,00 Luz * Tiempo 2,78E+13 16 1,74E+12 5,17 0,00Nitrato * Luz * Tiempo 7,60E+13 32 2,38E+12 7,07 0,00 MCultivo * Tiempo 3,11E+14 8 3,89E+13 115,67 0,00 Nitrato * MCultivo * Tiempo 1,05E+14 16 6,55E+12 19,48 0,00 Luz * MCultivo * Tiempo 4,22E+13 16 2,64E+12 7,84 0,00 Nitrato * Luz * MCultivo * Tiempo 6,24E+13 32 1,95E+12 5,80 0,00 Error 1,09E+14 324 3,36E+11 Total 5,14E+15 486 Total corregida 3,03E+15 485 R cuadrado = 0,964 (R cuadrado corregida = 0,946)
La prueba de Tukey realizada para el factor nitrato de sodio (Tabla
3.10) muestra tres subconjuntos de datos, donde el nivel de 4mM tiene el
promedio más alto y se sitúa en el primer subconjunto.
58
Tabla 3.10 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Nitrato de Sodio en milimoles. Tabla 11 3.10
Células/mL DHS de Tukey
Nitrato de Sodio, en milimoles N
Subconjunto 2 3 1
0 mM 162 784185,36 8 mM 162 2532844,86 4 mM 162 2937239,93 Significación 1,000 1,000 1,000
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162,00 b Alfa = 0,05. Tabla 0.12Tabla 3.10 Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Nitrato de Sodio en milimoles.
En cuanto al factor Irradiancia, la prueba de Tukey agrupó a las medias
conformadas por el nivel de 5 Kluxes y de 8 Kluxes, en un mismo nivel de
significancia estadística, mientras que la media más alta está definida por el
nivel de Irradiancia de 11 Kluxes en el subconjunto 1 (Tabla 3.11) Tabla 0.13Tabla 3.11. Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Irradiancia en Kluxes.
Tabla 3.11. Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Irradiancia
en Kluxes. DHS de Tukey
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes) N
Subconjunto
2 1 8 kluxes 162 1962276,96 5 kluxes 162 1990061,90 11 kluxes 162 2301931,28 Significación ,903 1,000
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162,00 b Alfa = ,05.
Cuando se aplicó la prueba de Tukey al factor Tiempo (Tabla 3.12) se
muestran cinco subconjuntos de datos, en donde se aprecia que para los días
27, 21 y 24 no existe diferencia estadística en las medias para la concentración
celular, siendo estas las más altas conseguidas.
59
Tabla 3.12. Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Tiempo. Tabla 0.14Tabla 3.12. Prueba de Tukey para la variable Células/mL del factor Tiempo
Células/mL DHS de Tukey
Tiempo, en días
N Subconjunto 1 2 3 4 5 6 1
Día 6 54 267153,96 Día 9 54 599148,41 Día 12 54 1010111,37 Día 15 54 1835752,63 Día 18 54 2741832,52 Día 30 54 2869832,52 2869832,52 Día 27 54 3074128,81 3074128,81 3074128,81Día 21 54 3136647,33 3136647,33Día 24 54 3228202,89Significación ,076 1,000 1,000 ,075 ,292 ,904
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 54,00 b Alfa = 0,05.
60
3.3 Cuantificación de proteína.
3.3.1 Elaboración de una curva estándar
La curva estándar de proteínas se construyó con los siguientes promedios
obtenidos de las cinco repeticiones de absorbancias medidas (Tabla 3.13) para
cada una de las concentraciones de BSA que se consideraron.a 0.15Tabla 3.13
de las absas medidas para la construcción de la Curva Estánd
Tabla 3.13 Resultados de las absorbancias medidas para la construcción de la
Curva Estándar. Concentración de
BSA µg/ML Promedio
10 0,060 20 0,089 30 0,117 50 0,170
100 0,259 200 0,444 300 0,589 500 0,804 800 1,078
1000 1,190
A partir de los datos medidos se construyó la curva que se muestra en
la Figura 3.6, la cual se aproximó a la línea de tendencia polinomial de segundo
grado, cuya ecuación y R2 se indican en la Figura 3.25. 31.
Figura 3.25. Curva Estándar y ecuación de segundo grado utilizadas para la
cuantificación de proteínas en µg/mL. Figura
Abs
orba
ncia
8E-07x2 + 0,002x + 0,062
Concentración de proteína BSA, en ug/ml1,0008006004002000
1.200
1.000
0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
Sq r cuadrático =0.994
61
Para validar estadísticamente la curva, los datos se analizaron mediante
la prueba de homogeneidad de las varianzas de Levene (Tabla 3.14). Se
comprobó la validación del método con un nivel crítico de significancia de 0,061
(p> 0,05) aceptando la hipótesis nula de la igualdad de las varianzas
poblacionales basándose en la mediana, cuyos valores son muy similares a las
medias para cada caso. Además se realizó una prueba t en donde se verifica la
similitud entre ensayos (Anexo H). Tabla 0.16Tabla 3.14 Prueba de homogeneidad de varianzas de las absorbancias medidas en la elaboración de la curva estándar para cuantificar proteínas utilizando BSA.
Tabla 3.14 Prueba de homogeneidad de varianzas de las absorbancias
medidas en la elaboración de la curva estándar para cuantificar proteínas
utilizando BSA.
Estadístico de
Levene gl1 gl2 Sig. Absorbancia Basándose en la
mediana. 2,033 9 40 0,061
Basándose en la mediana y con gl corregido
2,033 9 5,540 0,211
3.3.2 Análisis Estadístico de la concentración de Proteína Total de
Chlorogloea (C10).
El promedio más alto para la concentración de proteína en el caso de
Chlorogloea (C10) se consiguió con el tratamiento en el que se utilizó medio
BG11 con una concentración 4mM de nitrato de sodio a una intensidad de 11
Kluxes con una media de 79.71 µg/mL; y el promedio más bajo con agua de
vertiente sin nitrato de sodio a 5 Kluxes (Tabla 3.15).
62
Tabla 3.15. Promedios e Intervalos de confianza de la concentración de
proteínas (µg/mL) con respecto al nitrato de sodio, irradiancia y medio de
cultivo. abla 0.17Tabla 3.15. Promedios e Intervalos de confianza de la
concende cultivo.
Nitrato de Sodio, en milimoles
Irradiancia, en kluxes
(1000 luxes)
Medio de Cultivo Media Intervalo de confianza al
95%. Límite inferior
Límite superior
0 mM 5 kluxes BG11 14,485 10,981 17,988 Agua de Vertiente 10,431 6,927 13,935 8 kluxes BG11 24,508 21,004 28,012 Agua de Vertiente 22,053 18,550 25,557 11 kluxes BG11 20,940 17,436 24,443 Agua de Vertiente 14,420 10,916 17,924 4 mM 5 kluxes BG11 67,104 63,601 70,608 Agua de Vertiente 27,105 23,601 30,609 8 kluxes BG11 72,709 69,205 76,213 Agua de Vertiente 39,000 35,496 42,504 11 kluxes BG11 79,718 76,214 83,221 Agua de Vertiente 20,268 16,764 23,772 8 mM 5 kluxes BG11 73,925 70,421 77,429 Agua de Vertiente 26,710 23,206 30,213 8 kluxes BG11 62,521 59,017 66,025 Agua de Vertiente 41,811 38,307 45,315 11 kluxes BG11 75,906 72,402 79,410 Agua de Vertiente 43,176 39,672 46,680
La interacción entre factores se aprecia en la siguientes gráficas de
perfil (Figura 3.26), a) con respecto al medio de cultivo y a la concentración de
nitrato de sodio, la producción de proteína es más elevada en medio BG11 con
una concentración de nitrato de sodio 4mM ; b) en cuanto al tiempo, se aprecia
que en medio BG11 se tiene el promedio más alto de concentración de
proteína en el día 27, muy por encima de los promedios conseguidos, cuando
se cultivó en agua de vertiente.
63
a.
b. b. b. Figura 3.26. Gráficas de Perfil de la producción de proteínas en µg/mL.
a. Interacción del medio de cultivo versus nitrato de Sodio. b. Interacción del
medio de cultivo versus el tiempo. Figura 32 Figura 3.18. Gráficas de Perfil de la producción de proteínas en µg/mL,
Las medias de la producción de proteínas con relación a la
concentración de nitrato de sodio versus la irradiancia se muestra en la
siguiente gráfica (Figura 3.19 a), en donde la mayor concentración de
proteínas se tiene a 11 Kluxes con medio de cultivo con una concentración de
nitrato de sodio 8mM. En la Figura 3.27 b. se representa la relación entre la
concentración de la biomasa (en barras), la concentración de proteínas (en
líneas) con respecto al medio de cultivo utilizado (BG11 y agua de vertiente).
Se aprecia que existe una relación proporcional.
Tiempo, en díasDía 30Día 27Día 24Día 21Día 18Día 15Día 12Día 9Día 6
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
Nitrato de Sodio, en milimoles8 mM4 mM0 mM
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
80.000
60.000
40.000
20.000
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
64
Medio de CultivoAgua de VertienteBG11
Med
ia C
élu
las/
mL
4,000,000
3,000,000
2,000,000
1,000,000
0
Med
ia Pro
teinas u
g/m
L
60.000
50.000
40.000
30.000
20.000
10.000
0.000
a.
b.
Figura 3.27. Promedio de la concentración de Proteínas
a. Irradiancia versus nitrato de sodio. b. Con relación al medio de cultivo y la
concentración celular. Figura 33 Figura 3.19. Promedio de la concentración de Proteínas
Mediante el análisis de varianza (ANOVA) se comprobó que para todas
las fuentes de variabilidad estudiadas existe significancia estadística,
mostrando que los grupos definidos por cada una de las variables y sus
interacciones dan lugar a una concentración de proteínas totales
significativamente diferente para todos los factores, siendo de estos los más
significativos, como indica el F, el nitrato de sodio, medio de cultivo y el tiempo
(Tabla 3.16).
Nitrato de Sodio, en milimoles8 mM4 mM0 mM
Med
ia P
rote
inas
ug/
mL
60.000
50.000
40.000
30.000
20.000
10.000
0.000
y
11 kluxes8 kluxes5 kluxes
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes)
65
Tabla 3.16. Análisis de varianza para la variable proteínas de Chlorogloea. Tabla 0.18Tabla 3.16. Análisis de varianza para la variable proteínas de Chlorogloea
Variable dependiente: Proteínas µg/mL
Fuente
Suma de cuadrados
tipo III gl Media
cuadrática F Significación Modelo corregido 787428,248(a) 161 4890,859 57,106 ,000 Intersección 814285,584 1 814285,584 9507,667 ,000 Nitrato 130707,823 2 65353,911 763,078 ,000 Luz 4656,436 2 2328,218 27,184 ,000 MCultivo 85490,982 1 85490,982 998,200 ,000 Tiempo 179435,501 8 22429,438 261,888 ,000 Nitrato * Luz 3226,271 4 806,568 9,418 ,000 Nitrato * MCultivo 40000,251 2 20000,125 233,523 ,000 Luz * MCultivo 4022,799 2 2011,400 23,485 ,000 Nitrato * Luz * MCultivo 6363,008 4 1590,752 18,574 ,000 Nitrato * Tiempo 64064,825 16 4004,052 46,752 ,000 Luz * Tiempo 61635,811 16 3852,238 44,979 ,000 Nitrato * Luz * Tiempo 68653,454 32 2145,420 25,050 ,000 MCultivo * Tiempo 53209,581 8 6651,198 77,660 ,000 Nitrato * MCultivo * Tiempo 19559,102 16 1222,444 14,273 ,000
Luz * MCultivo * Tiempo 23664,959 16 1479,060 17,270 ,000 Nitrato * Luz * MCultivo * Tiempo 42737,444 32 1335,545 15,594 ,000
Error 27749,029 324 85,645 Total 1629462,861 486 Total corregida 815177,277 485
a R cuadrado = 0,966 (R cuadrado corregida = 0,949)
La prueba de Tukey realizada para el factor nitrato de sodio (Tabla
3.17) muestra tres subconjuntos de datos, donde los promedios más altos
están en el primer subconjunto perteneciente a la concentración 8mM. Tabla 0.19Tabla 3.17 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor Nitrato de sodio
Tabla 3.17 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Nitrato de sodio (0 mM, 4 mM y 8 mM). DHS de Tukey
Nitrato de Sodio, en milimoles N
Subconjunto
2 3 1 0 mM 162 17,80600 4 mM 162 50,98390 8 mM 162 54,00816 Significación 1,000 1,000 1,000
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162
66
Con respecto a la irradiancia se han agrupado los promedios en dos
subconjuntos, siendo los mejores promedios conseguidos a 11 Kluxes y 8
Kluxes sin una diferencia significativa entre los promedios conseguidos con
estos dos niveles (Tabla 3.18). Tabla 0.20Tabla 3.17 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor Irradiancia ( 5 Kluxes, 8
Kluxes y 11 Kluxes).
Tabla 3.18 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Irradiancia ( 5 Kluxes, 8 Kluxes y 11 Kluxes). DHS de Tukey
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes) N
Subconjunto
2 1 5 kluxes 162 36,62647 11 kluxes 162 42,40453 8 kluxes 162 43,76705 Significación 1,000 ,382
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos.
La prueba de Tukey aplicada al factor tiempo, agrupa las medias de
proteínas en seis subconjuntos, donde se aprecia que para el día 30
únicamente se tiene el promedio más elevado, seguido del día 27, sin
diferencia estadística entre ellos (Tabla 3.19). Tabla 0.21Tabla 3.18 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor Tiempo, medido en días.
Tabla 3.19 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Tiempo, medido en días. DHS de Tukey
Tiempo, en días N
Subconjunto
2 3 4 5 6 1 Día 6 54 6,55835 Día 9 54 17,49929 Día 12 54 24,08089 Día 15 54 42,71057 Día 30 54 45,84381 Día 21 54 52,10531 Día 18 54 53,01361 Día 27 54 61,01988Día 24 54 65,56246Significación 1,000 1,000 1,000 ,709 1,000 ,212
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 54
67
3.3.3 Análisis Estadístico de la concentración de Proteína Total de
Nostoc (C15).
El promedio más alto para la concentración de proteína en el caso de
Nostoc (C15) se consiguió con el tratamiento con medio BG11 sin nitrato de
sodio a una intensidad de 11 Kluxes con una media de 125,395 µg/mL; y el
promedio más bajo con agua de vertiente sin nitrato de sodio a 5 Kluxes (Tabla
3.20). Tabla 0.22Tabla 3.19. Promedios e Intervalos de confianza de la concentración de proteínas (µg/mL) con respecto al nitrato de sodio, irradiancia y medio de cultivo.
Tabla 3.20 Promedios e Intervalos de confianza de la concentración de
proteínas (µg/mL) con respecto al nitrato de sodio, irradiancia y medio de
cultivo.
Nitrato de Sodio
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes) Medio de Cultivo Media
Intervalo de confianza al 95%.
Límite inferior Límite
superior 0 mM 5 kluxes BG11 54,108 49,259 58,956 Agua de Vertiente 12,500 7,652 17,349 8 kluxes BG11 86,246 81,397 91,094 Agua de Vertiente 12,403 7,555 17,252 11 kluxes BG11 125,395 120,547 130,244 Agua de Vertiente 13,337 8,489 18,1864 mM 5 kluxes BG11 63,188 58,339 68,036 Agua de Vertiente 17,879 13,030 22,727 8 kluxes BG11 73,698 68,850 78,546 Agua de Vertiente 18,721 13,873 23,570 11 kluxes BG11 66,339 61,491 71,188 Agua de Vertiente 19,224 14,376 24,0738 mM 5 kluxes BG11 68,527 63,678 73,375 Agua de Vertiente 21,090 16,241 25,938 8 kluxes BG11 110,824 105,976 115,673 Agua de Vertiente 18,900 14,052 23,749 11 kluxes BG11 69,273 64,425 74,121 Agua de Vertiente 25,796 20,947 30,644
La interacción entre factores se aprecia en la siguientes gráficas de
perfil, en la Figura 3.28a. se observa que con respecto al medio de cultivo y a la
concentración de nitrato de sodio, la producción de proteína es más elevada en
medio BG11 con promedios más altos sin nitrato de sodio. En la figura 3.28b.
68
con respecto al tiempo se nota que en medio BG11 se tienen mejores
promedios de concentración de proteína en el día 30, por encima de los
promedios conseguidos en agua de vertiente.
a.
b.
Figura 3.28. Gráficas de Perfil de la producción de Proteínas en µg/mL, a)
Interacción del medio de cultivo versus nitrato de sodio, b) Interacción del
medio de cultivo versus el tiempo. Figura 34 Figura 3.20. Gráficas de Perfil de la producción de Proteínas en µg/mL
Las medias de la producción de proteínas con relación a la
concentración de nitrato de sodio versus la irradiancia indican mayor
concentración de proteínas a 11 Kluxes con medio de cultivo sin nitrato de
sodio (Figura 3.29 a.). En la Figura 3.20 b. se representa la relación entre la
concentración de la biomasa (en barras), la concentración de proteínas (línea)
Nitrato de Sodio8 mM4 mM0 mM
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
Tiempo, en díasDía 30Día 27Día 24Día 21Día 18Día 15Día 12Día 9Día 6
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
250.000
200.000
150.000
100.000
50.000
0.000
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
69
con respecto al medio de cultivo utilizado (BG11 y agua de vertiente), se
aprecia que existe una relación proporcional.
a.
b.
Figura 3.29. Promedio de la concentración de proteínas
a) Irradiancia versus nitrato de sodio. b) Con relación al medio de cultivo y la
concentración celular. Figura 35 Figura 3.20. Promedio de la concentración de proteínas
Mediante el análisis de varianza (ANOVA) se concluyó que para todas
las fuentes de variabilidad estudiadas existe significancia estadística. Esto
quiere decir que los grupos definidos por cada uno de los factores y sus
interacciones dan lugar a la producción de proteínas totales significativamente
Med
ia P
rote
inas
ug/
mL 60.000
40.000
20.000
0.000
Nitrato de Sodio8 mM4 mM0 mM
11 kluxes8 kluxes5 kluxes
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes)
Medio de CultivoAgua de VertienteBG11
Med
ia C
élul
as/m
L
4,000,000
3,000,000
2,000,000
1,000,000
0
Media Proteinas ug/m
L
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
724,493
3,323,332
17.761
79.733
70
diferente. Con los F más altos de la tabla se indica las interaciones que tienen
un efecto más significativo sobre la concentración de proteínas (Tabla 3.21).
Tabla 3.21 Análisis de varianza para la variable proteínas de Nostoc (C15).
Fuente Suma de
cuadrados tipo III
gl Media cuadrática F Significación
Modelo corregido 2390855,82(a) 161 14850,036 90,558 ,000 Intersección 1154873,172 1 1154873,17
2 7042,617 ,000
Nitrato 7789,432 2 3894,716 23,751 ,000 Luz 20566,378 2 10283,189 62,709 ,000 MCultivo 466621,335 1 466621,335 2845,538 ,000 Tiempo 631630,427 8 78953,803 481,474 ,000 Nitrato * Luz 28352,656 4 7088,164 43,225 ,000 Nitrato * MCultivo 14502,751 2 7251,375 44,220 ,000 Luz * MCultivo 18682,568 2 9341,284 56,965 ,000 Nitrato * Luz * MCultivo 35151,910 4 8787,978 53,591 ,000 Nitrato * Tiempo 56663,124 16 3541,445 21,596 ,000 Luz * Tiempo 98135,836 16 6133,490 37,403 ,000 Nitrato * Luz * Tiempo 190108,606 32 5940,894 36,229 ,000 MCultivo * Tiempo 461422,685 8 57677,836 351,729 ,000 Nitrato * MCultivo * Tiempo 66323,906 16 4145,244 25,278 ,000
Luz * MCultivo * Tiempo 60144,062 16 3759,004 22,923 ,000 Nitrato * Luz * MCultivo * Tiempo 234760,168 32 7336,255 44,738 ,000
Error 53130,664 324 163,984 Total 3598859,678 486 Total corregida 2443986,506 485
a R cuadrado = 0,978 (R cuadrado corregida = 0,967)Tabla 0.23Tabla 3.20 Análisis de varianza para la variable Protínas de Nostoc sp.
La prueba de Tukey realizada para el factor nitrato de sodio (Tabla
3.22) muestra dos subconjuntos de datos, donde los promedios más altos
están en el primer subconjunto pertenecientes a las concentraciones de 4 mM y
8mM, sin diferencia estadística entre ellos. Tabla 0.24Tabla 3.21 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor Nitrato de sodio
Tabla 3.22 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Nitrato de sodio (o mM, 4 mM y 8 mM).
Nitrato de Sodio N
Subconjunto
2 1 4 mM 162 43,17488 0 mM 162 50,664938 mM 162 52,40157Significación 1,000 ,442
a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162,00
71
En cuanto a la irradiancia se han agrupado los promedios en dos
subconjuntos, siendo los mejores promedios conseguidos a 11 Kluxes y 8
Kluxes sin una diferencia significativa entre los promedios conseguidos con
estos dos niveles (Tabla 3.23). Tabla 0.25Tabla 3.22 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor Irradiancia (5 Kluxes, 8
Kluxes y 11 Kluxes).
Tabla 3.23 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Irradiancia (5 Kluxes, 8 Kluxes y 11 Kluxes). DHS de Tukey
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes) N
Subconjunto
2 1 5 kluxes 162 39,54841 11 kluxes 162 53,22748 8 kluxes 162 53,46549 Significación 1,000 ,985
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162,00
La prueba de Tukey considerando el factor tiempo, agrupa las medias
de proteínas en siete subconjuntos, donde se aprecia que para el día 30
únicamente se tiene el promedio más elevado, seguido del grupo conformado
por el día 27 y 24, sin diferencia estadísticamente significativa entre estos dos
días (Tabla 3.24). Tabla 0.26Tabla 3.23 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor tiempo, medido en días.
Tabla 3.24 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
tiempo, medido en días.
DHS de Tukey Tiempo, en días N Subconjunto
1 2 3 4 5 6 7 1 Día 6 54 5,18987 Día 9 54 6,53322 Día 12 54 16,84946 Día 15 54 24,78239 Día 18 54 45,28170 Día 21 54 66,69667 Día 27 54 77,41859 Día 24 54 83,48372 Día 30 54 112,48850Significación 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 ,255 1,000
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 54
72
3.3.4 Análisis Estadístico de la concentración de Proteína total de Nostoc
(C37). En cuanto a la producción de proteína obtuvo el mejor promedio de
concentración en µg/mL para el tratamiento en el que se utilizó medio BG11
con nitrato de sodio (4mM) a una intensidad de 11 Kluxes con una media de
141,188 µg/mL; y el promedio más bajo con agua de vertiente sin nitrato de
sodio a 11 kluxes (Tabla 3.25). Tabla 0.27Tabla 3.24. Promedios e Intervalos de confianza de la concentración de proteínas (µg/mL) con
Tabla 3.25 Promedios e Intervalos de confianza de la concentración de
proteínas (µg/mL) con respecto al nitrato de sodio, irradiancia y medio de
cultivo
Nitrato de Sodio, en milimoles
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes) Medio de Cultivo Media
Intervalo de confianza al 95%.
Límite inferior Límite
superior 0 mM 5 kluxes BG11 47,046 43,496 50,597 Agua de Vertiente 8,720 5,169 12,270 8 kluxes BG11 32,588 29,038 36,139 Agua de Vertiente 10,439 6,889 13,990 11 kluxes BG11 29,907 26,357 33,458 Agua de Vertiente 6,278 2,728 9,8294 mM 5 kluxes BG11 120,003 116,453 123,554 Agua de Vertiente 29,224 25,674 32,775 8 kluxes BG11 111,958 108,408 115,508 Agua de Vertiente 28,385 24,834 31,935 11 kluxes BG11 141,188 137,637 144,738 Agua de Vertiente 28,941 25,390 32,4918 mM 5 kluxes BG11 110,575 107,025 114,126 Agua de Vertiente 18,918 15,368 22,469 8 kluxes BG11 53,250 49,699 56,800 Agua de Vertiente 24,086 20,536 27,636 11 kluxes BG11 102,578 99,028 106,128 Agua de Vertiente 29,925 26,374 33,475
La interacción entre factores (Figura 3.21), con respecto al medio de cultivo y
la irradiancia indica que la producción de proteína es más elevada en medio
BG11 sin embargo se tienen mejores promedios para 5 y 11 Kluxes (Figura
3.21a). En cuanto al tiempo se nota que la máxima producción de proteína se
obtiene en el día 27, con el medio de cultivo BG11 (Figura 3.21b).
73
Figura 3.21. Gráficas de Perfil de la producción de Proteínas en µg/mL,
a. Interacción del Medio de cultivo versus la Irradiancia. b. Interacción del
Tiempo versus el Medio de Cultivo. Figura 36 Figura 3.21. Gráficas de Perfil de la producción de Proas en µg/mL,
Cuando analizamos las medias de la producción de proteínas con
relación a la concentración de nitrato de sodio versus la irradiancia se nota
claramente que la mayor concentración de proteínas se tiene a 5 Kluxes con
medio de cultivo con 8 mM (Figura 3.30).
Figura 3.30 Gráfica de la producción de Proteínas en µg/mL, con respecto a la
concentración de Nitrato de Sodio en relación a la Irradiancia Figura 37 Figura 3.22 Gráfica de la producción de Proteínas en µg/mL, con respecto a la concentración de
Nitrato de Sodio en relación a la Irradiancia
.
a. b.
Med
ia P
rote
inas
ug
/mL
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
Nitrato de Sodio, en milimoles8 mM4 mM0 mM
11 kluxes8 kluxes5 kluxes
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes)
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes)11 kluxes8 kluxes5 kluxes
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
Agua de VertienteBG11
Medio de Cultivo
Medio de CultivoAgua de VertienteBG11
Med
ias
mar
gina
les
estim
adas
140.000
120.000
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
Día 30Día 27Día 24Día 21Día 18Día 15Día 12Día 9Día 6
Tiempo, en días
74
Medio de CultivoAgua de VertienteBG11
Med
ia C
élu
las/
mL
6,000,000
4,000,000
2,000,000
0
Med
ia Pro
teinas u
g/m
L
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
2,982,539
6,475,432
20.546
83.233
Otro de los factores más significativos en la producción de proteínas es
el tiempo, en la gráfica inferior se destaca que la mayor concentración de
proteína se tiene en los días 18, 27 y 24 respectivamente, en todos los casos
coincide que se obtienen mejores resultados con el medio de cultivo 4mM
(Figura 3.31).
Figura 3.31 Gráfica de la producción de Proteínas en µg/mL, con respecto al Tiempo
y a la concentración de nitrato de sodio.
La producción de proteínas (línea) tiene una relación proporcional con
la concentración de células por mililitro (barras), para los dos medios de cultivo
utilizados. Como se puede apreciar en la siguiente gráfica, no obstante, en
agua de vertiente, la producción de proteínas es inferior a la barra que indica la
concentración celular (Figura 3.32).
Figura 3.32 Gráfica de la producción de proteínas en µg/mL, en relación a la
concentración de células por mililitro. Figura 38 Figura 3.24 Gráfica de la producción de proteínas en µg/mL, en relación a la concentración de
células por mililitro.
Tiempo, en díasDía 30Día 27Día 24Día 21Día 18Día 15Día 12Día 9Día 6
Med
ia P
rote
inas
ug/
mL
120.000
100.000
80.000
60.000
40.000
20.000
0.000
8 mM4 mM0 mM
Nitrato de Sodio, en milimoles
75
Al igual que en el caso de la biomasa, se aplicó la prueba de Levene
para contrastar la hipótesis de que los grupos definidos por los factores que
son objeto de este estudio, proceden de poblaciones con la misma varianza,
(Anexo F) y considerando la robustez de la prueba ANOVA, se dio paso a
considerar los resultados que originó.
Mediante el análisis de varianza (ANOVA) se concluyó que para todas
las fuentes de variabilidad estudiadas existe significancia estadística,
mostrando que los grupos definidos por cada una de las variables y sus
interacciones dan lugar a la producción de proteínas totales significativamente
diferente en todos los niveles (Tabla 3.26). Tabla 0.28Tabla 3.25 Análisis de varianza para la variable Proteínas de Nostoc sp. (C37).
Tabla 3.26 Análisis de varianza para la variable Proteínas de Nostoc sp. (C37).
Fuente
Suma de cuadrados tipo
III gl Media
cuadrática F Significación Modelo corregido 1781115,407(a) 161 11062,829 125,805 ,000 Intersección 1308561,755 1 1308561,755 14880,740 ,000 Nitrato 242536,543 2 121268,271 1379,042 ,000 Luz 17345,552 2 8672,776 98,625 ,000 MCultivo 477445,618 1 477445,618 5429,430 ,000 Tiempo 276974,423 8 34621,803 393,713 ,000 Nitrato * Luz 17612,154 4 4403,039 50,071 ,000 Nitrato * MCultivo 92457,600 2 46228,800 525,706 ,000 Luz * MCultivo 19421,905 2 9710,952 110,431 ,000 Nitrato * Luz * MCultivo 16455,927 4 4113,982 46,783 ,000 Nitrato * Tiempo 92370,180 16 5773,136 65,651 ,000 Luz * Tiempo 26789,495 16 1674,343 19,040 ,000 Nitrato * Luz * Tiempo 98788,925 32 3087,154 35,107 ,000 MCultivo * Tiempo 234863,975 8 29357,997 333,854 ,000 Nitrato * MCultivo * Tiempo 59007,846 16 3687,990 41,939 ,000
Luz * MCultivo * Tiempo 35654,706 16 2228,419 25,341 ,000 Nitrato * Luz * MCultivo * Tiempo 73390,559 32 2293,455 26,081 ,000
Error 28491,459 324 87,937 Total 3118168,622 486 Total corregida 1809606,866 485
a R cuadrado = 0,984 (R cuadrado corregida = 0,976)
76
La prueba de Tukey realizada para el factor nitrato de sodio (Tabla
3.27) muestra tres subconjuntos de datos, donde el nivel de 4mM tiene el mejor
promedio y se sitúa en el primer subconjunto.
Tabla 3.27 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Nitrato de sodio (0 mM, 4 mM y 8 mM). 0.29ato de sodio, irradiancia y medio de cultivo.
Nitrato de Sodio, en milimoles N
Subconjunto
2 3 1 0 mM 162 22,49652 8 mM 162 56,55534 4 mM 162 76,61645 Significación 1,000 1,000 1,000
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162
En lo que respecta al factor de la irradiancia, la prueba de Tukey
muestra dos subconjuntos en donde el promedio más alto de producción de
proteínas corresponde al generado a la intensidad de 11 Kluxes,
conjuntamente con el generado a una intensidad de 5 Kluxes (Tabla 3.28).
Tabla 3.28 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Irradiancia (5 Kluxes 8 Kluxes, 11 Kluxes). Tabla 0.30Tabla 3uxes, 11 Kluxes).
DHS de Tukeya,b
Irradiancia, en kluxes (1000 luxes) N
Subconjunto
2 1 8 kluxes 162 43,45099 5 kluxes 162 55,74790 11 kluxes 162 56,46942 Significación 1,000 ,768
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 162
En cuanto a la prueba de Tukey para el tiempo se ve que los
promedios más altos de la producción de proteínas se tienen al día 24, 27 y 18
respectivamente, agrupados en un solo subconjunto sin una diferencia
estadísticamente significativa entre ellos (Tabla 3.29).
77
Tabla 3.29 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Tiempo.Tabla 0.31Tabla 3.28 Prueba de Tukey para la variable Proteínas µg/mL del factor
Proteínas µg/mL DHS de Tukey
Tiempo, en días N
Subconjunto
2 3 4 5 6 1 Día 6 54 10,49464 Día 9 54 22,80939 Día 12 54 30,84179 Día 30 54 53,04055 Día 15 54 53,78611 Día 21 54 63,40418 Día 18 54 74,40003 Día 27 54 78,68523 Día 24 54 79,54303 Significación 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 ,105
Se muestran las medias para los grupos en subconjuntos homogéneos. a Usa el tamaño muestral de la media armónica = 54 b Alfa = 0,05.
78
CAPÍTULO 4: DISCUSIÓN
La determinación de las cianobacterias mediante clave microscópica,
en condiciones naturales, es generalmente complicada y los criterios que se
emplean para las especies se basan en caracteres observables que
habitualmente presentan una elevada variabilidad (Alba-Lois et al., 2008). Sin
embargo, en el presente trabajo se utilizaron los lineamientos disponibles para
establecer una identificación confiable, la clave de Bergey’s sirvió para
establecer características generales; y con las claves de Komárek &
Anagnostidis, 1998 y Desickachary, 1959, se señalaron características
específicas con información más detallada para cada género; además de ser
las más utilizadas en publicaciones similares (Argañaraz et al., 2005; De
Domitrovic et al., 2005).
La separación del género Nostoc y Anabaena ha sido discutida en los
últimos años (Henson et al., 2002; Tamas et al., 2000), existen muchas
características similares entre estos dos géneros que complica su
diferenciación, por eso se ha tomado como referencia el ciclo de vida particular
que presenta Nostoc para poder establecer su diferencia de Anabaena.
Espíndola (2010) reporta el crecimiento de la cianobacteria C15 en
cuatro fases, que ratifican los datos respecto a la cianobacteria de esta
investigación, esta peculiaridad permitió aseverar que se trata de Nostoc, muy
probablemente de la cepa Nostoc commune por la semejanza encontrada en
bibliografía C15 y C37 perteneciendo al mismo género presentaron
características morfológicas que les distinguen entre ellas, pero también con
similitudes generales que les sitúan dentro del mismo grupo.
Los estudios de filogenia de las cianobacterias han demostrado que las
relaciones genéticas a veces generan conflicto con la clasificación morfológica
(Lyra et al., 2001; Iteman et al., 2002; Gugger & Hoffmann, 2004). De hecho, la
comparación morfológica con los datos genéticos se ha visto entorpecida por la
escasez de cultivos de varias morfoespecies de cianobacterias y datos
morfológicos poco adecuados de cepas ya secuenciadas, además de que
79
algunas cepas podrían perder características importantes como las vesículas
de gas y la forma de la colonia durante un largo cultivo en el laboratorio
(Lehtimäki et al., 2000; Gugger et al., 2002, Papaefthimiou et al., 2008) lo que
hace más difícil la identificación.
La cantidad de exopolisacáridos en los cultivos de las tres
cianobacterias, posiblemente se debió a la escasez de nitrógeno en que se
desarrollaron, estas condiciones de diazotrofía, estimulan la síntesis y
liberación de exopolisacáridos solubles y capsulares. Tal como ha sido descrito
en Limnothrix sp., Oscillatoria sp., Nostoc LAUN 0015, Phormidium sp., y en
Cyanothece (De Philippis et al., 1993; De Philippis y Vincenzini, 1998; Ortega et
al., 2004; Fuenmayor, 2005; Rosales, 2007; Jonte, 2008), reportados por Piña
(2009).
Para una identificación más específica y para poder ubicar a las
cianobacterias de este trabajo dentro de una especie sería necesario realizar
pruebas como perfiles proteínicos SDS-PAGE, secuenciación en base a la
subunidad 16S rRNA, RFLP’s y fingerprinting genómico para identificar
polimorfismos y ubicar las cepas dentro de la especie correcta, la
caracterización con respecto a la producción proteínica y crecimiento que aquí
se presenta, deja un importante precedente de cianobacterias prometedoras en
un nivel industrial que deberían ser consideradas para futuros análisis a nivel
molecular.
Las tres cianobacterias que sirvieron para este trabajo de investigación
presentaron heterocistos en el medio diferencial carente de nitrato de sodio. En
el caso de Chlorogloea (C10) fue de significativa importancia la identificación
de las estructuras heterocísticas, situándola en este género mediante las
claves de Komárek y Anagnostidis 1989 y con la clasificación de Rippka (1979)
la subsección I de las cianobacterias unicelulares.
Hasta recientemente, la capacidad para la fijación de nitrógeno entre
las algas verde azules (cianobacterias) se consideró invariablemente asociada
con la habilidad de formar heterocistos, los cuales no son producidos por
80
cianobacterias unicelulares como es el caso de las Chroococales con la
excepción de Chlorogloea fritschii, un organismo cuya asignación a las
Chroococales es aún controversial (Stanier et al., 1971), no obstante, existen
varias publicaciones con respecto a la presencia de estas estructuras en
Chlorogloea (Fay, 1965; Peat y Whitton 1967; Evans H y G, Britton, 1983). En
esta investigación se vio que puede mostrarse como pseudofilamentosa y en
colonias de células independientes agrupadas en relación a la edad del cultivo.
Es importante subrayar que la cuantificación de células por mililitro
mediante la técnica de conteo con cámara de Neubauer está sujeta al error del
ojo del investigador, mientras que la cuantificación de biomasa mediante
turbidez o peso seco puede verse afectada por la descomposición de fuentes
orgánicas o minerales (Piña, 2009), es decir, materia muerta; es por eso que se
precisó la concentración celular mediante una correlación de los datos de las
absorbancias medidas, y así con la creación de un modelo para cada
cianobacteria se aproximó con mayor exactitud la concentración celular de
cada una.
Con respecto a la concentración de biomasa en los tres tipos de
cianobacterias que se estudiaron, se aprecia una importante significancia del
medio de cultivo que se utilizó. Los mejores resultados se obtuvieron para el
medio BG11 mientras que para el agua de vertiente la concentración de
biomasa fue baja, además de presentar una coloración pálida; las causas
apuntan directamente a la composición del agua de vertiente que se utilizó, que
en comparación con el medio BG11 tiene deficiencia en metales de gran
importancia para el desarrollo de las cianobacterias como es el caso del
Molibdeno, presente en el BG11 como molibdato de sodio (Na2MoO4.2H2O).
Así mismo, se puede constatar la necesidad de metales importantes
para el desarrollo y la síntesis de proteínas (Wolk, 1973), se tiene reportes de
la importancia de elementos como hierro y calcio, como agentes quelantes y el
molibdeno como cofactor, por estar contenido en el Mo-Fe de la nitrogenasa, el
cual actúa como aceptor de electrones, de gran importancia para la fijación del
81
nitrógeno y la regulación de la síntesis de la nitrogenasa (Devlin, 1982).
Además en varias publicaciones se menciona al calcio en la fijación de
nitrógeno atmosférico como protector de la nitrogenasa contra una inactivación
por O2 (Giráldez, 1997; De Philippis et al., 1998; Brill et al., 1974; Kennedy and
Postgate, 1977).
El agua de vertiente proviene de una fuente muy cercana al Pasochoa,
lugar donde se ha reportado minerales de origen volcánico (IEDECA, 2008),
que le proporcionan una composición rica en macronutrientes como: nitrógeno,
fósforo, potasio, calcio, magnesio, y micronutrientes como el zinc, cobre, calcio
y molibdeno, sumado a esto, la poca presencia humana hace que esta agua
sea de muy buena calidad. Tomando en cuenta esto se decidió no suplementar
al medio de cultivo con metales adicionales en perspectiva de probar el
crecimiento microalgal masivo con un medio de cultivo que pueda ser
aprovechado manteniendo su composición original de minerales que las
cianobacterias necesitan en una cantidad mínima y que sea de fácil acceso en
perspectiva a su utilización con fines prácticos.
Los análisis de la composición del agua de vertiente que estuvieron
disponibles no incluyeron al molibdeno (Anexo D) sin embargo las
concentraciones de macro y micro nutrientes de esta agua permitieron que las
cianobacterias se adaptaron y crecieran.
Con respecto a las pruebas de homogeneidad del análisis estadístico
se conoce que en todo experimento siempre habrá un remanente de
variabilidad debida a causas comunes o aleatorias que provocan la variabilidad
natural del proceso (Gutiérrez et al., 2008).
La prueba de Levene consiste en llevar a cabo un análisis de varianza
de un factor utilizando como variable dependiente la diferencia en valor
absoluto entre cada puntuación individual y la media (o la mediana, o la medida
recortada) de su grupo. La significancia asociada al estadístico de Levene
permitió contrastar la hipótesis de homogeneidad de varianzas: en este trabajo
82
los resultados arrojaron que para las tres cianobacterias, el valor crítico es
menor que 0,05 y, por lo tanto, se podría rechazar la hipótesis de
homogeneidad.
Considerando la extensión del diseño experimental, el número de
repeticiones por tratamiento no ameritó el realizar pruebas no paramétricas. La
robustez de la prueba ANOVA mostró su pertinencia.
En lo que se relaciona con la cinética de crecimiento y la producción de
proteínas de las tres cianobacterias, como era de esperarse, los resultados
indican diferencias en los tratamientos aplicados. Todos los factores y sus
interacciones resultaron ser significantes: el medio de cultivo, la concentración
de nitrato de sodio, el tiempo y la irradiancia, exceptuando este último en el
crecimiento de C10, asignada al género Chlorogloea, en donde la intensidad
luminosa no desempeñó un papel significante en su desarrollo y llegó a ser la
cianobacteria con la máxima concentración de células por mililitro con
alrededor de 14x106 cel/mL en el tratamiento con medio de cultivo BG11 con
una concentración 4mM de nitrato de sodio a 8 Kluxes en el día 24.
En trabajos parecidos (Jonte et al., 2003; Loreto et al., 2003) se puede
constatar que las microalgas crecen mejor con mayores niveles de nitrato de
sodio, sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta particularidad no se rige a
todos los cultivos microalgales, que presentan necesidades nutricionales
variadas dependiendo de la especie a la que pertenezca. Dentro de cada
especie, los requerimientos también varían en función de las condiciones
ambientales como luz, temperatura y pH (Abalde, 1995; Jonte et al., 2003;
Saswati y Prasanna, 2007; Rajaniemi, 2005) es así que los resultados indican
diferencias entre cada tipo de cianobacteria para conseguir mayor crecimiento
y producción de proteínas; se debe enfatizar que en medio de cultivo carente
de nitrato de sodio se observó un importante crecimiento de biomasa, en
condiciones diazotróficas.
83
Cuando se construyó la curva de crecimiento en C15 se observa un
decrecimiento para el día 21 con una aparente fase estacionaria que repunta
en el día 27, este fenómeno puede explicarse por el hecho de que la cianoficina
normalmente se acumula durante la fase estacionaria inducida por una falta de
nutrientes aparte del nitrógeno y desaparece cuando el crecimiento se equilibra
(Allen, 1984; Simón, 1987) también se acumula cuando las células carentes o
repletas de nitrógeno tienen acceso a una fuente de nitrógeno utilizable
(Brownel, 1967; Allen & Hutchison, 1980; Lawry & Simon, 1982;). En estudios
similares a las células carentes de nitrógeno a las que se les proporcionó una
fuente nitrógenada, se pudo ver que la cianoficina aumentó temporalmente, y el
crecimiento no recomenzó hasta que la cianoficina se degradó de nuevo (Allen
& Hutchison, 1980). Esto demostró que la cianoficina tiene un metabolismo
dinámico bajo algunas condiciones y simplemente no se metaboliza durante el
exponencial a la transición de la fase estacionaria, esta proteína es la
responsable de frenar o estimular el metabolismo de las células que claramente
puede verse con variaciones en las curvas de crecimiento.
La intensidad luminosa a la que se obtuvo mayor concentración de
proteínas fue la de 11 Kluxes, se atribuye al hecho de que en fase exponencial
las células aceleran su maquinaria fotosintetizadora y se ven beneficiadas con
mayor cantidad de luz en el entorno (Raps et al., 1983).
En el caso del crecimiento de Chlorogloea (C10) la intensidad lumínica
no tuvo un efecto estadísticamente significativo, mas no fue así en lo que
respecta a la producción de proteínas, en donde si tuvo incidencia, es decir que
el metabolismo celular dirigido a la producción de proteínas se ve modificado
con la intensidad de luz, mas no se afecta el crecimiento celular. Oh y Rhee
(1991) sugieren que la demanda de luz para la fotosíntesis y para el
crecimiento no es la misma, ya que existen otros factores que también
participan como la respiración y el metabolismo basal.
Jonte et al., 2003, registraron un incremento progresivo en el contenido
de proteínas, a medida que aumentaba la intensidad luminosa al igual que en
84
Fábregas, 2002. Se anota que la influencia de la luz varía de un género a otro e
incluso entre especies, es así que cada cepa tiene un rango óptimo de
crecimiento en función de la irradiancia.
Se destaca además que la asimilación de nitrógeno es dependiente de
la luz por la necesidad de la intervención de ATP que se obtiene en la
fotosíntesis para el transporte activo de nitrato (Rajasekarán et al., 1981) En
estudios similares, se ha reportado la influencia de la irradiancia en el
contenido de proteínas.
En Loreto et al., 2003 han encontrado mayor contenido de proteínas a
156 µmol m-2 s-1 (aprox. 11000 luxes), además destacan que la incorporación
del nitrato en microalgas y cianobacterias es dependiente de la fotofosforilación
y de la irradiancia (Tischner & Lorenzen, 1979). De tal manera que, la velocidad
de transporte de este nutriente pueda estar influida a una determinada
intensidad luminosa.
Con respecto al medio de cultivo en la producción de proteínas se tiene
mejores resultados con BG11. Esto se explica porque la suficiente
concentración de nutrientes en el medio que permite la asimilación eficiente de
nitrógeno para la síntesis de proteínas, lo que no sucede con el agua de
vertiente.
Llama la atención que en Nostoc (C15) se tiene el promedio más alto
de producción de proteínas cuando se cultivó en medio BG11 sin nitrato de
sodio. Según se reporta en Thomas (1984), la deficiencia de sodio en el medio
de cultivo resulta en una significante reducción en el contenido de nitrógeno
total y en compuestos a base de nitrógeno, especialmente aminoácidos y
proteínas, sin embargo, la actividad de dos enzimas clave involucradas en la
asimilación de NH4+ y la síntesis de otros aminoácidos, como la glutamina
sintetasa y aminotransferasa, son independientes de la presencia de Na+,
además, la tasa de incorporación de aminoácidos dentro de las proteínas y por
85
lo tanto su síntesis proteica en cultivos con deficiencia de Na+, se ve mejorada
como ya ha sido reportado en A. torulosa.
La concentración de nitrato influyó en la producción de proteínas de
todas las cianobacterias y además muy ligado a este factor está la etapa de su
desarrollo en la que se encuentran, es así que coinciden los valores más altos
en los tres microorganismos en los días finales de su etapa exponencial y en la
estacionaria debido a la deficiencia de nitrógeno, y a la necesidad de movilizar
el nitrógeno existente hacia rutas metabólicas esenciales para la síntesis de
macromoléculas proteicas (Alison, 1990).
De las tres cianobacterias la concentración de proteínas mas alta
conseguida con Nostoc (C37) supera la cuantificación de proteínas en otros
estudios de cultivos microalgales similares (Quevedo et al., 2008, Loreto y
Morales, 2003).
86
CAPITULO 5. CONCLUSIONES
5.1 Las cianobacterias de este estudio se asignaron a los géneros
Chlorogloea, perteneciente a la familia Entophysalidaceae orden de las
Chroococcales y, las otras dos, a Nostoc de la familia Nostocaceae del orden
de las Nostocales, por la clasificación tradicional Komárek & Anagnostidis,
1989; Desikachary, 1959 y la subsección I de la clasificación bacteriológica
Rippka et al., 2001 en el manual de Bergey’s
5.2 Las máximas concentraciones celulares que se alcanzaron para cada
cianobacteria fueron: Chlorogloea (C10) 14x106 cel /mL, Nostoc (C15) 8x106
cel/mL y Nostoc (C37) 10x106 cel /mL.
5.3 El promedio de concentración de proteínas más alto para Chlorogloea. Se
consiguió con el tratamiento que utilizó medio BG11 con una concentración
4mM de nitrato de sodio a una intensidad de 11 Kluxes con una media de
79,718 µg/mL.
5.4 El promedio de concentración de proteínas más alto para Nostoc (C15) se
consiguió con el tratamiento que utilizó medio BG11 sin nitrato de sodio a una
intensidad de 11 Kluxes con una media de 125,395 µg/mL.
5.5 El promedio de concentración de proteínas más alto para Nostoc se
consiguió con el tratamiento que usó medio BG11 con nitrato de sodio (4mM) a
una intensidad de 11 Kluxes con una media de 141,188 µg/mL.
5.6 Todos los factores que se utilizaron así como sus interacciones
demostraron ser estadísticamente significantes para determinar la
concentración de biomasa y la producción de proteínas en las tres
cianobacterias, con la excepción de la irradiancia en el caso de Chlorogloea
(C10).
87
5.7 El agua de vertiente presenta serias limitaciones para el crecimiento de
las tres cianobacterias, que, si bien lograron adaptarse, su producción de
biomasa y proteínas totales es notablemente menor que en el medio de cultivo
BG11, atribuyendo este hecho a la escasez de metales fundamentales en su
composición.
88
CAPITULO 6. RECOMENDACIONES
Las asociaciones cianobiontes que desempeñan las cianobacterias epífitas de
este trabajo en el equilibrio del ecosistema de los bosques de Polylepis pauta
podría ser motivo de un trabajo amplio.
Sería conveniente realizar una caracterización molecular de las tres
cianobacterias descritas en este trabajo para aseverar la especie a la que
pertenecen.
Según las observaciones realizadas, las tres cianobacterias presentan una
notable capa mucilaginosa que las recubre, esto es un claro indicio de la
presencia de exopolisacáridos que podrían cuantificarse en un trabajo
posterior.
La producción proteica de las tres cianobacterias podría ser aprovechada en
alimentación animal o humana una vez que se realicen pruebas de toxicidad en
Daphnia magna o pullex, Hydra attenuata o Artemia y su actividad hemolítica.
Sería importante probar el crecimiento de las cianobacterias suplementando el
agua de vertiente con metales traza de la composición del medio BG11 que
son básicos para su crecimiento y así abaratar los costos que implica un cultivo
microalgal masivo.
Las cianobacterias podrían ser masificadas utilizando medios mixotróficos o
heterotróficos como medio de cultivo y asi se evitaría el suministro de luz, sin
embargo podrían ocurrir problemas con la contaminación de otro tipo de
microorganismos, por lo tanto es necesario realizar ensayos sobre este tema.
Es notorio que los factores ambientales influyen considerablemente en el
desarrollo y metabolismo microalgal, en este caso se notó que se conseguía un
crecimiento mejor al inocular las cianobacterias en medio de cultivo frío (5-6ºC
aprox.)
89
CAPITULO 7. BIBLIOGRAFÍA
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110
ANEXOS ANEXO A. Tipos, origen y propiedades de las toxinas de cianobacterias (Codd
GA and Bell SG, 1996 modificado por Pereira et al., 2005).
Toxina Géneros productores Estructura molecular
Número de variantes
NEUROTOXINAS
Anatoxina-a
Anabaena,Microcystis ,
Oscillatoria, Phormidium,
Aphanizomenon
Alcaloide, Amina
secundaria 1
Homoanatoxina-a Phormidium Amina Secundaria
Alcaloide 1
Toxinas PSP, “Paralitic
Shellfish Poisoning”
(Saxitoxinas, neo-
saxitoxinas,toxinas GTX)
Aphanizomenon, Anabaena Alcaloides Al menos 8
Anatoxina-a (s) Anabaena
Éster de
guanidina metil
fosfato
1
HEPATOTOXINAS
Nodularina Nodularia Pentapéptido
cíclico 6
Microcistinas Microcystis, Anabaena,
Nostoc, Oscilatoria
Hapapéptido
cíclico >50
Cilindrospermosina Cylindrospermopsis,
Umezakia
Alcaloide cíclico
guanidina 1
ENDOTOXINAS
LPS Muchos géneros Lipopolisacárido >3
ANest
For
N.
eda
NEXO B. (tudio.
rmación de
paludosu
aphicum. f.
Pag.1) Esq
e acinetos
b. N. kihlm
Ciclo de vi
quema de
apoheteroc
manii c. N
ida de Nos
111
e las ciano
cíticos de d
N. commune
toc. Anagn
a
c
e
obacterias
diferentes e
e d. N. pun
ostidis, K. y
relaciona
especies d
niforme
y Komárek,
adas con e
e Nostoc.
e. N
, J. (1985).
b
d
f
el
a.
N.
112
e.
(Pg.2) Tricomas metaméricos en algunos tipos de Anabaena. a. Esquema
comparativo de los tricomas con sus heterocistos (H) y paraheterocistos (PH).
b. A. viguieri. c. A. pertutbete d. A. subcylindrica. e. A. solitaria. (Kómarek,
1975).
a.
b c
d
113
(pg.3) Formas comunes de algunos géneros de Chlorogloea. a. C. tuberculosa.
b. C. purpúrea. c. C. microcystoides durante su desarrollo (Geitler, 1932).
a. b
c.
c.
114
Cuadro 2.3. Macroelementos del medio de cultivo BG11 (Rippka et al. 1979).
ANEXO C Preparación de medio de cultivo BG11
Líquido.
Para preparar el medio BG11, previamente se tiene la solución de metales
traza y de los macroelementos por separado cuya composición se indica en los
siguientes cuadros.
Metales traza mg/L
Na2MoO4 . 2H2O 0.39H3BO3 2.8Co(NO3)2 . 6H2O 0.049MnCl2 . 4H2O 1.8ZnSO4 . 7H2O 0.2CuSO4 . 5H2O 0.079
Componente g/LNaNO3 1.5K2HPO4 0.03MgSO4 . 7H2O 0.075CaCl2 0.036Ácido cítrico 0.006Citrato amónico férrico 0.006Na2CO3 0.02EDTA – Na2 0.001
A los macroelementos se le añade 1 mL de la solución de metales traza, en 1 L
de agua destilada. Se puede agilitar la disolución de los componentes del
medio de cultivo mediante la aplicación de agitación magnética, pero no se
debe suministrar calor, se dispensa y esteriliza el medio de cultivo a 121°C y 15
psi de presión durante 15 minutos (Koch et al, 2008).
Cuadro 2.2. Solución de metales traza del medio de cultivo BG11 (Rippka et al. 1979).
115
Sólido Disolver los componentes del Cuadro 2 conjuntamente con 1 mL de la
solución de metales traza del Cuadro1, en 500 mL de agua destilada. Se puede
agilitar la disolución de los componentes del medio de cultivo mediante la
aplicación de agitación magnética, pero no se debe suministrar calor.
- En otro recipiente, se disuelve 12.5 g de bacto agar en 500 mL de agua
destilada, con la ayuda de agitación magnética y suministro de calor.
- Esterilizar ambas soluciones a 121°C y 15 psi de presión durante 15
minutos.
- Enfríe las soluciones a aproximadamente 50 °C, mézclelas y dispense el
medio de cultivo en cajas petri estériles (Koch et al, 2008).
116
ANEXO D. Componentes del Agua de Vertiente a Utilizar*
Anexo E Componentes del Agua de Vertiente a Utilizar*
Parámetros Resultados (ppm) Amonio (mg NH₄⁺/l) 0,01 Bicarbonatos (mg HCO₃⁻/l) 59,5 Carbonatos (mg CO²⁻₃/l) 0 Calcio (mg Ca²⁺/l) 9,6 Cloruros (mg Cl⁻/l) 1,6 Cobre (mg Cu⁺/l) 0,03 Dureza total (mg CaCO₃/l) 38 Fosfatos (mg PO³⁻₄/l) 0,43 Magnesio (mg Mg²⁺/l) 3,4 Manganeso (mg Mn²⁺/l) <0,001 Nitratos (mg NO₃⁻/l) 20,7 Nitrógeno total (mg NTK/l) 1,4 Potasio (mg K⁺/l) 2,9 Salinidad (g/kg) 33.5Sulfatos (mg SO₄²⁻/l) 1 Zinc (mg Zn²⁺/l) 0,05 Sodio (mg Na1⁺/l) 8.87
* Resultados del Análisis del Agua realizado en el laboratorio de Aguas y Microbiología
y Metalurgia Extractiva de la Escuela Politécnica Nacional.
117
ANEXO E. Correlación de los datos de absorbancia y conteo celular.
Chlorogloea (C10).
Nostoc (C15)
y = 1E+07x + 2E+06R² = 0,929
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
18000000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Chlorogloea (C10).
y = 6E+06x ‐ 14695R² = 0,926
‐2000000
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
0 0,5 1 1,5 2
Nostoc (C15)
Absorbancia
118
Nostoc (C37)
y = 8E+06x ‐ 46860R² = 0,991
‐10000000
100000020000003000000400000050000006000000700000080000009000000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Nostoc (C37)
Absorbancia
Células /m
L (Neu
baue
r)
119
ANEXO F Prueba de Levenne para la homogeneidad de las varianzas
A partir de los datos tomados para el crecimiento de cada una de las
tres cianobacterias mediante turbidez y recuento celular, se estableció un
modelo de cuantificación de células por mililitro, mediante la correlación de los
dos grupos de datos. A partir de los datos de concentración celular obtenidos,
se procedió al análisis estadístico con relación a la biomasa (cel/mL) obtenida a
lo largo de la medición.
Se aplicó la prueba de Levene para contrastar la hipótesis de que los
grupos definidos por los factores que son objeto de este estudio en cada una
de las tres cianobacterias, proceden de poblaciones con la misma varianza, y
considerando la robustez de la prueba Anova, se dio paso a considerar los
resultados que originó.
Para cada una de las cianobacterias se analizó la concentración de cel/mL
tomando en cuenta los diferentes niveles de los factores en que fueron
cultivadas
BIOMASA Chlorogloea (C10) Contraste de Levene sobre la igualdad de las varianzas error(a) Variable dependiente: Células/mL
F gl1 gl2 Significación 4,468 161 324 ,000
Nostoc (C15) Contraste de Levene sobre la igualdad de las varianzas error(a) Variable dependiente: Células/mL
F gl1 gl2 Significación 7,802 161 324 ,000
120
Nostoc (C37) Contraste de Levene sobre la igualdad de las varianzas error(a) Variable dependiente: Células/mL
F gl1 gl2 Significación 7,493 161 324 ,000
PROTEINAS Chlorogloea (C10) Contraste de Levene sobre la igualdad de las varianzas error(a) Variable dependiente: Proteinas µg/mL
F gl1 gl2 Significación 4,558 161 324 ,000
Nostoc (C15) Contraste de Levene sobre la igualdad de las varianzas error(a) Variable dependiente: Proteinas µg/mL
F gl1 gl2 Significación 5,434 161 324 ,000
Nostoc (C37) Contraste de Levene sobre la igualdad de las varianzas error(a) Variable dependiente: Proteinas µg/mL
F gl1 gl2 Significación 4,254 161 324 ,000
121
ANEXO G Claves Microscópicas
Anexo H Claves Microscópicas
Clave Microscópica Nostoc vaucher. Tallos mucilaginosos gelatinosos o coriáceos, al principio globosos, luego
oblongos al final, folioso, filiforme, bulloso, sólido o hueco, sin adhesiones, la
periferia densa y de color opaco, de filamentos flexibles, curvada o enredada; la
matriz es a veces distinta, generalmente difluente, de tricoma toruloso (de
cuerpo cilíndrico; hinchado y estrecho por intervalos); de células hendidas,
esféricas, cilíndricas o de forma de barril; heterocistos intercalados, y en
condiciones juveniles terminales; esporas esféricas u oblongas, formadas
centrífugamente en series entre los heterocistos (Desickachary, 1959).
Clave de las especies.
1. Tallos unidos, maculiformes, filamentos retorcidos.........................1. N. maculiforme (p. 374)
1. Tallos no maculiformes.............................................................................................................2
2. Tallos sin una pared externa firme, más o menos suaves y sin forma.........................3
2. Tallos con una pared firme........................................................................................15
3. Tricomas muy densamente enrollados apenas vistos 2.4-4.4 µ de ancho 2. N. punciforme
(p. 374).
3. Tricomas menos densamente enrollados en su mayoría claramente visible............................4
4. Tallos microscópicamente pequeños..........................................................................5
4. Tallos macroscópicos....................................................................................................6
5. Tricomas 2.5-3 u de ancho, relativamente densamente dispuestos....3 N. entophytum (p 375)
5. Tricomas 3.3-5 u de ancho, laxos (sin tensión)....................................4. N. palodosum (p.
375)
6. Acuático........................................................................................................................7
6. Subaéreo.....................................................................................................................11
7. Tricomas densamente arreglados enrollados...............................................5. N. linkia (p. 377)
7. Tricomas no arreglados densamente .......................................................................................8
8. Esporas esféricas.......................................................................6. N. piscinale (pg. 377)
8. Esporas más largas que anchas...................................................................................9
9. Células cilíndricas....................................................................................................................10
9. Células un poco mas largas que anchas.................................................7. N. rivulare (p. 379)
10. Heterocistos 7-8 µ de ancho, esporas 6-7 x 10-12 u 8. N. spongiaeforme
10. Heterocistos 6µ de ancho. Esporas 6 X 8-10u.....................9. N. carneum (p. 381)
122
11. Células cilíndricas..............................................................................10. N. ellipsosporum (p.
383)
11. Células de forma de barril, mas cortas o mas largas que
anchas..........................................12
12. Tricomas 2.2-3 u de ancho.......................................................................................13
12. Tricomas 3.5-5 u de ancho........................................................................................14
13. Esporas oblongas...........................................................................11. N. humifusom (pg. 84)
13. Esporas esféricas..................................................................................12. N calcicota (p.
384)
14. Tricomas paralelos, esporas 6x 8 µ................................13. N. passerinianum (p. 385)
14. Tricomas con modo no definido arreglo......................14. N. moscorum (p. 385)
15.
Subaereas..............................................................................................................................16
15. Acuáticas...............................................................................................................................17
16. Tallo muy largo, llano, membranoso...............................15. N. commune (p. 387)
16. Tallo pequeño de 1mm o que alcanzan un máximo de 1 cm, mas o menos esférico,
Tricomas de 5 a 8u de ancho............................................................16. N. microscopicum
(p.387)
17. Tricomas no dispuestos radialmente....................................................................................18
17.Tricomas dispuestos radialmente..........................................................................................21
18 Tallos arrugados en la superficie.....................................17. N verrucosum (p.388)
18. Tallos lisos en la superficie.......................................................................................19
19. Heterocistos de aprox. 10u de ancho...................................18. N. coeruleum (p. 388)
19. Heterocistos más estrechos..................................................................................................20
20. Colonias adultas de varios cm de diámetro.................................................22
20. Colonias sobre los 2 cm de diámetro................................19. N. hatei (p.389)
21. Tallos adheridos, discoidales o ligulados...................................20. N. parmelioides (p. 389)
21. Tallos de libre natación, más o menos esféricos.......................21. N. pruniforme (p.390
22. Tricomas de 4 a 5 u de ancho, tallos sobre los 7 cm de ancho.
.....................................................................................................22.Nostoc sphaericum (p.390).
22. Tricomas de 2 a 3 u de ancho, tallos más largos.......23. N. amplissimum (p.390)
(Desickachary, 1959).
Clave de identificación morfológica Chlorogloea
Colonias mucilaginosas, multicelulares, en el contorno más esférico,
hemisférico, llano o granular irregular con la superficie áspera, a menudo
compuesta de subcolonias, normalmente macroscópicas, fijas a un sustrato
(plantas, piedras) o de vida libre, epipélicas o metáficas, a veces formando una
123
masa gelatinosa grande compuesta solamente de microcolonias (Komárek &
Anagnostidis (1998)..
Clave para el género 1ª Células sin envoltura individual diferenciada, o con envoltura simple sin estratificación;
colonias micro o macroscópicas……………………………………………………………….….2
1b Células con envoltura individual estratificada interna invariable; colonias usualmente
grandes, macroscópicas…………………………………………………………………………...4
2ª Tallos con precipitados de hierro…………………………………………...……1. Paracapsa
2b Tallos sin precipitados de hierro……………………………………………………..………..3
3ª Tallos compuestos de “fasículos” de células encapsuladas en hileras diferenciadas y
ordenadas (las envolturas individuales confluyen alrededor de las células)…..2. Lithocapsa
3b Tallos irregulares, células en hileras solamente en colonias jóvenes y en colonias
marginales; células con y sin envoltura individual sencilla…………………….3. Chlorogloea
4ª Colonias ± amorfas en los márgenes de consistencia babosa; la organización radial de las
células es reconocible solamente en las colonias internas………………4. Entophysalis
4b Colonias firmes, pseudodicotomales o irregularmente ramificadas con la superficie
firmemente delimitada, polarizada; células organizadas irregularmente, ± radiales solamente en
las colonias marginales……………………………………..……..5. Cyanoarbor
Clave de las especies
1a Marina, epifítica y epizóica en la región litoral; de mucílago incoloro, carente de estructura, células
de aproximadamente 1 a 2.5 um de diámetro……………………………………………1. C. tuberculosa.
1b Agua dulce y especies aerofíticas…………………………………………………………………………2
2a Células esféricas de 1.5 a 2.5 um de diámetro, rojizas con especies bentónicas en lagos de agua
clara, sin estructura mucilagenosa y sin coloración……………...………………………….2. C. purpúrea
2b Células esféricas, elongadas o redondeadas de forma poligonal, siempre sobre los 2um de
diámetro, grises, verde azules o amarillentas; en agua estancada o corriente o aerofíticas
…………………………………………………………………………………………………………………...3
3ª Agua dulce (rara vez en zonas supralitorales), en corrientes o en lagos litorales, rara vez
subaerofíticas o en rocas húmedas…………………………………………………………………………..4
3b Especies aerofíticas de rocas de limo húmedo, creciendo en rocas volcánicas calcáreas; células
usualmente rodeadas de una envoltura individual, refractiva oval o envoltura redondeada poligonal,
que tiene entre 8.5 y 12 µm de diámetro, mucílago descolorido y en colonias viejas amarillo
café…………………………………………………………………………………………….... 5. C. novacekii
4ª Células principalmente en envolturas individuales, epilíticas en biotipos sumergidos…………….5
4b Células de los alrededores muy finas , difícilmente visibles, envolturas individuales difluyentes, de
vida libre (metafíticas), en bentos de los lagos nórdicos (colonias
esferoides/globosas)………………………………………………………………………………6. C. gentilis
124
5ª Células de 3-4 (6) µm en diámetro, mucílago sin color, epilítica en ríos claros no
calcáreos………….…………………………………………………………….…………………3. C. rivularis
5b Células de 2-3.8 µm de diámetro; mucílago sin color o amirillo-café (dependiendo de la
insolación); epilítico en zonas litorales o supralitorales, en lagos y ríos
calcáreos………………………………………………………………..…………………4. C. microcystoides
125
ANEXO H. (pag.1) Igualdad de las varianzas poblacionales basándose en la
mediana. (Cuyos valores son muy similares a las medias para cada caso),
prueba t en donde se verifica la similitud entre ensayos.o I Iguad de las varianzas s
Descriptivos Concentración Estadístico Error típ. Absorbancia 10 Media ,06060 ,001030 ,05774 Límite superior ,06346 Media recortada al 5% ,06056 Mediana ,06100 Varianza ,000 Desv. típ. ,002302 Mínimo ,058 Máximo ,064 Rango ,006 Amplitud intercuartil ,004 Asimetría ,606 ,913 Curtosis ,274 2,000 20 Media ,08920 ,000800 ,08698 Límite superior ,09142 Media recortada al 5% ,08922 Mediana ,08900 Varianza ,000 Desv. típ. ,001789 Mínimo ,087 Máximo ,091 Rango ,004 Amplitud intercuartil ,004 Asimetría -,052 ,913 Curtosis -2,324 2,000 30 Media ,11700 ,000447 ,11576 Límite superior ,11824 Media recortada al 5% ,11700 Mediana ,11700 Varianza ,000 Desv. típ. ,001000 Mínimo ,116 Máximo ,118 Rango ,002 Amplitud intercuartil ,002 Asimetría ,000 ,913 Curtosis -3,000 2,000 50 Media ,17080 ,001200 ,16747 Límite superior ,17413 Media recortada al 5% ,17089 Mediana ,17200 Varianza ,000 Desv. típ. ,002683 Mínimo ,167 Máximo ,173 Rango ,006 Amplitud intercuartil ,005 Asimetría -,813 ,913 Curtosis -1,539 2,000 100 Media
,25900 ,011336
,22753 Límite superior ,29047
126
Media recortada al 5% ,25917 Mediana ,25500 Varianza ,001 Desv. típ. ,025348 Mínimo ,230 Máximo ,285 Rango ,055 Amplitud intercuartil ,050 Asimetría ,098 ,913 Curtosis -2,695 2,000 200 Media ,44400 ,002470 ,43714 Límite superior ,45086 Media recortada al 5% ,44383 Mediana ,44000 Varianza ,000 Desv. típ. ,005523 Mínimo ,440 Máximo ,451 Rango ,011 Amplitud intercuartil ,010 Asimetría ,683 ,913 Curtosis -2,902 2,000 300 Media ,58980 ,005380 ,57486 Límite superior ,60474 Media recortada al 5% ,59006 Mediana ,59500 Varianza ,000 Desv. típ. ,012029 Mínimo ,572 Máximo ,603 Rango ,031 Amplitud intercuartil ,021 Asimetría -,779 ,913 Curtosis -,040 2,000 500 Media ,80460 ,012683 ,76939 Límite superior ,83981 Media recortada al 5% ,80472 Mediana ,80600 Varianza ,001 Desv. típ. ,028360 Mínimo ,770 Máximo ,837 Rango ,067 Amplitud intercuartil ,056 Asimetría -,114 ,913 Curtosis -2,194 2,000 800 Media 1,07860 ,013064 1,04233 Límite superior 1,11487 Media recortada al 5% 1,07906 Mediana 1,08100 Varianza ,001 Desv. típ. ,029211 Mínimo 1,037 Máximo 1,112 Rango ,075 Amplitud intercuartil ,054 Asimetría -,500 ,913
Curtosis -,420 2,000 1000 Media 1,19080 ,032785
127
1,09977 Límite superior 1,28183 Media recortada al 5% 1,19456 Mediana 1,22200 Varianza ,005 Desv. típ. ,073309 Mínimo 1,065 Máximo 1,249 Rango ,184 Amplitud intercuartil ,110 Asimetría -1,815 ,913 Curtosis 3,451 2,000
128
(pag. 4) Prueba t en donde se verifica la similitud entre ensayos.
Diferencias relacionadas t gl Sig.
(bilateral)
Media Desviación
típ.
Error típ. de la
media
95% Intervalo de confianza para la
diferencia Media Desviació
n típ.
Error típ. de la
media
Inferior Superior Inferior Superior Inferior Super
ior Inferior Superior Par 1 1 -2 -,08300 ,30688 ,09253 -,28917 ,12317 -,897 10 ,391Par 2 1-3 -,18436 ,60303 ,18182 -,58949 ,22076 -1,014 10 ,334Par 3 1-4 -,27182 ,90521 ,27293 -,87995 ,33631 -,996 10 ,343Par 4 1-5 -,37055 1,20394 ,36300 -1,17936 ,43827 -1,021 10 ,331Par 5 2 -3 -,10136 ,30413 ,09170 -,30568 ,10296 -1,105 10 ,295Par 6 2 -4 -,18882 ,60330 ,18190 -,59412 ,21649 -1,038 10 ,324Par 7 2 -5 -,28755 ,90103 ,27167 -,89286 ,31777 -1,058 10 ,315Par 8 3 - 4 -,08745 ,30432 ,09175 -,29190 ,11699 -,953 10 ,363Par 9 3 - 5 -,18618 ,60204 ,18152 -,59064 ,21828 -1,026 10 ,329Par 10
4 - 5 -,09873 ,29940 ,09027 -,29986 ,10241 -1,094 10 ,300
Según la prueba de significancia se comprueba la validación del método con
una significancia mayor al 5% aceptando la hipótesis nula de que cada ensayo
es similar al otro.
129
ANEXO I. Glosario de Términos. J Glosario de Términos
Intercalar: Los heterocistos intercalares ocurren en medio de células vegetativas.
Metamérico: Cuando varios heterocistos se desarrollan en distancias más o menos
regulares a lo largo del tricoma completo de tal forma que varios ejes perpendiculares
pueden dividir al tricoma en varios segmentos morfológicamente casi idénticos.
Subsimétrico Cuando unos pocos heterocistos no están situados en una posición
estrictamente simétrica desarrollados en un tricoma, ocurre una estructura final
subsimétrica.
Paraheterocítico Los acinetos se desarrollan bajo condiciones “normales” en números
mas o menos pequeños (usualmente de 1 a 8) cerca de los heterocistos.
Apoheterocítico Los acinetos empiezan a diferenciarse mas o menos en la mitad del
“intervalo heterocístico” entre dos heterocistos de células vegetativas, los acinetos
cambian hacia ambos lados de los heterocistos.
130
ANEXO J. Tabla de Abreviaturas
Ilustración 1 ANEXO J. Tabla de Abreviaturas
Tipo ABC transportador de nitrito /nitrato NRT
Tipo ABC - transportador de úrea Urt
Permeasa de amonio Amt
Nitrato reductasa Nar
Nitrito reductasa Nir
Complejo nitrogenasa NifHDK
Ferredoxina específica de heterocistos FdxH
Ferredoxina reducida Fdxred
Fosfoenolpiruvato carboxilasa PEP carboxilasa
2-oxoglutarato 2-OG
Glutamina sintetasa GS
Glutamato sintasa GOGAT
Radiación ultravioleta UVR
Células Vegetativas CV