antibiograma practica microbilogía

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ANTIBIOGRAMA: DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS INTRODUCCIÓN El uso y abuso de los antibióticos en las terapias contra infecciones de origen  bacteriano, conlleva a la selección de cepas bacterianas resistente. La diseminación de estas resistencias a otras cepas de la misma o diferente especie se ve facilitada cuando los marcadores de resistencia (genes) se encuentran en elementos genéticos móviles como son plásmidos y/o transposones La susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos se determina mediante técnicas basadas en la dilución o difusión del antibiótico en un medio de cultivo donde desarrolla el microorganismo en estudio. Las técnicas de dilución en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un agente antimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. La CIM indica la concentración de antimicrobiano que se necesita para matar o inhibir el crecimiento del microorganismo analizado y permite valorar comparativamente la  potencia de los antimicrobianos . La reproducibilidad de estas prueba s es de ± 1 dilución y para evitar una gran variabilidad éstas deben ser estandarizadas y controladas muy cuidadosamente. Los métodos estandarizados se detallan ampliamente en el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) Para el caso de las técnicas que se basan en la difusión del antibiótico, el método universalmente utilizado es el de Bauer y Kirby comúnmente llamado antibiograma. Este método consiste básicamente en un disco de papel embebido en el antibiótico que es colocado sobre un medio de cultivo sólido inoculado con el microorganismo a ensayar; luego de 18 a 24 horas de incubación se mide el halo de inhibición del crecimiento bacteriano que produce el antibiótico al difundir desde el disco de papel que lo contiene, radialmente hacia el medio de cultivo donde esta creciendo el microorganismo. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento en un antibiograma y el valor de la CIM para un determinado antibiótico son un criterio de referencia experimental para determinar si un microorganismo es resistente o s ensible a ese antibiótico. Otro novedoso método es el Etest TM  , que permite la determinación de la (CIM) . El Etest TM  es una tira plástica que contiene un gradiente continuo de un antibiótico, la técnica combina el fenómeno de difusión con el de dilución del antibiótico para determinar la CIM para un dado microorganismo. Este método, como veremos en el trabajo práctico, es mucho más certero que el antibiograma y más rápido y preciso que la técnica de dilución para obtener la C IM, que usualmente se realiza en varios pasos de dilución y cultivo lo cual requiere disponer de mucho material estéril para una sola determinación. Materiales Cultivo exponencial de  la cepa bacteriana a analizar. Agar Müller Hinton Cajas de Petri estériles Ansa Pipetas de 1 ml y 10 ml estériles Solución de hipoclorito al 5% para descarte de material contaminado. Tubos de ensayo estériles

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  • ANTIBIOGRAMA: DETERMINACIN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS

    ANTIBITICOS

    INTRODUCCIN

    El uso y abuso de los antibiticos en las terapias contra infecciones de origen

    bacteriano, conlleva a la seleccin de cepas bacterianas resistente. La diseminacin de

    estas resistencias a otras cepas de la misma o diferente especie se ve facilitada cuando

    los marcadores de resistencia (genes) se encuentran en elementos genticos mviles

    como son plsmidos y/o transposones

    La susceptibilidad de los microorganismos a los antibiticos se determina mediante

    tcnicas basadas en la dilucin o difusin del antibitico en un medio de cultivo donde

    desarrolla el microorganismo en estudio.

    Las tcnicas de dilucin en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un

    agente antimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la

    concentracin inhibitoria mnima (CIM) que es la menor concentracin de

    antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento bacteriano.

    La CIM indica la concentracin de antimicrobiano que se necesita para matar o inhibir

    el crecimiento del microorganismo analizado y permite valorar comparativamente la

    potencia de los antimicrobianos. La reproducibilidad de estas pruebas es de 1 dilucin

    y para evitar una gran variabilidad stas deben ser estandarizadas y controladas muy

    cuidadosamente. Los mtodos estandarizados se detallan ampliamente en el NCCLS

    (National Committee for Clinical Laboratory Standards)

    Para el caso de las tcnicas que se basan en la difusin del antibitico, el mtodo

    universalmente utilizado es el de Bauer y Kirby comnmente llamado antibiograma.

    Este mtodo consiste bsicamente en un disco de papel embebido en el antibitico que

    es colocado sobre un medio de cultivo slido inoculado con el microorganismo a

    ensayar; luego de 18 a 24 horas de incubacin se mide el halo de inhibicin del

    crecimiento bacteriano que produce el antibitico al difundir desde el disco de papel que

    lo contiene, radialmente hacia el medio de cultivo donde esta creciendo el

    microorganismo.

    El dimetro del halo de inhibicin del crecimiento en un antibiograma y el valor de la

    CIM para un determinado antibitico son un criterio de referencia experimental para

    determinar si un microorganismo es resistente o sensible a ese antibitico.

    Otro novedoso mtodo es el EtestTM

    , que permite la determinacin de la (CIM) .

    El EtestTM

    es una tira plstica que contiene un gradiente continuo de un antibitico, la

    tcnica combina el fenmeno de difusin con el de dilucin del antibitico para

    determinar la CIM para un dado microorganismo. Este mtodo, como veremos en el

    trabajo prctico, es mucho ms certero que el antibiograma y ms rpido y preciso que

    la tcnica de dilucin para obtener la CIM, que usualmente se realiza en varios pasos de

    dilucin y cultivo lo cual requiere disponer de mucho material estril para una sola

    determinacin.

    Materiales Cultivo exponencial de la cepa bacteriana a analizar.

    Agar Mller Hinton

    Cajas de Petri estriles

    Ansa

    Pipetas de 1 ml y 10 ml estriles

    Solucin de hipoclorito al 5% para descarte de material contaminado.

    Tubos de ensayo estriles

  • Hispos estriles

    Escala de McFarland Tubo 1 y # 5 (0.5 de Bacl2 (1.75%) y 99.5 de H2SO4 (1%).

    Discos de antibiograma

    Estufa a 37 C

    Desarrollo del trabajo prctico

    Determinacin de la CIM por dilucin en caldo

    1. Se realizan diluciones decrecientes del o los antibiticos en tubos conteniendo 1 ml

    de caldo Mueller-Hinton

    2. Se siembra 1ml de una suspencin bacteriana de aproximadamente 10 5

    bacterias por

    ml que equivale a una dilucin 1/500 del tubo 1 de la escala de Mc Farland.

    3. Se realiza un control de crecimiento inoculando un caldo sin antibitico y un control

    negativo con caldo sin inocular.

    4. Se incuban todos los tubos a 37 C durante 24 horas. Luego se observa turbidez

    indicativa del desarrollo bacteriano.

    5. Se determina la CIM como aquella concentracin del antibitico contenida en el tubo

    que posee la mayor dilucin del mismo en la que se detecta falta de turbidez. La mnima

    concentracin que inhibe el crecimiento bacteriano.

    Antibiograma

    1. Preparar placas de Petri con agar Mller Hinton de aproximadamente 4 mm de alto.

    (30ml) Dejar solidificar y secar bien.

    2. Preparar con el cultivo de la cepa a analizar, una suspensin bacteriana con solucin

    fisiolgica estril, ajustarla al tubo # 5 de la escala de McFarland.

    3. Sumergir un hisopo estril en la suspensin recin preparada, escurrir el excedente de

    lquido en las paredes del tubo y sembrar la placa de Petri con medio de cultivo

    anteriormente preparada. Distribuir uniformemente el inculo en toda la superficie del

    agar.

    4. Cuando la superficie del agar este completamente seca, apoyar los discos de

    antibiograma utilizando el aplicador o una pinza estril. Asegurarse que toda la

    superficie de los discos est en contacto con el agar, una vez colocados no deber ser

    movidos, dado que el antibitico es liberado instantneamente cuando entra en contacto

    con el agar.

    5. Incubar en estufa a 37 C durante 24 horas.

    6. Observar y medir para cada disco el halo de inhibicin del crecimiento.

    7. Analizar si las cepas bacterianas utilizadas son resistentes o sensibles a los

    antibiticos probados, segn los datos que figuran en tablas de sensibilidad a

    antibiticos.

    Bibliografa Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., Turk, M. American Journal of Clinical Pathology, 45:

    493-496, 1986.

    Davis, D. B., Dulbecco, R., Eisen, H., Ginsberg, H., Tratado de Microbiologa. captulo

    7 Salvat Editores, Tercera edicin, 1984.