Download - Antibiosis e Interpreacion
Actualización de Métodos deSusceptibilidad en el Laboratorio
Principios generales del método de difusión de disco
Alcances y limitaciones
Requerimientos
Mantenimiento de los materiales
Preparado de las placas de agar
Preparación del inóculo e inoculado de las placas
Colocación de los discos
Lectura de resultados e interpretación: las tablas de NCCLS
Problemas comunes
Principios generales del método
Difusión de disco en placa (Bauer-Kirby)
Disco conantibiótico
X mm
R I S≤A B-C ≥D
concentración inhibitoria
Principios generales del método
Alcances y limitaciones
Método MUY barato y versátil
Resultados en un máximo de 24 horas
No requiere equipo especializado
Fácil de leer y de interpretar
No se puede aplicar a bacterias de crecimiento lento ni a anaerobias
Algunas diferencias biológicas sutiles no son detectadas
Requerimientos
Medio de cultivoPlacas de petri
Placas con medio
CultivoSolución salina
Inóculo estandarizado
Hisopos
Sensi-discosAplicadorPlantilla
Estufa de cultivo
Refrigerador
Refrigerador(2-8 °C)
Cte. McFarlandcolorímetro
calibrador
Mantenimiento de los materiales
Medio de cultivo deshidratado
En lugar fresco y secoFrasco bien cerrado
Cajas de petri 100 x 15 mm
Usar el contenido completo de la bolsa(sacar solo las necesarias/cerrar bolsa)
Mueller-HintonMueller-Hinton + sangre 5%
HTM
Sensi-discos
En refrigeración (2-8 °C)En el blister intacto, o en un frasco o “tupper” con desecante, o en el recipiente del despachador con desecante activo
Preparado de las placas de agar
Reconstitución del medio
Use agua “fresca”Hervir hasta disolver -o- Agitar BIEN después de esterilizarNo exceder tiempos/temperaturasNo re-fundir más de una vezAñadir suplementos ~50 °C
Seguir las indicaciones del envaseUsar agua destilada
Vaciado de las placas
Verifique que la mesa donde solidificarán las placasesté nivelada.
Use un nivel de burbuja para verificarUse siempre la mesa verificada para dejar solidificarDesconfíe de mesas recubiertas con acero o formicaPreferentemente NO apile las placas solidificando
Preparación del inóculo e inoculado de las placas
Preparación del inóculo
Partir SIEMPRE de un cultivo puro y fresco en medio no-selectivo
colonias aisladas
cultivo enmedio líquido
Constante deMcFarland 0.5
Suspensión ensalina (0.85% NaCl)
Control de calidad
Grosorcada placa
Soporte de crecimientocada lote
Contaminacióncada placa antes de usar
E. coli ATCC
4 (±0.5) mm
Vaciado de las placas
Si el Mueller-Hinton no es de una marcaconfiable, la variación entre lotes es muy grande.Consulte el procedimiento de NCCLS para control de calidad
Preparación del inóculo e inoculado de las placas
La constante de McFarland 0.5
0.5 mL de BaCl2 0.048 M (1.175% BaCl2•2H2O)
99.5 mL de H2SO4 0.18 M (1%)
Absorbencia a 625 nm 0.08-0.10
Mantener en oscuridad en tubos con tapa-rosca
Remplazar o verificar cada mes
Inoculado de las placas
Suspensión bacteriana(<30 min)
Hisopo estéril
Humedecer y exprimir
Hisopar la superficie en 3 direcciones (60° aprox.)
Preparación del inóculo e inoculado de las placas
Colocación de los discos
Llevar a temperatura ambiente(sacar del refrigerador 30 minutos antes de usar)
Evita la condensación de la humedad ambiental enlos discos frios, que podría humedecer al antibiótico,haciéndolo inestable.
…pero primero
Los discos de beta-lactámicos se dañan con muchafacilidad al estar húmedos; los inhibidores de beta-lactamasas
(clavulanato, tazobactam) son aun más sensibles
Colocación de los discos
Precauciones especiales
Nunca re-posicione
o “lo caido, caido”
Colocación de los discos
La distancia mínima de centro a centro es de 22 mmSi coloca manualmente, use una plantillaEn una placa de 100 mm no caben más de 9 discosDiscos muy cercanos a la orilla producen halos asimétricosDiscos muy cercanos entre si producen halos empalmados
No ponga juntos discos de antibióticos sinérgicos e.g., b-lact y b-lact+inh, b-lact y aminoglucósidos
Incubación
Para las enterobacterias, 18-24 hs a 35-37°C
Incube inmediatamente después de colocar los discos(máximo, 1 hora después)
Nunca más de 24 horas
Puede incubar en CO2, en frasco o pouch GasPak.
Lectura de resultados e interpretación: las tablas de NCCLS
El halo más grande no es -siempre- el delantibiótico más efectivo
Medir el halo, usando preferentemente un calibrador (vernier)También se puede usar una regla transparente con marcas bien impresas.Registrar los diámetros de los halos como resultado primario
Hay variaciones de antibiótico a antibiótico, y también de bacteria a bacteria
Lectura de resultados e interpretación: las tablas de NCCLS
AmpicilinaResistente Intermedio Sensible
enterobacterias ≤13 14-16 ≥17
estafilococos ≤28 ≥29
enterococos ≤16 ≥17
estreptococos ≤21 22-29 ≥30
Piperacilina/Tazo
enterobacterias ≤17 18-20 ≥21
P. aeruginosa ≤17 ≥18
intermedio ≠ resistente
Control de calidad
Escherichia coli 25922Staphylococcus aureus 29213Pseudomonas aeruginosa 27853
Verifique que los valores caigan dentro de los intervaloscorrespondientes.
Uso de cepas de ATCC (American Type Culture Collection)Permite saber si el método en general está produciendo resultados confiablesDebiera correrse el control en cada nuevo lote de medio y de discos, o al menos una vez cada 15 dias
Escherichia coli 35218
Haemophilus influenzae 49247Streptococcus pneumoniae 49619
productora de beta-lactamasa
Problemas comunes
Colonias dentro de los halos
Cultivo contaminadoVariantes hiper-resistentes
Halos difusos
Proteus y su swarmingSulfonamidas y su efecto bacteriostático
Crecimiento pobre
Probar diferentes ángulos de luz reflejada
¿Inhibición del crecimiento o de la hemólisis?
El halo de hemólisis es siempre menor que el de inhibición
Problemas comunes
Halos asimétricos
Discos muy cerca de las orillas de la cajaEfecto sinérgico
Halos empalmados
Gran susceptibilidadDiscos muy juntos
Dobles halos
Cultivo contaminado
Discos caidos
No se presionaron bien contra la superficie del agar
Los métodos automatizados
Principio general
0 1 2 4 8 16 32 µg/mL
.. .. .. .. .. .. ..
MIC
Los métodos automatizados
fuente de luz
fotocelda
Los métodos automatizados
Ventajas y limitaciones
Rápido (desde 4 horas)Menor tiempo de preparaciónResultados como MIC interpretados
Muy costosoImpide probar antibióticos distintosRequiere equipo dedicadoContaminantes pueden pasar desapercibidosFallas difíciles de detectar y solucionar
Los métodos automatizados
Necesidad de control de calidad
Fallas posibles Diagnóstico
Medio no soporta crecimientoTemperatura inadecuada
Falla en fotoelementosControles internos
Antibióticos degradados Cepas ATCC
Fundamental cuando aparecen supuestos “brotes”de bacterias resistentes a combinaciones con
inhibidores de beta-lactamasas, como el tazobactam.
Los métodos automatizados
Precauciones especiales
Cuidar las condiciones de almacenamiento de los páneleso tarjetas
Mantener limpia la cámara del nefelómetro
Mantener discos y placas disponibles para controlexterno en caso de dudas
Categorías interpretativas de las pruebas de susceptibilidad
(NCCLS)
Susceptible (S), la infección debida a la cepa aislada puede tratarse con la dósis recomendada del antibiótico
Intermedio (I), la aplicación clínica en sitios donde se concentre la droga o cuando se pueden usar dósis más altas o es la zona de errores técnicos incotrolados causa de las mayores discrepancias interpretativas
Resistente (R ) cepas no inhibidas por concentraciones sistémicas usuales
Tabla interpretación de la zona del diámetro de inhibición para enterobacterias (NCCLS)
Valores límite de cepas control de calidad para prueba de difusión con disco (NCCLS)
Almacenamiento, mismo procedimiento que para aislamientos clínicos. Prolongado a -20°C, preferentemente a -60°C, caldo con suero fetal bovino al 50% 10-15% de glicerol con caldo soya tripticasa sangre de carnero desfibrinada leche descremada liofilizadas. Cultivos de trabajo: cepas no fastidiosas en agar soya tripticasa fastidiosas en agar chocolate a 2-8°C, máximo una semana.
Conservación de las cepas ATCC, control de calidad de susceptibilidad antimicrobiana.
¿Qué hacer frente a resultados no comunes?
Evaluar contaminación de la prueba No usar discos inadecuados o defectuosos Confirmar identificación de la cepa Repetir prueba de susceptibilidad Buscar errores de transcripción Buscar antecedentes de cepas similares
confirmadas del paciente Enviar cepas al laboratorio de referencia
Nuevas recomendaciones NILS 2005
Salmonella y quinolonas
Probar ácido nalídixico en cepas extraintestinales de Salmonella spp sensibles a ciprofloxacino
> 21 mm = sensible (difusión)
0.12 – 1.0 g/mL (CIM) < 1 = sensible
En cepas resistente a ácido nalídixico y sensible a fluoroquinolonas agregar el comentario:
El uso de fluoroquinolonas no erradica al agente, se recomienda interconsulta infectologíca
M100.S14 (M2, M7); Tabla 2A
NNCLS recomienda.....
Prueba para evaluar resistencia inducible a clindamicina o “D test”
Difusión
Con discos de clindamicina (2ug) colocar de 15-26 mm del borde de un disco de eritro (15ug),
Usar como controles cepas internas D test (-) y (+)
Aún no se ha seleccionado la cepa control de calidad a utilizar
Determinación de de la resistencia inducible a clindamicina o D test
D test positivo D test negativo
Recomendación para determinar resistencia a clindamicina
Difusión: realizar D test a todas las cepas de Staphylococcus spp
Dilución (CIM): realizar D test a las cepas
que resulten resistentes a eritro y sensibles a clinada
Informar
Eritro Clinda Informe
S S Sensible a ambas drogas
R R Resistente a ambas drogas
R D test (-) Resistente a eritro y sensible a clinda
R D test (+) Resistente a ambas drogas
Recomendaciones del NCCLS En Staphylococcus es posible utilizar el disco de cefoxitina de 30ug y sus valores de corte para predecir la resistencia a oxacilina mediada por mecA (M100-S14 (M2,M7), Tabla 2C)
El disco de cefoxitina es mejor que los de oxa para detectar la oxa resistencia en S. aureus
El estándar de oro sigue siendo la detecciòn de mec A (PBP 2A)
Disco de cefoxitina para detección de resistencia por mecA en Staphylococcus spp
Reemplazar el disco de oxacilina por el de cefoxitina (30ug)
Incubar por 24h, si la cepa es resistente se puede detectar a partir de las 18h
Determinar si la cepa es resistente o sensible según los valores de corte para cefoxitina
En el informe reportar resultado para OXACILINA, no para cefoxitina
S. aureus oxacilina resistentes
Diámetro del halo de inhibición (mm) cefoxitina 30ug
> 20 < 19
Informar
oxacilino resistente
Informar
oxacilino sensible
SCN oxacilina resistentes
Diámetro del halo de inhibición (mm) cefoxitina 30ug
> 25 < 24
Informar
oxacilino resistente
Informar
oxacilino sensible
Determinación de BLEEs
Determinación de la producción de BLEEs en K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli NCCLS
Preparación de discos de CAZ/ac. clavulánico y CTX/ac. clavulánico
Se preparan los discos a una concentración 30 g/10 g (discos CAZ o CTX comerciales + ac. clavulánico)
Discos comerciales de CAZ y de CTX con 30g
Solución stock del ácido clavulánico 1, 000g/mL
Adicionar 10 L del stocx por disco de CAZ o CTX
Preparar una hora antes de aplicar a la placa
No almacenar
Determinación de la producción de BLEEs de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli NCCLS
Producción de BLEEs (+)
Determinación de la producción de BLEEs de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli NCCLS
Incremento > 5mm del diámetro de la zona de inhibición del antibiótico mas el inhibidor de -lactamasas respecto del antibiótico solo indica que una bacteria es productora de BLEEs
Determinación de la producción de BLEEs prueba Etest
TZ/TZL > 8 = producción de BLEEs
Determinación de -lactamasas AmpC inducibles
Achatamiento de la zona de inhibición alrededor del disco de ceftazidime debido a la inducción de AmpC por
cefoxitina
La elección adecuada de los antibióticos a probar contra un gérmen infeccioso específico es importante para la utilidad del resultado Para cada grupo de microorganismos se deben probar agentes que sean eficaces in vitro y en el tratamiento in vivo El procesamiento adecuado con un buen control de calidad hacen un reporte de susceptibilidad confiable de valor clínico, con implicación en la minimización de emergencia de resistencia debida al uso inadecuado de antibióticos, estancias hospitalarias más cortas y disminución en el costo.
Conclusiones
Disco de cefoxitina para detección de resistencia por mecA en Staphylococcus spp
Mecanismo de oxa resistencia
S.aureus SCN
Producción de PBP 2a (gen mecA SAMR)
+ +
Hiperproducción de beta-lactamasas
+ -
Alteración PBPs preexistentes
+ -
organismos Fenotipo inusual
Enterobacterias intermedio o resistente a carbapenen
C. freundii, Enterobacter spp, S. marcescens,
Sensible a ampicilina, o a cefalotina
Klebsiella spp, P. vulgaris, Providencia spp
Sensibles a ampicilina
Determinación de CIM por diluciones seriadas dobles en agar
Que diluciones se incluyen: la dilución mas alta de la línea de corte de resistencia para el tipo de m.o. en estudio de acuerdo al NCCLS y la dilución mas baja de sensibilidad de la cepa control ATCC incluida
Ciertos suplementos se añadirán al agar en determinados casos:
NaCl (2% p/v) para pruebas con oxacilina, meticilina, para Staphylococci
5 % de sangre desfibrinada de carnero para gérmenes fastidiosos que la requieren para su crecimiento
( S.pneumoniae).
•Preparación del medio como indica el fabricante
•Después de esterilizar por autoclave, se mantiene a 45-50° C, añadir asépticamente los antibióticos y suplementos.
•Colocar un volumen constante a placas Petri
Estandarización del inóculo
Preparación del inóculo : al menos 3-5 colonias bien aisladas y misma morfología se transfieren a 5 ml de medio de cultivo, se incuba y se compara la turbidez de la suspensión bacteriana con el estándar de McFarland 0.5 (1x108 UFC/mL). Se hará una dilución 1:10 (1x107 UFC/mL). Cuando 0.005 mL de esta suspensión es inoculada, la concentración final de bacterias será de 5x104 UFC/mL.
Estándar de turbidez de Ba SO4 , equivalente a 0.5 de McFarland : 0.5 ml de BaCl2 (1.175 % p/v Ba Cl2 x 2H2 O) + 99.5 mL de H2SO4 (1% v/v) (Abs625= 0.08)
Concentración Mínima Inhibitoria
La CMI está entre la concentración mas baja del antibiótico que inhibe el crecimiento del m.o. y la siguiente concentración
donde es visible el crecimiento
Métodos de dilución en caldo: macro y microdilución
Medio recomendado (NCCLS): caldo Mueller-Hinton estéril en tubos de 13x100.
Soluciones stock de antibióticos esterilizadas por filtración.
Diluciones dobles seriadas con el antibiótico preparadas volumetricamente
Adición constante de inóculo estandarizado
Uso de tubo control de esterilidad con caldo sin antimicrobiano
MACRODILUCIÓN EN CALDO
Microdilución en caldo
Involucra el uso de pequeños volúmenes de caldo (100 L x pozo) en microplacas de 96 pozos.
NCCLS: Diluciones seriadas del antimicrobiano a la concentración deseada con 50 L por pozo y llenando hasta 100 L
El ensayo deberá incluir pozos control de crecimiento (control positivo de crecimiento y control negativo de caldo sin inóculo)
NCCLS: que el volumen no exeda el 10 % del volumen del pozo (< 5 L de inoculo en 100 L de solución)
Prevenir desecación de la placa
Margen de error mayor cuando se usan 5 L del inóculo. Modificación : usar un volumen de 50 L.
Densidad del inóculo comparado con 0.5 McFarland = 1.5x108 UFC/mL diluír 1:100 tomar 50 L para inocular cada pozo= 7.5x104 UFC/mL
Stock de antibiótico: 10 veces más (1280) de la concentración más alta a usar (128) De 1280 diluír 1:5 = 256 a partir de esta concentración diluciones seriadas dobles con volumen final de 50 L : 256 128 64 32 16 8 4 2 1 + 50 L de inóculo: 128 64 32 16 8 4 2 1
Microdilución en caldo
Microdilución en caldo
La CIM es la concentración mas baja del antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento del m.o. en el pozo comparando con los pozos control (crecimiento negativo y positivo)
Susceptibilidad antimicrobianapor E-test
Prueba comercial, principio de difusión con disco. Provee un resultado cuantitativo de CIM
METAS DEL CONTROL DE CALIDAD:
Mantener precisión y exactitud del procedimiento usado para las pruebas de sensibilidad
Uso de cepas de referencia (ATCC) seleccionadas por su estabilidad genética y utilidad para control del método
Reproducibilidad del método
Uso de puntos de corte bien establecidos (Tablas NCCLS), con calidad aceptable de los reactivos usados
INFORME DE RESULTADOS
Un informe adecuado incluye la correcta selección de los antimicrobianos probados, trabajo conjunto del laboratorio clínico, médico consultante y comité de control de infecciones.
Los antimicrobianos indicados por NCCLS son los de eficacia clínicamente aprobada para los distintos m.o.
CONCLUSIONES:
La correcta determinación de susceptibilidad a un número limitado de drogas, ayuda al uso adecuado de antimicrobianos, minimizando la selección de cultivos nosocomiales multirresistentes.
La CIM obtenida usando métodos estandarizados, dice al Médico la concentración del agente antimicrobiano necesaria para inhibir la infección del m.o.