DIVERSIDAD GENÉTICA DE ESPECIES

FORESTALES:DE LOS ESTUDIOS DE PROCEDENCIAS A

UNA APROXIMACIÓN GENÓMICA EN PINOSIBÉRICOS

M.T. Cervera, Genética Forestal (INIA)

Pinus longaeva

Prunus avium

Angiospermas

50 a.

100 a.

150 a.

250 a.

1.000 a.

1.500 a.

3.500 a.

5.000 a.

Sequoia gigantea

HOMBRE

Taxus bacata

Gimnospermas

ADAPTACIÓN acambios medioambientales

factores bióticos y abióticosalternancia estacional

árbolescalentamiento

misma escala temporal

Cambio climático

Cambio climático y vida de las especies forestales

Temperatura (°C)

Años

(Hughes, 2000)

• Incremento de Temperatura°• Diferencias marcadas entre estaciones• Incremento de tormentas • Alteraciones pluviométricas

Las coníferas, especies modelo en genómica deorganismos alógamos

• Débil estructura genética poblacional y elevadonúmero efectivo de individuos

• Bajo nivel de domesticación y alta diversidadgenética dentro de individuos

• Fácil identificación de haplotipos (presencia de tejido haploide, el megagametófito, en la semilla)

• Algunas especies se pueden propagarvegetativamente incrementando la precisión dela evaluación fenotípica

• Amplio rango de distribución y existencia de interacción genotipo-ambiente (según muestranlos ensayos de campo multi-localidad)

Pinus pinaster

Desarrollo de herramientas moleculares

(Geada-López et al. 2002. Int J Plant Sci 163: 737 -747)

1. Transferencia

Transferencia de microsatélites nucleares de P. taeda, P. sylvestris y P. radiata

Colaboración con Texas A&M University (USA) & ForestResearch (NZ) / INRA-Cestas (FR)Estudios comparativos entre coníferas36% to 42% (González-Martínez, Robledo-Arnuncio et al. TAG, 109:

103-111)54% (Chagné et al. TAG, in press)

cDNA-SSRs (librerías ESTs de P. pinaster y P. taeda )Colaboración con INRA-CestasEstudio del comportamiento frente a nc-SSRs65% to 87% (Chagné et al. TAG, in press)

(CA)n >10CACACACACACACACACACA

GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTMicrosatélites (SSRs)

Consorcio Internacional “Maritime Pine Microsatellite Consortium”>100 SSRsmapas saturados con marcadores co-dominantesselección (comparativo: mapeo / diversidad)

Poster: M.A. Guevara, D. Chagné, C. Collada, A. Soto de Viana, A. Ramboer, G. Vendramin, C. Plomion, Cervera MT

Obtención rápida de nSSRs combinando AFLPs con enriquecimiento basado en primers biotinilados

(CA)n >10CACACACACACACACACACA

GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTMicrosatélites (SSRs)

2. Nueva obtención

ESTs y genes candidatos

1. Transferencia

ESTPs de mapeo comparativo (CCGP)71.0% to 96.4% ESTs (Chagné et al. 2003 Mol Breed 12: 185-195)

GCs expresionales y posicionales (lignificación)81.5% Genes candidatos de propiedades de la madera(Chagné et al. 2003 Mol Breed 12: 185-195)

respuesta al estímulo luminoso

Ajustar los ciclos decrecimiento estacional

respuesta al estrés hídrico

Crecimiento y supervivencia

genes candidatos

2. Identificación de ortólogos

GCs funcionales (respuesta al estímulo luminoso)PHYP, PHYO, PHYN, CRY1, CRY2

PHYD

PHYA PHYP

PHYNPHYCPHYB

PHYO PHYE

AngiospermasConíferas

- Diseño de primer basados en análisis de secuencias en otras especies

- Amplificación y secuenciación en P. pinaster

- Diseño de GSPs basados en las secuencias

- RACE- Identificación de SNPs

genes candidatos

3. Identificación ESTs

GCs de expersión (respuesta a sequía)

Colaboración con INRA-Cestas (FR)

Librerías acículas y raíces sometidas a estrés hídrico vs control

- cDNA –AFLPs

- secuenciación ESTs + análisis diferencial + 2DG

Estudio del control genético de caracteres adaptativos

mapas genéticos

análisis de QTL

identificación de GCs mapeo comparativo(co-localización)

estudios de asociación

CGposicional

Cruzamientos controlados

P. pinaster 14 P. pinaster 15X

F1 (120)

P. pinaster 15 P. pinaster 14X

F1 (57)

orden de marcadores - interacción QTL x genotipoP. pinaster 14 P. pinaster 32

X

F1 (62)

Construcción de mapas genéticos de pino rodeno (Pinus pinaster)

XMapas genéticos

combinaciones primersseleccionados

Saturaciónmarcadores dominantes

AFLPs / SAMPLsF1

Análisis de segregación

Análisis de segregaciónmarcadores co-dominantesApprox 20: SSRsAppox 60: SNPs / ESTPs / STSs

SSCPs / DGGEs

SSR 1

SSR 2

F1

DNA(2n)

Nueva seleccióncp

Construcción de mapas genéticos de especies alógamas

F1 especies leñosas ~ F2 o retrocruzamiento en cultivos

Estrategia de mapeoPseudo-cruzamiento prueba en dos sentidos

F1

1:1

1:1

3:1SSR

1:1 / 3:1 / 1:2:11:1 / 3:1 / 1:2:1

3:1, SSRsESTPs, SNPs

P. pinaster 14 P. pinaster 15X

F1 (120)

1:1 / 3:1 / 1:2:1

P. pinaster 15 P. pinaster 14XF1 (57)

1:1 / 3:1 / 1:2:13:1, SSRsESTPs, SNPs

1:1 / 3:1 / 1:2:1

P. pinaster 14 P. pinaster 32XF1 (62)

1:1 / 3:1 / 1:2:13:1, SSRsESTPs, SNPs

1 generación♂♀

Número degeneraciones

X

X

XX

X

X

X

DL

X X

Análisis de QTL

+ : número de marcadores + : intervalos de confianza- : intervalos de confianza - : número de marcadores o GCs

CG

Estudios de asociación

A/AA/GG/G

T/TT/AA/A

Elementos de un estudio de asociaciónbasado en genes candidatos

SNP-1SNP-2 QTN

SNP-1

SNP-2

• Selección de genes candidatos• Descubrimiento de SNPs• Genotipado de una población

natural empleando SNPs y marcadores neutros

Variación genética de P. pinaster en la P.I. (cpSSRs)(colaboración con C. Plomion y G.G. Vendramin)

C

A

B

Diversidad de P. pinaster en la Península Ibérica

A/AA/GG/G

T/TT/AA/A

Elementos de un estudio de asociaciónbasado en genes candidatos

SNP-1SNP-2 QTN

SNP-1

SNP-2

• Selección de genes candidatos• Descubrimiento de SNPs• Genotipado de una población

natural• Fenotipado de una población

natural• Test de asociación

La diversidad genética en pino es mayor que la observadaen humanos y soja pero menor que la de maíz o Drosophila

Species Reference Numberof loci θtot θsyn θnon-syn

Halushka et al. (1999) 75 8.3 ± 1.9 15.1 ± 3.6 5.7 ± 1.4HumansCargill et al. (1999) 106 5.3 ± 1.3 11.7 ± 2.9 3.4 ± 0.9

Soybean Zhu et al. (2003) 142 9.7 ± 3.3 10 ± 3.9 3.8 ± 1.5Cryptomeriajaponica Kado et al. (2003) 7 20 ± 14 34 ± 25 7 ± 5

Loblolly pine Wood properties candidategenes 18 42 ± 14 75 ± - 12 ± -

Loblolly pine Water deficit candidategenes (Gonzalez Martinez) 16 46 ± 26 71 ± 60 19 ± 18

Douglas-fir Krutovskii et al. (in prep.) 4 60 ± 23 117 ± 48 30 ± 17

Drosophila Moriyama and Powell(1996) 24 70 ± 58 130 ± 92 15 ± 14

Maize Tenaillon et al. (2001) 21 96 ± 32 173 ± 61 39 ± 14

Los valores de diversidad están multiplicados por 104

Finlandia: Coord: Univ. OuluMETLA

Suecia: Univ. UppsalaFrancia: INRA CestásEspaña: INIA-ETSIM

SIA-ZaragozaItalia: Universidad de Udine

UK: SCRI, Escocia

Francia: INRA CestásEspaña: INIA-ETSIM

NEIKERAlemania: Univ. Göttingen

TREESNIPSDeveloping single nucleotide polymorphisms (SNP) markers

for adaptive variation in forest trees

CARACTERIZACIÓN Y MAPEO DE GCs

WP1

ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN FENOTÍPICA

WP2

DIVERSIDAD NUCLEOTÍDICA &DISEÑO DE SNPs

WP3

COMPARACIÓN DE LA VARIACIÓN ALÉLICA (SNPs) Y FENOTÍPICA

WP4

Sequía y fenologíaPinus pinaster

DIGENFORNaturally occurring nucleotide diversity in candidate genes for forest tree adaptation:

magnitude, distribution and association with quantitative trait variations

Genes candidatos

Transducción de señalrd 21 A-2erd3

Respuesta a sequíalp3-1lp3-3lp5dhn 1Aquaporin MIP

Kinasas y fosfatasaspp2c

Enzimas de detoxificaciónSODcatalase

Ajuste osmóticoSusySPSPhosphofructokinaseProlin dehydrogenase

Control del fotoperiodoPHYPPHYOPHYNCRY1CRY2

Descubrimiento de SNPs(colección de 30 megagametofitos)

0 500 1000

221 385

F1 R1

9

3

1

9

3

3

5

1

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

HAP1 G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

G G A

T G A

T G A

HAP2 T G A

T G A

T G A

HAP3 G G G

G G G

HAP4 G A A

• Amplificación de las regiones del GC

• Análisis de la diversidad de nucleótidos y el desequilibrio de ligamiento

• Diseño de primers para análisis de haplotipos frecuentes

• Genotipado de poblaciones que conforman el ensayo de progenies-procedencias empleando SNPs

Tamrabta

TabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarkaTabarka

CuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarCuellarBayubas de AbajoCoca

San Leonardo de Yagüe

ValdemaquedaArenas de San Pedro

San Cipriano

Petrock

Le Verdon

Olonne/Mer

HourtinMimizan

CenicientosAhin

St Jean de Monts

Pleucadeuc

PinetaVero

Aulenne

Restonica

ZonzaPinia

Oria

Erdeven

Pinus pinastergeographic range

Francia

España

Túnez

Portugal

Marruecos

Localización de las poblaciones que conforman el ensayo de progenies-procedencias de Pinus pinaster

Caracterización fenotípica de progenies y ensayos

Estandarización de los protocolos de:a) Evaluación de los caracteres de interésControl del fotoperiodo: evaluación fenológicaTolerancia al estrés hídrico: discriminación isotópica

Morfológicos: rectitud, altura y diámetro de fuste y ramificación

b) Propagación de material juvenilcon los que abordar evaluaciones destructivas

Selección de progenitores con comportamientos diferenciales para los caracteres adaptativos con los que generar

nuevas progenies para analizar la estabilidad de QTL en diversos fondos genéticos.

Ensayo de progenies-procedencias

Grandes diferencias en tolerancia a sequía de los pinos mediterrános

(Geada-López et al. 2002. Int J Plant Sci 163: 737 -747)

P. halepensis

P. pinea

P. pinaster

P. canariensis

Transferencia

INIA / ETSIM

Ma Ángeles Guevara Álvaro Soto

Santiago González - MartínezIria Fernández - SilvaZafeiro Vaxevanidou

Carmen ColladaMaría Teresa Cervera

Ismael ArandaDolores Agúndez

Juan José RobledoRegina Campbel

Luis GilRicardo Alía

DGCNSalus Iglesias

CITA

Carmen MaestroEduardo Notivol

CIFA-Lourizan

Rafael ZasEster Merlo

NEIKER

Pablo GoicoecheaEnrique Ritter

Univ. de Valencia / Oulu

Rosario García

INRA-Cestas (FR)

Christophe PlomionDavid ChagnéPauline Geré

Antoine Kremer

Univ. de Oulu, Oulu (FIN)

Outi Savolainen

Univ. Firence (It)

Giuseppe G. Vendramin

USDA / Univ. Davis (USA)

David Neale

Univ. de GottingenR. Finkeldey

O. GailingM. Ziehe

L. Leinemann