ANTIBIOGRAMA: DETERMINACIN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS

ANTIBITICOS

INTRODUCCIN

El uso y abuso de los antibiticos en las terapias contra infecciones de origen

bacteriano, conlleva a la seleccin de cepas bacterianas resistente. La diseminacin de

estas resistencias a otras cepas de la misma o diferente especie se ve facilitada cuando

los marcadores de resistencia (genes) se encuentran en elementos genticos mviles

como son plsmidos y/o transposones

La susceptibilidad de los microorganismos a los antibiticos se determina mediante

tcnicas basadas en la dilucin o difusin del antibitico en un medio de cultivo donde

desarrolla el microorganismo en estudio.

Las tcnicas de dilucin en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un

agente antimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la

concentracin inhibitoria mnima (CIM) que es la menor concentracin de

antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento bacteriano.

La CIM indica la concentracin de antimicrobiano que se necesita para matar o inhibir

el crecimiento del microorganismo analizado y permite valorar comparativamente la

potencia de los antimicrobianos. La reproducibilidad de estas pruebas es de 1 dilucin

y para evitar una gran variabilidad stas deben ser estandarizadas y controladas muy

cuidadosamente. Los mtodos estandarizados se detallan ampliamente en el NCCLS

(National Committee for Clinical Laboratory Standards)

Para el caso de las tcnicas que se basan en la difusin del antibitico, el mtodo

universalmente utilizado es el de Bauer y Kirby comnmente llamado antibiograma.

Este mtodo consiste bsicamente en un disco de papel embebido en el antibitico que

es colocado sobre un medio de cultivo slido inoculado con el microorganismo a

ensayar; luego de 18 a 24 horas de incubacin se mide el halo de inhibicin del

crecimiento bacteriano que produce el antibitico al difundir desde el disco de papel que

lo contiene, radialmente hacia el medio de cultivo donde esta creciendo el

microorganismo.

El dimetro del halo de inhibicin del crecimiento en un antibiograma y el valor de la

CIM para un determinado antibitico son un criterio de referencia experimental para

determinar si un microorganismo es resistente o sensible a ese antibitico.

Otro novedoso mtodo es el EtestTM

, que permite la determinacin de la (CIM) .

El EtestTM

es una tira plstica que contiene un gradiente continuo de un antibitico, la

tcnica combina el fenmeno de difusin con el de dilucin del antibitico para

determinar la CIM para un dado microorganismo. Este mtodo, como veremos en el

trabajo prctico, es mucho ms certero que el antibiograma y ms rpido y preciso que

la tcnica de dilucin para obtener la CIM, que usualmente se realiza en varios pasos de

dilucin y cultivo lo cual requiere disponer de mucho material estril para una sola

determinacin.

Materiales Cultivo exponencial de la cepa bacteriana a analizar.

Agar Mller Hinton

Cajas de Petri estriles

Ansa

Pipetas de 1 ml y 10 ml estriles

Solucin de hipoclorito al 5% para descarte de material contaminado.

Tubos de ensayo estriles

Hispos estriles

Escala de McFarland Tubo 1 y # 5 (0.5 de Bacl2 (1.75%) y 99.5 de H2SO4 (1%).

Discos de antibiograma

Estufa a 37 C

Desarrollo del trabajo prctico

Determinacin de la CIM por dilucin en caldo

1. Se realizan diluciones decrecientes del o los antibiticos en tubos conteniendo 1 ml

de caldo Mueller-Hinton

2. Se siembra 1ml de una suspencin bacteriana de aproximadamente 10 5

bacterias por

ml que equivale a una dilucin 1/500 del tubo 1 de la escala de Mc Farland.

3. Se realiza un control de crecimiento inoculando un caldo sin antibitico y un control

negativo con caldo sin inocular.

4. Se incuban todos los tubos a 37 C durante 24 horas. Luego se observa turbidez

indicativa del desarrollo bacteriano.

5. Se determina la CIM como aquella concentracin del antibitico contenida en el tubo

que posee la mayor dilucin del mismo en la que se detecta falta de turbidez. La mnima

concentracin que inhibe el crecimiento bacteriano.

Antibiograma

1. Preparar placas de Petri con agar Mller Hinton de aproximadamente 4 mm de alto.

(30ml) Dejar solidificar y secar bien.

2. Preparar con el cultivo de la cepa a analizar, una suspensin bacteriana con solucin

fisiolgica estril, ajustarla al tubo # 5 de la escala de McFarland.

3. Sumergir un hisopo estril en la suspensin recin preparada, escurrir el excedente de

lquido en las paredes del tubo y sembrar la placa de Petri con medio de cultivo

anteriormente preparada. Distribuir uniformemente el inculo en toda la superficie del

agar.

4. Cuando la superficie del agar este completamente seca, apoyar los discos de

antibiograma utilizando el aplicador o una pinza estril. Asegurarse que toda la

superficie de los discos est en contacto con el agar, una vez colocados no deber ser

movidos, dado que el antibitico es liberado instantneamente cuando entra en contacto

con el agar.

5. Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas.

6. Observar y medir para cada disco el halo de inhibicin del crecimiento.

7. Analizar si las cepas bacterianas utilizadas son resistentes o sensibles a los

antibiticos probados, segn los datos que figuran en tablas de sensibilidad a

antibiticos.

Bibliografa Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., Turk, M. American Journal of Clinical Pathology, 45:

493-496, 1986.

Davis, D. B., Dulbecco, R., Eisen, H., Ginsberg, H., Tratado de Microbiologa. captulo

7 Salvat Editores, Tercera edicin, 1984.