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Casa ab¡& al tiemw
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DMSiON DE ClENClAS BlOLOOlCAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL
ss CBS o771 95
LIC. JULIO DE IARA ISASSI COORDINADOR DE SISTEMAS ESCOLARES PRESENTE.
Por medio de la presente se hace constar que el alumno cuyos datos se describen a continuación, concluyó su Servicio Social:
NOMBRE: SCHACK LEFO VlVlANE
MATR¡CULA: 90337505
LICENCIATURA: INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS
PROYECTO: CARACTERIZACIÓN DE PROTEINAS GLOBULARES POR DlCROlSMO CIRCULAR
Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, a los siete dlas del mes de Diciembre de m l novecientos noventa y cinco.
Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo"
M. k~ c. ROSAURA GRETHYR &LU DIRECTORA
'LPO
UNDAD VTAPALAPA Av. Miohoacin y La Punaima Iztapalapa 09340 MLxico, D.F. A.P. 55535 Fax: (5) 61240-83 Tela. 724-46-81 y 85
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UNNERSlaAO AUTONOMA METROPOUTANA P
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SERVICIO SOCIAL
“CARACTERIZACION DE PROTEINAS GLOBULARES POR
DICROISMO CIRCULAR”
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’ALUMNO: VIVIANE M. SCHACK LEFO
1 INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS
ASESOR: Dr. SALVADOR R. T E L L 0 SOLIS
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
NOVIEMBRE 1995 J
8 UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y La Purisima. Col. Vicantina, 09340 M6xiui. 6.F. Tel.: 724-4800 TELEFM (5) 612 0885
L
I
D E S C R I P C I ~ N DEL FENÓMENO DE DICROISMO CIRCULAR.
.." ?- Aíiri ciimido !a inayoria de 1'3s iiiitodos cspcctroscópicos ( infrarrojo,
resoriaiicia iiiagiiética nuclear, flitoresceiicia ) son particiilaniieiite sensibles a la i
coiiipocicióii atómica de los grupos qiiiiiiicos y Iejaiiaiiieiite afectado por el
arreglo geométrico de estos g ~ i p o s o la geometría de su entorno, la actividad
óptica espectroscópica es sensible de manera única a dichos aspectos
geométricos de la estructura inolecular. Por esta razón, la actividad óptica
espectroscópica es un nietodo espectral elegido para estudios de geometria
molecular.
La actividad óptica espectroscópica se inicia coli las mediciones de
dispersión de rotación óptica, este método espectral Iia sido sustituido en su
inayoria por un método más sensible y accesible: Dicroisino Circular (DC). El
eiiteiidiiiiieiito de la espectroscopia de DC requiere coiiociinieiitos de la energía
polarizada utilizada y de la naturaleza de su iiiteraccióii con la materia.
LUZ EN PLANO POLARIZADO
La energía luminosa se coiisidera que consiste de radiación que varía
periódicaiiieiite eii los campos eléctrico y inagiético, cuyo comportamiento es
descrito por las ecuacioiies de M a w ell para un cairipo electromagnético. Los
campos eltctrico y magnético de esta radiación electroinagietica oscilan en
ángulos Iiacia la derecha de uno y otro en un plano perpendicular a la dirección
de la propagación del rayo de luz.
La luz restringida a una sola longitud de onda o frecuencia se le llama . - monocroinática.
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I,? ]LIZ eii ti11 plaiio polxizxlo cs liii. rrsttiiigida irioiiocroináticaineiite por lo
que el sector elictrico oscila cii iiiia y solaiiie:ite iiiia dirección (aziniut) en el
plaiio perpeiidici!lar a !a J i w x i O i i de propayciói i del rayo. El vector
magnético de la Iiiz e:i p!aiio polarizada eiitoiices oscilar$ eii el plano
niiitiiarneiite perpeiidicular n la direccióii de propagación del rayo de luz y del
azimut de oscilacióii del vector clictrico. Coiiveiicioiialineiite, la dirección Z es
tomada coino la direcccióii de pi’opagacióii de la luz, y el eje Y es tomado
coino el aziiiiut de oscilacióii del vector ekctrico creando el plano Y-Z que es
el plano eléctrico de polarizncióii. El ejc X es tomado como el azimut de
oscilación del sector imgii t ico Iiacieiido qiie el plano X-Z sea el de
polarizacióii iriagiética.
LUZ CIRCULARMENTE POLARIZADA
El ténniiio de ‘ h z circulanneiite polarizada.” es simplemente una
rzpreseiitacióii coiiveiiieiite de los modos de ondas vibratonas que son
producidas cuando las iiiteiisidades de los dos coiiipoiieiites superimpuestos de
la onda, qiie soli polarizados eii difereiites planos, se suman. La luz
circiilaniieiite polarizada es prodiicida ciiaiido de fonna selectiva es retardado
uno de los coinpoiieiitq y sea ciialqiiirra de los coinpoiieiietes polarizados X
o Y, de la luz en plano polarizado i i i i ciiarto J e loiigitiid de onda. La figura A
miiestra la resultaiite de l a Iiiz cii-ciilannriite polarizada cuando la componente
Y es retardada i i i i cuarto de loiigitiid de onda ( 90 grados) en relación con el
componeiite X. Ciiaiido es obser\.ado hacia abajo, eii la dirección de la
propagación (eje Z), los vectores elictricos resiiltaiites rotaii, al chocar el rayo
sobre iiii piiiito de obsenacióii, de manera circiilar, en el sentido de las
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a) Radiación incidente polatizada en un plano
b) Radiacion que emerge de un medio con actividad 6ptica
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inanecillas del reh j alrededor del tjc Z. La figiira B muestra el vector eléctrico
einergeiite qiie rota Iiacia la izqiiiei.il;i n dos tieiiipos arbitrarios t i y tz.
DESCRIPCIÓN DEL FEIVÓAIENO DE DICROISRIO CIRCULAR
Los feiióineiios de Dicroisiiio Circiilar (DC) y Dispersión Optica Rotatoria
@OR) son causados por la respiicsta de tina siistancia “ópticamente activa’’ a
la radiacibii electroinagietica Eii geiieral, la radiación induce eii un medio
material uti inoiiieiito dipolar- eléctrico p y uti irioinento dipolar magnética M
que están dados por las eciiacioiies sigtiieiites.
En las eciiacioiies aiiteriores N es el iiiiinero de sistemas o moléciials por
unidad de \oliiiiieii qiie coiistitii)eii el iiiedio, a y K son la polarizabilidad y la
susceptibilidad iiiapiética r’sspccti\ aineiite: el paráinetro p puede ser designado
como “parámetro óptico” ya que coiiio se verá inás adelante, de éste depende
la existeiicia de los Ilaiiiados ”feiióiiieiios ópticos” (DC y DOR). Los vectores
E ‘y B‘ son los vectores del caiiipo elcctrico efectivo y del campo magnetic0
efectivo de la radiación ( es decir, estos vectores son los que interaccionan a
nivel inicroscópico coil la iriol~ciilas de iiiedio inaterial ). Los vectores E’ y B‘
represeiitaii las derivadas parciales de E’ y B‘ coli respecto al tiempo. Sin
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P
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eiiib;irgo, Jccde iiii piiiito de \ i j i i i espcriiiiciital estainos interesados en los
caiiipos iiiacroscópicos proincdio (E Y B). Para iiiedios isotrópicos
gerieraliiieiite se Iia usado la relacioii electrosiática entre E' y E :
E'= SE (A.3)
s = ( 1 - 4nN aA) - ' doiide
Eii el caso qiic iios ocupa es coiiveiiieiite utilizar las ecuacioiies de Maxwell
para inedios inateriales eii l a fonna
doiide C es la velocidad de la luz eii el vncio. Usando las eciiacioiies A. 1, A.2,
A.3, A.4, A.5 y A.6 se obtieiie la c.ciiacioii siguieiite:
CI
F
L ..
en donde se Iia iisaio I J irlacibii V:<T'.UE=-V'E l a cual es válida cuaiido
VoE=O ( es decir, el proinedio dc la deiisidad de carga es igual a cero). Cuaiido
N = 9, la eciiacióii A.7 se rcdiice a la cciiacioii eii el vacío:
cuya soliicióii es
E = E~ exp(-ia( t - ,,c Y)]
donde z es la dirección de propagacióii y w es 2nv. En un medio inactivo
ópticamente (N * O J3 = O), la soliicióii de la eciiacióii A.7 es:
siendo q el íiidice de refraccioii , el cual está dado por
= [ 1 + 47rNSa/ I - 4ríN.Y~
(A. 1 O)
(A. 1 1)
c
b 6
.--..--- _L--
~~~,..* ~~ ~---- r-'
....
?- Ei tiniii,io que iiivoliicra ii K cs bastante iiiciicir que el correspondiente a u
por lo cii:il se acostiiiiibra igiial'ii~ el dciioiiiiiiadoi. de l a eciiacioii A. 1 1 a la
unidad, Eii el caso en que N=.O y p;.o podciiioj siipoiier qiie la eciiacióii A.7
tiene iiiiil solución de la foniia:
- F'
.- c
c
L.
r-
i.
i-
r
L._
c
(A.12)
Dicha siiposicióii conduce a la siguiente relacióii:
(A. 13)
Corno E es perpendicular a la dircccioii de propagacióa (V.E=O), su amplitud
puede escribirse coiiio E, = i El + j E2 y la eciiacióii A.12 se transforma en
donde Ii = 8 ; r N C ~ d c . El detenniiiaiite de este par de eciiacioiies homogéneas
debe ser cero, coli lo cual se tieiie qiie (17' - 17') ' - /1'17' = O . Con
una aprosiinacióii de primer orden en Ii se obtienen dos soluciones positivas
para : L
P-
i-
r- __
7
... .
cx
c
(A. 16)
Los valores de q+ y q- geiieraii a su vez dos solucioiies (tainbiéii coli tina
aproxiinacióii de priiner ordeii eii ii ) para el sisteina de ecuacioiies A.13 y
A.14: E2 = iEi y E2 = ¡El . Esto iiidica que eii iiii inedio Ópticaineiite activo se
propagaii dos fonnas de radiacióii que soli:
(A.17)
(A. 18)
Las ecuacioiies aiiteriores describeii oiidas electroinagiéticas de ainplitud
constaiite, pero que tieiieii iiiia trayectoria lielicoidal (las ecuacioiies Iiaii sido
derivadas para el vector E, pero puede deinostrarse que B tieiie uii
coinportaiiiieiito siinilar). E+ y E. se coiioceii coinúiiineiite como radiacióii
Y
~ A&-- , - ____._-.__- - ' L
r- circiilanneiite polrii-izada dcrwliii c irqiiici-cia respectivaineiite. En geiicral es
tin iiúiiiero coiiiplejo, por lo qiir 2s posiide sei- ibi i .. c
c
con estas relaciones las eciiacioiies A. 17 y A. I8 adquieren la forma -.
c
- r-
L_
r.
c-
c-
c
c
.-
r,.
(A.19)
(A.20)
Este resultado nos indica qiie eii titi iiiedio ópticaineiite activo, la radiación
polarizada eii iiii plano es resuelta en dos coinpoiieiites circulares que tieiieii
diferente velocidad de fase.
Después de viajar iiiia distancia "z" eii el inedio la diferencia de fase eiitre
E+ y E. es (mZlic)*(ii - '-ii-'). Poi- ejeiiiplo, si eii tin inedio i p i ~ .
tendretrios el feiióiiieiio de destrorotacióii del plano de polarizacióii. En la
figura 15.a liemos representado esqiieináticaiiieiite el Iiaz incidente (E)
polarizado en el plano "XZ ' ( la direccióii de propagación, "Z", es
perpeiidiciilar y hacia afuera del plano del papel) eii fiiiición de sus dos vectores
- P circu1;ircs. Eri I;r tigira I5,b i-ep~eseii~~~iiios la i-adiacióii que emerge del inedio
(para el caso ipi1.). Coiiio la fase E+ es iiiayor que la de E., se puede apreciar .._ c ..- en la figlira que el plano de polarizacióii Iia rotado tin ángulo . El vrilor de es
r- conocido coino “rotación óptica” y , en tinidades de radiaiies por unidad de L longitud del inedio, esta dado por la eciiacióii r- L
(A.2 I )
donde b’es la parte real de p. El feiióiiieiio de Dispersión Óptica rotatoria
coiistittiye siinpleineiite la mriacióii de en fiiiicióii de la longitud de onda de la
radiación.
En las ecuacioiies A.19 y A.20 se observas que la ainpiitud de los vectores
E+ y E- tainbieii depende de 2. Coino la intensidad de la radiación es
proporcional a (E)’ tenemos qiiz:
O0
I ,== I , esp (-?O~’’Z/C}
I. = I, esp {-2c~)q“z,k]
(A.22)
(A.23)
I O
-.. . __I
y por taiito los cocticiciitcs di. cxtiiiciijii corres-poiidicntes serán E*=(~u/c) rlr .
La diferencia eiitre estos dos coeticieiites es conocida como dicroisino circular
y está dada por
(A.24)
Esto quiere decir que en tin medio ópticamente activo los coinponentes
circulares de la radiación polarizada en tin plaiio tendrán diferente velocidad de
fase y diferente estiiicióii ( SI la loiigitiid de onda corresponde a una zona de
absorción del inedio). Coino resiiltado teiieinos que la radiación transmitida se
encuentra polarizada elipticaiiieiitc, como se iliistra esqueináticamente en la
figura A y B.
De los resiiltatios del trataiiiieiito anterior se observa qiie los fenómenos
ópticos (DC >. D o n ) depeiideii dcl valor de E . Es posible deiiiostrar qiie el
d o r de este paráiiietro est5 relacionado coli los inoineiitm de transición
eléctrico, < ~ i I p in> , y inagnético,<: illirilin> , de las inoléculas del sistema. Esta
relación se conoce coino la eciiaciun de Rosenfeld.
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&ride .cilI y < n i ; son dos cstx1,)s cic la iiiol2ciila con eiiergia E,, y E,,,
respectivaniente. Los v e c k x s li y iii represciitaii los operadores de los
momeiitos eléctrico y inagiiitico. Mediaiiic el LISO de la Teoría de bmipos se ha
dzmostrado que el prodiicto tieiie valor cero para moléciilas o croinóforos que
poseen centro de iiiversióii, plaiios de ieflesibii, o ciialqiiier otro tipo de eje de
rotoreflesióii. Desde Iiiego, ciialqiiier iiiolticiila que posea algiiiia de las
operaciones de siinetria iiieiicioiiadas ai-ri'ua iio presentara ninguno de los
fenómenos Ópticos y será desigiada coirio Ópticaineiite activa.
DICROISMO CIRCULAR
El Dicroisino Circtilar (DC) y la Dispersioii óptica rotatoria (DOR) son dos
fenómeiios que se eiiciieiitraii iiiterrelacioiiados y qtie soii utilizados para inedir
la actividad óptica de irioléciilas asiinétricas en solución. La DOR es la
habilidad de. la inolecula de rotar eii el plano de Iiiz linealineiite polarizada
coinó iiiia fiiiicióii de la loiigitiid de oiida. DC proporcioiia iiifonnacióii con
rescpecto a la absorcióii desigual de liiz circtilaniieiite polarizada, taiito a la
izquierda coino a la derecha., por iiioleciilas opticaiiieiite activas.
Debido a qiie hoy eii dia coiitairios coil iiistriiineiitos de alta precision, el DC
se ha establecido coino iiiia téciiica estaiidar para inedir la actividad óptica de
lac proteiiias.
Las sefialss de DC se observan eii las iiiisiiias regiones espectrales doiide se
encuentran las bandas de absorcióii de tin coiiipiiesto eii particular . Estas
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seiin1t.s wii pi-opoi.cioii;ii!rij pii. l o b r-cspc'cti\.os griipos croiiioforos o sii
ainbieiite iiioleciilar el cita¡ es :ij¡iiicii.¡cü.
Lab baiidas de DC cie las pi.orciii;is octirr-cii eii dos regioiies espectrales. Eii
el ultravioleta Icjaiio o rcgióii aiiiida ( 170-750 iiiii) las cual se eiicueiitra
dominada por coiitr-ibucioiies de eiilaccs peptídicos; la otra región correspoiide
al ultravioleta cercano (250-300 iiiii) c u ! ~ baiidas soil origiiiadas por
aminoácidos aroiriáticos. Adciiiis, uiiioiies disiilfiiro dan lugar a pequeíias
baiidas de DC alrededor de 250 iiiii. Ainbas regioiies espectrales proporcionkn
iiifonnacióii de diferente tipo coil respecto a la estructura de las proteíiias.
Las bandas de DC eii la regioii aiiiida coiitieiieii iiifonnación respecto a los
enlaces peptidicos y las estructiira seciiiidaria de la proteína y son
frecueiiteiiieiite ultilizadas pnra inoiiitorear los cainbios en la estructura
secuiidaria duraiite el curso de las traiisicioiies estnictiirales. En particular, la a-
hélice iniiestra uii fuerte y característico espectro de DC en la región del
ultravioleta Iejaiio. La coiitribucioii espectral de otros eleineiitos de la
estructura seciiiidaria no se eiiciieiitraii taii defiiiidos.
Las bandas de DC eii el iiltravioleta cercano se observan cuan las cadenas
aroináticas laterales soli iiiiiiovilizadas eii uiia proteíaii doblada y soli
transferidas a t in aiiibieiite asiiiihico. El DC de residuos aroináticos es ilitiy
peqiietio debido a l a auseiicia de estr-iictiiras ordenadas, coino por ejemplo,
peptidos cortos. La setial, iiiagiiitud y longitud de onda de las bandas de DC de
coiiipuestos ai'oiháticos no se piiedeii predecir, depeiideii del ainbieiite
electrónico y estructural de los croiiióforos iiiinovilizados. Por lo taiito, los
picos iiidi\.idriales en el iiiiiy coiiiplejo espectro de DC en el UV-cercaiio de
una proteiiia, iisualiiieiite iio se debcii n la traiisicióii de las cadenas laterales de
ainiiioácidos específicos
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[>c cii:iiqiiicr iiiaiiera, el espccttv de DC cii cI UV-cercaiio, represeiita iiii
criterio altainciite especifico para el estado i ia t iw de iiiia proteiiia.
Coi:cltiyciicio, podeiiios decir de la [&mica di: DC es iriiiy í i t i l para
inoiiitorcar la tniisicióii estriictiiríil de protciiias
MEDII)/l DEL DICROSIhlO CIRCULAR
Geiieralineiite, la difereiicia eii absorbaiicia entre la luz circularmente
polarizada, derecha e izquierda, de uiia iiiiiestra dc proteiiia es estreinadaineiite
pequeiia. Eii I J regióii del iiltravioleta lejaiio se eiicueiitra eii un rango de
unidades de absorbaiicia entre 104y eii iriiiestras que presentan un total de
absorbaiicia de aprosiiriadaiiieiite I .O. Esto requiere que inenos del 0.1% de la
seiial de absorbancia sea inedida eii foima adecuada y sea reproducible. Por lo
tanto, iiistruinciitos altaineiite seiisibles soil iiececarios y es necesario que la
inuestra se prepare coli cuidado.
Instrumentos.
Espectropolaríiiietros de DC inodei-iios iitiliznii t in inodulador fotoeléctrico de
alta freciieiicia para generar alteiiiadaineiite las dos coinpoiieiites de la liiz
circulanneiite polarizada Depeiidieiido del iiistiiiineiito . la seiial puede ser
2 Tabada ya sea directaiiieiite c a n o \ilia difereiicia de absorbancia, o corno
elipticidad, expresada eii iniligrados.
El iiistniineiito de DC o p m de iiiaiiera siiiiilar a i i i i espectrofotóinetro qiie
registra la absorbancia de t i i i solo ra)'o. Uii coiiipoiieiicte adecuado para la
calibración del iiistriiiiieiiteo es el :icicto d- I O-caiiiforsiilfóiiico.
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D&iJo a qiie I;is baiidas dc DC‘ %)i1 gciicrnliiiciitc iiiiiy pqiieiias se requiere
uria graii estabilidad, eii c i i d o < I l ; i sciial di: DC se refiere. Dicha estabilidad
se deteniiiiiri iitilizaiido ti113 soliicitiii bl:iiico e11 la regióii, loiigitiid dc d a , de
iiiteres por tiii detcrmiiiado periodo c k tieiiipo.La desviación eii l a dirección de
la sena1 dcbe ser iiieiior de 0.5-1 iiidegh. . .La liiiea base del espectro de la
mayor parte de los iiistrtiiiieiitus de DC piiede ser ajustada inaiiiialiiieiite o
electrónicaineiite
Las celdas que se iitilizaii para iiiedir DC deben de ser de cuarzo fusionado,
especiíicaiiieiite elaboradas para DC; iio debeii de ser birefiirigeiites. Para qiie
maiitengaii iiii biieii coiitrol de temperatura, debeii de utilizarse celdas
eiicliaqiictadas .
Los solveiites que se iitiliceii para preparar las muestras deben de ciiinplir
coil ciertas características. La coiitribiicióii de los buffers o sales a la
absorbaiicia total de la muestra debeii ser lo iiieiior posible. La inagiitiid del
DC \‘a a depeiider de la coiiceiitracióii de proteha, la cual, por lo tanto, debe
coiitribiiir eii graii parte a que la deiisidad óptica total de la muestra sea lo más
alta posible. Para inedicioiies eii la regióii del UV-lejaiio altas coiiceiitracioiies
de proteiiia debeii de utilizarse para iiiiiiiiiiizar la coiitribiicióii del solveiite a la
absorbaiicia i0t:il.
Pasteur, Vaiit Hotf y Le Be1 desan-ollaroii los priiicipios que los qtiíiiiicos
inodenios coiisideraii coiiio reqiieriiiiieiitos para qiie uiia inoléclila posea
“actividad óptica”, esto es, para qiie haga girar el plaiio de l a liiz polarizada.
Un coinpiiesto es ópticaiiieiite activo eii soliicióii, ciiaiido su estnictiira no
puede hacerse coiiicidir coli la de sii iiiiageii reflejada, es decir, ciiaiido el
Coinpiiesto iio posee ii i i plaiio o iiii ceiitro de siiiietria. Si iiii átoino de carbono
tetrakdrico está iiiiido a cuatro =riipos siistitiiyciites difereiites, se dice que es
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asiinetrico y prodiice ui;a ncti\.idiid olitica, n iiiciios qiie la iiioleciila coiiteiiga
tiii sqiiiido atoiiio de carboiio asiiiii'ti-ico siiiiilar coil los inisiiios siistituyeiites.
Por ejemplo, el icido iiiesotai~tirico y o t r a coinpuestos iiieso 110 soli
ópticaineiite activos. Eii el caso de iiiiiclios coiiipiiestos no plaiiares, tales coino
los compuestos espiro, alileiiicos y nlgiiiii>s bifeiiilos siistittiidos, piiedcii
presentarse estriictiiras asiiiiétricas coil acti\.idad optica, sin que exista un
átoino de carboiio asiiiiétrico eii la iiioléciila. Eii la misma foiina, la actividad
óptica no está limitada a los átoinos de carboiio, siiio que puede ocumr en
ciialqiiier coinpiiesto tridiiiieiisioiinl asiiiiitrico.
Algiiiias sustaiicias solo esliibeii actividad óptica eii el estado sólido
cristaliiio, Eii los cristales iio ciibico, esisteii ciiaiido ineiios dos direccioiies
primarias eii el tristal que iniiestraii diferentes distribuciones espaciales de los
átoinos y, por lo tanto, difereiites caiiipos de fuerza. La radiacióii se traiismite a
velocidades desigiiales eii las diferentes direccioiies. A estos cristales de les
llama cristales aiiisotrópicos y Iiaceii girar el plano de la iiiz polarizada.
APLICACIONES DE LA DISPEIISIÓS ROTATORIA ÓPTICA Y DEL
DICROISIIlO CIRCULAR.
Las priiicipales aplicacioiies de la dispersióii rotatoria óptica y del dicroísino
circular se eiiciieiiti'aii cii el irea de la detenniiiacióii de estnictiiras de
sustaiicias ópticaineiite activas. tales coiiio ainiiioácidos, polipéptidos y
proteiiias, esteroides, aiitibióticos, terpeiios y coiiiplejos de metal -ligando.
Miiclias de las aplicacioiies iiiodenias soil de iiatiiraleza empírica y dependen
del coiiociiiiieiito del coiiipoitaiiiieiito de coinpiiestos similares a los
iiivestigados. Siii eiiibargo, se esistcii n l y i a s reglas generales.
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1.0s niiiiiioricidos alifiiicos ediibcii ti i i cfdcto Cotton iiiiiy especial, cuyo
sitio izfleja la estereoqiiíiiiica eii el ctiitro asiiiiitrico. Los a-ainiiioicidos de
coiifigiracióii levógira iiitiestraii iiii efecto Cciioii positivo alrededor de 2 15
nm, inieiitras que, los eiiaiitióiiiei'os destiógiros tieiieii iiii efecto Cotton
negativo. En los polipéptidos, es posiblc. estiliiar el porcentaje de estnicttira
helicoidal a por iiiedio de inedicioiies de la dispersión rotatoria óptica.
En los esteroides, las iiiiioiies anulares cis y /ratis produecen diversos tipos
de curvas de dispersión rotatoria y óptica. Eii iiiia de las fonnas, la rotacion
especifica aiiiiieiita al disiniiiiiir la loiigitiid de onda, Iiasta que alcanza un
máxiino y coiiiieiiza a iiivei-tirse ( c i i i u positiva), y eii la otra, la rotacióii
específica disiniiiiiye al reducir la longitud de onda Iiasta alcanzar el valle e
invertirse (curva negativa). L a localizacióii de los p i p o s carboiiilo en los
esteroides Frecueiiteineiite piiede quedar liiiiitada a iiiias pocas posibilidades
observando el signo de la curva del efecto Cotton y la longitud de onda y la
rotación específica del pico del valle.
Los estudios teóricos de la absorcióii de energía radiante en los cromóforos
distribuidos asiiiiétricaineiite alredzdor de tiiia iiioléciila han conducido a la
llamada regla de los "octaiites".
E L POL.4Rl>IETRO
El polai'iiiietro coiisistz de las siyiziitcs paiíes bisicas:
1 .- Una fiieiite de luz
2.- Uii polarizador
3.- Un analizador
4.- Un círculo gadiiado para inedii' el p a d o de rotación.
5 . - Tubos para iiitiestra.
17
L.
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L
Escepto eii los iiistriiiiietitos iiias seiicillos, tainbiéii se iiicliiye iii1 aparato
de peiiiiiiibra. Algiiiios polni-iiiietros piiedeii estar eqiiipados coil fotoceldas u
otros dispositivos para la iiiedicióii de la iiiteiisidad de la luz que einerge del
iiistniineiito, aiiiiqiie la iiiayoria de los polariinetros están disefiados para
observacióii visiial.
Las fuentes de luz in i s coiniiiies para la polarhetría soil las Iáinparas de
vapor de sodio y las lainparas de vapor de inerciirio. La lámpara de sodio emite
Iiiz de loiigitiides de oiida de 5 890.
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DICROISNIO CIRCULAR EY PROTElN.4S Y POLIPÉPTIDOS.
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iiifonnacióii coiisiderable referente a la estructura de proteínas en disolución
piiede obteiierse a partir de la inedida de su actividad optica. La gai i asimetría
de las iiioleciilas de proteiiia cs rcspoiisable de las seiiales que esliibeii los
métodos iiitenelacioiiados de Dispersióii Óptica Rotatoria (Om) y de
Dici'oísiiio Circiilar (DC). Dispersión óptica rotatoria (Om) es la medida, en
fuiicióii.de la loiigitiid de onda, de la habilidad de una itiolécula de rotar el
plano de l a luz liiiealineiite polarizada; Dicroísiiio Circular (DC) evalua de
manera siiniiar l a absorción irregiilar de la liiz circiilanneiite polarizada a la
derecha y a la izqiiiei.da.
Aiiiiqiie todos los ainiiioácidos excepto la gliciiia contienen por lo ineiios un
átoiiio de carbono asiiiiétrico (la coiifigiiracióii L o D), la mayoría de los
ariiiiioácidos iniiestraii sólo peqiieiias bandas de ORD y DC. Es la
coiiforiiiacióii de l a proteíiia, es decir, el acoinodo asiinétrico y periódico de las
unidades del péptido eii cl espacio, lo que da lugar a los espectros
característicos de ORD y DC.
Eli aiios reckiites el aiiálisis por difraccióii de rayos X a llevado a coinpletar
el iiiapeo ds In coliiiniia \.ei-tebral del p2ptido. así coino, las posiciones de las
cadeiias laterales de la lisoziiiia,(' 'algiiiias otras eiiziinas,"' así coino proteínas
en el estado sólido. T2ciiicas iiiievas coino la difiaccióii de iieiitroiies y la
resoiiaiicia inagiética de alta resoliiciúii Iinii generado iiifonnacion respecto a
los átoinos de hidrógeno eii las proteínas; esto se eiicuentra más allá de las
-resoliicióii del aiiálisis coil rayos X. ORD y CD son técnicas que carecen de la
capacidad de deteniiiiiar de iiiaiiei'a exacta la ectnictura, lo cual es posible coil ."_ r-
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los rr:;todos inc'iicluiiados ¿iiiici-ioi.iii~iite, :;in eiiibargo tienen ia veiitaja de que
Lmo se piiede aprosiiiiar ripidaiiiciite a los porcentajes de coiifonnacióii
presente en disoluciones diliiidiis de pi'otdiiia. Una inuestra de proteína de
menos de O . 1 ing geiieraiiiii-iite es suficiente para una detenninación con DC ti
ORD.
Para estudios referentes n la estriictiira de polipéptidos sintéticos,
macroinoliculas que generaliiieiite exhiben una coiifonnacióii repetitiva regular,
ORD y CD pueden ser excelentes. ORD y DC son herramientas espectralts
rniiy sensibles y pueden ser de utilidad en el estudio de reacciones que
iiivoliicran cambios en la actividad óptica. Asi, son excelentes para medir en
polipéptidos desiiatiiralizacióii de proteínas y transiciones Iielicoidales.
También pueden ser utilizados para medir la iiiteraccióii de enzima y sustrato,
inhibidores y coeiiziinas, así coni0 la iiiiióii de ioiies inetálicos y tintas a
proteínas y polipéptidos.
En 1963 t in capitiilo respecto al ORD de proteinas fiié escrito por Fasinan,
en es2 t i m p o , debido a las liinitacioiies iiisti-iiineiitales, las mayor parte de los
estiidios de proteinas con ORD iiivoliicrabaii medidas en un rango de longitud
de onda siiperior a los 240 ni11 y el análisis de los datos se llevaba a cabo coil
las ecuacioiies de Driide y Moffit. El estudio del efecto Cotton derivado
directaineiite de la transición de péptidos asiinétricos croinóforos fiie solaineiite
el inicio. En los aiios sigiieiites, dos tipos de mejoras eii los
espectropoláriineti-os, re\.oliicioiiaroii Ins medidas de propiedades ópticas
rotatorias de las proteinas, causando una proliferación en la investigación de
proteínas y polipéptidos. El priiner avance fiié desarrollado en iiistmmentos
cornerciales, pennitieiido las inedicioiies de ORD de nitiiia en un rango
espectral dz 185-600 iiin, incluyendo los efectos Cotton provenieiites de
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21
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péptidos croiiiillim~s. El sc iy ida y iiiis iitil di. los a\mces fiie el de el
espectrofotóinetro de DC capaz de operar en el iiiisino rango espectral. Las
ventajas de DC sobre ORD para estudios coiiforniacioiiales de las proteínas
son: (1 ) cada transición electróiiica óp!icaiiieiite activa proporciona solo una
banda de DC en lugar de Ins seiiales positi\,as y negativas como en ORD y las
bandas son resiieltas y asiyiiadas iiiiis fiiciliiieiite ; (2) DC a diferencia de
ORD, las bandas soli de una aiiclio dcfíiiido y. por lo tanto, el espectro de DC
no contiene contribuciones de transiciones qiie tengan lugar fuera del rango
espectal establecido. Por estas razoncs la inayor parte de las investigaciones de
proteínas se llevan a cabo con DC en lugar de ORD desde los inicios de 1968.
Otro avance importante fiié el desciibriinieiito de la conformación p Iiidrosoluble de la poli-L liciiia al calentarla. Por lo tanto , la contribución de las
foniias p así como las a-lielicoidales y estructuras al azar a la coiifonnación de
las proteínas en disolución puede ser considerada. Esto hizo posible analizar
coil espectros de DC y ORD la mezcla de las tres estructuras antes
mencionadas utilizando polipéptidos sintéticos, poli-L-Lisina como modelo.
Estos métodos parecían ser tina aprosiiiiacióii iitil a la coiifonnacióii de
proteínas altamente estriicttiradas. Siii eiiibargo, problemas que no se Iian
resuelto en la iiiterpretacióii sui-geii de la elección del modelo estnictura, la
contribución de ci-oiiióforos acti\.os que no son péptidos y el efecto de la
dispersión de la luz.
Sin embargo, la iiitrepretacióii de un espectro de DC no es sencilla.
.. ..
Tres iiistwiieiitos coiricricalcs, el Car!. el .!risco y el Jouaii, soii capaces de
generar espectros de alta resoliicibii de DC ii ORD con relativamente bajos
riivclcs de ruido de Iiasta IS5 iiiii y se piiedeii utilizar para el estudio de
proteinas.
I . Espectropolarinietro coil registro Caiy 60 con accesorios para DC 6001 y el
dicróinetro circiilar Cary 6 I . Los iiistriiiiieiitos Cary utilizan un prisina doble
nioiiocroinático, uiia celda Faraday para iiiodiilación rotacional del rayo de luz,
prismas Rochoii para el poiarizador y el analizador , y celda Pockels como
inodiiiador de DC y plato de iiii cuaito de onda. Una descripción del
polaríinetro en el modo ORD ya ha sido proporcionado; la operación y
presicióii del Caiy 60 y 6 I coiiio iiii iiistriiiiieiito de DC son muy similares. Los
datos son reproducibles deiitro de 0.001" de rotación (ORD) o elipticidad (DC)
y densidades.ópticas de 5 2 iisiialineiite piiedeii ser toleradas. El nivel de niido
es -de 0.0005" de rotación o eiipticidad bajo condiciones de absorbancia
peqiiefia a b 2 2 0 iiin, y se incrementa Iiasta 0.005" para una muestra de
proteína de absorbaiicia -2 a 190 i i i i i . El espectro es registrado en un rollo
coiitiiiiio de papel para g~aficar.
7. Diirnini-Jasco modelo 5-20 DC .Este iiisti'iiineiito ha sido coiisiderableineiite
mejorado sobre el modelo Jasco 5, y su fiiiicioiiaiiiieiito es ahora similar al del
Cary GO/GI. Un avance iiiiportaiite es que la línea base ahora puede ser de
puntos multiples. Una posible desventaja es la gáfica preiinpresa. El
instrumento Jasco difiere del Caiy en qiie no utiliza el efecto Faraday, y en
medir directamente DC en absorbancia dicróica diferencial
( A[.- All) en lugar de eii elipticidad.
I- .
3. Dicrógrafo de Roiissei-Joiiaii [IC iiio~ido I I Este iiistniineiito es similar al
Jotiaii previaineiite descrito, pero recieiiteiiieiite inodificado para medir el
espectro de DC, coino (AI~-AI<) Iiacia abajo hasta 185 nin. Aún no ha sido
exteiisaineiite iitilizado para proteiiias y polipeptidos. De cualquier modo, los
datos obtsiiidos del ;iistniiiieiito Joiiaii eii algunos laboratorios Europeos son de
buena calidad coil respecto al nivel de riiido.
4. Espectropolariinetro Beiidiu-Ericssoii Polariinatic 62 con registro. El Bendix
es capaz de Iiacer medidas precisas de ORD solo a longitudes de onda mayores
a 220 tiin y es, por lo tanto, iio i n i i v i i t i l para croinóforos de péptidoc.
i ) CALIBRACIÓ,,\'
La absoltita presicióii de ciiaiqiiier inedida cuantitativa depende de la
estaiidarizacióii del método. Es fricil verificar la calibración de instrumentos de
ORD: valores de rotacióii especifica ( a varias ioiigitiides de onda de 250 a 589
t i i n ) de iiiia soliicióii a 0.25°,ó de sacarosa p e d e ser comparada con valores en
la literatura. Si es iiecesario el polariiiieti'o piiede ser recalibrado.
De ciialqtiier inaiiera, iioy eii dia iio hay iiii estaiidar de DC accesible con la
pureza coiisisteiite .de la sacarosa. El coiiipuesto cointiiiineiite utilizado para
calibrar espectropolaríinetros de DC es el ácido(+) d-IO-cainforsulfónico al
O . 1% eii soiiicióii aciiosa, lo qiie iiiiisstra tina aiiiplia baiida de elipticidad a 290
iiin. Pero el ácido(+) d- I O-caiiiforsiilfóiiico fonna tin hidrato conteniendo
aprosiinadaineiite 7% de agua bajo coiidicioiies iioiinaies de laboratorio, por lo
que el peso piiede iio ser tina inedida exacta de coiiceiitracióii. Además,
r^ imptireas aiiiarilkis fiicruii Ii~1l~icl:is C I I algiiiios lotes de p d o reactivo I_.
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(Eastmaii Kodalij del aciclo(f) J- I O-caiiiforsiilfóiiico. El ácido puede ser
piiriticacio por recristalizncióii a paitir de ácido acético, seguido de m a
sublimacióii al vacío, secado a SO" a l vacío y alinaceiiainieiito en un desecador.
Entonces es adecuado como tin estaiidar de DC inediaiite lo cual la señal gana
ajuste controlando la magnitud de la setial de DC observada en un instrumento
puede ser inaiiipiilada
El valor exacto del pico de elipticidad iiiolecular, [0?90] del ácido (+)d-10-
camforsiilfóiiico no es conocido coli cciteza, parcialiiieiite debido a problemas
de iiiipiireza. Afoitiiiiadaiiieiite, el valor de puede ser calculado por
medio de la traiisfonnacióii de Kroiiig-Krainer, de los datos exactos de ORD sobre l a inisma muestra del iícido(+)d- 1 O-cainforsiilfóiiico obtenida en un
polaríinetro bien calibrado. Para que este cálculo sea válido la muestra no debe
contener impurezas ópticaiiieiite activas aunque peqiieiias cantidades de agua
son tolerables. Uiia inaiiera siiiiple de obtener uii valor absoluto de DC para
una solución acuosa rotacioiialineiite pura de ácido(+) d- IO-camforsulfónico
estandar es utilizaiido las relaciones calciiladas de Cassiin y Yang del pico de
elipticidad iiiolecular al pico >. iiiiiiiiiio de rotacióii inolecular: [8:90]![M]30ú =
1.76 y [?.l]:-!, = -1.37.P~ ejziiiplo. iiiia iiiiiestra seca y purificada de
ácido(+) d- 1 O-cainfarsiilfóiiico geiieró iiiedidad de rotacióii de = +4480
y [MI170 = - 5700, 'de donde [O]:t)io eq!iivale al promedio de 4480 x 1.76= 7880
y - 5700 s -1.37 = 7500, o [e]?,,, = 7840 (coi-respoiidieiite a A E L - ~ = 2.37). La
mabmitiid resultante [ O ] 1 , , , puede etitoiices ser utilizada para calibrar el
espectropolaríinetro, auiiqiie la iiiiiestra de ácido(+) d-l O-cainforsulfóiiico
puede coiiteiier algo de agua.
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ii) DISOLlJCIOivES P
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I.
Las condiciones del disolveiite, la coiiceiitracióri de proteína y la longitud de
paso óptico eii la celda debeii ser elegidas de tal inaiiera que la disolución
pennaiiezca relativamente traiisparciite eii la región de la longitud de onda de
riiiestro interés ( deiisidad óptica por debajo de 2 en la mayoría de los casos),
pero también que esté presente stificieiite soluto para registrar una rotación 'o
elipticidad fácilineiite inedibles c'oii tiiia seiial alta en ruido.
L a primera coiisideracióii es iitilizar t i n disolvente que transmita suficiente
luz. El agua es el disolvente más tisiial para estudios espectrales de proteínas y
polipéptidos. Los regiiladoras de Tris y acetatos, eii coiiceiitración moderada,
pueden ser utilizados a 1,2700 iiiii, pero más lejos en el iiltravioleta no hay u11
regulador adecuado para absorbaiicia baja. Sales de cloruro y perclorato
puedeii ser utilizadas hasta el limite espectral mas bajo de instrumentación para
maiiteiier la fiierza ióiiica deseada, pero la mayoría de las sales comunes,
iiicliiyeiido los cloruros, Iiidrósidos y fosfatos, deben de evitarse en el
ultravioleta lejano. Miiclios disolveiites orgánicos eii los cuales a lp i ias
proteiiias y polipéptidos soil solubles, coiiio In diinetil fonnainida y el dimetil
sulfósido, iio soil adecuados para estudios rotacionales a hc%0 run a menos
que las celdas utilizadas teiigaii itiia loiigitiid de trayectoria extremadamente
delgada. Hay iii i iiiiiriero de disolveiites de proteína de suficiente transpareiicia,
por ejemplo, el trifluoroetaiiol, Iiesafluoroisopropaiiol, triinetil fosfato y ácido
inetaiiosiilfóiiico. L a adicióii de ciialqiiier disolveiite orgánico, así coino
cualquier caiiibio de pH y teiiiperattira, piiedeii afectar l a conformación de la
proteína y debe ser utilizado con precaiicibii.
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L a sigiiieiite coiisideracióii cs 1;i coiiceiitracitii de la iiiiiestra. Para estudios
de proteiiias y polipéptidos eii tl i-aiigo espectral de 185-240 iiin, disoluciones
coiiceiitradas de 0.01-0 1?ó, coli DC iiicdido eii celdas de longitud de
trayectoria de O . 1-1 inm, iiswiliiieiite resulta en datos que inuestran un buen
coinproiiiiso entre una seiial suficiente y una adecuada iiiteiisidad luininosa.
Una absorbancia de 0.7 geiieraliiieiite es óptiiiia. Experiinentos cercanos al
ultravioleta (la240 nin) usiialiiieiite requieren mayores concentraciones y/o
celdas más largas. Puede ser iiecesario variar la concentración y/o longitud de
la trayectoria duraiite el esperiiiieiito de iiiaiiera que sea posible medir
exactamente cada una de las baiidas de DC y ORD de interés. En circunstancia
de uiia fuerza rotatoria baja ó iina baja iiiteiisidad de luz, o si hay sospecha de
agregacióii, es tina buena práctica toinar medidas a diferentes concentraciones
(ó longitudes de paso óptico), coiiio tina prueba para los aparatos.
Las disoluciones que se vaii a iiiedir deben de filtrarse ( filtros Millipore son
iitiles) o centrifiigarse para reinovei' el iiiaterial en siispeiisióii.
Las concentraciones de las iniiestras deben de conocerse con exactitud para
poder calcular elipticidades o i-otacioiies inolares o residuales. El peso medido
de la iniiestra no es suficieiite para detenniiiar la concentración, ya que la
iiiayoría de las proteínas y polipiptidoc retieiieii t in poco de agua aíiii después
del secado a vacío con iiioderadas teiiipti'atiii'as. Eiitoiices, la concentración de
la disolución iitilitada para DC debe ser aiializada ( después de la filtración).
Para inuclias proteiiias, valores de coeficientes de extinción para cadenas
laterales aromáticas son conocidos; eii estos casos, l a concentración puede
obteiierse por una siinple deteniiiiiacióii de densidad óptica. Para todas las
proteínas y polipéptidos, el aiidisis Nessler iiiicro-Kjeldalil para nitrógeno total
puede ser utilizado; de cualquier inaiiera para obtener la concentración en
r. teniiiiios de residuos peptidicos por litro, la coiiiposicióii de ainiiioácidos debe
ser coiiocida. Adicioiialiiieiite,eiis~~~os coloriiiiétiicos coino Biuret, Lortry o
niiiliidriiia piiedeii ser utilizados, pero para resiiltados exactos cada initodo
debe ser estandarizado coli la proteiiia que se va a inedir.
- . P - r-
.. iii) CELDAS.
Solo celdas circulares de ctiarzo fiiiidido deben ser utilizadas para DC.
Dichas celdas se eiiciieiitraii eii wia graii \ariedad de longitudes de adaptación
y adaptaciones especiales (coiiio por ejeiiiplo eiicliaqiietadas con agua) y deben
ser probadas para birrefriiigeiicia. Para longitudes de trayectoria de 1 inin o
menos, celdas de doble cuello soli recoineiidadas porque son relativamente
fáciles de llenar y liinpiar.
iv) MEDIDAS
La inayoria de los polariiiietros que hoy eii día se usan pueden ahora ser
ajustados para generar tina linea base plana (para iiii disolvente dado en una
celda dada). La necesidad de toiiiar blniicos de aire freciieiiteineiite, se aplica a
DC. Eii DC la sehal de las iiiedidas de la iiiiiestra debeii coincidir con la linea
base del disolvente en las regioiies espectrales doiido 110 hay absorción; si no es
asi, puede ser qiie la celda iio se eiictit'iitr? eii la posicióii correcta.
Algiiiios iiistruiiieiitos piiedeii ser equipados coli portaceldas de muestra
inodificados para pennitir l a inedicióii directa de DC por diferencia. Estos
métodos eiiviielveii coinpeiisacióii para los artefactos, pero pueden ser títiles
para el aiiálicis de peqiiehos caiiibios eii la coiifonnacióii de proteínas, coino
28
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F piiede ocurrir por l a tiiiióii de siistratos, iiiliibidc>res y coeiiziinas. La misma
infoniiacióii puede ser obteiiida iiidirectaiiieiite, por ejelnplo, por la resta de los
espectros liidepeiidieiiteiiieiite deteiiiiiiiados de eiiiiina e iiiliibidor del medido
por DC del complejo eiiziiria-iiiliibidor bajo las inisina condiciones.
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L La inayoria de los iiistriiiiieiitos tieiieii tennostáto para que las medidas se
piiedaii llevar a cabo a teiiiperatiii-a coiistaiite ( usualineiite cerca de los 25"). f-
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Temperaturas iiiiiestra entre los -30" a 100" piiedeii obtenerse por medio de un
tennostato de baiio circulaiite conectado a la celda para muestra enchaqueatada
o para portaceldas Iiuecos. El caleiitaiiiieiito y eiifriainieirto eléctricos también
puede ser utilizado. Es iiecesario iiioiiitorear la temperatura de la muestra
durante los esperiineiitos que iiivoliicreii caleiitainieiito y eiifnamiento.
v) CALCULOS
La gráfica que trace ciialqiieir espectro de DC contiene un ruido
sigiiificaiite, el cual iisalineiite se proiiiedia a "ojo". Si el espectro ha sido
registrado lo siificieiiteineiite leiito, esto no presenta problema.
Alteniativaineiite, si soli accesibles accesorios digitales la curva de DC (un
registro de uii solo espectro) piiede ser suavizada por computadora. Esta
técnica mejora l a presicióii de los datos reduciendo el niido. Adicioiialmente,
una Coinputadora .de Proiiiedios Traiisieiites (CAT) puede ser utilizada para
incrementar la resolucióii a travSs de registros repetitivos. Este método es
particulaniieiite Uti1 eii los casos eii los que la fiierza rotacional es pequeña,
coino por ejemplo, con L-triptofaiio.
Las Iíiieas base de niido proiiiedio (para la inisina celda, solvente y rango de
sensibilidad) debe eiitoiices ser restada del espectro de la muestra a cada
29
loiigitiid de oiida de iiiteris, y lii dilrreiicia eii la grafica iniiltiplicada por l a
seiisibilidad del iiistruiiiciito El resultado para DC, depeiidieiido del
instniinento, es observado ya sca t'ii grados de elipticidad e eii absorbaiicia
dicroica circiilar difereiicial, (AL,- Ai(), eii iiiiidades de absorbaiicia. Los
cálculos que s ipe i i coiivierteii estos datos en iiiedidas cuaiititativas de rotación
o DC.
vi) D I S P E R S I ~ N ÓPTICA ROTA TORM.
La actividad óptica geiieraliiieiite es repoitada eii ténniiios de rotación molar
(M) ( para sustancias de bajo peso inolecular coino los derivados de
ainiiioácidos) y de residiio de i'otacióii (in)(Macroinoléculas). Los residuos de
rotacióii daii iiiia iiidicaciori de la actividad óptica de tina unidad de péptido
cromóforo simple eii tina cadeiia de polipéptidos o proteínas. La rotación
específica a iiiia loiigitiid de onda tija, [u];., es Uti1 principalineiite coino criterio
de pureza, para coiiiparar con literatiira aiiterior y para el cálculo de puntos
Driide.
I . Rofncióti c.\pcc$7ca. L a actividad óptica es definida en ténniiios de la
rotacióii especifica.[u];.:
donde T = a l a teiiipterattii'a; h = loiigitiid de oiida; sobs= rotación observada en
gados;(disolucióii iiieiios el blaiico de solvente); 1 = recorrido óptico de la
c-
celda en decímetros; c = coiiceiitrncióii eii gaiiios por 100 ml. Para películas, c
= concentracióii en gramos/ tin'.
2 . Rotación Molar. Para sustancia de bajo peso molecular [MIA se define
como:
donde MW = niasa inolectilar del soluto.
3 . Rotación Residtiaf. Para la coinparación de rotaciones de proteínas,
oligopéptidos y polipéptidos, que difieren grandemente en pesos moleculares,
una unidad inás significativa, la inedia de rotación residual, es utilizada:
MR W 1 O0
[It,] =--[a],
donde hfRW = inasa residual inedio de la unidad repetitiva. Las unidades
fisicas para (in) (así como para (M) y estas cantidades reducidas al vacío) son
grado centímetro cuadrado por deciiiiol. La iiiiidad inolecular repetitiva para las
proteínas es el residuo de ainiiioácido, por lo que el masa del residuo es la
suma de los inasas atómicos eii la iiiiidad -[C(=O)-CHR-"1- La MRW de
polipéptidos siiitéticos y proteínas de coinposicióii conocida pueden ser
calculados. La MRW para un gran pipo de proteínas es aproximadamente
31
-...
115, y este valor p e d e ser utilizado para propósitos coinparativos cuaiido la
exacta composición de aiiiiiioacidos es desconocida.
Uiia eciiacióii coiiveiiieiite para el cálciio de [in], cuando la coiiceiitración
del residuo inolar, c' (moles de residuo péptico/litro), se conoce que es:
ah x IO
I x c ' [ni] =
donde los deinás síinbolos ya Iiaii sido definidos anteriormente.
4. Rotaciotics tiiolcircs retiiicitltrs y rcsirlirnles. El poder rotatorio óptico
depende del iiidice de refraccióii del iiiedio. Entonces, para comparar
rotaciones observadas eii iiiia variedad de disolveiites, las rotacioiies son
reducidas al valor que teiidriaii al vacío,por medio del factor de correccion de
Loreiitz, 3/(ii2 + 2), doiide ti es el íiidice refractivo del solvente a una longitud
de oiida R . Valores de ti y de 31(ii2 + 2) para inuclios solventes ha sido
tabulado, y métodos para iriedir 17 Iiaii sido dados. Por ejemplo, valores de
3/(ii2 + 2) para agua soli 0.77 a 250 11111, 0.76 a 220 iiin, y 0.74 a 195 iun. La
rotación residual inedia redticida, [iii'], a iiiia loiigitud de onda h incorpora la
corrección del iiidice refractivo de la sigiiieiite inaiiera:
Uiia espresióii siinilar puede ser escrita para [M'], la rotación inolar
reducida, por la sustitiicióii del iriasa iiiolecular, MW, para masa residual.
32
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5. Eciincioncs dc I h d e )I A tofii//.
El inétodo inás iiifonnativo para el aiiálisis de datos de ORD, en estudios
recientes, es presentar las gáficas de dispersión ([M'] ó [m'] contra A), y
obtener los paráinetros característicos (posicióiies y magnitudes) para los
efectos Cotton que resulteii de la absorción eii el ultravioleta de péptidos y
cadenas laterales. No obstante, antes de que los estudios de ORD en el
ultravioleta fueraii factibles, fiieroii muy utilizadas las ecuaciones de Drude y
especialineiite l a de Moffitt para el análisis de proteínas con ORD. La
aplicación de estas ecuacioiies al estudio de proteínas, y los métodos gráficos
utilizados para la reducción de datos (iiicluyeiido ejemplos de cálculos) han
sido extensamente discutidos. Los cálculos de Mofitt ocasionalineiite soii
utilizados. ,
Muy breveiiieiite, l a ecuación de Dnide, que describe al ORD en
regiones espectrales lejos de las bandas de absorción ópticamente activas, es:
donde k es coiistaiite, y i., la ioiigitiid de onda inedia de la traiisición
electrónica ópticamente actka.
La eciiacióii de.Moffitt, desarrollada para polipéptidos sintéticos, es:
donde no. bo y ;lo soii constantes. Ciiaiido2.0 es tomada coli un valor de 2 12 nin,
bo tiene un valor de -630 para polipéptidos con tina conformación totalmente
11- !~:ICI:I 1;i ~i.i.c.cl~;i u-liciic~,;dni >. t iwe iiii \Ax cit. ccro p x n cspiralcs al azar; en
este caso !I,, para iiiia protciiia piit'dr: ser utilizado coiiio iiiia iiiedida de su
coiiteiiido Iidicoidd, si es libre dc. ciialqiiier estructura beta.
b
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L-
vii) DíCROiSd\íO CIRCL'LA R
Los datos en DC soli rcpoitados ya sea coino [e], la molaridad o la
elipticidad residual, o coino (EL- E¡<), la inolaridad diferencial del coeficiente de
extinción del DC. Ambas inedidias son proporcionales: [ 8 ] = 3 3 0 0 ( ~ ~ - ~ ~ ) .
La fiierza rotacioiial, R k , de la cual tiiia banda de absorción ópticamente activa
es alriiiias <_ veces calculada, proporcionó qiie las bandas experimentales de DC
piiedeii ser resueltas. Un Resolvedor Ciiivo du Poiit 310 es titi1 para éste
propósito. No Iiay ningiiii inftodo de análisis feiioineiiológico de DC
coinparabla a las ecuacioiies de Driidz y Moffitt.
L.
r' I . lilipllci~iud h t0lOi~ o l~c.viti1tnl. [O] c. La elipticidad iiiolai. (para iiioiéciilas peqiieiias) o la elipticidad media
residtial (para proteiiias o polipiptidos) se define coino: P
L..
#.- donde A = loiigitiid de olida; Q , h , = elipticidad observada , en gados; MW=
masa itioleciilar; M R W = inaja residiial inedio ( ver ORD); c" = concentración
eii granos por inililitro: d = loiigitiid de ruta en ceiitíinetros. Si la concentración
L "
c-
..- r L
c
L
3 1
L..
P
&..
13
c-
P
L
c
r-
L.
L
doiide I = loiigitiid de i-iita e11 dcciiiieti'os; c' = coiiceiiti'acióii eii residuos
iiiolarcs/iiti.o. LX iiiiidadcs para [O I soil grad ciii' din01 - l .
2.- i~iIpiIcI~icid redircitlrr ///olor o / . C . Y ~ L / M ~ , [O7 El índice de refraccioii de
correccióii de Loreiitz ( ver ORD) iio sc aplica tisiialineiite a datos de DC. Siii
embargo, esta coixccióii ocxioiidiiieiite es útil para comparacioiies eii la
Iitera[iira:
3.- Coefiooi/c de er/iiiotju de /I( ' c l ! f iv~~cia/ mob. Eii algunos iiistnitneiitos
l a difereiicia eii absorbancia eiitrc la luz circdaiineiite polarizada taiito a la
izquierda coiiio a la derecha, (.A,- A!<) es iiieclida directaineiitc. Eii diclios
cacos, el coeficieiite de estiiicióii inolai' de diciüijiiio circular (taiiibiéii Ilainado
absorcióii inolar dicroica), E!.- E!< se obtiene de:
doiide d = loiigitiid de paso óptico e11 ceiitiiiietros; c'= coiiceiitracióii eii moles
de residuo por litro:( &[.-El< ) t h e iiiiidiides de litros por iiiol ceiitíinetro.
4.- l < ~ l ~ / < ~ l l ~ ; ? L'/¡//'C' d ! p / ; < : l L / d I' i;t. 5 ¡ 1 I L ~ ! ¡ h l ' I I / L . I ~ L ' t l ' ~ / ~ / l .
La proi>orcioii~lidad. [ O ] =~ 3-300 (::I.- ) !'a Iia sido dada. Otra relacióii Ut i l ,
para l a cciiiparnciiiii de datos ci.iiduj de DC, es: 0,,1,, = 23(AI, -A[(). Aiiiiqie, t i i i a
elipticidad Dbsci-vada. de 0.00 1 gi.ados coi-rtspoiide a tina absorbaiicia dicroicn
difereiicial observada de 3 X I O -' cii iiiiidndes de absorbaiicia.
5.- /.irer_n m m / o t i d . La fiicrza rotacioiial Rk de l a K-ésiiiia baiida de
absorcióii ópticaiiieiite activa SI: defiiie por iiiia iiitegal la cual se puede
eiicoiitrnr coil facilidad. Si la baiida de DC se eiictieiitra cerca de la fonna
Gaussiaiia, eiitoiiccs:
doiide h,,,:,, = loiigitiid de onda de l a k-ésiiiia trniisici.óii; [8,,, , ,]~=[8] a h,,,, ; A = la initad del grosor de l a baiidn.
Reluciories erilre D C y ORD.
DC y l a rotxióii óptica se ciiciiciitrnii relacioiiadas, por la k-ésiina traiisicióii
ópticaiiieiite a c t i u ( s f x t o Cottoii), poi. las relacioiies de Kroiiig-Kraiiiers. Por
inedio de estas ti'aiisfonnacioiies coli iiitegrales, iiiforinacióii coiiteiiida eii uii
espectro completo de ORD piicde ser deducida, eii priiicipio, de iiiia curva de
DC, y \.ice\,ersa. Pi-oyaiiias de coiiipiitadora se eiicueiitraii accesibles para
estos cálciilos. Varios iriitodos para iiiaiiipiilacióii de datos pueden ser
coiiiparados eii esttidios sobi-e el ácido"'-d- 1 O-cainforsulfóiiico. Las
traiisfoniiacioiies piiedeii sc'r iitilizadas para la biisqiieda de traiisiciones
3 6
c
L
r-
L_
ri
L
c
.... c
L.
c
L.
r.
-.
c.
L i 7
b.
,-I óptic:iiiieiite :.cti\.,x iiiáj :ill:i LIcl i-aigo UV q i i t se piiede obsewar. Uria
generalizacioii Uti1 para ciiciilos ciditritivos de i m inagiitud de baiida es, si
una baiida de DC es aprosiiii~id;,,iieiit~ de foniia Gatissiaiia:
....
r-
L"
r-
.... c
L.
...
.3 7
r-
L
L
Los iiiétodos aiiteriores p x n la estiiiiacióii de la estnictiira proteica
utilizaban dispersión óptica rotatoria debido a qiie los instrumentos para -el
estudio coil dicroisiiio circular eii el ultravioleta lejano no eraii accesibles. Las
primeras medidas de dicroisiiio circii!ar de polipéptidos fiieroii realizadas por
Holzwaitli qiiiéii exainiiib los efectos Cottoii asociados con transiciones
electrónicas del péptido e!i a-lielicoidales y eiirollainientos al azar de
polipéptidos sintéticos y eii iiiiogldiiia (la ciial es ainpliameiite helicoidal).
Para poliineros Iielicoidales le asigiiaroii iiiia baiida de DC negativa a 222 nm a
la n+n* traiisicióii ainida, y la baiida negativa 208 iiin y la banda positiva 190
im a la banda polarizada paralela y perpeiidiciilar, respectivaineiite, n+n* transicioiies ainida Tainbiéii Iiicieroii asigiacioiies tentativas de las bandas de
DC de eiirollainieiito al azar, y iiiostraroii (por inedio de la traiisfonnacióii de
Kroiiig-Krainers) que los espectro: de ORD Iielicoidales y de eiirollainieiito al
azar eraii coiisisteiites coii las bniidas de DC.
Después de. este notable adelanto, iiistriiiiieiitos de DC inejorados se
volvieron más accesibles, espectros de DC para poli-L-lisiiia forma p fueron
medidos, y se vokió factible iiiteiyretar datos de DC sobre proteíiias en
ténniiios de coiifoiiiiacióii de polipéptidos, coiiio fiie Iieclio previaiiieiite para
ORD. DC es aliora esteiisaiiiciite utilizado para el estudio de la coiiformacióii
3s
r-
L
P..
-. P
i
P
- r-
L
C.
i
dr poiipcp:id:x J potciiiiis CI! s&i!l.ic,iciii, El Jicioisiiio circtilar tieiie i i i ia vciitaja
sobre I ; I ORD, que coiisijic cii qiic liii? iiiciios !raslape eiitre traiisicioiies
ópticaiiieiitc acti\..aj, y geiiaxiinciitc tiiio pticdc sepnrnr traiisicioiies debido a la
coluiniin veitebral polipeptidia de otros crciiiióforos
El espectro ilc LIC para tres coiifonnacioiies de referencia de l a poli-L-lisiiia
( a-lielice, foniia p y eiiro1l:iinieiito al .?zar) se iiiiiestra eii la figura I ~1
1 I'.
!
~
I- 1 ':, ~ '\ / I
Le - , XI
L ,-,
F i g I r a I
Espcctro dc Dicrosiiiio circular de I;) poli-L-1isiii;i cii 1;i coiiiorri1:icioiics a-liclicoidal a l 100%(cuna I) . p (ciin'a 2) ! ;II w x (ciin;i 3).
(Cabe Iincer notar que la sstriictiirn 13 exhibe solo iiiia baiida de DC iiegativa eii
l a regióii de los 270 iiiii).
Greenfield y. Fasinaii'.''iitiliznroii estas ctiwas para la poli-L-lisiiia para
calcular espectros de DC esperados para varias mezclas de las tres
coiifonnaciories ftiiidaineiitales. Utilizaroii estas ciirvas de DC calculadas para
coiiiparar coil espectros de DC espsriineiitnles para varias proteínas de
coiifonnacióii coiiocida ( a pnitir d~ ejtidios de rayos X). Los resultados de
este aiiiílisis, basados eii datos de 20s a 250 iiin se iniiestraii eii la figura 1
Grwi!f¡cld y Fasii iaii cixoiiti-miii, escciicialiiicnte, ciiaiido uiia protciria está
altaiiieiite oi.,dcii;!da ya sea qiic prcdoiiiiiie u-liélice o esti-uctiira 0, los
resultados ciicticiitraii iiiáj o iiiciiüj a tiii 5% de los datos obtenidos por
iayos X. :\tiiiqtie las estiinacioiies obtenidas para iiiioglobiiia, lisoziina, y Riiasa
sen bastniitc bueiias. Ciiaiido l as proteíiias estudiadas careciaii de gran caiitidad
de regiilnridad, las desviacioiies x a i i iiiuclio iiiayores.
la estructura
Eii este caso la cabida de
estiinada a la coiifonriacibii actual obtenida 110 fiié buena; de cualquier manera
estos resultados si dieroii uiia idea aprosiiiiada de la estructura secundaria de
las proteíiias.
Las difereiicias eiiti'e In> ~ i i i ~ a s Jc DC para proteínas calctiladas y
experimentales piiedeii ser nti ibiiídas cii g a i i p i t e a la naturaleza imperfecta
de los polipéptidos siiitéticos coi110 estiiitiai-es de DC para confonnacioiies
protiicas en cadciia. Piiede iiieiicioiinrse aquí que (1 ) los paráitietros de la
banda de DC pai-a a, p, y eiirollaiiiieiitos de polipéptidos al azar varíaii con las
cadena lateral y el disolveiite (figuras 3,3 y 5), (2) ciirvas de
Figim .: Diiroisnio Ciriiil:ir dc I:) :~-l idi ic cii \x ios pulipcptidos: ;\¿ido poli-L-giuiiniico cn H20 pH 4.4.
- Poli-L-lisiiin C I I H1O pH I 1 . 0 - Poli-[S ' -(l-l i I i l Io~i~tII)-L-~li i i ; i i i i I i~:i] cii nicI:iiioi ::igti:: .X:2. -Poli-L-
al;iiiiii:i ai trilliioiocuiiol k i d 0 irifliioro;icL;ii¿o. 9X 5 : 1.5 .
,,.*, .l""l
Fig1ir;i 4 Figura 5
Figurii : Disroisnio Circiilx dc 1;i foriii:i li dc viirios polipipiidos: -Poli-L-lisiiiii en ngun pH 11.0. Poli-L-
scriix en ngii:i.- Poli-S-c~irl>o\iriiciil-L-Cisiciiia en agua pH 4.3.
Figura : Dicroisnio circuliir dcl ciiro11;iiiiiciiio ;iI ii/.:ir dc 1 iirios poiip6ptidos:- &ido poli-L-glui;iiiiico en
tigun pH 7.5 -Poli-L-lisiiia CII iiguii lit1 F 7 . - Poli- [N ' - (?-liidrosiciil)-L-gluiriniinii] en iiguii.
DC de proteíiias iio ordeiiadas solo soportaii iiiia relacióii cualitativa para
aqiiellas de poli-L-Lisiiia coli eiirollainieiito al azar y del acido poli-L-
glutáinico, (3) otras coiifoi-iiiiicioiies regiilares (cómo la liéli~e-3~o) y
segneiitos muy peqiietios o distorcioiiados de las tres fonnas estandar siii duda
coritribiiyeii al DC de proteíiias eii itiia inaiiera diferente, y (4) gnipos
croinóforos, aroiiiáticos, disiilftiro de cistiiia y g-iipos prosteticos ópticamente
activos bien piiedeii iiifliieiiciar el espectro de DC de la proteína eii el
ultrvioleta lejano (350-1 90 iiin).
Varios pzpcles recieiites represeiitaii \,ariacioiies y refiiiainieiitos de los
inetodoc de aiiálisis coli DC preseiitados aiiterioiiiieiite. Straiis et.al"'rcalizaroii
cálculos siinilares del porceiitaje de foniias u, y al azar para varias proteiiias,
iitilizaiido polipeptidos variados ( iio solo la poli-L-lisiiia) coino estaiidares ( o
patroiiesj, y peniiitieiido a los paráiiietros de la baiida de DC variar para los
cálciilos. hlyer'"iitilizó plintos isodicróicos a 198, 204, y 208 iiin para la poli-
L-lisiiia eii su variadas coiiforitiiicioiies para el aiiáiisis del espectro de DC de
inioglobiiia, licoziiiia, Riiasa, y citocroiiio c. Roseiikraiiz y Sclioltaii("titilizaroii
poii-t.-bci-iiia eii ililiis c ~ i i ~ ~ i . l ~ i . ~ i c i ~ ) i i ' ~ s (!e s i l coiii;) su refcreiicia para la foiiiia
iio oi~derixki 1, c;iIciilatoii c i i n x de DC i)ni.a iiiioslobiiia, lisoziiiia, y Riiasa.
Logrriroii qtic eiic:i.jnra iiic-iot ii los kitos espeiiiiiwtales a h = 195$.2OS iim;
pero uii pcix eiiciijc ti b 2 O Y qiit :I que lograroii Greeiifield y Fasinaii.
Saseii:i y \~'etlaiifcr.'''e\.iirii.oii probleinas iiiliereiites eii estáiidares de
polipéptidos; ellos iitilizaroii prutciiias iiativas de coiiformacióii coiiocida para
obteiier ctiiyas de DC de tet'crciicin para coiiforiiiacioiies u, y no ordenadas.
Estos espectros estaiidar, obteiiiiios de datos cristalográficos y de DC pira
mioglobiiia, Riiasa, y lisoziiix [>, coiisider~ibleineiite diferentes de aquellos para
la poli-L-lisiiia (fig. 2) espccinliiieiitc i i i la foiiiia al azar] que después fiieron
utilizados para el cóiiipiito de ciitws de DC para otras proteíiias. Saxeiia and
Wetlaiifer'"obtiivieroii tiii iiiiiy biieii aciicrdo ( inejor que el obtenido por
Greeiifield y Fasiiiaii""pnta carbosipeptidasa, pero fué regular para la a-
quiinotripsiiia. Cada proteiiia probableineiite coiitieiie regiones de estructura
úiiica que no piiedeii ser aiializadas por cualqiiier juego de curvas de refereiicia
para u, p y coiifonnacióii a l azar; además, coiitribucioiies para el DC de
cadenas laterales croiiióforns soli difereiites para cada proteíiia.
Siii eiiibnrgo, este tipo de iiiterptrtacióii de DC basada eii datos de
proteíiias, es iiii paso eii In ditwcióii corttctn. Clieii y Yaiigliicieroii uso de
proteíiias deteniiiiiadns cristalo=i-riticaiiieiite para obtener los"o' paráinetros bo,
[ni]232 y para las foiiiin u-hélice y eiirollainieiito al azar.
Crítica del ; ini lkis : Coluii i i i~i I cr~cI)i~;il tlcl i)olip6ptido.
Polipéptidos siiititicos de cadciia larga soil iiiia eieccióii iinpeifecta coiiio
inodelos para deteiiiiiiiar la esti-tictiira proteica coli DC y ORD. Parainetros de
referencia coiifoiiiiacioiial prii.a fwixis u.. y al azar variaii coli el polipfptido,
y tiria variedad de posibles eo;ti-iictiiras proteicas soil escliiidas eii estos
políiiieros siiiiples. El uso de pulip'ptidos sintéticos coiiio refereiicias para la
coliiiniia proteica, y los efectos di. la loiigitiid de la cadeiia y de la agegacióii
seráii disciitidos.
a- Hélice
Acido poli-L-glutáiiiico de cadeiia larga y poli-L-lisiiia alcaliiia Iiaii sido
utilizados desde lince tieiiipo coiiio inodelos caiioiiicos para la a-lielice en
proteíiias. Aiiiiqiie el espectro qtiiróptico es ciialitativaineiite siinilar para
polipéptidos coi l difereiites cadc.ii;is I;iteralts eii solveiites variados (DC), los
valores iiiixiiiios variaii coiisid~.i~nblciiieiit~. Por ejeiiiplo, los datos de DC para
a-liélice del ácido poli-L-gliitáiiiico, poIi-L-lisiiia, poli-[N'-(2-liidrosietil)-L-
glutainiiia], poli-L- alaiiiiia: ~oIi-.I-itietiI-L-SIiitaii~nto, pli-L-inetioiiii-ra y poli-L-
Iioinoseriiia (eii varios disol\,eiites) estáii lejos de coiiicidir. Este cainbio eii los
paráirietros de la a-liélice iio se deb t tiiiicaiiieiite a los efectos del solveiite.
Cálciilos Iiaii predicho qiie efectos de cadenas laterales iio aroiiiáticas
44
.
. . coiitribiiii-iiii a 1;i f i i i i z n rot:itoi.ia di' 1)aiiil:is prptidicas u-lielicoii!:ilcs, dcbido a
scaiiibios eii la gi'oiiietria de coluiiiiiii i'itebi-al Iielicoidal. Este caiiibio eii la
fuerza rotatorin l i a sido i i iostrxio i ' ~ I ~ i ' ~ i i i i ~ i i t n 1 i i i ~ ~ i i t e coa copoliiiieros de L-
Ieticiiia )' L-lisiiia eii disoi:icióii acuosa, p i - a lo cual [ O ! ~ O S = -34 O00 permaiiece
coiistaiite, pero varia ccii el coiiteiiido de leiicina. Adeinas, el espectro
de DC de la u-lidice coiistrtiida de datos sobre proteínas difiere de aquellos
basados cii polipéptidos siiittticos. Se coiioce que la agegacióii cambia el
ORD de! rícido poli-L-glutáinico Iielicoidal, y se debe de teiier cuidado para
evitar sitiiacióiies parecidas eii protciiias.
Otra caiisn por la qiie los polipeptidos de cadeiia larga piiedeii no ser tin
biieii inodelo es debido a la loiigitiid de la cadeiia. Segineiitos de la a-liélice eii
proteiiias soil coi-tos, variaiido desde 3 hasta 20 uiiidadec peptídicas. Datos de
ORD iiiuestraii qiie los valores de [iii']233 para oligo-L-lisiiias, iiicluso a ii=22,
110 se aprosiina al de la la pol-L-lisiiia debido a la fonnacióii iiicompleta de la
Iiélice. Niiigúii inodelo helicoidal para cadeiias peptídicas cortas es accesible.
Cálciilos teóricos iiidicaii qiie la fuerza rotatoria de la traiisicióii I7 +íI* de la
u-li2lice eii las baiidas di: DC de 705 a 191 iiin debiera ser eii graii parte
dcpeiidieiite sobre !a loiigitiid de la cadeiia, pero varía eii predicciones respecto
a ia t r m c i o i i 11 - n*. ( baiiii;i DC 222 iii11).
Fo i-In as-p
Poli-L-lisiiia a pH elevado, di.sptit5s de caleiitainieiito y reenfriainieiito, es
s wieraliiieiite iitilizado coino tiiia rcfereiicia para la fonna p. Siii embargo, se
Iia iiiostrado qiie l a foiina 0 de la poli-L-lisiiia producida a uii pH iieutro coil
iloiicciI-.;.iiiI:iti> LIC. judiü (SUS! pi'cjL:iitii ii;i cspcctro de DC ligei-ainciite
difci-ciitc qiie ac)iicllos eiicwiti-dos C I I cl ag:in j<>1;1 a p H 1 I . La inagiiitiid de la
baiida de elipticidad de DC a I I Y iwi para esta timiia p tieiie solo l a initad de la
inagiiitiid de la !orina p prodiicid:i iil caleiitx poli-L-lisiiia en agua a pH 1 I ,
coiiio fui eiicoiiirxio por To\viiciid et.al. ""y por Sarkar y Doty.'") Li y
SIiector""estnblecier-oii qiic l;i fi-poli-L-lisiiia eii agua soia piizde fonnar una
hoja plegada iiifiiiita iiiteriiiolcciiI;ir y piiede no ser un buzii inodelo para las
secciones cortas de la estriictiii'a eiicoiitrada en proteínas. Ademas,
depeiidieiido de l a coiicciitracióii y la loiigittid de l a cadeiia, la poli-L-lisina es
capaz de foriiiai. hojas pleated p iiitra o iiitennoieculares ( o, en alginos casos
inezclas).
Difereiites ácidos poli-u-aiiiiiio cii la foriiia p intiectraii diferentes espectros
de DC depeiidieiido de la cadeiia lateral y el disolvente.
Otra dificiiltad es qiie hay tres tipos posibles de estiiicttira p en polipéptidos,
hojas iiiiidris a Iiidrogeiio iiitraiiioleciilaiec paralelas y aiitiparalelas, y
estriictiirn p criizada iiitraiiiolcctilar aiitiparalela. Ha sido iinposible asignar
espec tm de DC ii ORD iiieciiii\.ocriiiniileti;e a alguna de estas fonnas ti otra;
este probleinn lia sido discutido espc;.iiiieiitaliiieiite y teóricaineiite. Una
escepcióii es In ~~oli-[L.-nl~i-I.-~iii-(OEt)-FI,\.]. la cual parecc estar en tina
coiifoiinacióii criizada y coiitieiir: propiedades ópticas de la fonna I-p, caiciiló tina dcpeiidciicia de loiigitud de cadeiia teóricaineiite UIiV' I3 1
estreinadaiiieiite larga pai-a la traiisicioii i i - í l * eii hojas p plegadas
aiitiparalclas. qiie las oli-o-isoleiiciiias, ii= 7 y 8, eii solventes orgánicos
teiiíaii espectros de DC siiiiilnr 3 nqiiellos de polipéptidos p de cadena larga.
11.1 I
.. C”
._.. En rol la n i it ri to ;i I ;iza r.
c
L
c
L
r-
L
r L
c.
c
....
?-
L
El liso de polipeptidos sintéticos, tisiia!ineiite poli-L-lisiiia*HCI
coinpletaiiieiite cargada, poli-L-gliitciiiiato de sodio, coni0 modelos para
segmentos 113 ordciiados di: protziiins (las cuales tienen estructuras asiinétricas
bien defiiiidas nias no regiilariiiciite repetitivas) se encuentra abierto a la crítica.
Primero, el uso de tales polielectrolitos Iia sido cuestionado por Krintm
et,aI,(”’, cliiieii estableció (pie eii agua y a bajas concentraciones de sal el poli-
L-gliitaiiiato de sodio cargado foi-iiia t i n a estriictiira helicoidal extendida debida
a repiilsión de cargas (tal estriictiirri existe en el estado sólido). Debido a esto,
se Iia siigerido.que los polipéptidos (poli-L-gliitainato de sodio, poli-L-prolina o
poli-L-seriiia) en disoluciones salinas iniiy concentradas pueden ser mejores
estindares para cadenas proteicas no ordenadas. Sin embargo, esta sugestión es
disputada por Fasiiiaii et.al.“”’ qiiieiies citaron trabajos mostrando que en altas
concentraciones es posible qiie se colapse PGA en tina estnictiira coinpacta que
no piiede ser detenniiiada como uti eiirollainieiito estadístico verdadero.
Adzinás, se encontró qiie l a sa l piiede iiiteractiiar con los grupos carbonilo del
péptido y a consecuencia piiede caiiibiar los nioineiitos de transición. Hay
evidencia en contra de cualquier foiiiin helicoidal extendida para poli-L-lisina
protoiiada a bajas concentracioiies de sal. Las C L I I V ~ S de DC de eiirollamiento al
azar para poli-[N5-(2-liidi-or~ztil)-L-~Iiitciiiiiiia] no cargada en agia y para
varios ácidos poliainiiio no ioiiizados eii m i o s solventes son cualitativamente
siinilares a aquellas de polipéptidos cargados con una baja fuerza iónica; todas
exhiben bandas negativas de DC a I98 iini y bandas positivas a 218 nm
aFrosiiii3daiiieiitc, i i i i i i q w Ix i i i ay ! tdcs de baiidri son mayores para los
polielectrolitos.Cabe ineiicioiiai- qtie el icido stilfúrico fuerte (algunas veces
utilizado para producir foi.iiias de eiirollaiiiieiito al azar) puede protonar la
columna dcl péptido. El origeii dz la peqiieiia banda de DC a 338 nm es
incierto, y la asigiacióii de oti 'x bandas Iia sido discutido en teoría.
Una segiiiida crítica de la utilización de polipéptidos sintéticos como
eiirollamieiitos al azar modelo es de que stis patrones de DC en solución son
bastante diferentes de aquellos de proteínas destnaturalizadas
(presuinibleriieiite 110 ordenadas). Estas proteínas, desnaturalizadas por diversos
métodos, pticdcii
coiifonnacionales;
negativo a 220
aproxiinadameii te.
aiiii tener cadenas polipeptídicas sujetas a problemas
esliibeii espectros de DC caracterizados por un hombro
m i aproxiiiiadaineiite y una banda negativa a 200 nm Este tipo de ctiiva de DC también se muestra por películas
de polipéptidos sintéticos no ordenados en la cual las cadenas peptídicas son
presuinibleineiite restringidas aiiiique no tienen una asimetría repetitiva definida
y rebTilar. Sin eiiibargo, los polipéptidos sintéticos como una solución pueden
ser seriamente cuestionados coiiio tin iiiodelo adecuado para proteínas no
ordenadas.
Otras confortnaciones (le la columna.
La aplicabilidad de los polipéptidos de cadena larga como inodelos para
segmentos de a-liélices, hojas y eiirollainieiito a l azar en proteínas es aun
más notorio si estos segmentos estaii distorcioiiados o son inuy cortos. Además,
estnicturas de la coliiiniia qiie no sean a, p y no ordenadas se sabe que ocurren
eii protciiias y cada L i i i ; i di. c.;t;is c s m x t i i r x piiedr: coii!rilxiir sus propiedades
qiiiriipticas particiiliii'es a los il;it«s de DC. Por ejeiiiplo, cálciilos iiidicaii qiie l a
fiieza rotatoria d:: la lidice-.? ;,, eiisoiitrada eii proteínas, difiere de aqiiclla de la
a-hélice y iiiiiestra sii propia dcpc'iidsiicia dc loiigitiid de cadena.
La sitiiacióii piiede ociii-iir ciiaiido iiiia estriictiira arbitraria de la columna
piiede iiiiitar el DC de tina de las coiiforiiiacioiies de refereiicia (a, p y al azar)
los ciial interfiere seriaineiite.coii la iiiterpretacióii de los datos de DC. Un bueii
ejeinplo de esto es l a graiiiicidiiia S. Esta iiioléciila tieiie I O ainiiioácidos
acoinodados eii tina estriictiii'a tipo p cruzada. Los patroiies de DC obteiiidos
sori de algiiiia foniia siiiiilares a aqiiellos de tina a-hélice. Por lo tanto, la
siiriilaridad del espectro de la graiiiicidiiia al de u-hélice es solo superficial.
L a variedad de espectros de DC obteiiidos para otros compuestos modelo
pequeños coiiteiiieiido iiiio, dos y seis griipos aiiiida ilustra la gran variabilidad
en las propiedades rotatorias qiie se piiedeii concebir para residiios peptídicos
eii coiifoiinacioiies regiilares. Adeinis, existe evidencia qiie algiiios
polipéptidos piiedzii caiiibiar sil coiifoi'iiiacióii debido a agregación coil otros
polipéptidos; este Iiallazgo piiede ser relevaiite para proteínas bajo coiidiciones
de ag-egacioii ya sen iiiter o iiitraiiioleciilai-.
Dispersión (le la'luz
Un factor f inal qiie piiede distorsioiiar los espectros de DC de proteínas es
la dispcrsióii de la liiz. Recieiiteiiieiite se liaii llevado a cabo estiidios qiie
. ".
iiiiicstrai q~ i c Ins b~iiidiis roiacioiiiilcs 1)ucticii SLI. caiiibiadas a rojo y rcdiicidus
eii iiiriyiiiiid p x a siispciisioiics tiirbiiii(por c,jciiiplo, para prot2iiias en
preparacioiies de iiieiiibiaiia). L'ri!. 1, . I i fiieroii los priiiieros eii i i iteiitar
correlacioiiar Ins distoi-cioiics coiiocIdiis eii h i i d a s de DC de a-lidice de
proteiiias de iiiciiibi-aiia coi1 cilciiloj ( I C dispei-sióii diferencial de la Iiiz
esperados y iiii aplniimieiito dc 1:i LibsorciCiii cii sisteiiias con paiticiilas. Dichos
cálculos desde eiitoiiccs liaii sidci refiiiados. Datos de DC Iiaii sido obteiiidos
para siispeiisioiies y peliciilas dispersaiites de aeidos poliainiiio y para
preparacioiies de iiieiiibraiia. La c«iicliisii,ii teiitativa ( b,asada eii ~ a i i parte en
estudios sobre iiiciiibraiias de c i l i i l i i j rojas de la saiige fragneiitadas y no
dispersas y para siispeiisioiies dispersaiites de proteiiias Iielicoidales) es qiie los
efectos por distorcióii por priiticiilns ( piiiicipalineiite aplaiiainieiito de la
absorcióii) y iio coiifoiiiiacioiics cspeciales de proteiiias son las responsables
del espectro de DC característico de iiimbraiias, Debido a esta distorción hay
una coosiderable aiiibigüedid eii la iiiterpretacióii de espectros de DC de
sisteiiias coil paiticulas: pcliciiliis de poli-L-alaiiiiia conocidas coino a-
Iielicoidales a paitir de espectroscopia IR: iniiestraii im espectro de DC tipo j3
ciiaiido la dispersióii se pi'eseiita, 5. el aiiálisis iiiiiestra qiie las proteiiias de la
iiieiiibcma del M!.coplasiiia soil eii graii paiíe de coiifoniiacióii p, aiiiique su
ci i rw ds DC aparece siiiiilar a nqiiclla de tina a-liilice coil distorción por
dispersióii. Por lo. taiito, se deb t teiier iiiiiclio ciiidado eii la iiitrepretacióii de
espectros de DC de sisteiiins tiii.bios, y iiiitodos fisicos iiidepeiidieiites de
deteiiniiiacióii de coiifoiiiincióii debeii de ser iitilizados cuaiido sea posible.
Recieiiteineiite i i i ia celda I i a sido creada, la ciial puede corregir artefactos de
dicpei-sióii y se iiiiiestra proiiieiedoi-a.
( 1 -
Comcnta rios gcricrales
Dos tipos de crornofor'os qiic . iio fon:iaii paite L .i coliiinna, resiL-os de
airiiiioicidos aroiiiáticos y gi-tipos disiilfiiro, piiedeii causar coinplicaciones en
l a iiiterpretacióii de datos de DC. E¡ espectro de absorción de los aromáticos *
(feiiilalaiiiiia, tirosiiia y triptotaiioj y la cistiiia iiicliiyeii baiidas eii la región del
ultraviolela csrcaiio(3.30-300iiiii). Adziiiris, estos ainiiioácidos y la Iiistidiiia
tieiien baiiilas de alwrcióii eii 185-740 iiin eii la región peptidica. Cualqiiiera
de estas bandas piiede ser' ópticaiiieiite activa en iiiia proteiiia, especialineiite si
la cadeiia lateral se iiiaiitieiiz a i iiii aiiibieiite asiiiiitrico. Los efectos Cotton en
el iiltravioleta cercaiio, ciiaiido se asigiaii apr'opiadaineiite a cadenas laterales
específicas, puede ser de iitilidnd eii la deteiiiiinación de las iiiteracciones
coiifoiiiiacioiiales eii las proteiiias, por ejeiiiplo, la estnicttira terciaria de sitios
activos, Por otro lado. las lxiiidns de DC de cadeiias laterales de loiigitiides de
oiida inás bii.jas piiedeii iiiteIl>r¡r c a i la estiinacióii dc las estructiira secundaria
del aiirilisis del efecto Cottoii del pL;ptido. Estiidios de l a absorcióii y de las
propiedades qiiirópticas de coinpiiestos iiiodelo(derivados de ainiiioácidos y
polipéptidos) y de proteíiias Iiaii mostrado qiie en el rango del UV cercano
auiique Ins loiigitiidec de oiida de los t f íc toj Cottoii debidos a tiiia cadeiia
lateral croitiófora dada soil rzlatkaiiieiite constantes, la ainplitiid y hasta el
signo de estas baiidas pwdz variar con l a coiiiposicióii y geoinetría de la
inoliciila. Eii la regióii del UV iejaiio (i.440 i m ) la iiiteracción eiitre la cadeiia
lateral 1, los croiiióforos del piptido piiedeii catisar qiie la posición de las
bandas de DC y ORD seaii uriab1c.s . El pr-opcísito de esta sección es el de
restiiriir los niétodos eii los que se utilizaii los efectos Cotton de las cadenas
laterales para gaiiar iiifoiiiiricióii estructural, as¡ coino mostrar los peligos
idiereiites en tratar de iiitei-pretar los espectros de DC y ORD conteniendo
bandas qiie se traclapeii de piptidos J' cadeiix laterales.
Goodnian zt.al.!i8'esci.ibiei.oii dos artículos itiuy útiles sobre los efectos
Cotton aroiiiáticos eii proteiiias (y coiiipitestos iiiodelo) y en ácidos poliamino,
los cuales cubreii la literatiira iiiiportaiites hasta el año de 1968. El análisis ae
las bandas de DC de aroiiiáticos eii el ultravioleta cercano en proteínas (y
modelos), iisualineiite a 77' doiide estructuras finas caractensticas se vuelven
aparentes. Otro método freciieiiteineiite utilizado para la clasificación de
bandas de cadenas laterales es el caiiibio-rojo debido a la ioiiización (a pH alto)
de la absorción de tirosiiia y los efcctos Cottoii .
Muchos estudios se liaii ocupado con los ácidos aromáticos poli-a-amino
como modelos para estos croiiióforos atrapados eii orientaciones fijas como las
que ptiedeii existir en proteíiias. Dos probleirias son coiniines en estos estudios:
traslape de baiidas peptídicas y aroiiiiticac, y baja soltibilidad de los
polipéptidoc eii agua. Para superar el segiiiido problema, se ha hecho uso
esteiisivo de solveiites no-acuosos, y de copoliirieros (al azar o en bloque) con
residuos solubles en agua y cndeiias laterales iiiodificadas.
La actividad óptica de los residtios de cistiiia ha sido discutida por
Bzycliok." Ejeiiipios de proteiiias que iiiiiestraii bandas de DC en el
ultravioleta cercano a 250-2YOiiiii, atribuidas a los puentes S-S son insulina,
riboiiiicleasa y la~s iieiirofisiiias.
9 ) .
Eii ::iiiei:ii. la piwriiciii de residuos xoiiiiticos puede resultar eii [ilia
estiinacióii iniiy baja eii <I criiiteiiido de u-lidiccs (o foiina p) eii uiia proteíiia.
Est3 coiicliisióii sc basa eii iiiiiclios cstiidios eii el iiltravioleta lejano de DC
para aroiiiaticos siiiteticos c»iiteiiieiido polipéptidos en conformaciones
ordciiadas. (Poco se piicdc pi-ecfccir de derkados de ainiiioácidos aroináticos
iriás peqie~ios coli respecto a la scnnl y iii<igiiitud de los efectos Cotton en
proteínas). Efectos Cottoii positi\,os dt: cadeiias laterales caiicelaii parcialmente
(o cornpletaiiieiite) los efectos Cottoii peptídicos negativos eii el rango 'de
h=200-240 iiiii para poliineros y copoliineros de L-fenilalaiiiiia, L-tirosina , L-
triptofaiio y L-liistidiiia. Esto puede ser verdad bajo ciertas condiciones de una
variedad de solveiitcs,, iiicliiyciido iiiiiclios Joiide los primeros tres polimeros se
pensó que eraii u-lielicoidoles y doiide la poli-L-liistidiiia puede ser estructura
u ó p. Eiitoiices, el traslape de baiidas de DC aromáticas y peptídicas puede
llevar a debilitar apareiiteiiieiite valores iiegativos de elipticidad para la longitud
de onda de la regióii de los péptidos eii proteíiias estnicturadas, y resultar en
una siibestiiiiacióii de la caiitidad de estructura secuiidaria actualmente
preseiite. Por ejeiiiplo, uii estiidio sobre la poli-L-tirosiiia hace iiotar que en
casos iio fa\,orables tiiia cadciia lateral de la tirosiiia puede coinpeiisar la
coiitribucióii de tii ia iiiiióii pcptidica eii tina coiifoi-iiiricióii a-lielicoidal o /3. Uii
caso sobresalieiite de baiidas at-oiiiáticas eii el UV-lejano en proteíiias es aquel
de l a A\,idiiia, ct i~:o espectro de DC coiitieiie iiiia bmda positiva de triptofano
a 32s iii l i .
Existe poca iiifoi-inacióii respecto a los croinóforos disulfiiro asimétricos ai
DC de proteiiias o polipeptidos eii la regióii de loiigitud de onda por debajo de
los 240 i i i i i . Siii eiiibai-go, la preseiicia de bandas de DC por debajo de los 240
53
L- .
c
P
L
F
L
c
--
iiiii para la cistiii;i eii SI (cii iiiulls !. cii d i m ~ de KBr), y la esisteiicia de tina
banda de DC positiva a 230 iiiii, para grainicidiiia S, atribuida (por lo menos
parcialiiieiite) a una traiisicióii S-S puede seivir coino iiotas de precuación.
Algunos otros aiiiiiioácidos (cisteíiia, iiietioiiiiia , aspargina, ácido glutámico y
aspartic0 y ainidas) tainbiéii absorbeii luz en la reb"n de los 185-730 nin,
aiiiiqiie no tieiieii la inásiiiia absorcióii eii esta regióii. Su contribución a las
propiedades rotatorias de las proteiiias 110 Iia sido estudiada extensivamente,
pero no se espera que sea larga.
Derivados de miinoficidos y acido poli-L-amino
(I) Fenilaicrnina. Feiiilalaiiiiia puede ser tomada como el cromóforo aromático
típico, atiiique de alguna inanera iiieiios estudios se Iiaii practicado con ella que
con tirosiiia y triprofaiio. Todos los estudios aromáticos tienen en común los
probleinas de l a eleccióii de los coiiipiiestos inodelo y la resolución de las
bandas aroináticas rotatorias de baiidas peptidicas; las inisitias revisiones
piiedcii ser coiisiiltadas prirn todos los coinpiiestos aroinaticos residuales. El
espectro de absorcióii en el iiltrabioleta de feiiilalaiiiiia es el característico de un
aiiillo de beiiceiio inoiio sustituido. La baiida débil, con estructura vibracional
fina, en la regióii de los 260 iiiii da origeii a varios efectos Cotton débiles, no
todas las traiisicioiies soil ópticaineiite activas eii cualquier compuesto dado.
Adeinás, esisteii baiidas de absorcióii electróiiica fiiertes y ópticaineiite activas
inás allá eii el UV.
i?") Coiw 1ii jeii:ildo per I l o i o i \ i t L et. al. I:i estnictiira \ibracionnl fina de
DC varia iaii el coiiipiiestc: c'ii 1;i L-teiiilalaiiiiia por si sola , sólo soli dicroicas
las bandas proiiiiiieiites de absorcióii a 264 y 25s iiiii. (dando Iiigar a efectos
Cotton positivos), pero, por otra parte, en la m i d a y en proteiiias solo las
bandas de dt:bil absorción del croinóforo feiiilalaiiiiia a 268 y 262 nin son
opticaineiite actiws. La resolticitxi de las bandas de DC en el UV-cercano
piiedeii iiicreirieiitxse trabajaiido a 77'; se piiede hacer una asignación de
bandas iitil en l a caracterizacioi: de feiiilalaiiiiia en proteinas puede. Los
solventes orgiiiicos piiedeii afectar eiioniieiiieiite el espectro coinpleto de DC
de l a N-acetil-L-feiiilalaiiiiia aiiiida (así coino las de otros aromáticos).
Estudios sobre el croinóforo feiiilalaiiiiia en polipéptidos son coinplicados
por l a iiisoliibilidad de l a poli-L-feiiilalaiiiiia en agiia (necesitando el uso de
copoliiiieros o de disolventes org;íiiicos) y por el traslape de las bandas de la
cadena lateral y del péptido (esto Iiacieiido l a detenniiiacióii coiifonnacional
muy dificil).
Estudios de DC de políineros iiiostraroii dicroisino positivo ó débilmente
negativo en la región peptidica y se siigirió qiie una estniciira ordenada
(posibleiiieiite a-helicoidal) se foriiia bajo ciertas condiciones del disolvente.
üny'"'eiicoiitró que ia poIi-L-f;.iiii;iIaiiiiia foiina tal estrtictiira en 999ó
diclortiro de etileiio inás l",O de icido trifluoroacético (TFA). El DC forma
bandas finamente estnicti-tiadas de - I O0 deg.cin'/dinol cerca de 260 iim, más
tina banda a los 327 niii ([0]2::=-9000) y iiii Iioinbro positivo a 215 ntn; este
espectro es destruido por TFA adicional. Peggioii et.al.'22'lian concluído, a
partir de dos líneas de evidencia, qiie la estriictiira ordenada piiede ser una a-
hélice hacia l a derecha , aun y ciiaiido siis propiedades de DC son diferentes a
las de ins tipica u-lielicc. l'[~illic[~~.~. L'! eqiccti'o de DC de copoliineros de L-
feiiilalaiiiiia coil ~-cai-botieii~usi-l.-lisiii:i eii tctraliidrofmiio inostraroii una
perturvacióii gmciiial del pat1611 de la u-liilicc coil E-carbobeiisosi-L-lisiiia ai
introdiicir inis feii¡lnlai!iiia. pcia iiiiigúii caiiibio en el sentido Iielicoidal.
Seguido, poli-L-feiiilalaiiiiia pasa iiiia traiisicióii en mezclas agua-ácido
metaiiosiilfóiiico , eii iiiia iii;1ncra míloga a aqiiella de la transición u-hélice a
enrollainieiito de ~~oli-L-cicloliesil~iIniiiiia; bandas en el UV-cercano también
fueroii obseivadas en este estudio. Sin eiiibargo, los patrones de DC de la poli-
L feiiilaliiiiiiia p e d e ser atribiidos 'I iiii traslape de baiidas de cadeiias laterales
croinóforas depeiidieiites de la coiifonnacióii coil bandas iionnales de
eiirollaitiieiito al azar y de péptidos a-lielicoidales. Lo inisrno puede decirse
para l a poli-L-tirosiiia y para poli-L-triptofaiio. Un esriidio reciente de DC
realizado por Peggioii et.al.i'2'sobi.e copolíiiieros de lisiiia y fenilalaiiina en
agiia a varios valores de pIi siigicre qiie la presencia de feiiilalanina en este
sisteina induce a la fonnacióii de l a estructura p.
(ii) i / i m i m El espectro de abs«rció:i de la tirosiiia no ioiiizada (la fonna
presente eii prott'iiias a pH iieiitro) coiitieiie i i i ia banda débil a 275 nin (con un
iioiiibro a los IS2 iiiii) y dos picos iiihs fiiertcs a 723 y 193 iiin. El espectro de
DC de la L-tirosiiia iio ioiiizada iiitittstra bandas positivas con-espoiidieiites a
las transiciones eii 275 y 225 iiiii; la banda de DC iiitervieiie con la
detenniiiacióii coiifoiinacioiid de los polipéptidos de tirosiiia. La sefial de DC
es positiva taiiibiéii a )¿ < 200 11111. Czilciilos teóricos de la actividad óptica de la
tirosiiia iiaii sido elaborados. La estriictiira \.ibracioiial fina se vuelve aparente
en el DC de la tirosiiia (y stis deri\;ados) al eiifriarse. Cuando el g ~ i p o feiiólico
"I
es ioiiizado (a 1111 pI~I sobre I ? ) toda la absorción y bandas de DC son
cainbiadas a loiigitiides de oiiih i i i i j larps. (Este cambio a rojo es útil para
diagiosticar residuos de tirosiiia t'ii proteinas)
t'w :.o n o m i w x
Figura 6 ,-".,...<-,
Dicroisiiio Circultir dc lii poIi-L-~irosiiii~ 1iclicoid;il (- ) . poli-L-Tirosina al awr (--------) (ambas a pH
11.2). y L-tirosiiia a pH 8 ( ......... ) > i i pti I? La roriiiii Iiclicoidnl dcl polimcro fié prcparada por
diliicióii dirccio cn agii;i ;I pH 11.2: I;i ioriii:! dc ciirull;iiiiiciiIo :it :icir priiiicro iuc Ilcvada a pH > 12 y
dcspids a pH 11.2.
Los patrones de DC de l a N-iicetil-L-tirosiiia ainida se muestra en la figura
5 ; l a baiida de los 275 nin para este compuesto en agua es negativo. El ester
stílico de la L-tirosiiia y el ectet etílico de la N-acetil-L-tirosiiia tainbién han
sido esainiiiados a diferentes teiiilier'ntiiras y valores de pH. El espectro de DC
en el UV-cercano de la N-acetil-L-tirosiiia ainida y del etil ester son
estreiiiadaineiite dependientes del solveiite; la baiida de DC del ester a 275 nm
es positiva en diosaiio y iieptiva i'ii inetanol. Honvitz et.al.'2''siigirieron que
de-biera ser posible identificar los residiios de tirosha en proteínas a partir de su
estnictiira de DC vibracioiial eiitte los 275 y los 290 iiin. Las bandas entre los
*.
c
.._ r-
L
250 y 170 iiiii fiicruii iio ta i i iiiilrs cicbitlo al traslnpe de coiitribucioiies rzsiduos
de fenilalaiiiiin y piieiites Ji.iii1fiii.o.
Las propiedades de las dikciol!ipei.ariiias (tlipiptidos cíclicos) eii DC eri el
UV-ccrcaiio coiitciiieiido croiiiótoros aroiiiríticos Iian sido esaininados a
teinperattira aiiibieiite y por debnjo de esta. Los valores de elipticidad para L-
tirosiiia coiiteiiieiido dipéptidos ciclicos soii iiiiiclio inás &Tandes que para los
péptidos lineales análogos, apareiireiiieiite debido a la confonnacióii tígida de
las diketopiperaziiias. Caiiibios a rojo soli causados por la ionización de 'la
tirosiiia y por solveiites orgiiiiicos. L a L-tir-L-tir cíclica iniiestra una pequeña
coiitribiicióii escitoii eii sii DC. Zieglrr y Bush (*%oinpararoii el espectro de
ciclo-(%liciiia)j-L-tirosiiia con aquellos del Iiesapéptido lineal análogo y de la
ciclo-(Gly)-L-leiiciiia. Ellos coiicliiyeroii, con la ayuda de datos de resonancia
inagiitica iiiiclear, qiie el inejoraiiiieiito de las bandas de DC de la ainida x-x*
es el resultado del acoplainieiito entre los croinóforos tirosil y amida.
Coiiio coli los hesapéptidos cíclicos, la preociipacióii principal de los
estudios sobre polipéptidos que coiitieiieii tirosiiia (y otros aroináticos) es el de
resolver peptidos de bandas de DC de cadenas laterales y detenniiiar su
coiifoniiacióii. La estiinacióii de la esti-iictiira secundaria de estos poliineros es
iinpoitaiite si \ a i 1 a ser iit ilizados coi110 iiiodelos para la detenninación
estriictiiral de proteiiias, debido a qiie la coiitribiicióii de croinóforos aroináticos
al espectro de D C e s depeiidieiite de la coiifoi-iiiacióii. El espectro de DC del
políinero iio es la siinple siiiiia de aqiiel de un derivado del ainiiioácido
inoiioinérico (ej. L-tirosiiia) y aqiiel para u n polipéptido de conformación
conocida (ej. u-hélice): los ci-oiiióforos de cadenas laterales iiiteraccionan con
otro y coli croinóforos peptidicos. El probleina, coino lo ilustra con la poli-L-
P
.. -.
L
c
h.
c
i..
c
L_
P.
tirosiiia, es dificil. Las ctiivas dc DC para este políinero (fig. 6) obviamente
reflejan una mezcla de las bandas de péptiao y de tirosiiia. El espectro
resultante no corresponde, ni siquiera ciialitativainente a datos de DC del
polipéptido para las fonna conocidas u$ y al azar. Si pudiera mostrarse q w
un espectro de DC dado para l a poli-L-tirosiiia corresponde al del políinero en
cualquier confoniiación de la coliiiiiiia coiiocida (por ejemplo a-liélice),
entonces el patrón normal de DC para esta conformación puede ser restado.
Las contribución al DC de la cadena lateral piiede ser estimada, y estDs
resultados piiedeii ser aplicados para corregir el DC de proteínas conteniendo
residuos de tirosiiia en segmentos con esta coiifonnacióii. Sin embargo, si la
conformación de la poli-L-tirosiiia 110 se conoce, las contribuciones al DC de la
columna y las cadenas laterales no piiedeii separarse (porque los efectos Cotton
de la tirosina dependen de la coiiforiiiacióii) y los estudios de polímeros son
mucho menos útiles para aplicaciones sobre proteínas.
Después de i i n gran iiíiiiiero de estudios sobre DC y las propiedades fisicas
de la poli-L-tirosiiia y copolíiiieros en varios disolveiites, más cálculos teóricos
de DC, todo lo que se ptiede concliiir es qiie la poli-L-tirosina es
probablemente tina a-liélice hacia la derecha en disolución acuosa bajo ciertas
condiciones. También hay e\.ideiicia de tina Iiélice hacia la izquierda ( I 4 ) y de
formación de hoja p . Sin eiiibargo, tina geiieralizacióii íitil para la interpretación
de DC de proteínas emerge de datos qiiirópticos: todos los espectros de DC y
ORD de la poli-L-tirosiiia (110 iiiiportaiido cita1 es la estnictura correspondiente)
tienen valores de elipticidad en t i n rango entre 210 y 240 nin los cuales son
mucho más positivos que aqtiellos de los poliéptidos normales en
coiifonnaciones ordenadas conocidas, Por lo tanto, residuos de tirosina (y otros
arc!iiiticos) cii prcteíiias piicdeii c;ius;ir una cstiiiiacióii demasiado baja a partir
de datos de DC para cualqiiier coiifonii~icioii ordenada.
El primer s i g o de peciiliaiicirid para la poli-L-tirosiiia f i é su valor de bo
positivo. Beycliok y Fasinaii'"'esriitiiii~iroii sil DC y encontraron qiie el espectro
que se eiiciieiiti'a eii la fígiira 6. Debido a que I:] poli-L-tirosiiia no es soluble en
su forma total iio ioiiizada, el poliiiiero t w o qiie ser esaiiiiiiado a un pH alto.
En la fonna estrtictiirada (helicoidal) hay baiidüs de DC correspondientes a la
bandas de absorción de la tirosiiia no ioiiizada a 275 y 225 nm, más una banaa
a los 248 iiin atribuible a la tirosiiia ioiiizada. Todas estas están superimpuestas
en las baiidas de DC del piptido. Trabajos realizados inás tarde mostró la
presencia de tina baiida de DC positivo a 200 iiin en tninetil fosfato y en
NaCIOJ O. 1 M a pH 10.8; esta baiida, tainbiéii es probablemente una mezcla de
la absorcióii de la tirosiiia a 194 iiin inas la baiida de absorción del péptido 7 ~ -
x*. De alguna iiiaiiera ciirvas de DC difereiites encontradas para la poli-L-
tirosiiia, eii las cuales la baiida iiegativa a 225 iiin no se encuentre, se puede dar
por variaciones de ioiiizacióii.
Algiiiios estudios recientes de copoliiiieros qiie contienen tirosina son de
interés. Sliecliter et. al.'2"eiicoiitraroii qiie para un copolíinero de secuencia L-
tir-L-ala-L-GIu, la baiida de DC n 175 iiiii es negativa en l a conformación
Iislicoidal (,aiiiiqiie la baiida a 215 iiiii reticiie la inisina seiial que en el
hoinopoliinero). Este resiiltado indica l a seiisibilidad del cromoforo de tirosina
a SLI ambiente asiinétrico y iiiiiestra qiie sti habilidad de iiiteraccioiiar con otras
tirosiiia puede caitibiar si1 coiitribiicióii rotatoria. Rainacliaiidran et. al.
""'estiidiaroii el inisino copolíiiiero por iiiedio de ORD. Ellos l o compraron con
u11 copolíinero de seciieiicia al azar (Tir, ala, GIii) en ainbas formaciones a-
60
Iielicoidkil y al a n i . . y di0 c\id;.iicia COI^ d!fi.ncciiiii de rayus S para la fonna
Iielicoidal del copoliiiicro sccumciado. Ellos coiicliiyeroii que en la fonna u-
helicoidal, la coiiti-ibiicioii al ORD de los rccidtios de tirosiiia eii la region de
los 200-350 iiiii ( uii pico a los 33.3 i i i i i J iiiio por debajo de los 200 nrn) casi
caiicela la coiitribiicioii del u-lidice. L a coiitribiicióii de la tirosiiia del
copolíiiiero al azar eii la coiiforiiixióii u-lielicoidal es siinilar en la forma, pero
tieiie solo ciii tercio de la aiiiplittid
Poliinecos de Iiidro~ietil-I,-gliitain¡iia qiie iiicorporaron pequeiias cantidades
de L-tirosiiia iiiiiestr'aii efectos Cotton iiegativos eii l a región del UV cercano en
soliicióii actiosa de inetaiiol al YO04 ( doiide los políineros soli u-lielicoidales)
coiiio se intiestra eii la fíciii'ii 7. Estas baiidas de DC
2 50 2 M 2 ?O z6.a 290 x m .,,.m,
Figiir:i 7
Dicro iwo CirwI: ir en ci ul i rm iolci:i ccrcmo dc sopoliiiicros de N'-(?-liidro~iciil)-L-Cluinriiina con
c:iiiiid:idss u r t x k i s dc L-iirosiiia (iiicorpor;id;i :¡I w r . El so!! ct i i i cs SiIYú iiiclaiiol acuoso . cn cl cual los
copoliiiicros soti u-liclicoid;ilcs. Los \:!iorts cic [!)I soil dados por iiiol dc residuo dc tirositia. Porcicnto molar
dc tirosiii;i cii los coiiipliiiicros. 4 5 - - - - - ; S ~ 17 El cspcciro dc DC de N- acciil- L- lirosiiia ;iiiiidd cn i1ict:itioI . ... . sc 1iiucsir;i p:ir;i coiiipwicion L:is b: i r rx dc crror indican el aciicrdo de
di ipltcir loa c\pcriiticiiios
(calculadas por iiiol de tirosiiia residual) crece desproporcionadaineiite ai
aiiiiieiitar' el coiiteiiido de tirosiiia, otra vez inostraiido iiiteracción especifica.
Adeinás, copolíiiieros eii bloque de L-tirosiiia con DL-glutainato tienen bandas
de DC positi\as a 275 n i i i , siiiiilarts a l a poli-L-tirosiiia. No es posible, eii
ningiiiio de estos casos cnlciilat cl cspeciro de DC del copoliiiiero a cualquier
longitud de onda adicioiiaiido las ciirms de DC de derivados de tirosiiia
modelo, aíiii y ciiniido estos copoliiiietos tieiieii coiifonnacioiies iionnales. Este
resultado iniiestra qiie las coiitribiicioiies nioitiiticas al DC soii dependientes de
la coiifonnacibii, o que las cadenas laterales se iiimovilizaii debido a la
estructura de l a coliiiniia y por lo taiito soii atrapados en una configuración
asimétrico. El exaiiieii de las ciirvas de DC en l a región de la longitud de onda
del péptido para estos copoliiiietos Iiclicoidales iniiestra un descenso aparente
en la inagiiitiid de las bandas de DC del péptido al aiiineiitar el contenido de
tirosiiia; este Iiallazgo es iiiiiy siiiiilar al caso de los copolíineros de triptofaiio.
(Ver figura 8)
c
c
c
L
c.
r-
_- -I
L.
P
L,.
Fi:iir;i X 8:\.
Dicroisiiio Circular cii cI U.V. 1cj;iiio dc c-op-oliiiicros dc N i -(2- liidroxiciil)-L- glutamina con variadas
caiiiidadcs de trip1of;iiio ( incorporado ; I I ;i/. ;ir), Porciciilo 1iioI;ir dc [riptofano cn los copoliincros:
if .......... (poli-liidrosiciil-L-gliii:iiiiiii;i)
2s- X.8 ____---___ 14.8
Los vdiorcs dc [ii] soil d;idos por iiioi dc rcsiduo pcpiidico.
(A) Polipcpiidos u-liclicoid;ilcs CII soliicioii ;iciios;i dc iiiclanol al 80%.
(E) Coiiforiii:icioiics dc c~iroll:~~i~ici~to al :imr CII agua..
(iii) 7i~iptofo~io. Este ainiiioácido absorbe la luz a 227 nin (con estructura
vibracioiial), 2 1 S y 196 11111. El ORD del I=triptofaiio, N-acetil-L-triptofano
ainida y péptidos pequetios, iiiis el espectro de DC del ainiiio ácido, sus ésteres
y N-acetil-L-triptofaiio ainida Iiaii sido esainiiiados. Varias bandas positivas se
encuentran presentes entre los 270 4 300 nin para todos estos compuestos.
Stricklaiid et.al.'26)lian asignado estas bniidas vibracionales a temperatura
ambiente y 77"(doiide son iiie.ioradas) coil la asistencia del espectro se
absorcióii del iiidol. Dos trniisicioiies elcctroiiicas La y Lb, cootribuyen al DC
c
L_
c
L
c
L
c
- c
L
c
c
i
c
de coinpiiestos de triptofaw iiiodc!o en esta regibii. bandas vibracionales de
DC de Lb se eiiciieiitraii localizadas a 290 iiin para la transicón de 0-0 y a 283
iiin para la traiisicióii 0+85ü ciii-'; estas posicioiies iio son cambiados por los
diferentes disolveiites. Varias baiidas de La, localizadas entre los 265 y 297 nin
dependen del disolvente. Varios laboratorios estáii de acuerdo que en la región
de la loiigitud de onda baja el L-triptofaiio a pH neutral tiene bandas de DC a
222 nm (positiva) y a 195 iiin (negativa), lo cual corresponde a sus picos de
absorción. Además, bandas peqwfias a 240 y 200 nin son notadas en a l y n b s
reportes. El espectro de DC del L-triptofaiio es dependiente del pH, y es muy
siinilar a aquel de el N-acetil-L-tiiptofaiio ainida. Estudios de diketopiperazinas
iniiestra que las baiidas de DC eii el UV cercano de Gli-L-trp cíclico y de (L-
trp)z cíclico soli varias veces taii graiides coino aquellas correspondientes,
menos rigidas, a dipéptidos liiieales. Efectos del disolvente en el dipéptidos
fueron demostrados: el diosaiio parece que destruye la iiiteracción entre los
croinóforos iiidol y el aiiillo dipeptidico, pennitieiido una libertad rotacional
más ainplia. Las baiidas de DC del triptofaiio fiieron correlacionadas con
bandas eii P-lactoglobuliiia y aiiliidrasa carbóiiica. Las propiedades quirópticas
de poli-L-tiiptofaiio y siis copoliineroii iiiiiestraii traslape de bandas de péptido
y de cadeiias laterales, siiiiilar al caso de la poli-L-tirosiiia. Gran parte del
trabajo Iia sido resiiinido. Fasiiiaii et.al.""esairiiiiaroii el OF¿D de una película
de poli-L-triptofaiio y eiicoiitraioii a 233 iiin inás efectos Cotton peqiieiios en el
UV cercano. Ello's coiicliiyeroii qiie el poli-L-triptofaiio, aiiii teniendo un valor
de b, positivo, es iiiia a-lvilice Iiacia la derecha ya que una serie de copolimeros
coli y-beiizil-L-gliitaiiiato foiiiiaroii una relación lineal entre bo y el porcentaje
de triptofaiio. Stevens et.al. ""obtiivieroii espectros de DC de películas de poli-
- P - c
L..
(2'1, L-trp. Cos:iiii et :iI. cstti~li~w~i! los qiec t ros de DC de un copolíiiiero de
bloqit. de triptotiiiio coil .~-etil-DL-~liitaiiiato eii trifluoroetaiiol, solveiite eii el
cual el políiiiero apai-cce estriictiii.iido. Biiiidas de DC fueron encontradas a 290
iini (AF -0.63), 256 y ZSO(l1oiiitros positivos), 272 (A~=2.65) , 226
(,As=42.27), 310 (SE= -3ó.4), y 190 (Ac = 14.3). Las dos bandas dicroicas a
210 y I90 iiin soli de la iiiisiiia sciial y posicióii que de aquellas observadas
para polipéptidos en iiiia coiifonnacióii u-helicoidal hacia la derecha. De
cualqiiier iiiaiiera, l a baiida a 226 iiin iniiestra que transiciones iiidol
ópticaiiieiite xtivas se traslapoii a traiisicioiies peptídicac en este políinero, y la
asignación coiiforiiiacioiial requiere ser coiifiniiada.
(iv) Hislitlitia. El grtipo iiiiidazol de la Iiistidiiia tieiie iiii pico de absorción a los
210 iiin que podria iiitci-ferir coil las inedicioiies de DC en proteínas. El
espectro de DC del L-aiiiiiioácido iniiestra una banda positiva a los 213 nin (lo
ciial cainbia ligeraiiieiite a i-ojo eii ácido) y uiia baiida negativa a los 193 iiin. Se
mostró que iiiia baiida iiegatim a 2 17 iiin eii ciclo-Gliz-L-Tir-Gliz-L-His tiene
coiitr-ibircioiies de traiisicioiies m i d a i1-x- y traiisicioiies electrónicas iinidazol.
Poli-L-liistidiira Iia sido esttidiada por iiiedio de ORD, DC y espectroscopía
iiifraimjo. En general se está de actiei-do que a 1111 pH ineiior de 4, donde la
moiety del iiriidazol lleva uiia carga positiva y donde el espectro de DC se
caracteriza por tiiin baiida positiva a los 222 iiin, el políinero es tin
. eiirollaiiiieiito al azar (o tal vez illla cadeiia extendida). Sin embargo, en
65
.
süliicioiics aciios;!~ que s,: wciiei~iriiii p o r m i b a dcl pK de In traiisicióii del
iniiodazol (pH 5-6) hay iiiia coiiti.owIs¡a sobre la foiiiia ordeiiada (o fonnas) de
la poli-L-liistidiiia. A pi1 - 6 el DC coiitieiie bniidas a 221 iiin ([í3]--5000) y a
203 iiin ([O]- 16000j; caiiibios de DC intiy coirip!icados ( iiivolucrando más de
dos especies) fiieroii iiotados al \ aiiar el pH de 4 a 6. No qiieda claro si la poli-
L-histidiiia a pH neutral es i i i i ~ i IiZlice Iincia la izquierda, iina lidice hacia la
deieclia (con coiitribucioiies de cadeiias laterales que confunden las
propiedades qiiirópticas), iiiin hoja f3 o talvez algiina otra conformación o ina
mezcla. Eii ciialqiiier caso (coiiio parece ser l a regia para residuos aromáticos),
¡a preseiicia de Iiistidiiia resiiitn eii 1111 espectro de DC iniiclio menos negativo
en la región de 195-340 11111 qiie iiin c i i i w i ioi i i ial a o p. Peggioii et.al.'~'"'exainiiinroii espectros de DC de iina serie de copolíineros al
azar de L-liistidiiia coil L-lisiiia, y coiicluyeiw que la estructura ordenada
asiiinida por la poli-L-liistidiiia no protonada en apia no puede ser una a-
Iiélice. Uii copoliiiiero de seciieiicia L-(His-Ala-Glu),,, el cual es soluble en
agua y 1111 buen iiiodclo para Ii¡.itidiiia eii proteiiias, tieiie tin espectro de DC en
agua el cual iiidica eseiicialiiieiite iiiia coiifoiinacióii de eiirollainiento al azar a
todos los valores de pH, coil poca seiial de iiiterfereiicia de la actividad óptica
de cadeiias laterales.
fLy Resitlrios q r r c c0/7//~/1~~1 .\r///i/ro. Adtitiis de los residuos aromáticos, la
coiitribiicióii de los resicliios coiiteiiieiido sulfiiro, principalineiite cistiiia (S-S),
deben toiiiarse eii ciieiita. Cisteiiin (SH), iiietioiiiiia (SCH3) y cistina tienen
colas de absorción largas eii la regioii de los 195-230 nin; cistina tiene una
66
banda ;idicic)ii:I.l ;I los 250 iiiii I : I ~ ~ c ~ i i i u i i ) i - o jiiI1.iii.ü por si iriisino no parccc ser
ima fiiciitc iiiipoitaiits dt x í i \ , i c ! a i i i ipt ica.
Por otro lado, el craiiióibro cijtiiia disiilfitro presenta tina fiieiite iniiy
sigiificati\.a de actividad óptica. Uii agriipainieiito disiilfuro se fija rigidamente;
la barrera de roi;icióii de la i i i i i h i S-S es alta, y el disulfiiro piiede existir eii
ciialqucira de dos rotóiiicros tciiit'iiilo iiii seiitido de rotación ya sea hacia la
derecha o hacia l a izquierda. Aiiiique uii inievo centro de asimetría es creado en
la cadena peptídica, caiisaiido efectLx Cottoii eii las regiones de el ü V lejano y
cercaiio. El ,iiigiilo dihedral ( detiiiido por Cl-S-S y S-S-Cz) a t á cerca de los
!IO", eii la cistiiia iiiisiiia, pero piieclt' variar eii proteíiias. La banda de absorción
cambia a rojo si~iiificativaiiieiite al disiiiiiiiiir el áiigiilo dihedral de tal inaiiera
que las baiidas de DC de S-S CII el UV cercaiio piiedeii aparecer eii cualqiiier
parte eiitre los 250 y 270 iiiii aprosiinndaineiite. Además, estas bandas no
tieiien iiiia estriictiira vibiacioiial tii ia; este factor piiede ser una ayuda para el
diagiióstico de proteiiias.
Beycliok '.'''y Coleinaii y Bloiit '")eiicoiitraroii que la L-cistitia tiene una
aiiiplia baiidu de DC iiegativn dcpeiitlieiite del pH a 235 nin ([el- -2500), la
ciial ss coiiipaitida por dsii\riiios de N-acetil y por
iiieqiiiL.ocadaiiieiite asociada coii la traiisicióii
depeiidieiite del pH (positiva, cerca de los 230 iiiii),
estos coiiipuestos.
Iioinocistiiia y la cual es
disulfiiro. Otra banda
tainbiéii está presente en
Contribuciones no peptidic;is cii 1)rotcíii;is.
La re\ isióii de las propiedades qiiirópticas eii S I UV cercaiio (priiicipalinente
Dicroisiiio Circidar) de protciiias se Iia viielto en uiia técnica coinún
c-
*
C"
F
L.
P-
." c
L
c
L
c
L
r-
rL c i ;'I 1tc111 CI: ic piicdi: gi.:i~.i.:ii. I ii I;,i~iii:ici 011 (11 I I sobre rcsiciiios aroiiiá t ¡cos y
cistiiiicos e;peciticos y del i x J i o c p c ' 10s roclcii. por ejeiiiplo en el sitio nctko
de i i i ia ciiziiiia. Por otro lado, iiiii! poco sabe sobre ias coiitribucioiies de las
cadenas laterales al espectro de DC de protciiias en la región peptidica en el
UV- lejano, o solii-e iii&oclos gciiernles de iiiterpretacióii coiifonnacioiial en
presencia de bandas de DC cir crideiias laterales. Goodinaii y Toiiiolo'33'liaii
revisado el trabajo Iieclio a travr's de 196s sobre la actividad óptica aroinática
en proteínas. Beycliok "'h realizado estudios que coiitribiiyen con
iiiforiiiacióii dc DC eii disiilfiiros eii proteíiias. Uii estudio reciente sobre
iiisiiliiia ilustra ci probleiiia del trasiapes (!e las baiidas de péptidos y cadenas
laterales.
No Iiaii Iiabido cstiidios esp-ciíicaiiieiite sobre Iiistidiiia. Pocos estiidios se
tiaii centrado, en el papel de la ft.iiilalaiiiiia en proteiiias debido a la debilidad de
stis baiidas de DC; algunas excepciones soli investigaciones sobre peroxidasa,
y carboxipeptidasa. Estudios sobre tirosina iiicliiyeii a la riboiiucleasa, niicleasa
estafilococal, citocroiiio c. lijoziiiia, iiisiiliiia, coiicaiiavaliiia y
carbosiptptidasa. EL DC del triptot'aiio I ia sido exaiiiiiiado eii citocroino c,
lisoziiiia, nvidiiia, Iieiiiuglobiiia, psrosidasa, qiiiinotripsiiiógeiio y
carbosiprlptidasa. Piieiitrs de c i j t i i i a i 'ii riboiiiicleasa, lisoziina, iiisulina, las
iieiirofisiiias, y oti-as proteiiias Iiaii sido in\. sstigadas.
Ha sido posible difereiicini- bniiilas d? DC de varios residuos de cadenas
laterales por iiicdlo de estiwtiiix \ ibi,oiiic;i fiiia. Gim parte del trabajo se llevó
a cabo a baja tei1iperatiii.i. doiidc ILi rtjoliicióii de la banda era inejor. Uii
ejeinplo (raíz fiierte peroridasa AI iiiiiestia en la figlira 9 . Las bandas de
DC debidas a 1111
Figura 9A L.Cii<iIiiLl 11. 0iid:i (iiiii)
vi judimioi i . L:; p:ro\jd.;s;i ( 1 9 iill!
de sxi i2 (?!I 7 )
NOTA5. (A : ;ibsorci&i ) : Absorsioii .ipro\iiii.iil:i dc 1;i Iiciiic iiioic:! :I ? 9 I w sc iiiiicsir:i por I:i li~ic;~ piinicnda.
Asign;>-ioiics vibroiiicx soii d:id:is p~:i b ~ : i ~ i I . i ~ i i T7'
8. Diiroisiiio Circiilx € 1 Dicroisiiio s.- icgisir;i coi110 o\~-,-IL:) Loiijiiud dc ir:iycciori;i dc ccldii dc O. 12
mm. No sc ixi!csir:iii ~ J ~ O S n ;.< 270 iiiii ixiqiic i'$i ¡ii!csl¡g:ict6ii sc ocupo priiicip:iliiicriic coil Dicroisiiio
Circular dc iripiofxiii.
L I I > I : C ¡ I . I i'ii : ig:wg! i<mi ( I . 1 vlv) coiiiciiiciido 511 r i i M dc fosf;iio
tipo de cadena lateral dads piiedcii. c'ii casos favorables, ser correlacioiiadas
con residuos específicos y gciic'i'ar iiiforiiiacioii respecto al inedio que los
rodea.
Propiedades qiiirópticas de giipos prostiticos son estudiados en algunas
ocasiones, por ejeiiiplo, l a Iieiiioglobiiia. Estas bandas pueden ser resueltas a
partir de bandas de proteinas: esto se Iia llevado a cabo para los gupos Iieino
de la perosidasa, hemoglobina y citocromo c. Iiiformacioii respecto a la
estequioinetría y iiiaiiera dc coeiiziiiins y de l a unión iónica de metales a
enzimas puede ser obtenida inoiiitoreaiido los efectos Cotton extrínsecos (en la
región sobre los 300 i i in) sobre la t'oiinacióii de complejos enzima-cofactor en
la ausencia o en la preseiicia de siistrato. El ORD de varios sistemas ha sido
revisado. Un ejeiiiplo de tiun iiivestigncióii de DC siinilar (de glutainato
desliidrogeiiasa de Iiigado de rcs y NADH) p e d e ser visto en Koberstein y
Siiiid.
bluclias iiivestigacioiits t i t i l imr cniiibios de pH para distinguir entre bandas
de cadenas laterales: residiios de tirosina iiiiiestraii paiticulanneiite 1111 gran
cainbio a rojo al ioiiizai-se (ver íiyiia 6). Desiiattiralización de proteinas [por
calor, pH estreiiios, o adición de iiii desiiattiralizaiite (e.g. hidrocloruro de
piaiiidiiia)] es otra Iisi~aiiiieiita coiiiíiii; de esta inaiiera el ambiente de una
proteina de residiios dados piiede ser variado, al igual que el efecto sobre
70
estudios dc DC . La iiiayoiia tic l o s papeles catalogados aiiterioniieiite iiiideii
uiiicaineiite DC eii el UV cercmo (>.>?-lo iiiii); algiiiios tienen que vcr con
regiones de ineiior loiigitiid de o i i c i a .
La iiiodificacih qiiíiiiica de residtios específicos intiestra ser prometedor y
convertirse eii tiiia iiiiportaiite tfciiica de DC; tirosiiia en iiisiiliiia y en lisoziina,
y triptofaiio eii lisoziina, Iiaii sido estiicliados de esta manera. Los efectos de la
iiiiióii de iiii iiiliibidior o el sustrato sobre baiidas de DC de cadenas laterales
lian sido medidas para carboxipeptidasa, iiucleasa estafilococal, hs iieurofisiiias, coiicaiiavaliiia, lisoziina y riboiiiicleasa.
Ejeniplo especiycos. (r)l~ihoili,L.lecr.va~oiiii~l~~i.su I'cimmitica. Diversos tipos de
información pueden obteiierse a paitir de estudios ciiidadosos de DC y ORD de
una proteína. La riboiiiicleasa paiicreática Iia sido la eiiziina favorita para el
estudio porqiie la inoléciila no contiene residtios de triptofano o inucha a-
Iiélice; adeinás la asignación de los efectos Cotton que surgen de la tirosina y la
cistiiia son mas certeros qiie eii la inayoría de las proteinas. Algunas
investigaciones sobre la Riiasa Iiaii sido resiiinidas. En 1965, Glazer y
Siiiiinoiis""esttidiaroii priiiieio los espectros de ORD de la riboniicleasa. Una
baiida fiié encontrada cerca de los 775 iiiii a pH 6.2 la cual cambió a 292 nin a
pH 1 1 , inostraiido qiie la baiida estaba asociada con residuos de tirosina
expuestos a solvente y por lo taiito siisceptibles a ioiiizarse. Dodecil-siilfato de
sodio reiiiovió estas baiidas; adeinás In asimetría surgió de iiiteraccióiies
específicas de residuos de tirosiiia eii su ainbieiite nativo. Siinpsoii y Vallee
encontraron qiie estas baiidas estenias de tirosiiia podiaii ser inodificadas siii
afectar el resto del espectro de ORD. Siininoiis y Glazer07)~oiitiiiiiaron siis
.-
i36)
71
espci-iimiitos iitilizniiilo ílC 1 c~icoiiti-ai'oii iiiia banda de DC iiegativa a 273 11111
a p ~ i iieiitro tn c ~ i t cniiibio a 2x5 iiiii a pFi I I . Iiasiiiziiine et.ai. "X'coiiipararon
el DC de la i - i bü i i t i~ l~ . a~a A coli nqiiel de In poli-¿-tirosiiia y eiicoiitraroii que la
elipticidad de los rejidiios de tirosiiia eii la proteiiia era inticlio inás alta de lo
que se esperaba de la elipticictxl de l a poli-L-tirosina. Establecieron, por lo
tanto, que los residuos qiie ciiterrabaii a la proteína tenían tina inayor
coritribiicióii al DC que los residuos esteiiios. Al caleiitar l a Rnasa la
elipticidad disiniiiiiia a los 275 iini en dos pasos, sugiriendo que los residuos de
tirosiiia eiiteindos (los cuales cstabilizaii la estructiira terciaria de la proteína)
no se desdoblaron siiiiiiltaiieaiiieiite coil los espiiestos.. Siinons et.a1.'39'y
Bello(J'l'tainbiéii siguieron la desiiatiii.nlizacióii ténnica de la ribonucleasa y
llegaron a una coiicliisióii siiiiilar.
Hoiwitz et.al.'""esaiiiiiiriroii el espectro de DC en el UV cercano de la
riboiiiicleasa a 77". Siis resultados se iiiuestraii eii la figura 10.
270 Mo . 230 500
L O i i ~ i ! i i t l dc 0iid;i (iiiii)
Figura Iii.
Espcciro dc Dicroisiiio Circular cn el i i l l m iolci:i ccrc:!IIo dc I:¡ riboiiuclcns3 A a 17". Conccnirncion dc
protck i 5.6 iii%l. loiisiiiid d e 1;i ir;i!cc!ori:i 0 Z i i i t i i : soi\ciiti- :ip;i-gliccroi (I:]. v/v) con 25 InLí dc fosfaro
dc sodio. BL es I J iiiicii 1x1s:. El cqxclro ki sido rcjucllo c i i coiiipoiiciiics corrcspondicnics a coniribucioncs
Corrclacioiiiiiido el DC coli k i cstiictriia vibracioiial fina qiie iniiestra la proteiiia
y por coiiipiiestos iiiodelo eii el sspwtro de absorcióii, fiieroii capaces de
difereiiciar las coiitiibiicioiics :iI DC de los residiios de tirosiiia eiiterrados y
espiiestos y de los piieiites S-S. El iiiisino bwpo estudió la RNasa-S. y
eiicoiitrai'oii que el iiiedio de uiia solo residiio de tirosiiia cambiaba.
Pfliiiniii y Beycliok""estiidini.oii la rediiccióii y la reoxidación de la
riboiiiicleasa paiicrelitica y ciicoiitrnroii qiie la baiida de DC de la tirosiiia a 240
iiin parecía estar asociada coli la foiiiiacibii de los piieiites S-S correctos de la
eiiziiiia iiitacta. Siitioiis""esniiiiii~ el efecto de el eiilace de uii iiiliibidor,
3'CMP, sobre la batida de tii.osiiia a 230 iiin seiisible al medio que la rodea.
Eiicoiitró qiie titia cadena lateral de la tii'osiiia, reinovida lejanameiite del sitio
activo de l a Riiasa y previaiiieiite eiitenada, se volvió expiiesta al solveiite al
fonnarse el coinplejo eiiziiiia-iiiliil>idor.
El espectro de DC. eii el U V Iejaiio de la Rima iniiestra poca evidencia de
la baiidn de l a u-lii-lice cnracttristicn a 222 iiin. Debido a que la detenninación
coiifoniiricióiial poi' DC se eiiciic'iitrn eii hieii aciierdo coli los datos de rayos X,
la Riiaca iio es probableineiite 1\11 caso (coino el de la avidiiia) eii el ciial las
batidas de DC eii el tiltra\.ioleta kjaiio obsctireceii seriamente los efectos
Cottoii del péptido.
(/u /,/w://m/. El espectro de DC eii el U V cercano fue resuelto eii tres baiidas
positkas eiitre los 280 y los 300 iiiii m a bniida negativa a los 267 iiin; la
priiiicra l);iiidn 1i:i sido n ~ i ~ ~ l ~ ~ i i ~ l ~ i ; I / d~siiliiiro 1 3 la presciicia de iiii iiiliibidor
coiiipctitivo, ic'-ncetii-D-gliic«~~liiiiii~i, las h i idas aromáticas de DC se
iiiteiisificaii, lo ciinl iiidica qtic los rcsidiios aroiiiáticos expuestos eii el sitio
doiidc sc: liga el siib-hto soil ópticaiiiciiíc: iiciivos. Estudiando los efectos del
pH, I k d i ~t.al.','i'i.iicoiiti.ai.oii qiir algiiiios de los residuos de tirosiiia
ópticniiwitc activos soil espiicstüs ;i i i i i solveiite, piiedeii ser ioiiizados a pH
alcaliiio, pcro se viielveii ópticaiiieiitc iiiactivos cuaiido la lisozima se
desnaturaliza por esposicióii a iiii pH>I 2.
Mis i'ecieiiteiiieiite, I-lalper et.nl.'."'distiiiLiiieron eiitre las baiidas de
tirosiiin, triptofriiio y disiilfiiro poi. iiiedio de la dependencia al pH. Ellos
coiiipararoii la lisoziiiiri Iiiiiiiaiia con la de la clara de huevo de la galliiia y
eiicoiitraroii difereiicias eii la regióii del DC eii el UV cercano, .aíiii y cuaiido las
eiiziiiias mostraban 1111 espectro siiiiilar de DC eii el UV lejano, iiidicando
estructura secuiidaria aiialoga. Dos aitíciilos recientes tratan con las
inodificacioiies qiiíiiiicas de la lisoziiiia de galliiia: Teicliberg et.al. '46'oxidaron
el triptofano-108 selectivaiiieiite, y deteiiiiiiiaroti su coiitribiicióii al DC por
iiiedio de diferencia de espectros de DC. Eiicoiitraroii que este residuo es
rrspoiisable de In iiiayoria de In regióii aroiiiAtica de DC de la lisoziina, esto es
qiis la oxidacióii no nfkcta si=iiilicati\.,aiiiciite las baiidas de elipticidad
depeiidieiites de In coiifoi-iiincióii a 709 J' 192 iiiii, y que si hay un cambió de la
orieiitacióii de l a TRO- I OS cuniido iiiliibidores oligosacáridos se ligaii al sitio
activo. Atassi et.al. hizo dtrivados de dos tirosiiias y seis triptofaiios de
lisoziiiia; a l esaiiiiiiar 10s datos JI: DC y ORD estos mostrabati varias
caiitidadcs de desdoblniiiieiito.
PARTE F,SPEI<I\I EXT.\ I .
I N T R O D U C C I ~ Y :
La pepsiiia lia sido i i i ia de la pi.oteiiias iiiás esteiisameiite estudiadas, ya que
fiié reconocida desde hace l a r p ticiiipo coiiio el pi-iiicipal agente catalitico de
la disestióii gistiica en aiiiiiialcs: por eslo el gi'aii interés en la naturaleza de su
acción eiiziiiiática w7) . Se ha observado también iin material iiiactibo
catalíticaineiite (pepsiiiógeiio) el cual se Iia convertido a pepsina ciiando se
acidifica.(4s)
Hay varios tipos de pepsiiia qiie I iai i sido clasificadoscoino A, B, C y D; de
estos el predoiiiiiiaiite es el A, al cual se le lia Ilaiiiado siinpleineiite pepsiiia, los
deinás apareceii eii iiiia ineiior caiitidad.'J'9'
De los estudios que se hail realizado con la pepsina se ha visto
priiicipalineiite l a variacióii de si1 act¡\ idad en fiiiicióii del pH, ya que ésta tiene
uti papel iiiipoitaiite desdc SII piiriticncióii , pi-iiicipalineiite por inedio de
croiiiatogatia tradicioiiai."'"
Se ptirificó l a irpsiiia dz cciJo por iiiedio de croinatogafia líquida de alta
presióii (HPLC), iitilizaiido filtraciciii eii gc'l e iiitercainbio ióiiico. Adeinás se
estiiiió el coiiteiiido de estriictiii'a swiiiidaiia de la eiiziina, por Dicroisino
Circiilar.
D ic ro ís ni o Ci I'C ii I :I r
Los espectros de DicLoisino Circular se obtuvieron a 25°C en un
espectrofotopolaríit~~t~o Jasco J 500-A, calibrado con ácido (+)-io-
caiiforsiilfóiiico. Los espectros obteiiidos corresponden a la región del
ultravioleta le.jaiio 190-250 iiiii.
Resiiltados.
Las figuras I I a,b,c y d sc iiiiiestran los espectros de dicroísino circular de
la . . pepsiiia (coiiceiitracióii 0.250 iiigjiiil) a diferentes valores de pH, en la región
del ultravioleta lejano (I90 a 350 iiin). A pH = 5.7 se observan dos bandas, una
positiva centrada eii 190 iiin y otra negativa eii 214 iiin ( f i p r a 1 la); a pH=3.O
(figura I I b), se observa m a disiiiiiiiicióii a la initad, en l a intensidad de ambas
bandas. A pH=2.O (tigui.a I I C ) se obcena iiiia pérdida total de la banda
positiva. La eiiziina pierde totaliiieiite la estructura secuirdaria cuando el
pH=l.6 (figura d) y se desiiatiiraliza iireversibleineiite.
76
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L
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Figura I I:i Dicroisiiio Circiil;ir dc 1;) pcpsiii;~ pH 5.7 6.
77
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Longitud de onda (nrn) _. c
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Figura 1 Ib: Dicroisnio Circuhr dc pcpsiri:~ pH 3 0 L_
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Elip/lOCO (vrad.cnZ/dmol) ... . , "" I
I I ' 1
Figura I I C Dicroisi~io Circiilx dc pepsiii:i pH 2 o
c
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I I -8 CYLL".:."l.!.'.l.~Y.U"-..il( :.'+'..u.LLl.t ,../. i .J.,. ;.u ma 200 210 220 230
Lowltud de Onda (nm)
Figiira I Id: Dicroisiiio Circlihr dc pcpsiiiii pH I o,
Se calciiló el porcentaje de estriictiii'a secundaria por el inétodo LINCOMB,
de Perczel et.al.'"' .En 1;i t;ibln se prcseiitnii coiitribiicioiies de estnictiira
secuiidaria a cada iiiio de los \nlui-es de pH estiidindos.
L...
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b.. cr-hclicc
c
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Giros -[l+p-ixir:iiciii 45.SG
Cronioforos no 19.51
pcpiidiios (disulftiro.
aroniiiicos)
Z.Oí>
-36.77
15 44 3(i 78 34 78
22 65 2G.04
Estnicrtira irrcguhr
Hoja -p-nniip;inlcl;i 13 99
--11-...."...... I LI... " _LII "_- Se observa iina pérdida total de la coiitribiicióii debida a hoja P-paralela al
disiniiiuir el pH de 5.7 a 2.0, iiiieiitras que hay tin auineiito casi del 100% de
estriictiira irre@ilar y coiitribticióii no peptídica ( aroináticos y disulfuro) al
disminuir el pH.
c.
c
COIYCL USIóiV: El Dicroisiiio Circular piicdc. gciicrar estiiiiacioiies útiles de la estructura
secundaria de iiiia proteiiia. 5ii algiiiios casos, de acuerdo coil los resultados
por difracción de rayos X resiiita excelente.
Asiinisnio se piiede utilizar para el estudio de la estabilidad , ya sea en
fiiiición del pH o la teinpcratiira. Eii este trabajo, en la desnaturalización de la
pepsina frente al pH se obseilió iiiia pérdida total de la contribución debida a
hoja @-paralela al disiniiiiiir el pH de 5.7 a 2, mientras que hay un aumento de
estructura regular y contribución no pzptídica, aromáticos y puentes disulfuro al
disminuir el pH.
82
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c-
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