doctorado en ciencias naturales para el desarrollo enfasis en manejo de...

DOCTORADO EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO ENFASIS EN MANEJO DE RECURSOS NATURALES

INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA

ESTUDIO COMPARATIVO DE LA ACTIVIDAD ANTIFUNGICA DE UN EXTRACTO DE PROPOLEO MEXICANO Y DE TRES PLANTAS QUE Apis mellifera USA PARA SU PRODUCCION

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORA EN CIENCIAS NATURALES PARA EL DESARROLLO

PRESENTA

AMPARO LONDOÑO OROZCO

TUTORES DR. JOSE GUILLERMO PENIERES CARRILLO

DR. TONATIUH ALEJANDRO CRUZ SANCHEZ DR. CARLOS GERARDO GARCIA TOVAR

Cuautitlán Izcalli, Estado de México 2010

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto IN211008 del Programa de Apoyo a Proyectos de

Investigación e Innovación Tecnológica, de la Universidad Nacional Autónoma de México,

Evaluación de la actividad antimicótica de compuestos sintéticos y naturales sobre la

estructura de las células micóticas y la Cátedra de Investigación GVC11.

Por ti y para ti... Gracias Señor,

porque separada de ti nada puedo hacer

Papa y mamá†: Ustedes sembraron la semilla, esto les pertenece. Los amo! Tona, Saraí, Etni Alejandra: Gracias por el amor, el apoyo y la paciencia. Sola no hubiera podido. A mi familia: La distancia no es obstáculo. A mis amigos y mi iglesia Siempre están presentes.

AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Tecnológico de Costa Rica y a la Universidad Nacional Autónoma de

México, por permitirme formar parte de éste Programa que crea y fortalece

vínculos en pro del desarrollo de la región mesoamericana.

Al Dr. Tomás de Jesús Guzmán Hernández, por su asesoría, apoyo y paciencia

como Coordinador del Programa de Doctorado.

A los Doctores José Guillermo Penieres Carrillo, Tonatiuh Alejandro Cruz Sánchez

y Carlos Gerardo García Tovar, por su valiosa dirección para el desarrollo de este

trabajo.

A los Doctores José Guillermo Ávila Acevedo, María Margarita Canales Martínez y

Claudia Tzasna Hernández Delgado, por su asesoría y apoyo durante la

realización de mi Pasantía en la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la FES

Iztacala, UNAM.

A la Dra. Lourdes Juárez Mosqueda y al Dr. Jorge Hernández Hernández del

Departamento de Morfología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

de la UNAM, por la asesoría y el apoyo para la obtención e interpretación de las

micrografías electrónicas, así como a las Maestras en Ciencias Adriana Méndez B.

y Ana Luisa Ramírez N. de la Unidad de Microscopía Electrónica, por el apoyo

técnico para la realización de las mismas.

A mis compañeros del doctorado y de mi trabajo que compartieron conmigo esta

experiencia.

CONTENIDO

Página

1. INTRODUCCIÓN

1

1.1. Antecedentes del uso de productos naturales

1

1.2. Propóleo

2

1.3. Micosis

4

1.4. Hongos fitopatógenos

6

1.5. Micotoxicosis

7

1.6. Estructura fúngica

8

1.6.1. Levaduras

8

1.6.2. Hongos filamentosos

9

1.6.2.1. La hifa

9

1.6.2.2. Membrana celular

11

1.6.2.3. Pared celular

11

1.7. Antifúngicos

12

1.7.1. Mecanismo de acción de los antifúngicos

14

2. PERSPECTIVA TEÓRICA

17

3. JUSTIFICACIÓN

20

4. OBJETIVOS

21

4.1. OBJETIVO GENERAL

21

4.2. OBJETIVOS PARTICULARES

21

5. HIPÓTESIS

22

6. METODOLOGÍA

23

6.1. Diseño experimental 23

6.2. Obtención de compuestos de origen natural

24

6.2.1. Extractos de propóleo

24

6.2.2. Extractos herbales

24

6.3. Evaluación de la actividad antifúngica

28

6.3.1. Microorganismos utilizados

28

6.3.2. Pruebas de sensibilidad cualitativas

28

6.3.2.1. Hongos Levaduriformes: Método de difusión en agar

28

6.3.2.2. Hongos Filamentosos: Método de inhibición del crecimiento radial

29

6.3.3. Pruebas de sensibilidad cuantitativas

29

6.3.3.1. Hongos Levaduriformes

30

1. Determinación de la concentración inhibitoria

mínima (CIM): Método de dilución en placa

30

2. Método de microdilución para levaduras

30

3. Determinación de la concentración fungicida mínima

31

6.3.3.2. Hongos Filamentosos

32

1. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM): Método de dilución en placas de 24 pozos

32

6.4. Cinéticas de crecimiento

32

6.5. Observación de cambios estructurales

33

6.5.1. Microscopía de fluorescencia

33

6.5.2. Microscopía electrónica

33

6.6. Determinación comparativa de la composición química del propóleo y extractos activos

34

6.6.1 Cromatografía líquida de alta resolución

34

6.6.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

34

6.7. Análisis estadístico

35

7. RESULTADOS

36

7.1. Actividad antifúngica

36


52

7.3. Cambios estructurales

56

7.3.1. Microscopía óptica

56

7.3.2. Microscopia electrónica de transmisión (MET)

63

7.3.2.1. Micrografías electrónicas de Candida

albicans ATCC 10231 sin tratamiento

65

7.3.2.2. Micrografías electrónicas de Candida

albicans ATCC 10231 incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo

67

7.3.2.3. Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC 10231 incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus.

70

7.3.2.4. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin tratamiento

73

7.3.2.5. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto

etanólico de propóleo.

75

7.3.2.6. Micrografías electrónicas de Cryptococcus

neoformans incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus

78

7.4. Composición química

80

7.4.1. Cromatografía líquida de alta resolución

80

7.4.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría 81

de masas (GC-MS) 8. DISCUSION

86

9. RECOMENDACIONES

94

10. CONCLUSIONES

95

11. ANEXOS 98

ANEXO I Identificación de especies vegetales

98

ANEXO II Espectros de cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas

100

ANEXO III

Protocolo de microscopia electrónica de transmisión para levaduras

108

ANEXO IV Pasantía

109

12. BIBLIOGRAFÍA PUBLICACIONES 112

13. PUBLICACIONES 118

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1

Clasificación de los antifúngicos por su estructura química y mecanismo de acción

15

Tabla 2 Rendimiento de los extractos 37

Tabla 3 Actividad antifúngica de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos levaduriformes

40

Tabla 4 Lectura visual de la prueba de microdilución de Candida albicans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación

43

Tabla 5 Lectura visual de la prueba de microdilución de Cryptococcus neoformans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación

44

Tabla 6 Lectura espectrofotométrica a 490 nm de la prueba de microdilución después de 48 hrs de incubación

45

Tabla 7 CMI y CFM obtenidas para los extractos etanólico de propóleo y metanólico de C. citrinus, con cepas de Candida albicans y Cryptococcus neoformans

46

Tabla 8 Prueba de inhibición del crecimiento radial de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos filamentosos

47

Tabla 9 Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Rhizoctonia solani

49

Tabla 10 CIM del extracto metanólico de R. communis frente Fusarium moniliforme

50

Tabla 11 Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Trichophyton mentagrophytes

50

Tabla 12 Número total de hongos inhibidos por cada extracto 51

Tabla 13 Constituyentes de las fracciones del propóleo determinados por Cromatografía Líquida de Alta Resolución

80

Tabla 14 Compuestos volátiles identificados a partir de los espectros de masas del EEP y el extracto metanólico de flores de C. citrinus

85

INDICE DE FIGURAS

Página

Fig. 1 Esquema de una levadura en proceso de gemación

9

Fig. 2 Esquema de una hifa 10

Fig. 3 Esquema de la pared celular de una levadura 13

Fig. 4 Representación esquemática de los sitios de acción de diversos grupos de antifúngicos sobre la célula micótica

14

Fig. 5 Flora estudiada de las instalaciones de la FES

Cuautitlán, UNAM

25

Fig. 6 Imágenes del Apiario de la FES Cuautitlán 26

Fig. 7 Obtención de extractos 27

Fig. 8 Prueba de difusión en agar para levaduras 39

Fig. 9 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para levaduras

39

Fig. 10 Prueba de microdilución para levaduras 42

Fig. 11 Prueba de inhibición del crecimiento radial de hongos filamentosos

48

Fig. 12 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para hongos filamentosos

48

Fig. 13

Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin

extracto etanólico de propóleo 52

Fig. 14

Cinética de crecimiento de C. neoformans con y

sin extracto etanólico de propóleo 53

Fig. 15

Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin

extracto metanólico de flores de C. citrinus

54

Fig. 16

Cinética de crecimiento de C. neoformans con y

sin extracto metanólico de flores de C. citrinus

55

Fig. 17

Formación de tubo germinativo por C. albicans

ATCC 10231

57

Fig. 18

Tinción de C. albicans ATCC 10231 con Blanco

de Calcoflúor

58

Fig. 19

Tinción de levaduras de C. neoformans con

Blanco de Calcoflúor

59

Fig. 20

Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans ATCC 10231

60

Fig. 21

Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre la

longitud del tubo germinativo de C. albicans

ATCC 10231.

61

Fig. 22 Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. neoformans.

61

Fig. 23 Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el

diámetro de C. albicans y de C. neoformans

62

Fig. 24 a 26 Micrografías electrónicas de Candida albicans

ATCC 10231 sin tratamiento

65

Fig. 27 a 32 Micrografías electrónicas de Candida albicans

ATCC 10231 incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo

67

Fig. 33 a 38 Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC

10231 incubadas 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus

70

Fig. 39 a 42 Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin tratamiento

73

Fig. 43 a 48 Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas 24 hrs con extracto

etanólico de propóleo

75

Fig. 49 a 51 Micrografías electrónicas de Cryptococcus

neoformans incubadas 24 hrs con extracto 78

metanólico de flores de Callistemon citrinus

Fig. 52 Identificación del eucaliptol a partir de su espectro de masas

101

Fig. 53

Identificación del metil éster del ácido 3-acetoxi-3-hidroxipropiónico a partir de su espectro de masas

102

Fig. 54

Identificación del p-ment-1-en-8-ol a partir de su

espectro de masas

103

Fig. 55

Identificación del ethanone, 1-[4-[4-(dimethylamino) benzylienamino)phenyl]- a partir

de su espectro de masas

104

Fig. 56 Identificación del metil éster del ácido

hexadecanoico a partir de su espectro de masas

105

Fig. 57

Identificación del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas

106

Fig. 58 Identificación del metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico a partir de su espectro de

masas

107

GLOSARIO DE ABREVIATURAS

AcOEt

Acetato de etilo

ATCC American Type Culture Collection

CFM Concentración Fungicida Mínima

CIM Concentración Inhibitoria Mínima

CLSI

Clinical and Laboratory Standard Institute

DMSO Dimetilsulfóxido

EEP Extracto Etanólico de Propóleo

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FES Facultad de Estudios Superiores

GC-MS Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

h hora

MET Microscopia Electrónica de Transmisión

L microlitros

µg miligramos

mL mililitros

mm milímetros

MOPS

3-(N-morpholino)propanesulfonic acid

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standard

nm nanómetros

ºC Grados Celsius

UFC Unidades Formadoras de Colonias

UUnn eelleemmeennttoo ddee llaa nnaattuurraalleezzaa ssee ccoonnvviieerrttee eenn rreeccuurrssoo nnaattuurraall bbaajjoo ttrreess

ccoonnddiicciioonneess:: pprriimmeerraa,, qquuee eexxiissttaa eell eelleemmeennttoo eenn llaa nnaattuurraalleezzaa yy qquuee eell sseerr

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RESUMEN El uso de productos naturales actualmente es una alternativa válida para enfrentar

el proceso salud-enfermedad, siendo los productos apícolas y los extractos

herbales algunos de los más usados.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad antifúngica del propóleo de

la abeja Apis mellifera, que es la especie con mayor distribución a nivel mundial, y

de los extractos de algunas de las plantas que son visitadas por dichas abejas

para recolectar resinas, néctar o polen, sobre levaduras y hongos filamentosos de

importancia mèdica

Con este fin se obtuvieron once extractos, dos de ellos provenientes de propóleo

de la abeja Apis mellifera, recolectado en el apiario de la Facultad de Estudios

Superiores Cuautitlán, UNAM, y nueve de flores de tres de las plantas visitadas

por las abejas dentro de la misma Facultad. Estas fueron Ricinus communis L,

Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Callistemon citrinus Stapf.

Se emplearon ocho cepas de hongos de importancia en medicina humana y/o

veterinaria o como fitopatógenos. Estos incluyeron dos hongos levaduriformes,

Candida albicans (ATCC 10231) y Cryptococcus neoformans y seis hongos

filamentosos, Aspergillus niger, A. flavus (ATCC 204304), Fusarium moniliforme,

Fusarium sporotrichum (ATCC NRLL3299), Rhizoctonia solani y Trichophyton

mentagrophytes.

Las pruebas de sensibilidad fueron previamente estandarizadas y se desarrollaron

en primera instancia pruebas cualitativas de difusión en agar, para tener un

panorama general de la sensibilidad de los hongos a cada uno de los extractos.

Con los extractos que presentaron actividad frente a uno o más hongos, se

realizaron pruebas cuantitativas, empleando los métodos de dilución en agar y de

microdilución, determinando así su concentración inhibitoria mínima (CIM) y su

concentración fungicida mínima (CFM).

Cuatro de las seis cepas probadas resultaron sensibles al extracto de propóleo.

Entre los extractos florales, los de C. citrinus fueron los que presentaron mayor

similitud con el propóleo. Llama la atención el hecho de que los extractos

preparados a partir de flores de E. camaldulensis no presentaron actividad frente

a ninguno de los hongos probados.

Al determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración fungicida

mínima de los extractos se encontró que estas oscilan entre los 0.25 y 2.0 mg/mL

para todos los extractos frente a las dos levaduras evaluadas, mientras que en los

hongos filamentosos los valores van desde 0.25 hasta más de 3.0 mg/mL.

Se realizaron pruebas comparativas de la composición química del propóleo con

el extracto metanólico de flores de C. citrinus, empleando técnicas de

cromatografía líquida de alta resolución y de cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas, encontrando ocho compuestos comunes a ambos

extractos, los cuales fueron: eucaliptol, metil éster del ácido 3-acetoxi-3-

hidroxipropiónico, p-ment-1-en-8-ol, etil éster del ácido dodecanoico, ethanone,

(1-[4-[4-(dimetilamino) benzilienamino)fenil]-), metil éster del ácido hexadecanoico,

ácido hexadecanoico, metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico.

De la misma manera, se observaron las alteraciones morfológicas ocasionadas

por dichos extractos a las células fúngicas mediante ensayos de microscopía

óptica y electrónica, encontrando cambios en la morfología de C. albicans y de C.

neoformans, con degeneración estructural después de la exposición a los

extractos.

Los datos obtenidos confirman la relación existente entre la composición del

propóleo y la de las plantas que visitan las abejas para recolectar algunos

ingredientes para su preparación y se plantea la posibilidad de emplear dichas

productos como fuentes de principios activos para el tratamiento de las micosis.

IInnttrroodduucccciióónn

DOCINADE Amparo Londoño Orozco Estudio comparativo de la actividad antifúngica de un extracto de propóleo mexicano y de tres plantas que Apis mellifera usa para su producción

1

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Antecedentes del uso de productos naturales

La medicina tradicional ocupa un lugar importante en la realidad médica mundial.

Aproximadamente el 60% de la población recurre al uso de las plantas

medicinales. En 1976, la Organización Mundial de la Salud (OMS) incorporó la

medicina tradicional en sus programas de Salud. En 1991, en China, la OMS

declaró el 22 de octubre el "Día Mundial de la Medicina Tradicional", señalando

que la salud del género humano aún necesita la medicina tradicional, por lo que

recomienda a los estados miembros establecer medidas para su rescate,

fortalecimiento, promoción, investigación, regulación, aplicación y seguridad en su

práctica.

Del vocablo griego pharmakon, remedio y gnosis, conocimiento, la Farmacognosia

es una ciencia multidisciplinaria cuyo objetivo fundamental es el estudio de los

productos naturales con propiedades medicinales.

Las plantas medicinales son recursos naturales que aportan productos herbales

valiosos, los cuales son usados desde la antigüedad para tratar varios

padecimientos (Chandrasekaran y Venkatesalu, 2004) y algunas de éstas todavía

se incluyen como parte del tratamiento habitual de varias enfermedades, entre

ellas las provocadas por hongos (Ríos y Recio, 2005).

Desde la antigüedad hasta nuestros días los agricultores han utilizado los

productos naturales para el control de enfermedades y sus agentes patógenos. Se

han realizado preparaciones artesanales tales como: extractos acuosos de la

cebolla, del tabaco y piretro, entre otros. Además, en la actualidad existe un auge

a nivel mundial en el uso de fitosanitarios naturales debido a la gran

contaminación ambiental que existe por los residuos persistentes y tóxicos que

dejan los productos sintéticos y ya muchos de ellos han provocado el desarrollo

de resistencia de las plagas (Martín, 2003, Mareggiani, 1999).


2

Muchos compuestos naturales son capaces de inhibir el crecimiento de

microorganismos y actualmente se considera una realidad que el uso de

compuestos naturales puede tener un gran impacto en la protección de alimentos

y en el control de enfermedades humanas y vegetales (García, 2006), aunque la

mayoría de las veces existe un gran desconocimiento sobre cómo emplearlas, sus

principios tóxicos y su dosificación para lograr efectos terapéuticos (Martínez,

2003).

1.2. Propóleo

El término Propóleo, etimológicamente se deriva del griego Pro- “delante de” y

Polis “ciudad”, haciendo referencia a que se encuentra en la entrada y en el

interior de la colmena o “polis” de las abejas (Serrano, 2000). El propóleo es un

material multifuncional colectado por las abejas a partir de yemas y pecíolos de

las hojas y de sustancias activamente secretadas o exudadas por heridas de

diferentes vegetales. Lo elaboran mezclándolas en la colmena con ceras, sus

secreciones salivares y otras sustancias en proporciones variables y es usado en

la construcción y mantenimiento de sus colmenas (Badascarrasbure et al., 2006).

Es una sustancia resinosa, balsámica, gomosa, de consistencia viscosa y color

verde pardo, castaño o incluso negro, sabor acre, frecuentemente amargo y olor

agradable y dulce. Su color y composición dependen en gran medida de su origen

botánico y del tipo de abeja que lo produzca. Las muestras de propóleo presentan

diferencias químicas significativas de acuerdo a su procedencia, razón por la cual,

se ha convertido en un tema de interés para químicos y biólogos y ha resultado

recientemente ser una fuente de nuevos compuestos biológicamente activos

(Bankova et al., 2002).

Múltiples reportes indican que el propóleo es relativamente no tóxico y tiene

diversos efectos sobre bacterias, hongos, parásitos y virus, así como propiedades

antitumorales, antioxidantes, como cicatrizante y regenerador de tejidos, entre

otros. La composición química del propóleo es muy compleja y depende de varios

factores, entre ellos el tipo de vegetales de donde recolectan las abejas algunos


3

ingredientes para su preparación (Bankova et al., 2002); se han aislado más de

180 compuestos, siendo sus principales componentes resinas y bálsamos que

contienen flavonoides y ácidos fenólicos o sus ésteres (50-55%), reportándose

éstos como las principales sustancias farmacológicamente activas; contenidos

muy variables de ceras (7.5-35%) que afectarán a los correspondientes

componentes restantes; aceites volátiles (10%); polen (5%) e impurezas (4.4-

19.5%). Además contienen pequeñas cantidades de terpenos, taninos, restos de

la secreción de las glándulas salivares de las abejas y posibles contaminantes y

se ha mencionado que se requiere la combinación de diferentes compuestos para

que sea biológicamente activo (Bedascarrasbure et al., 2006, González, 2007).

Los compuestos activos son:

Flavonoides, que incluyen:

Flavonas: ramnocitrina, kaempferol, crisina, galangina (3,5,7-

trihidroxiflavona), isalpinina, tectocrisina, acacetina, apigenina,

pectolinarigenina; 5,7-dioxi-3,4-dimetoxiflavona; 3,5-dioxi-7,4-

dimetoxiflavona y 5-oxi-7,4-dimetoxiflavona.

Flavonoles: kaempferido, quercetina, butelenol, ramnacina,

isoramnetina y ermanina.

Flavononas: pinocembrina, pinostrobina, sakuranetina, 5-oxi-7,4-

dimetoxiflavonona.

Terpeno del grupo del cariofileno: beta-bisabolol y alfa-acetoxibetulenol.

Aldehídos aromáticos: vanillina, isovanillina.

Ácidos aromáticos no saturados: ácido cinámico y derivados, ácido

cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico (4-oxi-3-metoxicinámico) y ácido

isoferúlico).

Ácidos orgánicos: ácido benzoico y derivados (ácido 4-hidroxibenzoico,

ácido 4-metoxibenzoico, ácido protocatéquico y ácido gálico).

Sustancias tánicas.

Cumarinas: ácido cumarínico, esculetolo, scopoletolo.


4

Vitaminas: vitamina B1 (tiamina), vitamina PP (ácido nicotínico),

provitamina A.

Microelementos: iones calcio, potasio, sodio, magnesio, hierro, aluminio,

fósforo, silicio, vanadio, estroncio. Algunos científicos han señalado

además boro, cromo, cobalto, manganeso, níquel, selenio, zinc, molibdeno,

plata y bario.

El propóleo de la especie Apis mellifera, especie de abeja con mayor distribución

en el mundo, ha sido reconocido en países como Cuba, Brasil y Argentina, por las

propiedades biológicas que posee. Su estudio científico inició en la década de los

40’s y se ha ido intensificando en la medida en que ha podido descifrarse su

compleja composición y se han descubierto nuevos aspectos de su actividad

biológica que permiten su uso en diversas áreas como la medicina, la biología y la

industria, ya que exhibe un amplio espectro de acciones terapéuticas, destacando

la actividad antibiótica, antiviral y antiinflamatoria (Bedascarrasbure et al., 2006,

González, 2007).

Los estudios de la actividad antifúngica del propóleo han sido limitados, y en

principio fueron enfocados casi exclusivamente al género Candida, considerando

que los sesquiterpenos, especialmente el bisabolol y flavononas (pinocembrina),

son los principales compuestos responsables de esta actividad (González et al.,

2007). En los últimos años su estudio se ha ampliado a otras especies de hongos

tanto levaduriformes como filamentosos.

1.3. Micosis

La micología es una rama de microbiología que tiene por objeto estudiar a los

hongos y las enfermedades que producen, las cuales se agrupan en tres campos

de estudio: intoxicaciones, alergias y micosis (López, 2008).

Las micosis son enfermedades causadas por la invasión de los tejidos por parte

de algunos hongos. La mayoría de hongos poseen escaso poder patógeno, por lo

que todas las micosis, en principio son oportunistas y es el estado inmunológico


5

del paciente lo que determina la gravedad de la infección (López, et al., 2004 y

2009). El establecimiento de una micosis implica la capacidad del microorganismo

de crecer en las condiciones de pH, temperatura y potencial redox presentes en

los tejidos del hospedero, las cuales generalmente son poco favorables para el

crecimiento y desarrollo de los hongos. Los agentes infectantes deben poseer, por

lo tanto, ciertas características que les permitan sobrevivir en tal ambiente así

como mecanismos para evadir las defensas del hospedero (Casadevall, 1998). La

virulencia de un microorganismo depende tanto de sus características como de

factores propios del hospedero (Casadevall y Pirofski, 2001), por lo que el

establecimiento de una enfermedad infecciosa depende del estrecho equilibrio

entre ambos.

Las micosis se clasifican de acuerdo a su topografía en cuatro grupos:

superficiales, subcutáneas, sistémicas y las causadas por hongos de bajo poder

patógeno (oportunistas), estas últimas pueden ser localizadas o bien invadir

diferentes órganos y sistemas dependiendo del daño inmunológico que presente

el hospedero (López, 2008). En patología veterinaria tienen importancia las

enfermedades micóticas debido al carácter zoonótico de la mayoría de estos

procesos, a las pérdidas que provocan en animales de producción y a que pueden

afectar a especies protegidas (Pérez, 2000).

En las dos últimas décadas la frecuencia de las infecciones fúngicas ha

aumentado de manera preocupante, representando actualmente del 6-10% de las

infecciones nosocomiales, de las cuales el 80% es debido a infección por Candida

spp., seguida por la aspergilosis invasiva causada principalmente por el

Aspergillus fumigatus, considerada por algunos el mayor problema fúngico actual

(Arathoon, 2001). Entre los posibles factores implicados en los cambios

epidemiológicos de las micosis están: el aumento en el número de órganos

trasplantados, el uso de antibióticos de amplio espectro, la quimioterapia agresiva,

los tratamientos inmunosupresores para enfermedades autoinmunes,

procedimientos invasivos como el uso de catéteres intravenosos o en las vías


6

urinarias, la intubación transtraqueal, los trasplantes de órganos y desde la

década de los 80s la aparición del SIDA (Escobar., 2004). Especies de Candida

sp. y Fusarium sp., tienen la capacidad de causar micosis en pacientes

inmunodeprimidos (Amantea et al.,1995). Algunas de las especies reportadas

como responsables de infecciones micóticas oportunistas en la corteza vegetal

son Fusarium solani, F. oxisporum, F. moniliforme, F. roseum (Matos et al., 1999).

Asimismo, las dermatofitosis son infecciones fúngicas de la piel, uñas y pelo

causadas por diferentes tipos de hongos filamentosos denominados dermatofitos

que se agrupan en tres géneros: Trichophyton, Epidermophyton y Microsporum.

Desde el punto de vista epidemiológico y preventivo, los dermatofitos también

pueden agruparse en tres categorías, según sus preferencias por el hospedero y

su hábitat natural: especies antropofílicas, zoofílicas y geofílicas (Begoña, 2001).

El género Trichophyton representa uno de los principales hongos causantes de

dermatomicosis en humanos, infectando de manera característica los tejidos

queratinizados. Estas infecciones son difíciles de erradicar, particularmente en los

habitantes de los países del tercer mundo, debido a la pobreza y condiciones de

sanidad de la población (Kuiate et al., 2006).

1.4. Hongos fitopatógenos

En lo referente a la importancia agrícola, en suelos cultivados aireados, los

hongos constituyen gran parte de la masa microbiana total. La patogenicidad por

hongos es una característica que se origina en el suelo, ya que algunas especies

que normalmente son saprobias pueden invadir tejido vivo y comportarse como

agentes patógenos. Pueden ser parásitos facultativos o verdaderos y permanecer

inactivos en el suelo por períodos largos si no encuentra la planta hospedera, o

bien desaparecer por completo (Moreno, 1988; Mitchell, 1992; Edwards, 1995;

Rao, 1995). Sólo una pequeña parte de los hongos del suelo causan

enfermedades en vegetales y los que las provocan con frecuencia pertenecen a

los géneros Armillaria, Fusarium, Helminthosporium, Ophiobolus, Phytophtora,

Plasmodiophora, Rhizoctonia, Sclerotium, Verticillium, Thielaviopsis, Phytium y


7

Aspergillus. Otros son cosmopolitas y saprobios como Mucor y Penicillium, entre

otros (Sánchez, 2004).

Algunos hongos han afectado cultivos comerciales, entre los que se encuentra

Rhizoctonia solani, que es un hongo fitopatógeno muy común en el suelo y con

una gran diversidad de plantas hospederas, siendo un agente causal de

enfermedades en las raíces (Coll y Tandrón, 2005). Además, provoca

descomposición de los frutos y enfermedades del follaje, haciendo necesario el

uso de biocidas para su control, lo cual induce la resistencia en los patógenos y

promueve el uso excesivo de estos productos. Debido a lo anterior, se ocasiona

contaminación del ambiente, particularmente en el suelo y el agua, generando

gastos adicionales en la producción (Georgiev, 1988).

1.5. Micotoxicosis

Por otra parte, las micotoxinas, metabolitos tóxicos producidos por ciertas

especies de hongos fitopatógenos, han ocasionado enfermedades en animales y

humanos por el consumo de forrajes y alimentos invadidos por hongos. Cuando

son ingeridas en forma gradual y constante en pequeñas dosis, algunas de éstas

producen enfermedades graves e incluso la muerte (Agrios, 1996), otras pueden

ser neurotóxicas, hepatotóxicas, nefrotóxicas y carcinogénicas (Albright, 2001).

Los hongos que producen micotoxinas se encuentran en todo el mundo y los

alimentos pueden contaminarse cuando éstos se desarrollan en el campo, durante

la cosecha, en el almacenamiento o durante el procesamiento. Las cosechas

contaminadas frecuentemente incluyen: maíz, sorgo, cebada, trigo, centeno, arroz

y semilla de algodón. Determinadas condiciones ambientales de temperatura y

humedad favorecen el desarrollo de los hongos y por consiguiente la generación

de micotoxinas. Esto ocurre principalmente en granos, pastas de oleaginosas y en

alimentos terminados, siendo en algunos casos inevitable en la industria pecuaria

latinoamericana el tener que utilizar granos contaminados, sobre todo en el caso

de importaciones, por ser prácticamente imposible su devolución (Aguilar, 2006).


8

Los alimentos son deteriorados por hongos cuando sufren cambios inaceptables

en su apariencia, textura, olor y sabor o cuando están contaminados con niveles

potencialmente peligrosos de una o más micotoxinas. Alimentos para animales

con niveles típicamente bajos de micotoxinas son habitualmente consumidos

especialmente por el ganado productor de leche y están asociados con pérdidas

subclínicas de la producción, aumento de enfermedades y desarrollo reproductivo

reducido. En algunos casos, las concentraciones de micotoxinas en alimentos son

suficientemente altas para ser asociadas con diversos problemas, incluyendo la

muerte (Aguilar, 2006).

1.6. Estructura fúngica

De acuerdo al tipo de crecimiento, los hongos pueden presentarse como

levaduras unicelulares, las cuales pueden reproducirse por gemación, o bien

como hongos filamentosos, los cuales corresponden a hongos “pluricelulares” u

organismos multinucleados.

Algunas levaduras, bajo determinadas condiciones ambientales, pueden sufrir

cambios morfogenéticos y comenzar a crecer como un hongo filamentoso. Este

fenómeno es conocido como dimorfismo.

1.6.1. Levaduras

Las levaduras no son un grupo taxonómico natural, esto quiere decir que reúne a

especies de hongos no emparentadas (Ascomycotas y Basidiomycotas), aunque

muestran varias características básicas en su organización celular (Fig. 1).

Los principales organelos citoplasmáticos son semejantes a los de cualquier célula

eucarionte. El citoplasma puede contener cuerpos lipídicos, glicógeno, e

inclusiones cristalinas, algunas de las cuales son esteroles (principalmente

ergosterol). Además, contiene una compleja red de microtúbulos, probablemente

relacionada con el movimiento de vesículas membranosas que participan en la


9

síntesis de pared celular. La levadura se reproduce por gemación y al madurar, la

célula hija se separa de la célula madre mediante la formación de un septo. El

proceso deja una cicatriz de gemación tanto en la célula madre como en la hija

(Hermosilla, 2000, Deacon, 1988).

1.6.2. Hongos filamentosos

1.6.2.1. La Hifa

Es un filamento de pared rígida en el que fluye el protoplasma (Fig. 2). Su longitud

es variable, pero su diámetro es relativamente constante, variando de 1 a 30 μm.

El extremo terminal de la hifa se llama ápice o zona de extensión y corresponde a

la región de crecimiento más activo de la pared.

Figura 1. Esquema de una levadura en proceso de gemación. P, pared celular; Vac, vacuola; CG, cicatriz de una gemación; M, mitocondria; CL, cuerpo lipídico; AG, aparato de Golgi; RE, retículo endoplasmático; V, vesícula; CHP, corpúsculo

huso-polar; N, núcleo (Hermosilla, 2000).


10

Figura 2: Esquema de una hifa (sección apical): AG, Aparato de Golgi; ER, retículo endoplasmático; L, cuerpo lipídico; M, mitocondria; MI, microcuerpos; N, núcleos; R, ribosomas; V, vesícula citoplasmática; VA, vacuola; W, pared celular

(Hermosilla, 2000).

La hifa no siempre es un filamento continuo. En hongos superiores, ésta posee

paredes transversales, espaciadas regularmente, denominadas septos. Los septos

son visibles fácilmente en el microscopio óptico y representan un rasgo

taxonómico valioso para la identificación de los distintos grupos fúngicos. Estos

septos por lo general tienen poros que permiten el paso del citoplasma e incluso

de los núcleos entre diferentes partes de la hifa. Por lo tanto, hablando

estrictamente, las hifas no constan de células sino más bien de compartimentos.

La membrana plasmática por lo general está muy próxima a la pared celular y

firmemente adherida a ésta. Los septos se encuentran en todos los hongos

filamentosos, excepto en los Zigomycotas. En este grupo los hongos son

aseptados o bien presentan septos muy irregularmente a lo largo de la hifa y por

ello son considerados hongos cenocíticos.

La longitud del compartimento apical de una hifa varía de acuerdo a la especie. En

su extremo prácticamente no hay organelos, pero se encuentran acumuladas

muchas vesículas membranosas. La disposición de estas vesículas difiere entre

los distintos grupos de hongos. En hongos septados la agrupación apical de

vesículas se observa como un cuerpo densamente teñido al microscopio óptico,


11

llamado Spitzenkörper. Las hifas normalmente son ramificadas. Estas

ramificaciones pueden originarse casi en cualquier punto a lo largo de la hifa,

excepto en la región apical. Las ramificaciones primarias pueden formar ramas

secundarias y así sucesivamente, hasta constituir el micelio del hongo. A medida

que divergen unas de otras, las ramas le dan a la colonia fúngica su perfil circular

característico. La mayoría de las hifas son hialinas (incoloras), aunque algunas,

especialmente las de los hongos dematiáceos, pueden ser obscuras. Sin

embargo, muchos hongos presentan colonias con colores característicos debido a

la aparición de esporas reproductivas con pigmentación (Hermosilla, 2000,

Deacon, 1988).

1.6.2.2. Membrana celular

La membrana celular desempeña una importante función en la división celular y en

el metabolismo. Las complejas partículas lipídicas llamadas esterolatos,

representan aproximadamente el 25 % de sus componentes. Sin embargo, el

contenido de esterol en las células fúngica y mamífera es diferente. En los

mamíferos el colesterol es el esterol que predomina, mientras que en las células

fúngicas el esterol primario es el ergosterol y entre sus funciones están: dar fluidez

e integridad a la membrana, permitir la función apropiada de muchas enzimas

unidas a ella y, al favorecer la función de la quitina sintetasa, permitir el

crecimiento y la división celular. Esta característica ha sido explotada y se ha

convertido en el blanco de acción de la mayoría de los fármacos antifúngicos

(Tapia, 2005).

1.6.2.3. Pared celular

La pared celular de los hongos cumple varias funciones importantes. Una de ellas

es determinar la morfología celular. La forma en que se desarrolla el hongo, sea

filamentoso o levadura, junto con las distintas estructuras diferenciadas que se

puedan producir, es un resultado directo de los componentes de la pared celular y

la forma en que éstos se organizan durante el crecimiento. Además, la pared

celular es la interfase entre el hongo y su medio, protegiendo la célula de la lisis


12

osmótica y probablemente de los metabolitos de otros organismos. También sirve

como sitio de unión para algunas enzimas y presenta componentes que le

permiten al hongo adherirse a distintos sustratos del hospedero. El análisis

químico de la pared celular revela un predominio de polisacáridos, pero también

grandes cantidades de proteínas y lípidos. Los polisacáridos difieren tanto

cuantitativa como cualitativamente en los distintos grupos de hongos, por lo que

constituye otro rasgo de valor taxonómico.

La composición de la pared celular en hongos es dinámica, variando de acuerdo a

las condiciones externas o de acuerdo a las distintas fases del ciclo de vida

(Hermosilla, 2000, Deacon, 1988). La pared de todos los hongos contiene una

mezcla de compuestos fibrilares y componentes amorfos. Los principales

componentes fibrilares incluyen la quitina y la celulosa. La quitina es un polímero

lineal de N-acetilglucosamina, con enlaces β (1-4), que forman microfibrillas

cristalinas debido a las cadenas lineales y con capacidad para compactarse. Otros

componentes importantes son los glucanos (polímeros de glucosa), proteínas,

polímeros de galactosamina y polímeros de manosas (mananos). La quitina,

aunque no es el componente más abundante en la pared celular de los hongos (1-

2%), se encuentra con la suficiente frecuencia como para ser considerada el

componente característico (Fig. 3) (Hermosilla, 2000, Deacon, 1988). La pared

celular es otro sitio de acción importante para los compuestos con actividad

antifúngica (Tapia, 2005).

1.7. Antifúngicos

El concepto de agente antifúngico o antimicótico engloba cualquier sustancia

capaz de producir una alteración tal de las estructuras de una célula fúngica que

consiga inhibir su desarrollo, alterando su viabilidad o capacidad de supervivencia,

bien directa o indirectamente, lo que facilita el funcionamiento de los sistemas de

defensa del hospedero (Gregorí, 2005).


13

Figura 3: Esquema de la pared celular de una levadura. CW: pared celular;

EM, medio extracelular; PM membrana plasmática; gp, glico(mano)proteínas; β-g, β-glucanos; β-g+c, β-glucanos y quitina; ps, espacio periplásmico (Hermosilla, 2000).

El interés en el tratamiento de las infecciones por hongos se ha incrementado

notablemente y en las últimas décadas se han desarrollado diversos, aunque no

numerosos, nuevos fármacos dotados con actividad antifúngica y mayor

tolerancia, que contribuyen a mejorar el pronóstico de las micosis, particularmente

las oportunistas (Torres, 2004).

Las primeras sustancias utilizadas en el tratamiento de las infecciones fúngicas

fueron compuestos tales como el yoduro de potasio, metaloides y derivados

azufrados. Posteriormente se introdujeron los primeros antifúngicos, denominados

de primera generación, por ser derivados de productos naturales o productos de

la actividad metabólica de determinados microorganismos. Más tarde se

desarrollaron los de segunda generación, obtenidos predominantemente por

síntesis química (Escobar, 2004).


14

Los primeros antimicóticos fueron descubiertos hace aproximadamente 50 años y

desde entonces ha habido grandes avances en la terapia antifúngica. Sin

embargo, las patologías han variado durante este período, haciendo necesaria la

permanente investigación de nuevos agentes. La mayoría de las micosis

superficiales responden bien a los tratamientos actuales, pero el creciente

espectro de micosis sistémicas diseminadas ha forzado el desarrollo de nuevas

moléculas (Gregorí, 2005).

La clasificación de los antifúngicos se realiza según criterios convencionales que

atienden a los siguientes aspectos: estructura o características (polienos, azoles,

alilaminas, etc), origen (sustancias producidas por organismos vivos o derivados

de síntesis química), espectro de acción (amplio o restringido), mecanismos de

acción (fungistáticos y fungicidas), vía de administración o empleo sobre el

hospedero (oral o parenteral, tópicos o sistémicos), toxicidad y selectividad de

acción (Vargas, 2005).

1.7.1. Mecanismo de acción de los antifúngicos

La figura 4 resume las estructuras de la célula micótica sobre las cuales actúan

los diversos grupos de antifúngicos.

Figura 4: Representación esquemática de los sitios de acción de diversos grupos

de antifúngicos sobre la célula micótica (Modificado de Tapia, 2005).


15

Tabla 1. Clasificación de los antifúngicos por su estructura química y mecanismo de acción

Sitio de acción Grupo de

antifúngicos Ejemplos Mecanismo de acción

Antifúngicos interactuando en membrana celular

Polienos

Nistatina, nistatina liposomal, natamicina,

anfotericina B

Se unen de manera irreversible a los componentes de la membrana

plasmática e interactúa con el

ergosterol, pero sin inhibir su síntesis. Al unirse al ergosterol, se forman poros

que alteran la permeabilidad de la membrana lo que permite una pérdida

de proteínas, glúcidos y cationes monovalentes y divalentes, causando la

muerte celular (Gregorí, 2005; Tapia, 2005).

Azoles

Imidazoles:

miconazol, clotrimazol,

ketoconazol, econazol, bifonazol

Triazoles: fluconazol,

itraconazol

Triazoles de segunda generación:

voriconazol, ravuconazol,

posaconazol

Inhiben la biosíntesis de ergosterol en el

paso de desmetilación del lanosterol, en el carbono 14; por lo tanto, su blanco es

la lanosterol-14-alfa-desmetilasa, que es una de las especies del citocromo P-450

(P-450-3-A), localizada en el retículo

endoplasmático. La disminución del ergosterol más la acumulación de

esteroles metilados causa una alteración de la membrana celular, la que se vuelve

más permeable y vulnerable a daños. Así, se altera el transporte de nutrientes

y la síntesis de quitina, lo que puede inhibir el crecimiento (Gregorí, 2005;

Tapia, 2005).

Algunos de los azoles son menos selectivos y suelen actuar sobre

enzimas hepáticas causando hepatitis fulminantes, ya que el mecanismo

descrito compromete funciones que dependen de la membrana, en la que

puede haber otras enzimas. (Tapia, 2005).

Alilaminas

Terbinafina, naftifina

De forma similar a los azoles inhiben la síntesis del ergosterol, pero en un paso

temprano de su síntesis. Las alilaminas inhiben a la enzima escualeno

epoxidasa, de esta forma disminuye la concentración de ergosterol, aumentan

los niveles de escualeno, aumenta la

permeabilidad de la membrana celular, se interrumpe la organización celular y

disminuye el crecimiento del hongo (Gregorí, 2005).

Tanto la escualeno epoxidasa como la

lanosterol-14-alfa-desmetilasa, inhibida por los azoles, son enzimas codificadas

por una familia de genes que pueden

mutar y generar una resistencia secundaria a los antimicóticos (Tapia,

2005).


16

Sitio de acción Grupo de

antifúngicos Ejemplos Mecanismo de acción

Antifúngicos interactuando en pared celular

Lipopéptidos

Papulacandinas

Triterpenos glicosilados

Equinocandinas: caspofungina, anidulofungina,

micafungina

Son antifúngicos que actúan sobre la

pared celular, y lo hacen inhibiendo la

síntesis de glucanos a través de la inactivación de la enzima 1,3-beta-

glucano sintetasa. La falta de glucanos en la pared

celular la vuelve débil e incapaz de soportar el estrés osmótico, por lo

que muere (Gregorí, 2005). Ya que

los glucanos no se encuentran en la célula eucarionte humana, estos

compuestos son relativamente selectivos (Tapia, 2005).

Antifúngicos interactuando en núcleo celular

Pirimidinas fluoradas

(Antimetabolitos)

Flucitosina o

5-fluorocitosina

Puede entrar en el citoplasma de la

célula fúngica gracias a la enzima citosina permeasa, que no está

presente en las células de mamíferos, por eso es específica. Al entrar en la

célula, esta molécula sufre

modificaciones y es convertida en 5-fluorouracilo (5-FU) por la citosina

diaminasa. El 5-FU es fosforilado e incorporado dentro del ARN en lugar

del uracilo y así origina una fluorouridina aberrante y por lo tanto

un ARN mutante. De esta manera se ve inhibida la enzima timidilato

sintetasa, que permite el paso de

uridina a timidina, porque el ADN está constituido por timidina y no por

uracilo, afectando entonces no sólo la síntesis de proteínas, sino también la

síntesis de ADN (Gregorí, 2005; Tapia, 2005)

Agentes misceláneos

Yoduro de potasio,

ciclopirox, tolnaftato, griseofulvina

En esta clase se encuentra la griseofulvina, cuyo mecanismo de

acción consiste en inhibir la mitosis de los hongos con la producción de

células multinucleadas. Interactúa con los microtúbulos polimerizados e

interrumpe el huso mitótico necesario para efectuar la división celular. Tiene

el inconveniente de que se debe administrar por períodos muy

prolongados, de seis meses a un año.

Además, como es poco selectiva, hay que controlar su uso con hemograma.

Por estos motivos, hoy está en desuso (Tapia, 2005).

PPeerrssppeeccttiivvaa

tteeóórriiccaa


17

2. PERSPECTIVA TEÓRICA

Durante los últimos 30 años se han intensificado los estudios farmacológicos y

químicos del propóleo, demostrando que los extractos de diversas regiones

geográficas tienen diferente actividad biológica (Bankova, 2002, Kosalec, 2005), lo

cual se ha atribuido a diferencias en su composición química, y además influyen

diversos factores como son la época de recolección, el tipo de vegetación, la

especie de abeja, la temporada de recolección, el método de preparación de la

tintura y el disolvente usado para su extracción (Bankova, 2002, Kosalec, 2005,

Kujumgiev et al., 1999, Sforcin et al., 2000). Además, se sabe que se requiere la

combinación de diferentes compuestos para que sea biológicamente activo

(Bankova et al., 1995, Kujumgiev et al., 1999, Sforcin et al., 2000).

Por otra parte, las plantas medicinales se han usado desde la antigüedad para el

tratamiento de diversos padecimientos (Chandrasekaran y Venkatesalu, 2004;

Ríos y Recio, 2005). La OMS estima que entre el 60 y el 80 % de los habitantes de

nuestro planeta confían en las medicinas tradicionales para sus principales

necesidades, razón por la cual ha hecho un llamado a todos los países que la

conforman a promover su uso y establecer programas de investigación en este

campo.

Este proyecto contempló tres etapas: Primero, la evaluación antifúngica del

propóleo y extractos herbales contra cepas de hongos patógenos, segundo,

evaluar el efecto de los extractos sobre las estructuras micóticas y tercero

establecer la composición química de los extractos y determinar cuál o cuáles de

ellos se encuentran en más de un extracto.

Se evaluó la actividad antifúngica de extractos del propóleo y de las flores de tres

plantas, Callistemon citrinus Stapf, Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Ricinus

communis L, que son visitadas por las abejas para la elaboración del propóleo en

el Estado de México, y se comparó con la del propóleo producido por las abejas

en la misma zona.


18

En cuanto a las plantas empleadas, se encuentra que el C. citrinus se reporta la

mayoría de las veces con uso ornamental y existen pocos reportes de su actividad

antibacteriana (Cock, 2008, Meléndez et al 2008). En diversas ocasiones se ha

demostrado la actividad antibacteriana del E. camaldulensis (Martos et al, 2000) y

en cuanto a R. communis, tradicionalmente se ha empleado su resina, con la

debida consideración de su alta toxicidad, pero además se ha demostrado que

posee diversas actividades biológicas como bactericida, insecticida y vermífuga,

entre muchas otras (Duke and Wain, 1981).

Actividad antifúngica

La actividad antifúngica de las plantas ha sido muy estudiada y su importancia

resulta mayor ante la gran problemática de las enfermedades causadas por

hongos que son muy difíciles de tratar por factores como inmunodeficiencias de

distintas etiologías o resistencia a los antifúngicos por muchos hongos patógenos

(Amantea et al.,1995).

El propóleo muestra, en distintos grados, efectos fungicidas frente a numerosas

especies como Candida albicans, Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Ascosphaera

apis y Plasmopara vitícola (Krell, 1996). La mayor inhibición sobre hongos

patógenos se observa en Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans y

Malassezia pachydermatis (Heinze, et al., 1998) y, en el género Candida, el efecto

del propóleo depende de las especies, siendo de mayor a menor en C. albicans,

C. tropicalis, C. krusei y C. guilliermondii. (Ota et al., 2001).

En un estudio se observó que la actividad antifúngica de los extractos etanólicos

de propóleo actúan de manera similar a la griseofulvina frente a dos variedades de

Aspergillus flavus, pues ambas sustancias reducen la masa miceliar seca, la

germinación de conidios, el crecimiento y la producción de aflatoxina B1, tanto

más cuanto mayor sea su concentración (Ghaly, 1998).


19

Otros reportes indican que en mucosa oral frente a Candida albicans, el extracto

etanólico de propóleo al 20% se muestra tan efectivo como la nistatina y supera a

otros antifúngicos como clotrimazol, econazol y fluconazol que presentan

resistencias (Martins, 2002).

Desde 1988 se reportó la actividad del extracto etanólico de propóleo contra 23

cepas de levaduras aisladas de diferentes partes del cuerpo humano, encontrando

que fue fungistático a una concentración de 0,55 mg/mL (Rojas, 1988). Otros

autores reportaron que la mínima concentración fungicida del extracto etanólico de

propóleo contra 15 cepas probadas fue de 3 a 7 mg/mL siendo, C. albicans más

susceptible que otras especies como C. tropicalis, C. krusei, y C. guilliermondii

(Martins, 2002).

En un estudio previo realizado en nuestro laboratorio (Quintero, 2008), se evaluó

la actividad antifúngica de ocho extractos etanólicos de propóleo provenientes de

diferentes regiones de México frente a 36 cepas de C. albicans de origen clínico y

una de referencia (ATCC 10231) y se demostró que todos presentaron actividad

biológica contra C. albicans, aunque con variaciones en los valores de CIM, pero

dentro de los rangos reportados en otras partes del mundo, los cuales oscilan

entre 0,2 y 12 mg/ml (Palamin, 1999, Ota, 2001, Hegazi, 2001, Sawaya, 2002).

No se encontraron referencias para poder establecer una comparación con otros

estudios sobre la actividad antimicótica del propóleo mexicano fabricado por A.

mellifera con la mostrada por los extractos florales de las especies vegetales

visitadas por ellas.

En general, los estudios que relacionan compuestos florales con productos

apícolas tienen que ver con el uso del polen de Apis meliffera por los humanos,

como fuente de alimento, como adyuvante en el tratamiento de diversas

enfermedades o como suplemento nutricional.

JJuussttiiffiiccaacciióónn


20

3. JUSTIFICACIÓN Este proyecto responde a la necesidad de contar con nuevos compuestos que

presenten actividad contra hongos, ya que:

Ha habido un notable incremento en la incidencia de micosis,

especialmente en las últimas décadas.

Pocos laboratorios realizan pruebas de sensibilidad a antifúngicos

Existen pocos principios activos contra hongos y la mayoría de los que

existen presentan alta toxicidad.

Muchas cepas de hongos desarrollan resistencia a los compuestos

antifúngicos.

Una buena parte de la población recurre a la medicina tradicional y el uso

de estos productos está ampliamente documentado, sin embargo, pocas

son las especies que se han estudiado científicamente.

OObbjjeettiivvooss


21

4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GENERAL:

1. Evaluar la actividad antifúngica del propóleo de la abeja Apis mellifera y de

los extractos de plantas visitadas por las abejas, sobre levaduras y hongos

filamentosos.

4.2. OBJETIVOS PARTICULARES:

1. Obtener propóleo del apiario de la Facultad de Estudios Superiores

Cuautitlán, UNAM.

2. Evaluar la actividad biológica del propóleo frente a hongos filamentosos y

levaduriformes, empleando pruebas cualitativas y cuantitativas.

3. Determinar cuáles son las especies de plantas que son visitadas por las

abejas para recolectar resinas, néctar o polen y recolectar muestras de sus

flores.

4. Obtener los extractos de las plantas y determinar si presentan actividad

antifúngica frente a los hongos inhibidos por el propóleo.

5. Determinar mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR/HPLC,

High performance liquid chromatography,) y cromatografía de gases

acoplada a espectrometría de masas, si el propóleo contiene el (los)

mismo(s) compuesto(s) activo(s) que las especies de plantas evaluadas.

6. Determinar si hay cambios estructurales en las células fúngicas, tras la

exposición al compuesto, mediante ensayos de microscopía óptica y

electrónica.

HHiippóótteessiiss


22

5. HIPÓTESIS

Se ha determinado que el propóleo presenta metabolitos secundarios que poseen

actividad antimicrobiana; entonces, es muy probable que el propóleo colectado del

apiario de la FES Cuautitlán, al igual que los extractos de las especies vegetales

que visitan las abejas de esta región, presenten actividad sobre especies de

hongos filamentosos y levaduriformes.

MMeettooddoollooggííaa


23

CCUURRVVAASS DDEE CCRREECCIIMMIIEENNTTOO

PPRRUUEEBBAASS CCUUAALLIITTAATTIIVVAASS::

DDIIFFUUSSIIÓÓNN EENN AAGGAARR

IINNHHIIBBIICCIIÓÓNN DDEELL CCRREECCIIMMIIEENNTTOO RRAADDIIAALL

PPRRUUEEBBAASS CCUUAANNTTIITTAATTIIVVAASS::

CCIIMM,, CCBBMM,, CCFFMM

OOBBTTEENNCCIIÓÓNN DDEE MMUUEESSTTRRAASS

OOBBTTEENNCCIIÓÓNN DDEE EEXXTTRRAACCTTOOSS

PPRROOPPÓÓLLEEOO EESSPPEECCIIEESS DDEE PPLLAANNTTAASS

VVIISSIITTAADDAASS PPOORR LLAASS AABBEEJJAASS

DDEETTEERRMMIINNAACCIIÓÓNN CCOOMMPPAARRAATTIIVVAA DDEE LLAA

CCOOMMPPOOSSIICCIIÓÓNN QQUUÍÍMMIICCAA DDEELL

PPRROOPPÓÓLLEEOO YY EEXXTTRRAACCTTOOSS AACCTTIIVVOOSS

EEVVAALLUUAACCIIÓÓNN DDEE LLAA

AACCTTIIVVIIDDAADD

AANNTTIIMMIICCRROOBBIIAANNAA

CCRROOMMAATTOOGGRRAAFFÍÍAA LLÍÍQQUUIIDDAA DDEE AALLTTAA

RREESSOOLLUUCCIIÓÓNN,,

CCRROOMMAATTOOGGRRAAFFÍÍAA DDEE GGAASSEESS

AACCOOPPLLAADDOO AA EESSPPEECCTTRROOMMEETTRRÍÍAA DDEE MMAASSAASS

DDEETTEERRMMIINNAACCIIÓÓNN DDEE CCAAMMBBIIOOSS

EESSTTRRUUCCTTUURRAALLEESS EENN CCÉÉLLUULLAASS FFÚÚNNGGIICCAASS::

MMIICCRROOSSCCOOPPÍÍAA ÓÓPPTTIICCAA YY EELLEECCTTRRÓÓNNIICCAA

AANNÁÁLLIISSIISS EESSTTAADDÍÍSSTTIICCOO

6. METODOLOGÍA

6.1. Diseño experimental


24

6.2. Obtención de compuestos de origen natural

Las muestras de las especies de plantas que son visitadas por las abejas y de

propóleo empleadas en el presente estudio fueron recolectadas en las

instalaciones de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (Km 2.5 Carretera

Cuautitlán Teoloyucan, San Sebastián Xhala, Cuautitlán Izcalli, Estado de México,

CP 54700, Campus 4, Universidad Nacional Autónoma de México) (Fig. 5).

6.2.1. Extractos de propóleo

Se obtuvo propóleo de la abeja Apis mellifera, procedente del apiario de la FES

Cuautitlán (Fig. 6). La muestra de propóleo se pesó, maceró y cubrió con etanol al

96%. Se dejó en reposo y protegido de la luz durante dos semanas.

Posteriormente fue filtrado y se realizó una partición con hexanos. Se calculó el

rendimiento para cada extracto obtenido. Ambos extractos fueron almacenados en

lugar fresco y seco, protegidos de la luz (Fig. 7).

6.2.2. Extractos herbales

Colecta del material

Se colectaron flores dentro de la Facultad de tres plantas que son visitadas por las

abejas para la elaboración del propóleo y otros productos apícolas, comúnmente

conocidas como Cepillo, Eucalipto e Higuerilla. A la vez se colectaron ejemplares

para herbario, las cuales fueron prensadas y secadas para realizar la

identificación taxonómica de cada espécimen.

La identificación del material botánico fue realizada en el herbario de la FES

Iztacala y un ejemplar de cada una de ellas fue integrado a su colección

etnobotánica.


25

Ricinus communis L

Higuerilla

Callistemon citrinus Stapf

Cepillo

EEuuccaallyyppttuuss ccaammaalldduulleennssiiss

DDeehhnnhhaarrttddtt

EEuuccaalliippttoo

E. camaldulensis Dehnhartdt

Eucalipto

Obtención de los extractos herbales

Las flores colectadas se dejaron secar completamente y posteriormente fueron

pesadas, molidas y almacenadas en un lugar seco.

Para obtener los extractos al material seco y triturado se le agregaron disolventes

en orden creciente de polaridad (hexano, acetato de etilo, metanol). Los extractos

se filtraron y concentraron a sequedad por destilación a presión reducida. Se

eliminaron los restos de disolventes por aireación (Fig. 7), se calculó el

rendimiento para cada extracto obtenido y se almacenaron en lugar fresco y seco.

Fig. 5. Flora estudiada de las instalaciones de la FES Cuautitlán, UNAM: Se muestran algunos de los ejemplares herbales de donde se obtuvo el material botánico para la preparación de los extractos.


26

A

B

C

Fig. 6. Imágenes del Apiario de la FES Cuautitlán, UNAM. A: Colmenas. B y C: Personal recolectando productos de las colmenas.


27

A

B C

D E F

Fig. 7. Obtención de extractos. A: Material floral y propóleo con diferentes disolventes. B y C: Partición para la obtención de fracciones etanólica y hexánica del propóleo. D: Concentración a sequedad por destilación a presión reducida. E: Extractos florales. F: Extracto blando de propóleo.


28

6.3. Evaluación de la actividad antifúngica 6.3.1. Microorganismos utilizados:

Los microorganismos utilizados para la evaluación antimicótica fueron los

siguientes:

Levaduras: Candida albicans (ATCC 10231)1 y Cryptococcus neoformans1.

Filamentosos: Aspergillus niger2, A. flavus (ATCC 204304)1, Fusarium

moniliforme2, Fusarium sporotrichum (ATCC NRLL3299) 2, Rhizoctonia solani2 y

Trichophyton mentagrohytes2

6.3.2. Pruebas de sensibilidad cualitativas

6.3.2.1. Hongos Levaduriformes Método de difusión en agar:

Se sembraron las levaduras en Caldo Dextrosa Sabouraud (CDS, DIBICO) e

incubaron a 35ºC durante 24-48 horas. Se ajustó la densidad del inóculo de

acuerdo al tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (aprox. 1-5 x 106 UFC/mL),

(Vanden Berghe and Vlietinck, 1997, NCCLS/CLSI M44-A, Pfaller, 2004).

Medio de prueba: Agar Mueller-Hinton suplementado con 2% de glucosa y 0.5

µg/mL de azul de metileno.

Preparación de los discos:

Se emplearon discos de papel Whatman Nº 5, de 5 mm de diámetro. Se

impregnaron con 10 l de una solución de 2 mg/ 10 L de compuesto y se dejaron

secar a temperatura ambiente.

1 FES-Cuautitlán, 2 Laboratorio de Fitoquímica, UBIPRO, FES-Iztacala.


29

Realización de la prueba:

A partir del inóculo con una concentración de 1x106 levaduras/ mL., se realizó un

sembrado masivo sobre las placas de SDA. Se incubaron por 24 horas y se midió

el diámetro de los halos de inhibición. Se reincubaron las placas y se midió

nuevamente el diámetro de los halos a las 48 horas de incubación.

Nota: Como testigos positivos se emplearon discos impregnados con 0.7 µg/mL

de un antifúngico conocido (Ketoconazol, SIGMA) y como testigos negativos se

emplearon discos impregnados con cada disolvente utilizado.

6.3.2.2. Hongos Filamentosos Método de inhibición del crecimiento radial:

Método modificado de Wang y Bun, 2002: Se sembraron los hongos en placas de

Agar de Dextrosa y Papa (ADP, DIBICO) y se incubaron a 28ºC durante 7 días o

hasta que el desarrollo se apreció en toda la superficie del agar.

Se colocó en el centro de una placa Petri (100 x 15) con 20 mL de ADP un

inóculo de 5 mm de diámetro del hongo a probar. Posteriormente se colocaron

alrededor del inóculo, a una distancia de 30 mm del límite micelial, los discos

impregnados con los extractos a una concentración de 2 mg/ disco. Se incubaron

las placas a 28º C durante 72 a 96 horas, hasta que la superficie del agar estuvo

cubierta por el micelio. Se observó la formación de zonas de inhibición con

formas de medias lunas (Wang, 2002, Terán, 2006, Ávila, 2005).

6.3.3. Pruebas de sensibilidad cuantitativas Fueron realizadas a aquellos hongos que mostraron sensibilidad con las pruebas

cualitativas.


30

6.3.3.1. Hongos Levaduriformes: Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM):

Método de dilución en placa: (Modificado de Koneman et al. 2003)

Se prepararon placas Petri (60 x 15) con 6 mL de Agar Dextrosa Sabouraud

(SDA, DIBICO), adicionadas con diferentes concentraciones del extracto: 3.0, 2.5,

2.0, 1.5, 1.0, 0.75, 0.50, 0.25, 0.125 mg/mL, partiendo de una solución patrón.

Se inoculó por punteo con la suspensión de la levadura (1-5 x 106 UFC/mL), tres

veces en una placa del medio, por cada concentración de cada compuesto y se

incubó a 35ºC durante 24 a 48 horas. Se empleó como control de crecimiento un

cultivo en un medio sin compuesto. Se determinó la Concentración Inhibitoria

Mínima (CIM) para cada levadura.

Método de microdilución para levaduras (Documento NCCLS/CLSI M27-A2)

Se realizó para corroborar los resultados obtenidos mediante una prueba

estandarizada de reconocimiento internacional.

Preparación del inóculo: Se sembraron las levaduras en SDA y se realizó un pase

para estar seguros de que el cultivo era puro y viable.

Medio de prueba: El medio de cultivo empleado es el RPMI 1640 (con glutamina,

sin bicarbonato y con rojo de fenol como indicador de pH), adicionado con buffer

MOPS [3-(N-morfolino) acido propanesulfonico] a una concentración de 0.165

mol/L con un pH 7.0 +/- 0.1 a 25ºC.

Para preparar el inóculo se tomaron alrededor de 5 colonias de aproximadamente

1mm de diámetro de 24 hrs de desarrollo a 35ºC para Candida albicans, o 48 hrs

para Cryptococcus neoformans. Se suspendieron las colonias en solución salina

fisiológica (NaCl 0.85%), se mezclaron en el vórtex por 15 segundos y se ajustó la

suspensión con un espectrofotómetro, hasta tener la absorbancia correspondiente

al tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (a 625 nm la absorbancia debe de ser de

0.08 – 0.10), logrando una suspensión de 1– 5 x 106 células/mL. Posteriormente


31

se realizó una dilución 1:50, seguida por otra dilución 1:20, ambas con el medio

RPMI 1640, obteniéndose una suspensión de 1 - 5 x 103 unidades formadoras de

colonias por mililitro (UFC/mL).

Empleando placas de microdilución de 96 pozos, con fondo redondo, se añadieron

100 µL de cada dilución a los pozos rotulados con las 10 concentraciones a

probar. Se añadieron también 100 µL del inóculo a los 10 pozos y al pozo control

de crecimiento (control positivo). A éste último se adicionaron 100 µL de medio

RPMI 1640 y al pozo control de esterilidad (control negativo) se añadieron 200 µL

del mismo medio. Las placas se incubaron a 35ºC por 48 hrs. para C. albicans y

por 72 hrs. para C. neoformans.

Adicionalmente se realizó la prueba para ketoconazol como antifúngico con

actividad conocida.

Lectura de los resultados:

A las 24 horas de incubación se realizó la primera lectura visual, empleando un

espejo invertido (micro titulador). Se registraron los resultados y se reincubaron las

placas en las mismas condiciones iniciales. A las 48 horas de incubación, se

realizó la segunda lectura visual, comparando los resultados con la lectura de 24

hrs. Se agitaron los pozos utilizando palillos estériles y se observaron el pozo

control positivo (sin antifúngico) y el pozo control negativo (sin inóculo); después

de verificar que los resultados eran adecuados se procedió a la lectura

espectrofotométrica de la prueba, empleando un lector de ELISA (BIO RAD Model

680 Microplate Reader), a una longitud de onda de 490nm.

Determinación de la concentración fungicida mínima (CFM)

Después del período de incubación, se tomaron 10µL del último pozo que dio

positivo (crecimiento mínimo) y de tres siguientes de inhibición completa y se

cultivaron en SDA. Se incubaron a 35ºC de 3 a 4 días (Espinel, 2002).


32

6.3.3.2. Hongos Filamentosos: Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM):

Método de dilución en placas de 24 pozos: (Modificado de Ye et al, 1999)

Se preparó una solución patrón, igual que para levaduras y a partir de ella se

hicieron diluciones del compuesto: 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.50, 0.25 mg/mL. Se

emplearon placas de 24 pozos, adicionando a cada pozo 1 mL de medio con cada

una de las diferentes concentraciones de los extractos. Se consideraron tres

pozos para cada dilución.

Se inoculó el centro de cada pozo con un fragmento del cultivo del hongo de 1

mm. de diámetro. Se empleó como control negativo el medio sin extracto. Se

incubaron las placas a 28º C durante 24 a 72 horas y se midió el área de

crecimiento micelial, para determinar la CIM.

En base a los resultados obtenidos con las pruebas de sensibilidad antifúngica, se

seleccionaron el extracto etanólico de propóleo y el extracto metanólico de flores

de C. citrinus metanol, para realizar las pruebas adicionales.

6.4. Cinéticas de crecimiento (Cantón y Pemán, 1999)

Se realizaron curvas de crecimiento para C. albicans (ATCC 10231) y C.

neoformans con el fin de observar la dinámica de la acción antifúngica del extracto

etanólico de propóleo y del extracto metanólico de flores de C. citrinus. Para cada

curva se inocularon 4 tubos con 10 mL de CDS, los cuales contenían diferentes

concentraciones de los extractos, equivalentes a media CIM, CIM, CFM y un tubo

testigo sin extracto.

De cada tubo se realizaron dos diluciones: para la primera dilución se tomaron 50

µL y se adicionaron a tubos con 4.95 mL de una solución de cloruro de sodio al

0.85% (SSF). Después de homogenizar por agitación, se realizó a partir de ésta la

segunda dilución tomando nuevamente 50 µL y adicionándolos a tubos con 4.95

mL de SSF, homogeneizándolos por agitación.


33

Ambas diluciones fueron inoculadas en placas de SDA, depositando 100 µL sobre

la superficie del agar y dispersándolos con una varilla de vidrio, considerando éste

inóculo como el tiempo 0. Las placas fueron incubadas a 35º C y se tomaron

muestras periódicas hasta las 48 horas de incubación, siendo inoculadas en

placas de SDA, igual que en el tiempo 0. Después del período de incubación se

contaron las colonias y se hizo el cálculo de las UFC/mL, en base a la dilución

correspondiente.

6.5. Observación de cambios estructurales

Se prepararon inóculos en CDS a partir de cultivos frescos de C. albicans (ATCC

10231) y C. neoformans, empleando tres tubos para cada cepa, el primero de los

cuales se mantuvo como control sin tratamiento, al segundo se le adicionó la

concentración equivalente a la CFM del EEP para cada levadura y al tercero la

CFM del extracto metanólico de flores de C. citrinus para cada levedura. Todos

los tubos se incubaron a 35ºC durante 24 horas.

6.5.1. Microscopía de fluorescencia Se realizaron observaciones de Candida albicans (ATCC 10231) y de

Cryptococcus neoformans tratadas con los extractos y sin recibir tratamiento,

empleando un microscopio de luz con epifluorescencia, (Carl Zeiss, Axioscop 40)

teniendo acoplada una Cámara Evolution VF Cooled Color Media Cybernetics. Las

imágenes fueron analizadas usando un Software Q Capture Pro 6.0, considerando

10 observaciones por cada tipo celular.

6.5.2. Microscopía electrónica

También se obtuvieron micrografías electrónicas de transmisión de secciones

ultrafinas de ambas levaduras en un microscopio electrónico de transmisión (Carl

Zeiss, modelo 900).


34

Las células de levadura fueron prefijadas en una mezcla de paraformaldehído,

glutaraldehído, MgCl2, CaCl2, dimetilsulfóxido (DMSO) y Azul de Alcian por 3 hrs a

temperatura ambiente, de acuerdo a las recomendaciones de Shepherd, 1987 y

Jabra-Rizk, 1999 (Ver Apéndice III).

6.6. Determinación comparativa de la composición química del propóleo y

extractos activos

Para determinar si el propóleo contiene el (los) mismo(s) compuesto(s) activo(s)

que las especies de plantas evaluadas, se realizó una cromatografía líquida de

alta resolución (CLAR/HPLC) y una cromatografía de gases acoplada a

espectrometría de masas (GC-MS).


Se realizó una cromatografía líquida de alta resolución de las fracciones etanólica

y hexánica del propóleo. El equipo utilizado fue Hewlett-Packard HP, modelo 1100

series (Hewlett-Packard, Wilmington, DE, USA), equipado con un detector de

arreglo de diodos (DAD) 1100, operado con una fase móvil ChemStation AO903

metanol: acetonitrilo: agua (25: 25: 50); columna Allsphere ODS 1 (250 x 4.6 mm)

5 mm de diámetro interior; flujo 1 mL/min; detector de arreglo de diodos con

detector de ajuste en 260 nm y barridos de 200 a 700 nm.

La identificación de los componentes fue asignado en base a la comparación de

sus índices de retención con aquellos indicados en la literatura (Harbone, J. B.

1994).

6.6.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

Se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

los compuestos volátiles emitidos por la muestra del EEP, así como del extracto

metanólico de flores de C. citrinus.


35

Para el análisis se empleó un cromatógrafo de gases acoplado a un

espectrómetro de masas, marca Agilent Technologies. Cromatógrafo de gases

Modelo 6850, Espectrómetro de Masa Modelo 5975C (made in China). Columna

HP-5MS (made in USA), 30 m longitud, 0.25 mm diámetro interno, 0.25 micras

Film.

6.7. Análisis estadístico

Se realizó el análisis estadístico del efecto de los extractos sobre la estructura de

las células micóticas, mediante análisis de varianza unifactorial y bifactorial,

empleando el paquete estadístico GraphPad Prism 5 Project, Versión 5.01, 2007.

RReessuullttaaddooss


36

7. RESULTADOS Se recolectaron muestras de flores de tres plantas que son visitadas por las

abejas para la elaboración del propóleo y otros productos apícolas, las cuales

fueron identificadas en el herbario de la FES-Iztacala, donde se depositó un

ejemplar de cada una de ellas.

Los ejemplares fueron identificados como Callistemon citrinus Stapf, número de

registro IZTA 42143, Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt, número de registro

IZTA 42144 y Ricinus communis L, número de registro IZTA 42146 (Apéndice I).

En la tabla 2 se describen las características organolépticas y el rendimiento

obtenido para cada uno de los extractos.

7.1. Actividad antifúngica

Mediante la prueba de difusión en agar para levaduras (Fig. 8) se determinó que

tanto la cepa de Candida albicans (ATCC 10231) como la de Cryptococcus

neoformans son sensibles a los extractos hexánico y etanólico de propóleo y a los

extractos de flores de R. communis y de C. citrinus con acetato de etilo y con

metanol, pero no al extracto hexánico de flores de R. communis y a ninguno de

los extractos de flores de E. camaldulensis. Por otra parte, sólo el C. neoformans

presentó sensibilidad frente al extracto hexánico de C. citrinus (Tabla 3).

Se determinaron la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración

fungicida mínima (CFM) para levaduras de los extractos que presentaron actividad

en las prueba de difusión (Fig. 9, Tabla 3).


37

Tabla 2. Rendimiento de los extractos

Peso de flores (g)

Peso de extracto (g) Rendimiento

(%) Características organolépticas

Propóleo 94.05

Etanol 29.85 31.74 Color pardo,

olor característico

Hexano 13.85 14.73 Color verdoso +

ceras, olor característico

R. communis (Higuerilla)

119.30

Hexano 4.8 4.02 Color verdoso,


Acetato de Etilo

4.9 4.11 Color verde

obscuro, olor característico

Metanol 4.8 4.02 Color pardo,


E. camaldulensis

(Eucalipto) 136.74

Hexano 4.9 3.58 Color mostaza,


Acetato de Etilo

4.2 3.07 Color verdoso,


Metanol 4.9 3.59 Color pardo,


C. citrinus (Cepillo)

33.86

Hexano 4.9 14.47 Color pardo,


Acetato de Etilo

4.8 14.17 Color verde olivo, olor

característico

Metanol 4.9 14.47 Color rojizo,



38

Mediante la prueba de dilución en placa se encontró para C. albicans una CIM de

0.25 mg/mL y una CFM de 0.5 mg/mL con los extractos hexánico y etanólico de

propóleo; con los extractos de acetato de etilo y metanol de flores de R.

communis, se obtuvieron CIM de 0.75 y 1.5 mg/mL y CFM de 1.0 y 2.0 mg/mL

respectivamente; en el caso de los extractos de acetato de etilo y metanol de

flores de C. citrinus se obtuvieron CIM de 0.25 y 0.5 mg/mL y CFM de 0.5 y 0.75

mg/mL respectivamente.

Para C. neoformans se obtuvieron CIMs de 1.5 y 0.5 mg/mL y CFMs de 2.0 y 0.75

mg/mL con los extractos hexánico y etanólico de propóleo respectivamente; con

los extractos de acetato de etilo y metanol de flores de R. communis, se

obtuvieron CIM de 1.0 mg/mL y CFM de 1.5 mg/mL; el extracto hexánico de flores

de C. citrinus presentó una CIM de 1.5 mg/mL y una CFM de 2.0 mg/mL, mientras

que los extractos obtenidos con acetato de etilo y metanol presentaron CIMs de

0.75 y 0.25 mg/mL y CFMs de 1.0 y 0.25 mg/mL, respectivamente.


39

2.5 mg/ml 3.0 mg/ml 2.0 mg/ml

1.5 mg/ml 1.0 mg/ml 0.75 mg/ml

0.50 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125 mg/ml

Fig. 8. Prueba de difusión en agar para levaduras. Uso de agar Müeller Hinton suplementado con 2% de glucosa y 0.5 µg/mL de azul de metileno como medio de prueba (NCCLS/CLSI M44-A). Se observa la inhibición producida por la fracción etanólica del propóleo frente a C. neoformans.

Fig. 9. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para levaduras. Se observa la reducción del crecimiento de C. neoformans con el incremento en la concentración del extracto metanólico de flores de R. communis.


40

Tabla 3. Actividad antifúngica de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos levaduriformes. Se presentan los resultados de la

prueba de difusión en agar (halos de inhibición) y de la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración fungicida mínima (CFM) para los extractos que presentaron actividad antifúngica.

Extracto

Candida albicans Cryptococcus

neoformans

Halos de inhibición

(mm)

CIM (mg/mL)

CFM (mg/mL)

Halos de inhibición

(mm)

CIM (mg/mL)

CFM (mg/mL)

Propóleo Hexano 10.0 0.25 0.5 15.6 1.5 2.0

Etanol 12.0 0.25 0.5 17.6 0.5 0.75

R. communis

Hexano n.a na

Ac de Et 19.6 0.75 1.0 26.0 1.0 1.5

Metanol 21.0 1.5 2.0 27.6 1.0 1.5

E. camaldulen-sis

Hexano n.a na

Ac de Et n.a na

Metanol n.a na

C. citrinus

Hexano n.a 14.0 1.5 2.0

Ac de Et 17.3 0.25 0.5 23.0 0.75 1.0

Metanol 17.3 0.5 0.75 25.6 0.25 0.25

na: no presentó actividad


41

La lectura de la prueba de microdilución se realizó de manera visual a las 24 hrs y

de manera visual y espectrofotométrica a las 48 para las levaduras C. albicans

ATCC 10231 y C. neoformans, habiendo probado 10 concentraciones entre 0.05 y

0.9 mg/mL de los extractos etanólico de propóleo y metanólico de C. citrinus,

determinando la CIM y posteriormente la CFM (Fig. 10, Tablas 4 y 5).

Simultáneamente se realizó la prueba de microdilución con ketoconazol, como

control de la prueba y de las cepas. Se obtuvieron valores de 0.031 µg/mL tanto

para C. albicans como para C. neoformans y en base a los criterios de

susceptibilidad de las levaduras frente a ketoconazol, se considera susceptible

cuando su CIM es menor a 0.125 µg/Ml (Tabla 6) (Silva, 2002).

Se encontró una alta similitud entre los resultados obtenidos a través de las

pruebas de dilución en placa y de microdilución, ya que C. albicans con extracto

etanólico de propóleo presentó en la prueba de dilución en placa una CIM de 0.25

mg/mL y en la de microdilución de 0.2 mg/mL. Con extracto metanólico de C.

citrinus presentó en la prueba de dilución en placa una CIM de 0.5 mg/mL y en la

de microdilución de 0.1 mg/mL.

C. neoformans tuvo un comportamiento similar, presentando CIM para el extracto

etanólico de propóleo de 0.5 mg/mL en la prueba de dilución en placa y de 0.2

mg/mL en la de microdilución, mientras que para el extracto metanólico de C.

citrinus se encontró una CIM de 0.25 mg/mL con la prueba de dilución en placa y

de 0.1 con la de microdilución (Tabla 7).


42

Fig. 10. Prueba de microdilución para levaduras: desarrollada en placa de 96

pozos, de acuerdo al documento NCCLS/CLSI M27-A2. Incubación de 48 hrs. para C. albicans y de 72 hrs. para C. neoformans.


43

Tabla 4. Lectura visual de la prueba de microdilución de Candida albicans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación.

Control

(+) 0.05

mg/mL 0.1

mg/mL 0.2

mg/mL 0.3

mg/mL 0.4

mg/mL 0.5

mg/mL 0.6

mg/mL 0.7

mg/mL 0.8

mg/mL 0.9

mg/mL

Control (-)

CIM mg/mL

CIM 490 nm

C. albicans - Propóleo

+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2

C. albicans - Propóleo

+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2

C. albicans – C. citrinus

+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1

C. albicans – C. citrinus

+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1

(+++): Crecimiento igual al control +; ( ++) Reducción de crecimiento comparado con el control +; (-) Sin crecimiento

CIM: concentración inhibitoria mínima


44

Tabla 5. Lectura visual de la prueba de microdilución de Cryptococcus neoformans frente a extractos de propóleo y C. citrinus a las 48hrs de incubación.

(+++): Crecimiento igual al control +; ( ++) Reducción de crecimiento comparado con el control +; (-) Sin crecimiento

CIM: concentración inhibitoria mínima

Control

(+) 0.05

mg/mL 0.1

mg/mL 0.2

mg/mL 0.3

mg/mL 0.4

mg/mL 0.5

mg/mL 0.6

mg/mL 0.7

mg/mL 0.8

mg/mL 0.9

mg/mL Control

(-) CIM

mg/mL CIM

490 nm

C. neoformans – Propóleo

+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2

C. neoformans – Propóleo

+++ +++ ++ - - - - - - - - - 0.2 0.2

C. neoformans – C. citrinus

+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1

C. neoformans – C. citrinus

+++ +++ - - - - - - - - - - 0.1 0.1


45

Tabla 6. Lectura espectrofotométrica a 490 nm de la prueba de microdilución para ketoconazol, propóleo y C. citrinus después de 48 hrs de incubación.

16

µg/ml

8

µg/ml

4

µg/ml

2

µg/ml

1

µg/ml

0.5

µg/ml

0.25

µg/ml

0.125

µg/ml

0.062

µg/ml

0.031

µg/ml C+ C- CMI50

C. albicans -

Ketoconazol 0.249 0.263 0.268 0.271 0.261 0.285 0.320 0.353 0.357 0.421 0.912 0.291

0.031

µg/ml

C. neoformans -

Ketoconazol 0.240 0.236 0.239 0.241 0.242 0.242 0.245 0.254 0.272 0.376 0.621 0.267

0.031

µg/ml

0.9

mg/ml

0.8

mg/ml

0.7

mg/ml

0.6

mg/ml

0.5

mg/ml

0.4

mg/ml

0.3

mg/ml

0.2

mg/ml

0.1

mg/ml

0.05

mg/ml

C. albicans -

Propóleo 0.280 0.263 0.289 0.422 0.428 0.469 0.512 0.703 0.907 0.929 0.883 0.286

0.2

mg/ml

C. albicans –

C. citrinus 0.341 0.351 0.344 0.420 0.463 0.486 0.504 0.511 0.520 0.538 0.964 0.255

0.1

mg/ml

C. neoformans -

Propóleo 0.204 0.207 0.228 0.240 0.242 0.275 0.282 0.298 0.341 0.491 0.504 0.216

0.2

mg/ml

C. neoformans –

C. citrinus 0.297 0.275 0.293 0.307 0.312 0.319 0.321 0.332 0.334 0.460 0.575 0.289

0.1

mg/ml


46

Tabla 7. Comparación de los resultados obtenidos para la Concentración inhibitoria mínima (CMI) en mg/mL y Concentración fungicida mínima (CFM) en mg/mL obtenidas para el extracto etanólico de propóleo y el extracto metanólico de C. citrinus, con cepas de Candida albicans y Cryptococcus neoformans, mediante las pruebas de microdilución y dilución en placa.

ORGANISMO

PROPÓLEO-ETANOL C. citrinus-METANOL MICRODILUCIÓN

CIM (PLACA)

MICRODILUCIÓN

CIM (PLACA) CIM (visual)

CIM50 (490nm)

CIM (visual)

CIM50 (490nm)

Candida albicans 0.2 0.2 0.25 0.1 0.1 0.5

Cryptococcus neoformans 0.2 0.2 0.5 0.1 0.1 0.25

Con la prueba de inhibición del crecimiento radial para hongos filamentosos se

encontró que fue inhibido el desarrollo de Fusarium moniliforme por el extracto

metanólico de flores de R. communis, la cepa de Rhizoctonia solani fue inhibida

por los extractos hexánico y etanólico de propóleo (Fig. 11), por el extracto

hexánico de flores de R. communis y por los extractos hexánico, etanólico y de

acetato de etilo de flores de C. citrinus, mientras que la cepa de Trichophyton

mentagrophytes fue inhibida únicamente por las dos fracciones del extracto de

propóleo y por el extracto metanólico de C. citrinus (Tabla 8).

Tabla 8. Prueba de inhibición del crecimiento radial de los extractos de las especies vegetales y del propóleo sobre hongos filamentosos.

EXTRACTO

HONGO

An A.fl Fm Fs Rs Tm

Propóleo Hexano - - - - + +

Etanol - - - - + +

R. communis

Hexano - - - - + -

Ac de Et - - - - - -

Metanol - - + - - -

E. camaldulensis

Hexano - - - - - -

Ac de Et - - - - - -

Metanol - - - - - -

C. citrinus

Hexano - - - - + -

Ac de Et - - - - + -

Metanol - - - - + +

An: Aspergillus niger; Afl: Aspergillus flavus; Fm: Fusarium moniliforme; Fs: Fusarium sporotrichum; Rs: Rhizoctonia solani; Tm: Trichophyton mentagrophytes. + : Activo; - : No activo


48

A B

Fig. 11. Prueba de inhibición del crecimiento radial para hongos filamentosos. Cultivo de Rhizoctonia solani en agar dextrosa papa; A: se

aprecian las zonas de inhibición del crecimiento en forma de medias lunas causadas por los extractos hexánico (A) y etanólico (B) de propóleo. B: Ausencia de inhibición en presencia de extracto metanólico de flores de R. communis. (Método modificado de Wang y Bun, 2002).

Fig. 12. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima para hongos filamentosos. Empleo de placa de 24 pozos, con tres repeticiones por cada dilución. Sólo se aprecia crecimiento en los tres pozos de control sin extracto para T. mentagrophytes en presencia de extracto hexánico de propóleo.


49

En las tablas 9 a 11 se presentan los resultados obtenidos para la determinación

de la Concentración Inhibitoria Mínima en placa de 24 pozos, para los hongos

filamentosos que resultaron sensibles en la prueba de inhibición del crecimiento

radial (Fig. 12).

Con R. solani se encontró una CIM de 1.0 mg/mL para las fracciones hexánica y

etanólica de propóleo, mientras que para el extracto hexánico de flores de R.

communis y los tres extractos de flores de C. citrinus, se observó reducción de

crecimiento, pero se considera que las CIM son mayores a 3.0 mg/mL que fue la

máxima concentración probada, ya que no se alcanzó la inhibición completa del

crecimiento (Tabla 9).

Tabla 9. Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Rhizoctonia solani: Diámetro promedio de la colonia en mm.

Extracto mg/mL

Propóleo Hexano

Propóleo Etanol

R.

communis Hexano

C.

citrinus Hexano

C.

citrinus Ac de

Et

C.

citrinus Metanol

Control 15 15 15 15 15 15

0.25 5 5 11 14 14 15

0.5 3 5 10.66 12.66 12 14

1 0 0 10 10.66 10 10.33

1.5 0 0 10 8 7.66 9

2 0 0 9 7.33 7 7.66

2.5 0 0 8.66 7.66 5.66 7

3 0 0 8 6 5 5.66


50

De la misma manera, la CIM del extracto hexánico de flores de R. communis

frente a F. moniliforme se considera mayor a 3.0 mg/mL por presentar reducción,

pero no inhibición total del crecimiento (Tabla 10), mientras que para T.

mentagrophytes se encontró una CIM de 0.25 mg/mL para las fracciones hexánica

y etanólica de propóleo y de 1.5 mg/mL para el extracto metanólico de flores de C.

citrinus (Tabla 11).

Tabla 10. CIM del extracto metanólico de flores de R. communis frente a Fusarium moniliforme: Diámetro promedio de la colonia en mm.

Extracto (mg/mL)

R. communis Metanol

Control 15

0.25 15

0.5 14.66

1 14

1.5 13

2 11.66

2.5 10.66

3 10

Tabla 11. Determinación de la CIM de diferentes extractos frente a Trichophyton mentagrophytes: Diámetro promedio de la colonia en mm.

Extracto (mg/mL)

Propóleo Hexano

Propóleo Etanol

C. citrinus Metanol

Control 13.66 12.66 12.66

0.25 0 0 10.33

0.5 0 0 8.66

1 0 0 2.66

1.5 0 0 0

2 0 0 0

2.5 0 0 0

3 0 0 0


51

Se probaron once extractos frente a dos levaduras y seis hongos filamentosos . En

la Tabla 12 se resume el número total de hongos que fueron inhibidos por cada

extracto.

Tabla 12. Número total de hongos inhibidos por cada extracto.

EXTRACTO

NÚMERO DE HONGOS INHIBIDOS

LEVADURAS FILAMENTOSOS TOTAL

Propóleo – Hexano 2/2 2/6 4/8

Propóleo - Etanol 2/2 2/6 4/8

R. communis Hexano 0/2 1/6 1/8

R. communis – Ac de Et 2/2 0/6 2/8

R. communis - Metanol 2/2 1/6 3/8

E. camaldulensis - Hexano 0/2 0/6 0/8

E. camaldulensis – Ac de Et 0/2 0/6 0/8

E. camaldulensis - Metanol 0/2 0/6 0/8

C. citrinus - Hexano 1/2 1/6 2/8

C. citrinus – Ac de Et 2/2 1/6 3/8

C. citrinus – Metanol 2/2 2/6 4/8


52


Se realizó el recuento de colonias de las placas, expresándolos en UFC/mL

(unidades formadoras de colonias por mililitro). La representación gráfica de las

curvas de letalidad a distintas concentraciones de los extractos se presenta en las

siguientes figuras:

Se observa inhibición en el crecimiento de C. albicans desde el inicio de la curva

en presencia de diferentes concentraciones de extracto etanólico de propóleo

(media MIC, MIC, CFM), comparado con el testigo sin extracto (Fig. 13).

Fig. 13. Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin extracto etanólico

de propóleo. Se observa inhibición en el crecimiento desde el inicio de la curva en presencia de diferentes concentraciones del extracto (media MIC, MIC, CFM), comparado con el testigo sin extracto.

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

UFC

/mL

C. albicans - PROPÓLEO

Testigo

1/2 MIC

MIC

CFM


53

De manera similar, C. neoformans presenta una rápida reducción en su

crecimiento en presencia de diferentes concentraciones del extracto (media MIC,

MIC, CFM), comparado con el testigo sin extracto (Fig. 14).

Fig. 14. Cinética de crecimiento de C. neoformans con y sin extracto etanólico de propóleo. Se observa una rápida reducción del crecimiento en presencia de diferentes concentraciones del extracto (media MIC, MIC, CFM),

comparado con el testigo sin extracto.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

UFC

/mL

C. neoformans - PROPÓLEO

Testigo

1/2 MIC

MIC

CFM


54

En la cinética de crecimiento de C. albicans con extracto metanólico de flores de

C. citrinus, no se presenta ddurante las primeras horas una inhibición aparente,

pero a partir del tiempo 4 (12 hrs de incubación) se observa reducción en el

crecimiento frente a la CFM y a partir del tiempo 6 (27 hrs de incubación) frente a

la media CIM y la CIM, en relación al desarrollo del testigo sin extracto (Fig. 15).

Fig. 15. Cinética de crecimiento de C. albicans con y sin extracto metanólico

de flores de C. citrinus. Durante las primeras horas no hay una inhibición aparente, pero a partir del tiempo 4 (12 hrs de incubación) se observa reducción en el crecimiento frente a la CFM y a partir del tiempo 6 (27 hrs de incubación)

frente a la media CIM y la CIM, en relación al desarrollo del testigo sin extracto.

0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

UFC

/m

L

C. albicans - C. citrinus

Testigo

1/2 MIC

MIC

CFM


55

En el caso de C. neoformans con extracto metanólico de flores de C. citrinus, se

observa reducción en el crecimiento frente a la CIM y la CFM a partir del tiempo 3

(9 hrs de incubación) y frente a la media CIM a partir del tiempo 7 (30 hrs de

incubación), comparado con el desarrollo del testigo sin extracto (Fig. 16)

Fig. 16. Cinética de crecimiento de C. neoformans con y sin extracto

metanólico de flores de C. citrinus. Se observa reducción en el crecimiento frente a la CIM y la CFM a partir del tiempo 3 (9 hrs de incubación) y frente a la media CIM a partir del tiempo 7 (30 hrs de incubación), comparado con el

desarrollo del testigo sin extracto.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

UFC

/mL

C. neoformans - C. citrinus

Testigo

1/2 MIC

MIC

CFM


56

7.3. Cambios estructurales 7.3.1. Microscopía óptica

Mediante el empleo de un microscopio de luz con campo claro y con

epifluorescencia se observaron alteraciones en la estructura celular al estar en

presencia de los extractos.

Hubo ausencia de formación de tubo germinativo por la exposición al EEP o al

extracto metanólico de flores de C. citrinus (Fig. 17 B, 18 D y E).

Se observa la deformación de algunas levaduras de C. albicans en presencia de

0.25 mg/mL de EEP (Fig. 18 D), así como alargamiento celular tras el contacto

con 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus (Fig. 18 F).

En el caso de C. neoformans, no se aprecia alteración aparente en la estructura

de las células incubadas en presencia de 0.5 mg/mL EEP, pero se observa

alargamiento de las células tras el contacto con 0.25 mg/mL de extracto

metanólico de flores de C. citrinus (Fig. 19 B y C).


57

A

B Fig. 17. A: Formación de tubo germinativo por C. albicans ATCC 10231, después de 3 hrs de incubación a 35°C en suero fetal bovino (flecha). B: Inhibición de la formación de tubo germinativo en presencia de 0.25 mg/mL de EEP, bajo las mismas condiciones de crecimiento que en A (campo claro, 100X).


58

Fig. 18. Tinción de C. albicans ATCC 10231 con Blanco de Calcoflúor, (tinción fluorescente, 100X). A y B: Se aprecia la tinción fluorescente de la pared celular de las levaduras (flechas), C: Se aprecia la formación de tubo germinativo después de incubación en suero fetal bovino a 35°C durante 3 hrs (flecha). D: Inhibición de la formación del tubo germinativo en presencia de 0.25 mg/mL de EEP. Se observa la deformación de algunas levaduras (flechas). E: Inhibición de la formación del tubo germinativo en presencia de 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus. F: Alargamiento de las células de C. albicans tras el contacto con 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus (flechas).


59

A B

C D

E

Fig. 19. Tinción de levaduras de C. neoformans con Blanco de Calcoflúor (100X). A: Células no tratadas. B: No se aprecia alteración significativa en la estructura de las células incubadas en presencia de 0.5 mg/mL EEP. C, D y E: Alargamiento de las células de C. neoformans tras el contacto con 0.25 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus.


60

Al realizar el análisis de varianza unifactorial, se encontró que el efecto del extracto

etanólico de propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C.

albicans ATCC 10231 y de C. neoformans no es significativo (P= 0.2067 y 0.4184

respectivamente) (Fig. 20 y 22), pero su efecto sobre la capacidad de C. albicans para

formar el tubo germinativo es sí lo es (P= <0.0001) (Fig. 21).

Con el análisis de varianza bifactorial, se asume que la levadura tiene el mismo efecto en

todos los niveles de tratamiento. Representa el 33% del total de la varianza. El efecto es

considerado significativo (P=0.0009). El tratamiento no tiene ningún efecto general y

representa el 7.03% del total de la varianza. El efecto es considerado no significativo

(P=0.7984) (Fig. 23).

Fig. 20. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans ATCC 10231. No hubo variación significativa en el diámetro de las levaduras por la exposición a los extractos (P= 0.2067). A: Diámetro de las levaduras sin ningún tratamiento. B: Efecto del EEP sobre las levaduras. C: Efecto del extracto metanólico de flores de C. citrinus sobre las levaduras.

Ca (+) Ca-PE Ca-CM

0

2

4

6

Diá

me

tro

de

la

s c

élu

las

(

m)

A B C


61

Fig. 21. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre la longitud del tubo germinativo de C. albicans ATCC 10231. Hubo ausencia de formación de tubo germinativo en presencia de ambos extractos. Efecto significativo (P= <0.0001). A: Longitud del tubo germinativo formado por las levaduras no tratadas. B: Inhibición de la formación de tubo germinativo en presencia de EEP. C: Inhibición de la formación de tubo germinativo en presencia de extracto de flores de C. citrinus.

Fig. 22. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. neoformans. No hubo variación significativa en el diámetro de las levaduras tras la exposición a los extractos (P= 0.4184). A: Diámetro de

Ca (+) Ca- P Ca- Cc0

10

20

30

Lo

ng

itu

d d

el T

ub

o g

erm

inati

vo

(

m)

A B C

Cn (+) Cn-P Cn-Cc0

2

4

6

8

10

Diá

me

tro

de

la

cé

lula

s (

m)

A B C


62

las levaduras sin ningún tratamiento. B: Efecto del EEP sobre las levaduras. C: Efecto del extracto de flores de C. citrinus sobre las levaduras.

A B C D E F

0

2

4

6

8

10D

iám

etr

o d

e l

as

cé

lula

s (

m)

Fig. 23. Efecto del extracto etanólico de Propóleo y del extracto metanólico de C. citrinus sobre el diámetro de C. albicans y de C. neoformans. Es significativo el efecto de la levadura (P=0.0009), pero no el del tratamiento (P=0.7984).A: C. albicans ATCC 10231 sin ningún tratamiento. B: C. albicans ATCC 10231 tratada con EEP. C: C. albicans ATCC 10231 tratada con extracto de flores de C. citrinus. D: C. neoformans sin ningún tratamiento. E: C. neoformans tratada con EEP. F: C. neoformans tratada con extracto de flores de C. citrinus.


63

7.3.2. Microscopia electrónica de transmisión (MET) Se observaron micrografías electrónicas de transmisión de secciones ultrafinas de

Candida albicans ATCC 10231 y de C. neoformans.

Las figuras 24 a 26 presentan las micrografías electrónicas de C. albicans ATCC

10231 sin tratamiento. En ellas puede observarse a 12000 aumentos, la estructura

normal de la levadura, incluyendo núcleo, mitocondrias, retículo endoplásmico,

vesículas, gotas de lípidos, gránulos de almacenamiento y su cubierta con

membrana citoplasmática y pared celular.

En las figuras 27 a 32 se presentan las micrografías electrónicas de Candida

albicans ATCC 10231 incubada 24 hrs con extracto EEP. En estas se encuentra

tanto células viables como degeneradas.

Los hallazgos ultraestructurales a 4400, 7000 y 12000 aumentos revelan diversas

alteraciones entre las que se cuentan la presencia de vacuolización, ruptura de la

cubierta celular con liberación de material intracelular e incremento en la

formación de gránulos de almacenamiento. También es visible la alteración en las

estructuras de la cubierta externa de la levadura.

En el interior de las levaduras pueden verse estructuras normales como

ribosomas, vesículas y retículo endoplásmico, así como puntos de fusión entre la

pared celular y la cápsula externa.

Las figuras 33 a 38 muestran las micrografías electrónicas a 4400, 7000 y 12000

aumentos de C. albicans ATCC 10231 incubada 24 hrs con extracto metanólico de

flores de Callistemon citrinus.

De manera característica se observa la inducción por parte del extracto, del

alargamiento de las células de C. albicans, lo cual había sido previamente

observado por microscopía de luz. Algunas de estas células alargadas parecen


64

ser producto de la formación de tubos germinativos, sin embargo otras de ellas se

aprecian como simples formas alargadas.

En una célula se observaron dos partículas hiperdensas semejantes a las

estructuras intravesiculares descritas como pigmentos por Rodrigues para C.

neoformans (Rodrigues, 2008).

En las figuras 39 a 42 se encuentran las micrografías electrónicas obtenidas de

Cryptococcus neoformans sin tratamiento. Al igual que para C. albicans, en ellas

puede observarse a 12000 aumentos, la estructura normal de la levadura. Puede

observarse la formación de vesículas, lo cual es una observación frecuente para

C. neoformans (Rodrigues, 2008).

Las micrografías electrónicas de células de C. neoformans incubadas 24 hrs con

EEP se presentan el las figuras 43 a 48. En ellas se observan tanto células

normales como degeneradas. Entre las alteraciones encontradas están la

contracción del contenido intracelular y destrucción de organelos subcelulares,

observado como una marcada separación entre este y su cubierta externa y la

ruptura de la cubierta celular con la consecuente salida de los componentes

internos.

Las figuras 49 a 51 presentan las micrografías electrónicas de Cryptococcus

neoformans incubada 24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon

citrinus, en las cuales se aprecian vesículas dentro y fuera de vacuolas, además

de material amorfo y granular intracelular. En la pared celular pueden observarse

regiones menos electrodensas que corresponden a alteraciones en su integridad

(Anderson, 1990).


65

7.3.2.1. Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC 10231 sin

tratamiento

Fig. 24. Se aprecia material granular heterogéneo (MGH), en cuyo interior se observan mitocondrias (M), vesículas (V) y una gran gota de lípido (L), rodeados por la pared celular (P) (12000x).

Fig. 25. Célula de levadura mostrando el

núcleo (N) rodeado de material granular heterogéneo (MGH) (12000x).


66

Fig. 26. Se aprecia una gran gota de lípido (L), una estructura no identificada (flecha) en el interior de un gránulo de almacenamiento (G), mitocondrias (M, posible retículo endoplásmico (RE), membrana citoplasmática (MC) y pared celular (PC) (12000x).


67

7.3.2.2. Micrografías electrónicas de Candida albicans ATCC 10231

incubadas 24 hrs con extracto etanólico de propóleo

Fig. 27. Se observa una gran vacuola (V) con dos gránulos de almacenamiento (G) en su interior. Las flechas señalan sitios de ruptura de la cubierta celular. En uno de ellos se aprecia el inicio de la liberación de material granular electrodenso homogéneo (MEH) presente en el interior de la levadura (12000x).

Fig. 28. Todas las células presentan gránulos de almacenamiento (G) (7000x).

G

G

G

G


68

Fig. 29. Se aprecian células de diferentes edades que pueden distinguirse por el grosor de su pared celular. Se observa vacuolización (V) y presencia de gránulos de almacenamiento (G) (4400x). Ver ampliación de la célula en el recuadro en la siguiente imagen.

Fig. 30. Se aprecia alteración en las estructuras externas de la levadura. En su interior pueden verse una vacuola (V), ribosomas (R) y retículo endoplásmico (RE) (12000x).

R V

RE


69

Fig. 31. Posible sitio de salida de una vesícula de secreción (flecha) (20000x).

Fig. 32. Se aprecia vacuolización del citoplasma. Una de las vacuolas (V) contiene una vesícula fusionada (flecha) y otra presenta un gránulo de almacenamiento (G). Se observan también otras vesículas (Ve) y ribosomas (R), así como puntos de fusión entre la pared celular y la cápsula externa (flecha blanca) (12000x).


70

7.3.2.3. Micrografías electrónicas de C. albicans ATCC 10231 incubadas 24

hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus.

Fig. 33. Célula con dos partículas hiperdensas semejantes a

pigmentos (20000x).

Fig. 34. Se observan diferentes formas celulares. Al centro una

forma filamentosa (7000x).


71

Fig. 35. Detalle de una forma filamentosa. Se aprecia un

septo transversal (20000x).

Fig. 36. Diferentes formas

celulares alteradas (4400x).


72

Fig. 37. Se aprecia una levadura normal (N), otra en gemación (G) y una célula alargada

(A) posiblemente desprendida por filamentación de una levadura (7000x)

Fig. 38. Formación de tubo germinativo (TG) por una célula dañada (7000x).

A

N G

TG


73

7.3.2.4. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans sin

tratamiento

Fig. 39. Célula viable, presenta su cubierta externa íntegra (12000x).

Fig. 40. Se aprecia material amorfo (A) y granular (G) en el interior de una célula en gemación. Se aprecia una vesícula secretada (V) (12000 x).

A

G

V


74

Fig. 41. Pueden observarse vesículas (V) y un gran gránulo de almacenamiento (G) (20000x)

Fig. 42. Se aprecian vacuolas (V), vesículas (Ve) y material granular heterogéneo (MGH) (12000x)

G

V

MGH

V

V

Ve


75

7.3.2.5. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas

24 hrs con extracto etanólico de propóleo.

Fig. 43. Se observan células normales y degeneradas (recuadro). Ver ampliación de la célula en el recuadro en la siguiente imagen (7000x).

Fig. 44. Levadura con ruptura de la cubierta celular (20000x).


76

Fig. 45. Se aprecia material granular electrodenso homogéneo, saliendo de una célula degenerada (50000x).

Fig. 46. Células alteradas

mostrando contracción del contenido intracelular (7000x).


77

Fig. 47. Ruptura de la cubierta celular antes del proceso de gemación (20000x).

Fig. 48. Células degeneradas por efecto del extracto con destrucción de organelos subcelulares (7000x).


78

7.3.2.6. Micrografías electrónicas de Cryptococcus neoformans incubadas

24 hrs con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus.

Fig. 49. Regiones menos electrodensas (flecha)

corresponden a alteraciones en la integridad de la pared celular. Se observan ribosomas

(20000x).

Fig. 50. Se aprecia una gran vacuola (V) conteniendo material difuso no identificado

(7000x).

V

R

V


79

Fig. 51. Célula degenerada con material amorfo (MA), material granular heterogéneo (MGH) y estructuras membranosas mal definidas. Además hay vesículas (Ve) dentro y fuera de vacuolas (V) (12000x).

MA

MGH

V

Ve


80

7.4. Composición química


De acuerdo a la comparación de sus índices de retención con los indicados en la

literatura, los compuestos asignados fueron: 1 isoflavona, 5 flavonas, 1

quercetina, 6 derivados del ácido cinámico y 1 derivado del ácido caféico (Tabla

13).

Tabla 13. Constituyentes de las fracciones del propóleo determinados por Cromatografía Líquida de Alta Resolución.

Fracción Tiempo de

Retención (min) Max. (nm)

Asignación de Compuestos

Propóleo-Etanol 3.5 236, 260,294 Isoflavona

4.1 238, 276, 324 Flavona

4.6 250,322 Quercetina

4.8 242, 296 324 Flavona

5.9 236, 288 Flavona

9.7 236, 293 328 Flavona

11.9

238, 292 328 Flavona

14.1 282 Derivado del ácido cinámico

16.1 236, 290 Derivado del ácido cinámico


Propóleo-Hexano

7.0 314 Derivado del ácido caféico





81

7.4.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS)

Se analizaron por GC-MS los compuestos volátiles emitidos por las muestras del

EEP y del extracto metanólico de flores de C. citrinus. Su identificación se realizó

por comparación de los espectros de masas obtenidos con los espectros de estos

compuestos almacenados en la librería del equipo. En el Anexo II se presentan

dichos espectros para ambos extractos, y en la Tabla 13 su identificación.

Los metabolitos que estuvieron presentes en ambos extractos son:

Eucaliptol

Estructura:

Nombre químico: 1,3,3-Trimetil-2-oxabiciclo[2.2.2]octano

Otros nombres: 1,8-Cineol, 1,8-Epoxi-p-mentano

Fórmula Molecular: C10H18O

Peso Molecular: 154.2 g/mol

Punto de fusión: 1.5 oC

Punto de ebullición: 176-177 oC

Es un líquido incoloro y transparente con olor parecido al del alcanfor (RE2, RE3)

Metil éster del ácido 3-acetoxi-hidroxipropiónico

Estructura:

Fórmula Molecular: C6H10O5



82

p-Ment-1-en-8-ol

Estructura:

Nombre químico: 2-(1-Metil-1-ciclohexen-4-il)propan-2-ol

Otros nombres: alfa-Terpineol, p- Ment-1-en-8-ol

Fórmula Molecular: C10H18O


Punto de fusión: 39 oC

Punto de ebullición: 219 oC (81-82 oC a 4.5 mm de Hg)

Hay tres isómeros, alfa-, beta-, y gamma- terpineol. El Terpineol es generalmente

una mezcla de estos isómeros con alfa- terpineol como el componente principal.

El Terpineol tiene un olor agradable similar a la lila y es un ingrediente común en

perfumes, cosméticos, y sabores (RE4).

Etil éster del ácido dodecanoico

Estructura:

Otros nombres: Dodecanoato de etilo, laurato de etilo



http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/Isomer


83

1-[4-(4-N,N-Dimetilamino)bencilaminofenil]etanona

Estructura:

Fórmula Molecular: C17H20N2O


Metil éster del ácido hexadecanoico

Estructura:

Otros nombres: Hexadecanoato de metilo, palmitato de metilo

Fórmula Molecular1: C17H34O2


Punto de fusión: 32-35 oC

Punto de ebullición: 185 oC (a 10 mm de Hg)

Sólido blanco. Se usa como fragancia en cosméticos y como saborizante (RE5,

RE6).


84

Ácido hexadecanoico

Estructura:

Otros nombres: Ácido palmítico


Punto de fusión: 59-63 oC

Punto de ebullición: 350-351 oC

Sólido blanco, insoluble en agua (RE7).

Metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico

Estructura:

Otros nombres: 7(Z),10(Z),13(Z)-Hexadecatrienoato de metilo, 16:3 (n−3)


Peso Molecular: 264.4 g/mol (RE8).


85

Tabla. 14. Compuestos volátiles identificados a partir de los espectros

de masas del EEP y el extracto metanólico de flores de C. citrinus.

COMPUESTO PROPÓLEO CEPILLO

T.R. min % DEL TOTAL

T.R. min % DEL TOTAL

EUCALIPTOL 6.297 0.337 6.288 35.56

METIL ÉSTER DEL ÁCIDO 3-ACETOXI-3-

HIDROXIPROPIÓNICO

8.059 0.208 7.922 5.705

p-MENT-1-EN-8-OL 9.182 0.190 9.167 2.757

ETIL ÉSTER DEL ÁCIDO DODECANOICO

15.639 0.185 15.923 14.903

1-[4-(4-N,N-

DIMETILAMINO)BENCILAMINOFENIL]ETANONA

16.382 0.888 16.243 3.235

METIL ÉSTER DEL ÁCIDO HEXADECANOICO

20.105 0.177 20.103 4.702

ÁCIDO HEXADECANOICO 20.513 0.160 20.487 2.548

METIL ÉSTER DEL ÁCIDO

7,10,13-HEXADECATRIENOICO

22.262 1.805 22.225 3.447

DDiissccuussiióónn


86

8. DISCUSION

De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo, se determinó que

tanto la cepa de Candida albicans (ATCC 10231) como la de Cryptococcus

neoformans son sensibles a los extractos hexánico y etanólico de propóleo y a los

extractos de flores de R. communis y de C. citrinus con acetato de etilo y con

metanol, pero no al extracto hexánico de flores de R. communis y a ninguno de

los extractos de flores de E. camaldulensis. En relación a estos últimos resultados,

es importante señalar que ellos son sorprendentes, debido a que era de esperarse

que presentaran cierta actividad antifúngica, principalmente por la presencia del

eucaliptol, uno de los principales metabolitos secundarios de esa especie vegetal

y que, además, fue identificado en el extracto metanólico de flores de C. citrinus

en este trabajo. Por otra parte, sólo el C. neoformans presentó sensibilidad frente

al extracto hexánico de C. citrinus.

Para hongos filamentosos se encontró que fue inhibido el desarrollo de Fusarium

moniliforme por el extracto metanólico de flores de R. communis, la cepa de

Rhizoctonia solani fue inhibida por los extractos hexánico y etanólico de propóleo,

por el extracto hexánico de flores de R. communis y por los extractos hexánico,

etanólico y de acetato de etilo de flores de C. citrinus, mientras que la cepa de

Trichophyton mentagrophytes fue inhibida únicamente por las dos fracciones del

extracto de propóleo y por el extracto metanólico de C. citrinus. Estos resultados

son muestra de la selectividad de los extractos empleados sobre algunas de las

cepas de los hongos filamentosos evaluados, lo que debe ser considerado para

su posible uso como tratamiento terapéutico.

La mayor actividad frente a C. albicans fue presentada por el extracto etanólico de

propóleo con valores de CIM de 0.25 mg/mL y CFM de 0.5 mg/mL y el extracto

metanólico de flores de C. citrinus, con valores de CIM de 0.5 mg/mL y CFM de

0.75 mg /mL, mientras que para C. neoformans el extracto etanólico de propóleo

presentó valores de CIM de 0.5 mg/mL y CFM de 0.75 mg/mL y el extracto

metanólico de flores de C. citrinus, presentó valores de 0.25 mg/mL tanto para la


87

CIM como para la CFM. Entre los hongos filamentosos, la mayor sensibilidad fue

mostrada por T. mentagrophytes frente a estos mismos extractos, presentando

una CIM de 0.25 mg/mL para los extractos etanólico y hexánico de propóleo y de

1.5 mg/mL para el extracto metanólico de flores de C. citrinus. Estos resultados

coinciden por lo reportado por Heinze, et al. en 1998.

Se realizaron curvas de crecimiento para C. albicans ATCC 10231 y C.

neoformans con el fin de observar la dinámica de la acción antifúngica del extracto

etanólico de propóleo y del extracto metanólico de flores de C. citrinus.

Se observó inhibición en el crecimiento de C. albicans y de C. neoformans desde

el inicio de la curva en presencia de diferentes concentraciones de extracto

etanólico de propóleo, lo que indica su importante actividad antifúngica.

El extracto metanólico de flores de C. citrinus, C. albicans no presentó una

inhibición aparente durante las primeras horas de incubación, pero a partir de las

12 horas se observó reducción en el crecimiento de las levaduras. En el caso de

C. neoformans con extracto metanólico de flores de C. citrinus, se observó

reducción en el crecimiento a partir de las 9 horas de incubación.

Por todo lo anterior, es necesario indicar que la actividad presentada de algunos

de los extractos contra los hongos estudiados constituye un aporte importante en

el estado del arte de nuevos sistemas antifúngicos.

Alteraciones celulares encontradas por microscopia

A pesar de que muchos estudios se han centrado en demostrar la actividad

antimicótica del propóleo y de diversos extractos, pocos han demostrado sus

efectos sobre la morfología y estructura de los hongos.

Así, los estudios de microscopía óptica empleando el colorante fluorescente

Blanco de Calcoflúor y microscopía electrónica de transmisión, revelaron un

importante daño celular ocasionado por el contacto con los extractos.


88

Tanto el EEP a concentraciones de 0.25 mg/mL, como el extracto metanólico de

flores de C. citrinus a 0.5 mg/mL, indujeron la inhibición de la formación de tubo

germinativo, lo cual revela que ambos tienen efecto sobre el proceso

morfogenético de C. albicans, impidiendo la transición de levadura a micelio.

Mello et al. habían encontrado en 2006 que el extracto de propóleo verde de Brasil

redujo la aparición de tubos germinativos de C. albicans después de dos horas de

exposición sin afectar el crecimiento de las células, mencionando los

investigadores que no es claro el mecanismo por el que esto ocurre (Mello, 2006),

sin embargo, en este trabajo se encontró inhibición completa de la formación de

tubo germinativo.

Se observó además en este trabajo la deformación de algunas levaduras de C.

albicans en presencia de 0.25 mg/mL de EEP, así como alargamiento celular tras

el contacto con 0.5 mg/mL de extracto metanólico de flores de C. citrinus.

En el caso de C. neoformans, no se apreció alteración aparente en la estructura

de las células incubadas en presencia de 0.5 mg/mL EEP, pero sí se observó

alargamiento de las células tras el contacto con 0.25 mg/mL de extracto


También se observaron micrografías electrónicas de transmisión de secciones

ultrafinas de Candida albicans ATCC 10231 y de C. neoformans. Los hallazgos

ultraestructurales revelaron que tras la incubación de C. albicans ATCC 10231 con

EEP, hay vacuolización, incremento en la formación de gránulos de

almacenamiento, además de alteración y ruptura de las estructuras de la cubierta

externa de la levadura, con liberación de material intracelular, mientras que al ser

incubada con extracto metanólico de flores de Callistemon citrinus, se observa de

manera característica la inducción por parte del extracto del alargamiento de las

células lo cual, como ya se mencionó, había sido previamente observado por

microscopía de luz. Es posible que se trate de un proceso de filamentación


89

alterado, puesto que se demostró por microscopía óptica que este extracto inhibe

la formación de tubos germinativos.

Entre las alteraciones encontradas por el contacto de C. neoformans con el EEP

está ruptura de la cubierta celular con la consecuente salida de los componentes

internos y, al parecer, hay destrucción de organelos subcelulares, lo cual se

observa por una marcada separación entre el contenido intracelular y su cubierta

externa o la presencia de cubiertas completas pero vacías. En las preparaciones

de C. neoformans incubadas con extracto metanólico de flores de C. citrinus, se

apreciaron células degeneradas que contenían material granular heterogéneo con

estructuras membranosas mal definidas y alteraciones en la integridad de la pared

celular, las cuales fueron previamente descritas por Anderson como

incongruencias de la pared asociadas a la presencia de vesículas (Anderson,

1990).

Por su parte, Mello et al. reportaron en 2006 las alteraciones ultraestructurales de

C. albicans observadas por microscopía electrónica de barrido al ser tratadas con

propóleo verde de Brasil, señalando la presencia de cambios en la pared celular

de las levaduras, con sitios de gemación irregulares, y perturbación de la división

resultando en defectos en la textura de la pared de de las células hijas.

El tratamiento in vitro de Candida con derivados de imidazol fue reportado por De

Nollin et al. en 1976, quienes observaron invaginación de la membrana plasmática

y en 1991, Montes et al. reportaron la formación de vesículas, proponiendo que

esto tal vez causa la interrupción de la relación dinámica entre la biosíntesis de

ergosterol y quitina, mismas que fueron observadas en este estudio en células de

C. albicans tratadas con EEP y en C. neoformans tratadas con ambos extractos.

Sin embargo, también fueron observadas en las levaduras de C. neoformans no

tratadas, lo cual coincide con lo reportado para esta levadura (Rodrigues, 2008).


90

Composición química de los extractos

La composición del propóleo es muy compleja y variada en función de la

diversidad fitogeográfica de las zonas de recolección. Aunque sus principales

componentes son los flavonoides y otros compuestos fenólicos, así como de

ácidos carboxílicos de cadena larga y sus ésteres, los métodos de análisis de que

se dispone en la actualidad permiten detectar un número cada vez mayor de

compuestos en el mismo, comprobándose que la variabilidad en su composición

es muy elevada (Farré, 2004).

En el presente estudio, mediante cromatografía líquida de alta resolución se

lograron identificar algunos de los componentes del EEP, correspondientes a una

isoflavona, cinco flavonas, una quercetina, seis derivados del ácido cinámico y un

derivado del ácido caféico, lo cual coincide con los reportes previos acerca de la

composición del propóleo (Bedascarrasbure et al., 2006, González, 2007).

Se ha propuesto que las proporciones del ácido caféico, los flavonoides y los

ésteres fenólicos son los principales responsables de la actividad biológica, pero

también se ha demostrado que existe un efecto sinérgico entre estos y otros

componentes del extracto (Kartal, 2003).

Los flavonoides (quercetina, apigenina, galangina, etc.) y los ácidos fenólicos

(caféico, isoferúlico, cinámico y benzoico) (Arvouet-Grand, 1994), además de ser

tóxicos para las levaduras (Bariliak, 1996), inhiben la actividad enzimática de la

hialuronidasa (Miyataka, 1997). Adicionalmente, el ácido caféico y la actividad de

dihidrofolato reductasa, podrían explicar la similitud entre algunos de sus efectos y

los de algunos antiinflamatorios no esteroideos (Strehl, 1994, Farré, 2004).

Por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas se analizaron el

extracto etanólico de propóleo y el extracto metanólico de flores de C. citrinus,

encontrando varios compuestos que estaban presentes en ambos extractos.

Estos fueron eucaliptol, metil éster del ácido 3-acetoxi-3-hidroxipropiónico, p-


91

ment-1-en-8-ol, étil ester del ácido dodecanoico, 1-[4-(4-dimetilamino)

bencilaminofenil]etanona, metil éster del ácido hexadecanoico, ácido

hexadecanoico, metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico.

El eucaliptol (1,8-cineol) que fue el componente mayoritario del extracto

metanólico de flores de C. citrinus, se sabe que constituye entre el 70 y el 85% del

aceite esencial del eucalipto el cual ha mostrado ser efectivo en el control de la

población de ácaros en las colonias de A. mellifera. El eucaliptol se encuentra

presente en otros aceites de plantas y se usa como comúnmente como

descongestionante y expectorante en infecciones respiratorias del tracto superior y

como ingrediente de algunos enjuagues bucales y preparados dentales como un

solvente endodóntico. En medicina veterinaria es usado de manera tópica por su

indicada actividad antibacteriana (RE2, RE3).

El p-ment-1-en-8-ol y el ácido hexadecanoico son usados en preparaciones

industriales o farmacéuticas, entre otros usos importantes (RE4, RE7).

En el año 2009, Jazet et al. trabajando con plantas de Camerún, encontraron que

monoterpenos oxigenados fueron los componentes predominantes del aceite

esencial de C. rigidus, mientras que en el aceite esencial de C. citrinus y sus

fracciones hubo tres compuestos principales, 1,8-cineol (73,8 %), α-pineno (16,3

%) y α-terpineol (4,8 %). 1,8-cineol y α-pineno fueron igualmente los componentes

principales en dos de las fracciones evaluadas, aunque estaban ausentes en otras

también estudiadas (Jazet et al., 2009).

En un estudio realizado en 2009 por Silva et al. en Brasil, encontraron también que

los aceites esenciales de Callistemon están compuestos en gran parte por

monoterpenoides oxigenados (Silva, 2009). El aceite esencial de C. viminalis y C.

citrinus se caracterizó por una gran cantidad de 1, 8-cineol (65,0 y el 77.0 %

respectivamente), un compuesto conocido por tener un pronunciado potencial

antimicrobiano y que fue encontrado también por Jazet como uno de los

http://www.bedri.es/Libreta_de_apuntes/E/EU/Eucalipto.htm

http://www.bedri.es/Comer_y_beber/La_miel/Las_abejas.htm


92

componentes mayoritarios. Además de la acción insecticida, este compuesto

también presenta actividad antiinflamatoria que está asociada a su capacidad para

inhibir la vía de la ciclooxigenasa, previniendo la biosíntesis de prostaglandinas.

Los compuestos del tipo del α-pineno reportados por Jazet, parecen ser capaces

de desintegrar la integridad celular, y causa inhibición de los procesos de

respiración y transporte de iones. Cerqueira et al. estudiaron el aceite esencial de

Myrcia nicaeensis (Myrtaceae) que presenta 87,3 % de α-pineno, compuesto

reportado por Jazet, y mostró fuerte actividad contra S. aureus, S. aureus

resistente a meticilina y C. albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus

fumigatus, Microsporum canis y Trichophyton rubrum (Jazet et al., 2009).

Los extractos de Callistemon probados en Australia exhibieron actividad contra

Bacillus cereus. Estos extractos también mostraron buena actividad antibacteriana

hacia bacterias Gram-negativas (Cock, 2008).

Aun cuando se han logrado importantes avances en la investigación acerca del

propóleo y plantas relacionadas en cuanto a su actividad biológica frente a

hongos, es recomendable ampliar los estudios enfocados a la caracterización de

estos productos, incluyendo la identificación de los principios activos, y determinar

su mecanismo de acción, así como su efecto en otros hongos patógenos.

Además, es importante recordar que las pruebas in vitro no reflejan las

condiciones reales encontradas en infecciones clínicas, si bien son de utilidad

para poder realizar posteriormente estudios in vivo, por lo que son necesarios

estudios adicionales con modelos animales para evaluar su efecto potencial in

vivo.

Cabe mencionar que existen reportes de diversos países sobre las alteraciones

celulares producidas por el extracto de propóleo en las levaduras mencionadas,

pero del daño producido por los extractos herbales empleados en este trabajo no

se encontraron en la literatura científica referencias que nos pudieran servir de


93

comparación, por lo que se considera que se ha realizado un aporte importante en

el área con el trabajo realizado en este proyecto.

RReeccoommeennddaacciioonneess


94

9. RECOMENDACIONES

Es recomendable ampliar los estudios enfocados a la caracterización del propóleo

y plantas relacionadas, incluyendo la identificación de los principios activos.

Determinar su mecanismo de acción sobre la célula micótica, así como su efecto

sobre otros hongos patógenos.

Debe recordarse que las pruebas in vitro son de utilidad para realizar

posteriormente estudios in vivo, pero no reflejan las condiciones reales

encontradas en infecciones clínicas, por lo que son necesarios estudios

adicionales con modelos animales para evaluar su efecto potencial in vivo.

CCoonncclluussiioonneess


95

10. CONCLUSIONES En el presente trabajo se evaluó la actividad antifúngica de once extractos, dos de

los cuales fueron obtenidos a partir de propóleo de la abeja Apis mellifera,

recolectado en el apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM,

y de tres de las plantas que son visitadas por las abejas para recolectar resinas,

néctar o polen dentro de la misma Facultad. Estas fueron Ricinus communis L,

Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt y Callistemon citrinus Stapf.

Se emplearon dos cepas de hongos levaduriformes, Candida albicans (ATCC

10231) y Cryptococcus neoformans y seis cepas de hongos filamentosos,

Aspergillus niger, A. flavus (ATCC 204304), Fusarium moniliforme, Fusarium

sporotrichum (ATCC NRLL3299), Rhizoctonia solani y Trichophyton

mentagrophytes.

Se estandarizaron y desarrollaron las pruebas de sensibilidad a antifúngicos,

encontrando que ninguno de los extractos preparados a partir de flores de E.

camaldulensis presentó actividad frente a ninguno de los hongos probados.

Los dos extractos de propóleo fueron activos frente a cuatro de las seis cepas

probadas, mientras que el C. citrinus presentó actividad frente a dos hongos con

el extracto hexánico, tres con el extracto de acetato de etilo y cuatro con el

extracto metanólico.

R. communis fue activo frente a un hongo con el extracto hexánico, dos con el

extracto de acetato de etilo y tres con el extracto metanólico.

Al determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración fungicida

mínima de los extractos se encontró que estas oscilan entre los 0.25 y 2.0 mg/mL

para todos los extractos frente a las dos levaduras evaluadas.


96

En el caso de los hongos filamentosos hubo mayor variación, ya que para R.

solani se encontró una CIM de 1.0 mg/mL para las fracciones hexánica y etanólica

de propóleo, mientras que para el extracto hexánico de flores de R. communis y

los tres extractos de flores de C. citrinus, se observó reducción de crecimiento,

pero se considera que las CIM son mayores a 3.0 mg/mL que fue la máxima

concentración probada, ya que no se alcanzó la inhibición completa del

crecimiento.

De igual forma, la CIM del extracto hexánico de flores de R. communis frente a F.

moniliforme se considera mayor a 3.0 mg/mL por presentar reducción, pero no

inhibición total del crecimiento, mientras que para T. mentagrophytes se encontró

una CIM de 0.25 mg/mL para las fracciones hexánica y etanólica de propóleo y de

1.5 mg/mL para el extracto metanólico de flores de C. citrinus.

Tras evaluar los resultados obtenidos con las pruebas de sensibilidad antifúngica,

se seleccionó el extracto metanólico de flores de C. citrinus para realizar las

pruebas de comparación de la composición química con el propóleo y la

observación de alteraciones morfológicas ocasionadas por dichos extractos a las

células fúngicas. Se hizo el estudio comparativo con el extracto etanólico del

propóleo.

Se identificaron algunos de los componentes del propóleo mediante

cromatografía líquida de alta resolución, correspondientes a 1 isoflavona, 5

flavonas, 1 quercetina, 6 derivados del ácido cinámico y 1 derivado del ácido

caféico.

Para determinar si el EEP contiene el (los) mismo(s) compuesto(s) activo(s) que el

extracto metanólico de flores de C. citrinus, se analizaron ambos extractos en un

cromatógrafo de gases acoplado a u espectrómetro de masas y se encontró

coincidencia en 8 compuestos: eucaliptol, metil éster del ácido 3-acetoxi-3-

hidroxipropiónico, p-ment-1-en-8-ol, etil éster del ácido dodecanoico, ethanone,


97

(1-[4-[4-(dimetilamino) benzilienamino)fenil]-), metil éster del ácido

hexadecanoico, ácido hexadecanoico, metil éster del ácido 7,10,13-

hexadecatrienoico.

Con las observaciones de microscopía óptica y electrónica, se observó la

presencia de cambios en la morfología de C. albicans y de C. neoformans,

presentando degeneración estructural después de la exposición a los extractos.

Con el análisis de los datos obtenidos, se corrobora la relación existente entre la

composición del propóleo y la de las plantas de las cuales recolectan las abejas

algunos ingredientes para su preparación, por lo que el espectro antimicrobiano

de cada propóleo varía dependiendo de la situación geográfica y la vegetación

circundante, pero además se plantea la posibilidad de emplear dichas plantas

como fuentes de metabolitos secundarios con actividad antimicótica.

AAnneexxooss


98

11. ANEXOS

ANEXO I

Identificación de especies vegetales en el herbario de la FES Iztacala.

Especie 1:

Familia: Euphorbiaceae

Nombre científico: Ricinus communis L.

Etimología: Ricinus = garrapata, por la apariencia de las semillas. Communis, del

latín communis = muy común o corriente.

Nombre común: Higuerilla, Ricino, higuera del diablo.

Lugar de origen: Nativo de África tropical, y hoy día naturalizado en los climas

templados de todo el mundo.

Clima: templado

Ciclo biológico: perenne

Especie 2:

Familia: Myrtaceae

Nombre científico: Callistemon citrinus Stapf

Nombre común: Cepillo, Limpiatubos, Árbol del cepillo, Escobillón rojo,

Limpiabotellas

Lugar de origen: Australia, Nueva Gales del Sur y Victoria

Clima: Templado

Ciclo biológico: Perenne

Especie 3:

Familia: Myrtaceae

Nombre científico: Eucalyptus camaldulensis Dehnhartdt

Nombre común: Eucalipto

Lugar de origen: Australia y Tasmania

Clima: Templado

Ciclo biológico: Perenne


99


100

ANEXO II

CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Se presentan espectros de masas obtenidos para los compuestos volátiles

presentes tanto en el extracto etanólico de propóleo como en el extracto



101

FIGURA 52: Identificación del eucaliptol a partir de su espectro de masas.


102

FIGURA 53: Identificación del metil éster del ácido 3-acetoxi-3-hidroxipropiónico a partir de su espectro de masas.


103

FIGURA 54: Identificación del p-ment-1-en-8-ol a partir de su espectro de masas.


104

FIGURA 55: Identificación del 1-[4-(4-dimetilamino)bencilaminofenil]etanona a partir de su espectro de masas.


105

FIGURA 56: Identificación del metil éster del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas.


106

FIGURA 57: Identificación del ácido hexadecanoico a partir de su espectro de masas.


107

FIGURA 58: Identificación del metil éster del ácido 7,10,13-hexadecatrienoico a partir de su espectro de masas.


108

ANEXO III

PROTOCOLO DE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN PARA LEVADURAS

(Shepherd, 1987; Jabra-Rizk, 1999.)

FIJACIÓN: Las células son prefijadas en una mezcla de paraformaldehído al 3%, glutaraldehído al 1%, MgCl2 1Mm, CaCl2 1mM, dimetilsulfóxido (DMSO) al 0.1%, 0.1% de Azul de Alcian en buffer de fosfatos (PBS) 01.M, pH 7.2, por 3 hrs a

temperatura ambiente. Se lavan las células 3 veces en el mismo buffer por 10 min.

POST-FIJACIÓN: Las muestras se incuban por 3 hrs a temperatura ambiente en una solución de OsO4 al 1%, K2Cr2O7 al 1%, NaCl al 0.85% (solución salina

fisiológica, SSF) y DMSO al 0.1% en el mismo buffer. Posteriormente se realizan 3 lavados por 10 min en SSF.

DESHIDRATACIÓN: Las células se deshidratan en una serie de etanol con acetato de uranilo. Etanol: 10, 25, 50, 70 % 30 min c/u, 90 % 1 hr, 100 % 1 hr (3

veces). INFLITRACIÓN:

A) Óxido de propileno: Etanol

3:1 24 hrs

2:1 12 hrs 1:1 12 hrs

B) Óxido de propileno: resina epóxica 3:1 1 día 1:1 1 día

1:3 1 día Epón 12 hrs

INCLUSIÓN en resina epóxica 100 % POLIMERIZACIÓN: 12 hrs 60 ºC

Posteriormente las muestras son cortadas con un micrótomo y posteñidas con acetato de uranilo al 2% en solución acuosa.

Realizar la observación en un microscopio electrónico de transmisión.


109

ANEXO IV

PASANTÍA

Unidad de Biotecnología y Prototipos

UBIPRO

En cumplimiento de la Pasantía requerida como parte del plan de estudios del

Programa de Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo, se realizó una

estancia en laboratorio de Fitoquímica de la Unidad de Biotecnología y Prototipos

(UBIPRO) de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM, la cual se

encuentra ubicada en la Av. de los Barrios No. 1, Los Reyes Iztacala,

Tlalnepantla, Estado de México, México, bajo la asesoría de los Doctores José

Guillermo Ávila Ácevedo, María Margarita Canales Martínez y Claudia Tzasná

Hernández Delgado.

La UBIPRO forma parte de las obras financiadas por el Programa UNAM-Banco

Interamericano de Desarrollo, y se ha constituido como un centro de investigación

de alto nivel dentro de la UNAM. Su objeto de estudio es el proceso de deterioro

ambiental en las zonas áridas, con la finalidad de entenderlo desde varias

perspectivas y sentar las bases para revertirlo y lograr la restauración de los

sistemas alterados, así como fomentar la conservación y el manejo adecuado de

los recursos naturales. La existencia de este objeto de estudio común, ha

permitido la formación de un grupo multidisciplinario donde se engloban las

especialidades de Fisiología Vegetal, Edafología, Cultivo de Tejidos, Evaluación

de Recursos Naturales, Fitoquímica, Ecología, Bioquímica Molecular,

Microbiología y Biogeoquímica. Así mismo, la existencia de un proyecto único,

favorece un constante intercambio de ideas entre varias disciplinas, redundando

en un avance más profundo en el estudio, así como, un uso más eficiente del los

recursos de infraestructura y tiempo.

El buen funcionamiento de la estructura organizativa de la UBIPRO se refleja en

los altos estándares de productividad alcanzados, incluyendo la formación de


110

recursos humanos y la productividad científica. Estos parámetros indican una

intensa labor de los investigadores de la Unidad en la incorporación de alumnos

de Licenciatura, Maestría y Doctorado, así como un proceso de maduración del

grupo de trabajo y del proyecto. Por otro lado, para el apoyo de los estudiantes en

todos los niveles y para el desarrollo de los proyectos de investigación, en la

UBIPRO, se cumplen funciones de obtención de recursos financieros, explorando

fuentes externas, tales como DGAPA (Dirección General de Asuntos del Personal

Académico de la UNAM), CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología),

instancias nacionales e internacionales, y obtención de recursos extraordinarios a

través de la prestación de servicios a entidades públicas y privadas. Existe

además un Consejo de Asesores Académicos externos, que evalúan el desarrollo

del proyecto y el desempeño individual de los académicos adscritos a la unidad.

Finalmente, la circunscripción del trabajo de investigación en un proyecto único no

se contrapone con la libertad de cátedra y de investigación de los académicos, ya

que, la magnitud de las instituciones y la prioridad e importancia nacional de los

proyectos elegidos, siempre será de mayor trascendencia y se ubicará por encima

de los intereses, aptitudes y vocación individuales (RE1).


111

BBiibblliiooggrraaffííaa


112

12. BIBLIOGRAFÍA

Agrios, G. N. 1996. Fitopatología. Noriega Editores. México D.F.

Aguilar, CN. 2006. Condiciones de cultivo para la producción de micotoxinas. Memorias del II Congreso Internacional Inocuidad de Seguridad Alimentaria 2006.

México. ISBN: 968-9031-09-0.

Albright, D. M. 2001. Human health effects of airborne mycotoxin exposure in fungi contaminated indoor environments. American Society of Safety

Engineers. University of Pennsylvania. 20:26-28.

Amantea, M. A., Bowden, R. A., Forrest, A., Working, P. K., Newman, M. S., Mamelok, R. D. 1995. Population pharmacokinetics and renal function-sparing

effects of amphotericin B colloidal dispersion in patients receiving bone marrow transplants. Antimicrob Agentes Chemother. 39:2042-2047.

Anderson, J., Mihalik, R. and Soll, D. 1990. Ultrastructure and Antigenicity of the Unique Cell Wall Pimple of the Candida Opaque Phenotype. USA. J. Bacteriol. Vol.

172(1): 224-235.

Arathoon, EG. 2001. Clinical efficacy of echinocandin antifungals. Curr opin infect dis. 14(6): 685-691.

Arvouet-Grand A, Vennat B, Pourrat A, Legret P. 1994. Standardization of propolis extract and identification of principal constituents. J Pharm Belg. 49(6):462-468.

Ávila O, Hernández DC. 2005. Composición y actividad antimicrobiana del aceite esencial de Cordia curassavica (Jacq) Roemer & Schultes: Boraginaceae

(Barredor). Tesis de Lic. en Biología, Facultad de Estudios Superiores Iztacala.

Badascarrasbure, E, Maldonado, L, Fierro, MW y Álvarez, A. 2006. Propóleos. Caracterización y normalización de propóleos argentinos. Revisión y actualización

de composición y propiedades. Ediciones Magna. Argentina. ISBN: 987-9390-70-9.

Bankova V, Christov R, Kujumgiev A. 1995. Chemical composition and antibacterial activity of Brazilian propolis. Z Naturforsch. 50:167-172.

Bankova, V, Popova, M, Bogdanov, S y Sabatini, A. G. 2002. Chemical composition of European propolis: Expected and unexcepted results. Z Naturforsch; 57: 530-533.

Bariliak IR, Berdyshev GD, Dugan AM. 1996. The antimutagenic action of apiculture products. Tsitol Genet. 30(6):48-55.


113

Begoña, E, Febrer, I, Pemán, J, Oliver, V y Sánchez CJL. 2001. Tinea capitis por Microsporum audouinii. Rev Iberoam Micol; 18: 88-90.

Benhamou, N. 1992. Ultrastructural detection of β-1,3-glucans in tobacco root tissues infected by Phytophthora parasitica var. nicotianae using a gold-complexed

tobacco β-1,3-glucanase. Physiol Mol Plant Pathol. 41:351-370.

Benoît Pharand, B, Carisse, O. and Benhamou, N. 2002. Cytological Aspects of Compost-Mediated Induced Resistance Against Fusarium Crown and Root Rot in

Tomato. Phytopathology. 92(4): 424-438.

Cantón, E y Pemán, J. 1999. Curvas de letalidad en antifúngicos. Rev Iberoam Micol; 16: 82-85.

Casadevall, A, Vecchiarelli, A y Monari, C. 1998. Specific Antibody to Cryptococcus neoformans Alters Human Leukocyte Cytokine Synthesis and

Promotes T-Cell Proliferation. Infect Immun, 66(3): 1244-1247. USA.

Casadevall, A y Pirofski, L. 2001. Host-Pathogen Interactions: The Attributes of

Virulence. J Infect Dis. 184: 337-344. USA.

Chandrasekaran, M., Venkatesalu, V. 2004. Antibacterial y antifungal activity of Zyzygium jambolanum seeds. J Ethnopharmacol. 91:105-108.

Coll, J. y Tandron, Y. 2005. Isolation and structure elucidation of three neo-clerodana diterpens from Teucrium fructicans L (Labiate). Phytochemistry. 66(19):

2298- 2303.

Deacon, J. 1988. Introducción a la micología moderna. 2a ed. Editorial Limusa.

S.A. México.

De Nollin S, Borges M. 1976. An ultrastructural and citochemical study of Candida albicans after in vitro treatment with imidazoles. Mycoses. 19:317- 328.

Duke, J.A. and Wain, K.K. 1981. Medicinal plants of the world. Computer index

with more than 85,000 entries. Vol.3.

Edwards, CA, Steiner, BR, Stinner, D and Rabatin S. 1995. Biological interactions in soil. Elsevier Science Publishiny Company Inc. New York, USA.

Escobar CM y Zuluaga A. 2004. Nuevos antimicóticos y su uso en dermatología. Med Cutan Iber Lat Am; 32(6): 231-242.

Espinel–Ingroff A, Fothergill A, Peter J, Rinaldi. M. G, & Walsh T. J. Testing. 2002. Conditions for Determination of Minimum Fungicidal Concentrations of new and


114

Established Antifungal Agents for Aspergillus spp: NCCLS Collaborative Study. J

Clin Microbiol. 40: 3204- 3208.

Farré R, Frasquet I, Sánchez A. 2004. Propolis And Human Health. Ars Pharm,

45(1): 21-43.

Ghaly MF, Ezzat SM, Sarhan MM. 1998. Use of propolis and ultragriseofulvin to inhibit aflatoxigenic fungi. Folia Microbiol. 43(2):156-160.

Georgiev, V. 1988. Fungal infections and the search for novel antifungal agents.

Antifungal drugs. Annals of the New York Academy of_Sciences. Vol 544. Ed. Vassil St. Georgiev. Pp. 1-2.

González, G.A.R. 2007. Avances y Perspectivas del Propóleos en la Salud

Humana. Ensayo. Memorias del XXI Seminario Americano de Apicultura. Organización Nacional de Apicultores. Mazatlán, Sinaloa.

Gregorí, VBS. 2005. Estructura y actividad de los antifúngicos. Rev Cubana Farm. 39(2).

Hegazi AG, El Hady FK. 2001. Egyptian propolis: 1-antimicrobial activity and chemical composition of Upper Egypt propolis. Z Naturforsch. 56: 82-88.

Heinze W, Holz J, Nattermann H, Blankesntein P. 1998. Effects of ethanol extracts

of propolis against common bacteria, fungi and viruses of veterinary importance. Tierarztl Umsch. 53(6):321-326.

Hermosilla, GD. 2000. Biología general de los hongos. Pp 301- 311.

Jabra-Rizk MA, Falkler WA, Merz WG, Kelley JI, Baqui A, Meiller TF. 1999. Candida dubliniensis and Candida albicans display surface variations consistent

with observed intergeneric coaggregation. Rev Iberoam Micol.; 16: 187-193.

Kartal M, Y›ld›z S, Kaya S, Kurucu S, Topçu G. 2003. Antimicrobial activity of propolis samples from two different regions of Anatolia. J Ethnopharmacol; 86: 69-

73.

Koneman, EW, Allen, SD, Dowell, VR, Sommers, HM. 2003. Diagnóstico microbiológico. Ed. Médica Panamericana, 5ª Ed., México. Pp. 386-393.

Krell R. 1996. Value-added products from beekeeping. FAO Agricultural Services. Rome. Bulletin Nº. 124.

Kuiate, J. R., Bessiére, J. M., Zollo, P. H. A., Kuate, S. P. 2006. Chemical composition and antidermatophytic properties of volatile fractions of hexanic


115

extract from leaves of Cupressus lusitanica Mill, from Cameroon. J

Ethnopharmacol. 103: 160-165.

Kujumgiev A, Tsvetkova I, Serkedjieva Yu, Bankova V, Christov R, Popov S. 1999.

Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J Ethnopharmacol; 64: 235-240.

López, MR, Méndez, TLJ, Hernández, HF, Castañón, OR. 2004. Micología Médica. Procedimientos para el diagnóstico de laboratorio. Ed. Trillas, 2ª Ed. ISBN: 968-

24-7008-0.

López MRI. 2008. Introducción importancia actual de la micología médica en México. Gac Med Mex. 144 (2).

López, MR, Méndez, TLJ, Manzano, GP, Hernández, HF. 2009. Principios de Micología Médica. Clínica, diagnóstico y terapéutica. Méndez Editores. ISBN: 978-607-7659-07-5.

Mareggiani G. 1999. Plantas insecticidas. Fac. de Agronomía. Universidad de

Buenos Aires. Ed. Secretaría de Publicaciones del Centro de Estudios Agronómicos de Buenos Aires, P. 52.

Martin de la G, A, González, TA, Marrero, AA, Milián, HV, Campañá, CH e Iglesias, RG. 2003. Obtención de un extracto plaguicida de Gliricidia sepium (Jaq.)

Steud bajo la irradiación con microondas. Rev Cubana Plant Med, 8(3).

Martínez N. 2003. Las plantas medicinales. Boletín de Nutrición Infantil CANIA.

Año 4, No. 8.

Martins R.S. 2002. Effect of commercial ethanol propolis extract on the in vitro growth of Candida albicans. J. Oral Sci. 44(1):41-48.

Martins RS, Pereira ES, Lima SM, Senna MI, Mesquita RA. 2002. Effect of

commercial ethanol propolis extract on the in vivo growth of Candida albicans collected from HIV-seropositive and HIV-seronegative Brazilian patiens with oral candidiasis. J Oral Sci. 44(1):41-48.

Matos, O.C. Baeta, J., Silva, M. J. Pinto, R. C. P. 1999. Sensitivity of Fusarium

strains to Chelidonium majus L. extracts. J Ethnopharmacol. 66: 151-158.

Mitchell, R. 1992. Environmental Microbiology. Ed. John Willey–Liss Inc.

Miyataka H, Nishiki M, Matsumoto H, Fujimoto T, Matsuka M, Satoh T. 1997.

Evaluation of propolis. Evaluation of Brazilian and Chinese propolis by enzimatic and physico-chemical methods. Biol Pharm Bull. 20(5): 496-501.

http://new.medigraphic.com/cgi-bin/resumen.cgi?IDREVISTA=16&IDARTICULO=16381&IDPUBLICACION=1671&NOMBRE=Gaceta%20Mdica%20de%20Mxico

http://new.medigraphic.com/cgi-bin/resumen.cgi?IDREVISTA=16&IDARTICULO=16381&IDPUBLICACION=1671&NOMBRE=Gaceta%20Mdica%20de%20Mxico


116

Montes B, Mallié M, Jouvert S, Bastide JM. 1991. Morphological changes on Candida albicans induced by saperconazole. Mycoses. 34:287- 292.

Moreno, ME. 1988. Manual para la identificación de hongos en granos y sus

derivados. UNAM, México.

NCCLS/CLSI. 2002. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. M-27A2. NCCLS. Villanova, Pennsylvania.

Ota C, Unterkircher C, Fantinato V, Shimizu MT. 2001. Antifungical activity of propolis on different species of Candida. Mycoses; 44: 375-378.

Palamin-Azevedo RV, Chinalli-Komesu M, Candido RC, Salvetti C, Caetano-Rezende FH. 1999. Candida sp in the oral cavity with and without lesions: maximal

inhibitory dilution of propolis and periogard. Rev Microbiol; 30: 335-341.

Quintero Mora ML , Londoño Orozco A, Manzano Gayosso P, Soto Zárate CI,

Carrillo Miranda L, Penieres Carrillo G, García Tovar CG, Hernández Hernández F, López Martínez R, Cruz Sánchez T. 2008. Effect of Mexican propolis extracts from Apis mellifera on Candida albicans in vitro growth. Rev Iberoam Micol. 25: 46-

50.

Rao, NS. 1995. Soil microorganisms & plant growth. Scrence Publishers. USA.

Ríos, J. L. y Recio, M. C. 2005. Medicinal plants and antimicrobial activity. J Ethnopharmacol, 100: 80-84.

Rodrigues, M, Nakayasu, E., Oliveira,D., Nimrichter,L., Nosanchuk, JD., Almeida, IC. and Casadevall, A. 2008 Extracellular Vesicles Produced by Cryptococcus

neoformans Contain Protein Components Associated with Virulence. Brasil.

Eukaryot. Cell, 7(1): 58–67.

Rojas, N. y Lugo, S. 1988. Efecto antifúngico del propóleos sobre cepas del género Candida. Memorias del I Simposio sobre los Efectos del Propóleos en la

Salud Humana y Animal. Cuba.

Sánchez CM. 2004. Microbiología de suelos. Técnicas, métodos y medios de cultivo. Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. ISBN 970-32-1907-1.

Pp 31.

Sawaya AC, Palma AM, Caetano FM, Marcucci MC, da Silva Cunha IB, Araujo CE, Shimizu MT. 2002. Comparative study of in vitro methods used to analyse the activity of propolis extracts with different compositions against species of Candida.

Lett Appl Microbiol; 35: 203-207.


117

Sforcin JM, A Fernandes Jr, Lopes CAM, Bankova V, Funari SRC. 2000. Seasonal effect on Brazil propolis antibacterial activity. J Ethnopharmacol; 73: 243-249.

Shepherd MG. 1987. Cell envelope of Candida albicans. CRC Clin Rev Microbiol;

15: 7-25.

Silva, VV. Díaz, JMC. Febré, N. 2002. Vigilancia de la resistencia de levaduras a antifúngicos. Rev Chil Infect; 19(2): 149-156. Chile.

Strehl E, Volpert R, Elstner EF. 1994. Biochemical activities of propolis extracts. III.

Inhibition of dihydrofolate reductase. Z Naturforsch C. 49(1-2):39-43. Tapia C. 2005. Mecanismos de Acción, Reacciones Adversas y Nuevos

Antimicóticos. Programa Microbiología y Micología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

Terán ChB y Hernández DT. 2006. Actividad antibacteriana y antifúngica de Cordia curassavica (Jacq) Roemer & Schultes (Barredor). Tesis de Lic. en

Biología, Facultad de Estudios Superiores Iztacala.

Torres, RJ. 2004. Antifúngicos. En Méndez TLJ, López, MR y Hernández, HF. Actualidades en Micología Médica. Facultad de Medicina, UNAM. 2ª Ed. Pp. 505-

520.

Wang H., Bun T. N. 2002. Isolation of an antifungal thaumatin–like protein from kiwi fruits. Phytochemestry. 61: 1-6.

Ye, X.Y., Wang, H.X., Ng, T.B., 1999. First chromatographic isolation of an antifungal thaumatin-like protein from French bean legumes and demonstration of its antifungal activity. Biochem Biophys Res Commun. 263: 130–134.

Referencias electrónicas

RE1: http://www.cife.unam.mx/archivos/FES-I/FOLIO4 FES-IZTACALA.doc

RE2: http://www.bedri.es/Libreta_de_apuntes/E/EU/Eucaliptol.htm

RE3: http://www.cosmos.com.mx/j/tec/czcz.htm

RE4: http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/ Terpineol

RE5: http://www.chemsynthesis.com/base/chemical-structure-24539.html

RE6: http://www. thegoodscentscompany.com/data/rw1057631.html

RE7: http://chemicalland21.com/industrialchem/organic/palmitic acid.htm

RE8: http://en.wikipedia.org/wiki/Polyunsaturated_fatty_acid

http://www.cife.unam.mx/archivos/FES-I/FOLIO4%20FES-IZTACALA.doc

http://www.bedri.es/Libreta_de_apuntes/E/EU/Eucaliptol.htm

http://www.cosmos.com.mx/j/tec/czcz.htm

http://www.worldlingo.com/ma/enwiki/es/%20Terpineol

http://www.chemsynthesis.com/base/chemical-structure-24539.html

http://chemicalland21.com/industrialchem/organic/palmitic%20acid.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/Polyunsaturated_fatty_acid

PPuubblliiccaacciioonneess


118

13. PUBLICACIONES

Londoño Orozco, Amparo; Penieres Carrillo, José Guillermo; García Tovar, Carlos

Gerardo; Carrillo M., Liborio; Quintero Mora, María Leonor; García Vázquez,

Susana Elvira; Mendoza Saavedra, Marco Antonio; Cruz Sánchez, Tonatiuh

Alejandro. Estudio de la actividad antifúngica de un extracto de propóleo de la

abeja Apis mellifera proveniente del estado de México. Tecnología en Marcha, Vol.

21-1, Enero-Marzo 2008, P. 49-55.

Londoño O., A., J.G.A. Acevedo, M.M.C. Martínez, C.T.H. Delgado, R. de P.

Serrano y C.M.F. Ortiz et al. , 2010. Antibacterial comparative study between

extracts of mexican propolis and of three plants which Apis mellifera use for its

production. J. Anim . Vet . Adv. , 9: 1250-1254.

Quintero Mora ML , Londoño Orozco A, Manzano Gayosso P, Soto Zárate CI,

Carrillo Miranda L, Penieres Carrillo G, García Tovar CG, Hernández Hernández

F, López Martínez R, Cruz Sánchez T. 2008. Efecto de extractos de propóleos

mexicanos de Apis mellifera sobre el crecimiento in vitro de Candida albicans. Rev

Iberoam Micol. 25: 46-50.

doctorado en ciencias naturales para el desarrollo enfasis en manejo de...

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