antibiosis e interpreacion

Actualización de Métodos deSusceptibilidad en el Laboratorio

Principios generales del método de difusión de disco

Alcances y limitaciones

Requerimientos

Mantenimiento de los materiales

Preparado de las placas de agar

Preparación del inóculo e inoculado de las placas

Colocación de los discos

Lectura de resultados e interpretación: las tablas de NCCLS

Problemas comunes

Principios generales del método

Difusión de disco en placa (Bauer-Kirby)

Disco conantibiótico

X mm

R I S≤A B-C ≥D

concentración inhibitoria

Principios generales del método

Alcances y limitaciones

Método MUY barato y versátil

Resultados en un máximo de 24 horas

No requiere equipo especializado

Fácil de leer y de interpretar

No se puede aplicar a bacterias de crecimiento lento ni a anaerobias

Algunas diferencias biológicas sutiles no son detectadas

Requerimientos

Medio de cultivoPlacas de petri

Placas con medio

CultivoSolución salina

Inóculo estandarizado

Hisopos

Sensi-discosAplicadorPlantilla

Estufa de cultivo

Refrigerador

Refrigerador(2-8 °C)

Cte. McFarlandcolorímetro

calibrador

Mantenimiento de los materiales

Medio de cultivo deshidratado

En lugar fresco y secoFrasco bien cerrado

Cajas de petri 100 x 15 mm

Usar el contenido completo de la bolsa(sacar solo las necesarias/cerrar bolsa)

Mueller-HintonMueller-Hinton + sangre 5%

HTM

Sensi-discos

En refrigeración (2-8 °C)En el blister intacto, o en un frasco o “tupper” con desecante, o en el recipiente del despachador con desecante activo

Preparado de las placas de agar

Reconstitución del medio

Use agua “fresca”Hervir hasta disolver -o- Agitar BIEN después de esterilizarNo exceder tiempos/temperaturasNo re-fundir más de una vezAñadir suplementos ~50 °C

Seguir las indicaciones del envaseUsar agua destilada

Vaciado de las placas

Verifique que la mesa donde solidificarán las placasesté nivelada.

Use un nivel de burbuja para verificarUse siempre la mesa verificada para dejar solidificarDesconfíe de mesas recubiertas con acero o formicaPreferentemente NO apile las placas solidificando


Preparación del inóculo

Partir SIEMPRE de un cultivo puro y fresco en medio no-selectivo

colonias aisladas

cultivo enmedio líquido

Constante deMcFarland 0.5

Suspensión ensalina (0.85% NaCl)

Control de calidad

Grosorcada placa

Soporte de crecimientocada lote

Contaminacióncada placa antes de usar

E. coli ATCC

4 (±0.5) mm

Vaciado de las placas

Si el Mueller-Hinton no es de una marcaconfiable, la variación entre lotes es muy grande.Consulte el procedimiento de NCCLS para control de calidad


La constante de McFarland 0.5

0.5 mL de BaCl2 0.048 M (1.175% BaCl2•2H2O)

99.5 mL de H2SO4 0.18 M (1%)

Absorbencia a 625 nm 0.08-0.10

Mantener en oscuridad en tubos con tapa-rosca

Remplazar o verificar cada mes

Inoculado de las placas

Suspensión bacteriana(<30 min)

Hisopo estéril

Humedecer y exprimir

Hisopar la superficie en 3 direcciones (60° aprox.)



Llevar a temperatura ambiente(sacar del refrigerador 30 minutos antes de usar)

Evita la condensación de la humedad ambiental enlos discos frios, que podría humedecer al antibiótico,haciéndolo inestable.

…pero primero

Los discos de beta-lactámicos se dañan con muchafacilidad al estar húmedos; los inhibidores de beta-lactamasas

(clavulanato, tazobactam) son aun más sensibles

Precauciones especiales

Nunca re-posicione

o “lo caido, caido”


La distancia mínima de centro a centro es de 22 mmSi coloca manualmente, use una plantillaEn una placa de 100 mm no caben más de 9 discosDiscos muy cercanos a la orilla producen halos asimétricosDiscos muy cercanos entre si producen halos empalmados

No ponga juntos discos de antibióticos sinérgicos e.g., b-lact y b-lact+inh, b-lact y aminoglucósidos

Incubación

Para las enterobacterias, 18-24 hs a 35-37°C

Incube inmediatamente después de colocar los discos(máximo, 1 hora después)

Nunca más de 24 horas

Puede incubar en CO2, en frasco o pouch GasPak.


El halo más grande no es -siempre- el delantibiótico más efectivo

Medir el halo, usando preferentemente un calibrador (vernier)También se puede usar una regla transparente con marcas bien impresas.Registrar los diámetros de los halos como resultado primario

Hay variaciones de antibiótico a antibiótico, y también de bacteria a bacteria


AmpicilinaResistente Intermedio Sensible

enterobacterias ≤13 14-16 ≥17

estafilococos ≤28 ≥29

enterococos ≤16 ≥17

estreptococos ≤21 22-29 ≥30

Piperacilina/Tazo

enterobacterias ≤17 18-20 ≥21

P. aeruginosa ≤17 ≥18

intermedio ≠ resistente

Control de calidad

Escherichia coli 25922Staphylococcus aureus 29213Pseudomonas aeruginosa 27853

Verifique que los valores caigan dentro de los intervaloscorrespondientes.

Uso de cepas de ATCC (American Type Culture Collection)Permite saber si el método en general está produciendo resultados confiablesDebiera correrse el control en cada nuevo lote de medio y de discos, o al menos una vez cada 15 dias

Escherichia coli 35218

Haemophilus influenzae 49247Streptococcus pneumoniae 49619

productora de beta-lactamasa

Problemas comunes

Colonias dentro de los halos

Cultivo contaminadoVariantes hiper-resistentes

Halos difusos

Proteus y su swarmingSulfonamidas y su efecto bacteriostático

Crecimiento pobre

Probar diferentes ángulos de luz reflejada

¿Inhibición del crecimiento o de la hemólisis?

El halo de hemólisis es siempre menor que el de inhibición

Problemas comunes

Halos asimétricos

Discos muy cerca de las orillas de la cajaEfecto sinérgico

Halos empalmados

Gran susceptibilidadDiscos muy juntos

Dobles halos

Cultivo contaminado

Discos caidos

No se presionaron bien contra la superficie del agar

Los métodos automatizados

Principio general

0 1 2 4 8 16 32 µg/mL

.. .. .. .. .. .. ..

MIC


fuente de luz

fotocelda


Ventajas y limitaciones

Rápido (desde 4 horas)Menor tiempo de preparaciónResultados como MIC interpretados

Muy costosoImpide probar antibióticos distintosRequiere equipo dedicadoContaminantes pueden pasar desapercibidosFallas difíciles de detectar y solucionar


Necesidad de control de calidad

Fallas posibles Diagnóstico

Medio no soporta crecimientoTemperatura inadecuada

Falla en fotoelementosControles internos

Antibióticos degradados Cepas ATCC

Fundamental cuando aparecen supuestos “brotes”de bacterias resistentes a combinaciones con

inhibidores de beta-lactamasas, como el tazobactam.


Precauciones especiales

Cuidar las condiciones de almacenamiento de los páneleso tarjetas

Mantener limpia la cámara del nefelómetro

Mantener discos y placas disponibles para controlexterno en caso de dudas

Categorías interpretativas de las pruebas de susceptibilidad

(NCCLS)

Susceptible (S), la infección debida a la cepa aislada puede tratarse con la dósis recomendada del antibiótico

Intermedio (I), la aplicación clínica en sitios donde se concentre la droga o cuando se pueden usar dósis más altas o es la zona de errores técnicos incotrolados causa de las mayores discrepancias interpretativas

Resistente (R ) cepas no inhibidas por concentraciones sistémicas usuales

Tabla interpretación de la zona del diámetro de inhibición para enterobacterias (NCCLS)

Valores límite de cepas control de calidad para prueba de difusión con disco (NCCLS)

Almacenamiento, mismo procedimiento que para aislamientos clínicos. Prolongado a -20°C, preferentemente a -60°C, caldo con suero fetal bovino al 50% 10-15% de glicerol con caldo soya tripticasa sangre de carnero desfibrinada leche descremada liofilizadas. Cultivos de trabajo: cepas no fastidiosas en agar soya tripticasa fastidiosas en agar chocolate a 2-8°C, máximo una semana.

Conservación de las cepas ATCC, control de calidad de susceptibilidad antimicrobiana.

¿Qué hacer frente a resultados no comunes?

Evaluar contaminación de la prueba No usar discos inadecuados o defectuosos Confirmar identificación de la cepa Repetir prueba de susceptibilidad Buscar errores de transcripción Buscar antecedentes de cepas similares

confirmadas del paciente Enviar cepas al laboratorio de referencia

Nuevas recomendaciones NILS 2005

Salmonella y quinolonas

Probar ácido nalídixico en cepas extraintestinales de Salmonella spp sensibles a ciprofloxacino

> 21 mm = sensible (difusión)

0.12 – 1.0 g/mL (CIM) < 1 = sensible

En cepas resistente a ácido nalídixico y sensible a fluoroquinolonas agregar el comentario:

El uso de fluoroquinolonas no erradica al agente, se recomienda interconsulta infectologíca

M100.S14 (M2, M7); Tabla 2A

NNCLS recomienda.....

Prueba para evaluar resistencia inducible a clindamicina o “D test”

Difusión

Con discos de clindamicina (2ug) colocar de 15-26 mm del borde de un disco de eritro (15ug),

Usar como controles cepas internas D test (-) y (+)

Aún no se ha seleccionado la cepa control de calidad a utilizar

Determinación de de la resistencia inducible a clindamicina o D test

D test positivo D test negativo

Recomendación para determinar resistencia a clindamicina

Difusión: realizar D test a todas las cepas de Staphylococcus spp

Dilución (CIM): realizar D test a las cepas

que resulten resistentes a eritro y sensibles a clinada

Informar

Eritro Clinda Informe

S S Sensible a ambas drogas

R R Resistente a ambas drogas

R D test (-) Resistente a eritro y sensible a clinda

R D test (+) Resistente a ambas drogas

Recomendaciones del NCCLS En Staphylococcus es posible utilizar el disco de cefoxitina de 30ug y sus valores de corte para predecir la resistencia a oxacilina mediada por mecA (M100-S14 (M2,M7), Tabla 2C)

El disco de cefoxitina es mejor que los de oxa para detectar la oxa resistencia en S. aureus

El estándar de oro sigue siendo la detecciòn de mec A (PBP 2A)

Disco de cefoxitina para detección de resistencia por mecA en Staphylococcus spp

Reemplazar el disco de oxacilina por el de cefoxitina (30ug)

Incubar por 24h, si la cepa es resistente se puede detectar a partir de las 18h

Determinar si la cepa es resistente o sensible según los valores de corte para cefoxitina

En el informe reportar resultado para OXACILINA, no para cefoxitina

S. aureus oxacilina resistentes

Diámetro del halo de inhibición (mm) cefoxitina 30ug

> 20 < 19

Informar

oxacilino resistente

Informar

oxacilino sensible

SCN oxacilina resistentes

Diámetro del halo de inhibición (mm) cefoxitina 30ug

> 25 < 24

Informar

oxacilino resistente

Informar

oxacilino sensible

Determinación de BLEEs

Determinación de la producción de BLEEs en K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli NCCLS

Preparación de discos de CAZ/ac. clavulánico y CTX/ac. clavulánico

Se preparan los discos a una concentración 30 g/10 g (discos CAZ o CTX comerciales + ac. clavulánico)

Discos comerciales de CAZ y de CTX con 30g

Solución stock del ácido clavulánico 1, 000g/mL

Adicionar 10 L del stocx por disco de CAZ o CTX

Preparar una hora antes de aplicar a la placa

No almacenar

Determinación de la producción de BLEEs de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli NCCLS

Producción de BLEEs (+)

Determinación de la producción de BLEEs de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli NCCLS

Incremento > 5mm del diámetro de la zona de inhibición del antibiótico mas el inhibidor de -lactamasas respecto del antibiótico solo indica que una bacteria es productora de BLEEs

Determinación de la producción de BLEEs prueba Etest

TZ/TZL > 8 = producción de BLEEs

Determinación de -lactamasas AmpC inducibles

Achatamiento de la zona de inhibición alrededor del disco de ceftazidime debido a la inducción de AmpC por

cefoxitina

La elección adecuada de los antibióticos a probar contra un gérmen infeccioso específico es importante para la utilidad del resultado Para cada grupo de microorganismos se deben probar agentes que sean eficaces in vitro y en el tratamiento in vivo El procesamiento adecuado con un buen control de calidad hacen un reporte de susceptibilidad confiable de valor clínico, con implicación en la minimización de emergencia de resistencia debida al uso inadecuado de antibióticos, estancias hospitalarias más cortas y disminución en el costo.

Conclusiones

Disco de cefoxitina para detección de resistencia por mecA en Staphylococcus spp

Mecanismo de oxa resistencia

S.aureus SCN

Producción de PBP 2a (gen mecA SAMR)

+ +

Hiperproducción de beta-lactamasas

+ -

Alteración PBPs preexistentes

+ -

organismos Fenotipo inusual

Enterobacterias intermedio o resistente a carbapenen

C. freundii, Enterobacter spp, S. marcescens,

Sensible a ampicilina, o a cefalotina

Klebsiella spp, P. vulgaris, Providencia spp

Sensibles a ampicilina

Determinación de CIM por diluciones seriadas dobles en agar

Que diluciones se incluyen: la dilución mas alta de la línea de corte de resistencia para el tipo de m.o. en estudio de acuerdo al NCCLS y la dilución mas baja de sensibilidad de la cepa control ATCC incluida

Ciertos suplementos se añadirán al agar en determinados casos:

NaCl (2% p/v) para pruebas con oxacilina, meticilina, para Staphylococci

5 % de sangre desfibrinada de carnero para gérmenes fastidiosos que la requieren para su crecimiento

( S.pneumoniae).

•Preparación del medio como indica el fabricante

•Después de esterilizar por autoclave, se mantiene a 45-50° C, añadir asépticamente los antibióticos y suplementos.

•Colocar un volumen constante a placas Petri

Estandarización del inóculo

Preparación del inóculo : al menos 3-5 colonias bien aisladas y misma morfología se transfieren a 5 ml de medio de cultivo, se incuba y se compara la turbidez de la suspensión bacteriana con el estándar de McFarland 0.5 (1x108 UFC/mL). Se hará una dilución 1:10 (1x107 UFC/mL). Cuando 0.005 mL de esta suspensión es inoculada, la concentración final de bacterias será de 5x104 UFC/mL.

Estándar de turbidez de Ba SO4 , equivalente a 0.5 de McFarland : 0.5 ml de BaCl2 (1.175 % p/v Ba Cl2 x 2H2 O) + 99.5 mL de H2SO4 (1% v/v) (Abs625= 0.08)

Concentración Mínima Inhibitoria

La CMI está entre la concentración mas baja del antibiótico que inhibe el crecimiento del m.o. y la siguiente concentración

donde es visible el crecimiento

Métodos de dilución en caldo: macro y microdilución

Medio recomendado (NCCLS): caldo Mueller-Hinton estéril en tubos de 13x100.

Soluciones stock de antibióticos esterilizadas por filtración.

Diluciones dobles seriadas con el antibiótico preparadas volumetricamente

Adición constante de inóculo estandarizado

Uso de tubo control de esterilidad con caldo sin antimicrobiano

MACRODILUCIÓN EN CALDO

Microdilución en caldo

Involucra el uso de pequeños volúmenes de caldo (100 L x pozo) en microplacas de 96 pozos.

NCCLS: Diluciones seriadas del antimicrobiano a la concentración deseada con 50 L por pozo y llenando hasta 100 L

El ensayo deberá incluir pozos control de crecimiento (control positivo de crecimiento y control negativo de caldo sin inóculo)

NCCLS: que el volumen no exeda el 10 % del volumen del pozo (< 5 L de inoculo en 100 L de solución)

Prevenir desecación de la placa

Margen de error mayor cuando se usan 5 L del inóculo. Modificación : usar un volumen de 50 L.

Densidad del inóculo comparado con 0.5 McFarland = 1.5x108 UFC/mL diluír 1:100 tomar 50 L para inocular cada pozo= 7.5x104 UFC/mL

Stock de antibiótico: 10 veces más (1280) de la concentración más alta a usar (128) De 1280 diluír 1:5 = 256 a partir de esta concentración diluciones seriadas dobles con volumen final de 50 L : 256 128 64 32 16 8 4 2 1 + 50 L de inóculo: 128 64 32 16 8 4 2 1



La CIM es la concentración mas baja del antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento del m.o. en el pozo comparando con los pozos control (crecimiento negativo y positivo)

Susceptibilidad antimicrobianapor E-test

Prueba comercial, principio de difusión con disco. Provee un resultado cuantitativo de CIM

METAS DEL CONTROL DE CALIDAD:

Mantener precisión y exactitud del procedimiento usado para las pruebas de sensibilidad

Uso de cepas de referencia (ATCC) seleccionadas por su estabilidad genética y utilidad para control del método

Reproducibilidad del método

Uso de puntos de corte bien establecidos (Tablas NCCLS), con calidad aceptable de los reactivos usados

INFORME DE RESULTADOS

Un informe adecuado incluye la correcta selección de los antimicrobianos probados, trabajo conjunto del laboratorio clínico, médico consultante y comité de control de infecciones.

Los antimicrobianos indicados por NCCLS son los de eficacia clínicamente aprobada para los distintos m.o.

CONCLUSIONES:

La correcta determinación de susceptibilidad a un número limitado de drogas, ayuda al uso adecuado de antimicrobianos, minimizando la selección de cultivos nosocomiales multirresistentes.

La CIM obtenida usando métodos estandarizados, dice al Médico la concentración del agente antimicrobiano necesaria para inhibir la infección del m.o.

antibiosis e interpreacion

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