diversidad de bacterias endofiticas y sus impactos …
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
Departamento de Microbiología
Bacterias endofíticas aisladas de fresa
(Fragaria × ananassa Dutch.) y su impacto sobre
plantas de interés agrícola
T E S I S
Q U E P A R A O B T E N E R E L G R A D O D E
M A E S T R I A E N C I E N C I A S
Q U I M I C O B I O L Ó G I C A S
P R E S E N T A
Q . F. B . Den i s se Ra mí r e z Ro d r í gu e z
DIRECTORES DE TESIS:
DR. EN TAO WANG HU
DRA. AÍDA VERÓNICA RODRÍGUEZ TOVAR
México, D. F. Junio 2010
ii
iii
APOYOS Y RECONOCIMIENTOS
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Ecología Microbiana del
Departamento de Microbiología en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del
Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección del Dr. En Tao Wang Hu y la Dra. Aída
Verónica Rodríguez Tovar.
La sustentante fue becaria del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(CONACYT), durante el periodo febrero 2008 a diciembre 2009 del Programa
Institucional de Formación de Investigadores (PIFI) de febrero de 2008 a junio 2010 y
de la beca extraordinaria de posgrado del IPN de febrero a junio de 2010.
Este trabajo fue financiado por la Secretaria de Investigación y Posgrado el IPN
por parte de los siguientes proyectos:
Bacterias endofíticas y simbióticas de la planta de fresa y frijol. Clave SIP
20080322
Caracterización molecular de las bacterias endofíticas y simbióticas de las plantas
de fresa y frijol en México Clave SIP 20090179
Diversidad de los microorganismos simbióticos- endófitos y sus potenciales en
agricultura y biotecnología Clave SIP20100067
iv
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. En Tao y a la Dra. Aída mis directores de tesis por su apoyo durante mi
formación y mi estancia en la ciudad.
A la Dra. Soledad por todo su apoyo y la orientación en este trabajo.
A mis sinodales por tomarse el tiempo de revisar, corregir y comentar esta tesis:
Dr. Carlos Fabián Vargas Mendoza, Dra. Janet Jan Roblero, Dra. Enriqueta F. Amora
Lazcano, Dra. Soledad Vásquez Murrieta.
Y a todos aquellos laboratorios que colaboraron, prestaron instalaciones y me
brindaron el material necesario para terminar esta tesis. Muchas gracias.
v
DEDICATORIA
A Dios gracias por la vida y permitirme culminar esta linda etapa.
A mis padres José Virgilio y María de la Paz por todo su apoyo en cada etapa de
mi vida, por sus consejos, por su ejemplo, por siempre tener una palabra de aliento en
los momentos mas difíciles. A ellos dedico este gran esfuerzo.
A mis hermanos Itzel, Juan Carlos y José Antonio por esa manera tan especial de
vivir la vida, porque siempre han hecho mi vida mas divertido, por ser mis compañeros
en todas mis travesuras.
A mi sobrina que aun siendo bebé me da muchos ánimos para seguir adelante.
A David por estar a mi lado, por apoyarme por estar conmigo en momentos
importantes, por ser mi compañero y gran amigo.
A los grandes amigos que conocí Claudia, Alma, Esmeralda, Myrtha, Andy,
Sofía, Julio, Oliver, Yane, Aline, Edson, Juan… gracias por todo su apoyo, por que
estuvieron a mi lado, por darme ánimos y siempre hacerme reír, por sus consejos y por
que gracias a ustedes conocí a la verdadera Denisse.
i
ÍNDICE GENERAL
Capítulo Páginas
ÍNDICE GENERAL i
ÍNDICE DE TABLAS iii
ÍNDICE DE FIGURAS iv
RESUMEN v
ABSTRACT vi
I. INTRODUCCIÓN 1
1.1 Historia del cultivo de fresa 1
1.2 Clasificación de la fresa 2
1.3 Características de la fresa 2
1.4 Importancia económica del cultivo de fresa en México 3
1.5 Relación planta – endófitos 5
1.6 Bacterias endofíticas 6
1.7 Bacterias endofíticas como promotoras del crecimiento vegetal 8
II. ANTECEDENTES 10
III. JUSTIFICACIÓN 12
IV. OBJETIVOS 13
4.1 Objetivo general 13
4.2 Objetivos particulares 13
V. MATERIALES Y MÉTODOS 14
5.1 Diagrama general de trabajo 15
5.2 Muestreo 15
5.3 Análisis fisicoquímico del suelo 15
5.4 Aislamiento de bacterias endofíticas 15
5.5 Identificación molecular de aislados 17
5.5.1 Extracción de DNA genómico 17
5.5.2 Amplificación del gen 16S rDNA por PCR 18
5.5.3 Análisis filogenético 18
5.6 Caracterización fenotípica de los aislados 19
5.6.1 Producción de Ácido Indol Acético (AIA) 19
ii
5.6.2 Solubilización de fosfato inorgánico 20
5.6.3 Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) 20
5.7 Evaluación del inóculo en cultivos de interés agrícola 20
5.7.1 Efecto de la producción de fitohormonas (AIA)
trigo y alfalfa 20
5.7.1.1 Trigo (Tritricum aestivum) y alfalfa (Medicago sativa) 22
5.7.2 Evaluación del efecto de las bacterias solubilizadoras de fosfato
tricálcico en bioensayos con cultivo de trigo y alafalfa 23
5.7.2.1 Diseño experimental 23
5.7.2.2 Trigo (Tritricum aestivum) y alfalfa (Medicago sativa) 24
5.8 Análisis estadístico 25
VI. RESULTADOS 27
6.1 Análisis fisicoquímico del suelo 27
6.2 Aislamiento de bacterias endofíticas 28
6.3 Identificación molecular de aislados 29
6.4 Caracterización fenotípica de los aislados 32
6.4.1 Producción de Ácido Indol Acético (AIA) 32
6.4.2 Solubilización de fosfato tricálcico Ca3(PO4)2 33
6.4.3 Fijación biológica de nitrógeno: Reducción de Acetileno (ARA) 35
6.5 Evaluación de la producción de fitohormonas en plantas 35
6.6 Movilización del fosforo inorgánico a nivel de invernadero 38
VII. DISCUSIÓN 41
VIII. CONCLUSIONES 46
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 47
X. ANEXOS 54
iii
ÍNDICE DE TABLAS
Número Páginas
Tabla 1. Origen y nombres de las principales variedades de fresa cultivadas en México.
Tabla 2. Bacterias endofíticas aisladas de plantas de interés agrícola y función dentro de
la planta.
Tabla 3. Características fisicoquímicas de los suelos.
Tabla 4. Unidades formadoras de colonia de bacterias endofíticas provenientes de hojas
y raíces de la planta de fresa.
Tabla 5. Identificación molecular de los aislados obtenidos de hoja y raíz.
Tabla 6. Índices de solubilización de fosfatos.
Tabla 7. Resumen de los aislados identificados y sus características fenotípicas.
Tabla 8. Evaluación del efecto de la producción de fitohormona en alfalfa.
Tabla 9. Evaluación del efecto de la producción de fitohormona en trigo.
Tabla 10. Evaluación del efecto de la solubilización de fosfato en alfalfa.
Tabla 11. Evaluación del efecto de la solubilización de fosfato inorgánico en trigo.
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Número Páginas
Figura 1. Planta de fresa.
Figura 2. Diagrama de las diferentes interacciones endofíticas planta-bacteria y sus
efectos sobre la planta.
Figura 3. Sitios donde se recolectaron las plantas de fresa.
Figura 4. (a) Porcentaje de bacterias endofíticas solubilizadoras de fosfato. (b)
formación de halos de solubilización.
Figura 5. Amplificado del gen 16S rDNA.
Figura 6. Dendograma de las secuencias parciales del gen 16s rRNA con el iniciador
FD1.
Figura 7. Curva de calibración de AIA.
Figura 8. Aislados de hoja que presentaron producción de AIA.
Figura 9. Aislados que se obtuvieron de raíz con producción de AIA.
Figura 10. Bacterias endofíticas solubilizadoras de fosfato.
Figura 11.Análisis de los componentes principales (ACP) para fitohormona en alfalfa.
Figura 12. Análisis de los componentes principales (ACP) para fitohormona en trigo.
Figura 13. Análisis de los componentes principales (ACP) para solubilización de
fosfatos en alfalfa.
Figura 14. Análisis de los componentes principales (ACP) para solubilización de
fosfatos en trigo.
v
RESUMEN
Aunque se desconoce la participación de las bacterias endofíticas, se ha demostrado
promueven el crecimiento de la planta; solubilizan nutrientes indispensables como
fósforo o contribuyen a asimilar el nitrógeno en las plantas. Actualmente se considera a
México como un productor y exportador importante de fresa y para mantener su posición
en el mercado internacional, existe interés en mejorar la producción del cultivo. Por lo
tanto, este trabajo se enfocó en aislar las bacterias que se encuentran en tejidos de esta
planta; así como también, se evaluó el efecto que pueden tener en otras plantas. Se
recolectaron plantas de fresa procedentes de los estados de Guanajuato y México. Se
aislaron bacterias endofíticas de raíces y hojas desinfestando previamente la superficie de
éstas. La mayor distribución de bacterias endofíticas se encuentra en la raíz y esta
influenciada por la disponibilidad de nutrientes y por la competencia con las bacterias de
la rizósfera; El aislamiento e identificación de las bacterias endofíticas se llevo a cabo por
métodos convencionales de cultivo y métodos moleculares. Para su identificación
molecular se extrajo el DNA de los aislados y se secuenció sus genes 16S rDNA aislados
relacionados con los géneros Pseudomonas, Bacillus, Paenibacillus, Rhizobium,
Arthrobacter, Rhodococcus, Staphylococcus, Burkholderia y Agrobacterium. Siendo
Pseudomonas el género de mayor abundancia. Las bacterias endofíticas aisladas tienen la
capacidad de solubilizar nutrientes indispensables para la planta, como el fosfato;
además producen fitohormonas, como el ácido indol acético, que promueve el
crecimiento vegetal por lo que se proponen como bioinoculantes por otra parte los
aislados que presentaron mayor producción de AIA fueron BE048 y BE036 los cuales se
evaluaron como productoras de fitohormonas a nivel invernadero. BE068 y BE080
solubilizaron el fosfato tricálcico y movilizaron fosforo hacia la planta; estos aislados
pertenecen al género Pseudomonas fluorescens. Finalmente se inocularon en plantas de
alfalfa y trigo, para evaluar su potencial como bacterias promotoras del crecimiento,
vi
ABSTRACT
Until today the role of bacteria inside plants is still unknow; it has been demonstrated
that endophytic bacteria are in a close contact with the plant, wich can be attribuited to
its ability to increase plant growth, solubilization of essential nutrients as phosphorus or
its help in nitrogen fixation in plants. Nowadays, Mexico is considered a main
strawberry productor and exporter and to be able to keep said level in the worldwide
market, the concern about the improvement of its production has increased recently;
that’s why this work was focused in the isolation of bacteria from the internal tissue of
this plant; as well as the assessment of a putative effect on plant growth. Strawberry
plants from the states of Guanajuato and México were sampled and bacteria were
isolated from superficially disinfested leafs and roots. The majority of the isolated were
obtained from root, and this distribution its supposed to be influenced by the availability
of nutrients and the minor competition against rhizosphere bacteria. Molecular and
traditional methodologies were used for the characterization and identification of the
isolates. For the molecular identification, the DNA from each isolated was obtained and
its 16S rRNA gene was sequenced, finding strains closely related to the genera
Pseudomonas, Bacillus, Paenibacillus, Rhizobium, Arthrobacter, Rhodococcus,
Staphylococcus, Burkholderia and Agrobacterium, being Pseudomonas the genera with
the most isolates. These strains have the capacity to solubilize essential nutrients for the
plant as indole acetic acid wich promotes the plant growth; based on these features, our
isolates can be suggested as bioinoculants for the improvement of crops. Based on these
results, the strains BE048 and BE036 are the best IAA producers an because of this
were selected for a greenhouse test. The strains BE068 and BE080 were able to
solubilize tricalcic phosphate and were tested as phosphorus solubilizer in plants. These
isolates belong to the species Pseudomonas fluorescens and wheat and alfalfa seedlings
were inoculated with these strains to assess its potential as growth promoting bacteria
under different treatments and the results were analized statistically.
1
I. INTRODUCCIÓN
1.1 Historia del cultivo de Fresa
Por el año 1400, se comenzó a cultivar en las laderas del sur de los Alpes la fresa
“alpina” (Fragaria moschata) que se distinguía por ser un planta con buen desarrollo y
frutos de un olor a almizcle. Alrededor del 1600 la planta de F. moschata fue llevada
por los colonizadores a América del Norte donde se adaptó muy bien en las costas del
Este. En 1614, el misionero español Alfonso Ovalle descubrió en Chile, cerca de la
población de Concepción, unos frutos grandes de fresas, que fueron clasificados
posteriormente como Fragaria chiloensis
(http://www.proexant.org.ec/Manual_Frutilla.html). Por otro lado, otros misioneros
documentaron otra especie nativa en el Norte de América, nombrándola Fragaria
virginiana (Ashman 1998).
En 1714, iniciaron los primeros trabajos de mejoramiento a través de
cruzamientos e hibridaciones. Del cruzamiento entre las especies de Fragaria chiloensis
y Fragaria virginiana se obtuvo una subespecie híbrida de mejor rendimiento y de
frutos grandes, la cual se clasificó como Fragaria × ananassa Dútchense, y entonces
regresó a América del Norte como un híbrido domesticado
(http://www.proexant.org.ec/Manual_Frutilla.html), a partir de este híbrido se han
desarrollado las variedades cultivadas actualmente (Stuadt 1989).
Cabe destacar que los trabajos de mejoramiento a través de cruzamientos e
hibridaciones usando especies americanas continuaron realizándose por varios
investigadores a finales del siglo XVIII. A partir de 1900, la Universidad de California,
EUA intensificó notablemente los trabajos de mejoramiento genético.
La fresa es una de las frutas de mayor aceptación mundial, utilizándose a nivel
comercial como producto de exportación e importación ya sea estado de congelación o
bien como producto fresco, también se utiliza en medicina y repostería como
saborizante (Zabetakis 1997).
2
Macías Rodríguez et al. (2002) señala que la composición química y los
atributos de calidad de la fresa se ven altamente influenciados por la combinación de
varios factores genéticos (variedad) y geográficos (clima y suelo, entre otros).
1.2 Clasificación de la Fresa
Familia Rosaceae
Subfamilia Rosoideae
Tribu Potentilleae
Género Fragaria
Especie Fragaria vesca, Fragaria dioica, Fragaria chiloensis
Fragaria virginiana
Fragaria × ananassa Dutch. es la subespecie híbrida más empleada en cultivos,
caracterizada por el incremento en la demanda de algunos de sus nutrientes como
fósforo, potasio y nitrógeno (Nestby & Tagliavini 2005).
1.3 Características de la fresa
La fresa es una planta perenne que produce brotes nuevos cada año. Presenta una
roseta basal de donde surgen las hojas y los tallos florales, ambos de la misma longitud.
En los tallos florales no presentan hojas. En su extremo aparecen las flores de cinco
pétalos blancos, que pueden ser perfectas (hermafroditas) o imperfectas (unisexuales),
las variedades actuales producen flores hermafrodita (Parker 2000).
Las hojas se subdividen en tres foliolos, pinadas o palmeadas, que se hallan
insertadas en pecíolos pilosos, tiene estipulas en su base y el espesor varía según la
variedad, son de color verde que manifiesta una nervadura destacada al igual que una
gran pilosidad como se observa en la Figura 1(Parker 2000).
El tallo es un eje corto de forma cónica denominado “corona”, a partir de éste se
genera una estructura denominada estolón, los cuales proceden de una planta madura
(planta madre); éstos crecen a lo largo del suelo. Se forman a partir del ápice apical de
la planta y en su extremo final se forma una roseta de hojas que en contacto con el suelo
3
puede originar raíces; produciendo una planta nueva idéntica a la planta madre (Parker
2000).
La raíz es de aspecto fibroso originada en la corona, presenta raíces primarias y
secundarias. Las raíces primarias o principales son gruesas y de color café oscuro con
una función de soporte. Las raíces secundarias son delgadas y de color marfil, las cuales
presentan una capacidad mayor en la captación de nutrientes (Parker 2000).
El fruto es de color rojo, carnoso, formado a partir del receptáculo floral de una
flor simple; es la parte comestible de la planta. En la superficie presenta múltiples
semillas duras llamadas aquenios de color amarillo. El fruto puede presenta de 150 a
200 aquenios (Figura 1) (Parker 2000).
Figura 1. Planta de fresa. De izquierda a derecha: hoja, flor y fruto (www.organic-city.com).
Las condiciones óptimas de crecimiento de la planta de fresa se presentan en una
gran intensidad de luz. La influencia del suelo, su estructura física y contenido químico
es una de las bases para el desarrollo de la planta, ésta requiere suelos equilibrados,
ricos en materia orgánica, aireados y bien drenados. El pH del suelo debe oscilar entre
6.5 a 7.0, situándose el óptimo en 6.5 e incluso menor (Parker 2000).
1.4 Importancia económica del cultivo de fresa en México
El cultivo de la fresa en México se inició a mediados del siglo pasado, en el
estado de Guanajuato, con variedades procedentes de la región de Lyon, Francia. En un
principio, esta producción apenas incipiente, se concretaba a cubrir las necesidades del
mercado doméstico; sin embargo, no fue sino hasta 1950, cuando la importancia de este
4
cultivo fue en aumento, debido a la creciente demanda por parte de Estados Unidos, con
el fin de asegurar su consumo durante el periodo invernal. Fue precisamente en ese
momento la posibilidad de México de exportar fresa, lo que originó que la instalación
de congeladoras y empacadoras proliferara en la región fresera de Guanajuato y se
extendiera al estado de Michoacán (http://sagarpa.gov.mx).
Para finales de los años ochenta, nuevas y mejores variedades se introdujeron al
país, y son, las que actualmente se cultivan y comercializan tanto en el mercado
nacional como en el internacional. Entre estas variedades podemos mencionar a la
Pájaro (o Pico de Pájaro como se conoce en algunas regiones del país), Chandler, Selva,
Oso grande, Seascape, Camarosa, Parker, Fern, etc. (Tabla 1) (http://sagarpa.gov.mx).
Tabla 1. Origen y nombres de las principales variedades de fresa cultivadas en México.
Variedades de la Universidad de
California
Variedades de la Universidad de
Florida
Pájaro o Pico de pájaro Camino real
Chandler Ventana
Oso grande Festival
Selva Carisma
Seascape
Camarosa
Parker
Fern
Gaviota
La fresa (Fragaria × ananassa Dutch.) es uno de los frutos mas populares en el
mundo. Se considera a México como un productor nacional importante y exportador de
fresa. Para poder mantener su posición en el mercado internacional existe un enorme
interés para mejorar la producción de fruta y su calidad (Macías-Rodríguez 2002).
En México el cultivo de fresa cubre una superficie de 2,500 a 3,000 hectáreas
(ha) aproximadamente. Los cultivos de fresa se concentran en los estados de
Michoacán, Guanajuato, Baja California Norte, Jalisco y el Estado de México
(Fundación PRODUCE 2003).
5
De acuerdo a datos dados a conocer por la Secretaría de Agricultura, Ganadería,
Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA), en el año 2001 cada uno de esos
estados alcanzaron el siguiente monto de producción de fresa medido en toneladas:
Aguascalientes 20, Baja California 31617.88, Baja California Sur 6122.30, Chihuahua
490.80, Durango 18.75, Guanajuato 19585, Jalisco 274.25, Edo. de México 3510.5,
Michoacán 68461.22, Morelos 224.5, Nayarit 360 y Querétaro 3.
La importancia de los cultivos de fresa radica en que es un producto perecedero
rentable, con una creciente posibilidad de expansión de consumo que genera un gran
número de empleos en la época de cosecha y de actividades laborales que se dan en la
industria de congelados, preparados y mermeladas (SEDAGRO 2005).
La mayoría de los cultivares de fresa provienen de clima templado, por lo que
requieren de cantidades moderadas de calor y no responden a altas temperaturas como
otros cultivos (Martínez Téllez et al. 2004).
1.5 Relación planta - endófitos
La palabra endófito se deriva del griego endon, que significa dentro y phyte que
significa planta. De Barry fue el primero en utilizar este término, en el año 1866, al
referirse a hongos viviendo dentro de los tejidos de una planta (Petrini 1986). Hasta la
fecha, el término endófitos se refiere a los microorganismos que pueden ser aislados de
tejidos vegetales desinfestados por superficie o extraídos del interior de la planta, y
visiblemente no perjudican a éstas (Hallman et al. 1997; Schulz & Boyle 2006).
También se puede definir a los endófitos como microorganismos que pueden colonizar
espacios intercelulares y vasculares en tejidos de plantas sin expresar patogenicidad o
proporcionar algún beneficio (Wang et al. 2006). En esta definición, se pueden
diferenciar los endófitos simbióticos y patógenos.
Anteriormente se desconocían las funciones de los endófitos. Inicialmente, las
bacterias endofíticas fueron consideradas como patógenos latentes o como
contaminantes de una incompleta desinfestación incompleta de la superficie, pero desde
entonces varios reportes han demostrado que las bacterias endofíticas son capaces de
promover el crecimiento y la salud de la planta (Compant et al. 2005).
6
Los microorganismos endófitos también inhibir patógenos, ayudan a remover
contaminantes, solubilizan fosfatos y contribuyen a asimilar el nitrógeno por las plantas.
Algunos endófitos se encuentran desde la semilla, pero otros tienen mecanismos para
colonizar las plantas. Otros son patógenos para humanos, tal es el caso de Salmonella
sp., que se ha encontrado como endófito en zanahoria, y esa bacteria no se ha eliminado
por el procedimiento de desinfestación el cual eliminan las bacterias superficiales
(Rosenblueth et al. 2006).
La estimulación del crecimiento por microorganismos puede ser a consecuencia
de la fijación de nitrógeno (Hurek et al. 2002; Iniguez et al. 2004; Rosenblueth et al.
2006; Sevilla et al. 2001) o la producción de fitohormonas, biocontrol de fitopatógenos
en la zona de raíz a través de la producción de agentes antifúngicos o antibacteriales,
producción de sideróforos o inmunidad (Sessitsch et al. 2002).
1.6 Bacterias endofíticas
Dentro de los endófitos un grupo importante son las bacterias endofíticas, estas
bacterias son universales en las plantas y a su vez cada planta puede tener uno o más
especies. Por eso es de esperarse una gran diversidad de bacterias endofíticas.
Recientemente se han realizado estudios moleculares sobre diversidad de bacterias
endofíticas y han revelado que existe una gran riqueza de géneros y especies
(Rosenblueth et al. 2006).
El número de bacterias endofíticas varia principalmente depende de la planta que
colonizan y la región de donde fueron obtenidas, por ejemplo, existen reportes de
poblaciones de organismos endofíticos diazotróficos en arroz de 102 a 10
3 UFC g
-1
(peso fresco) tanto de raíces y tejidos (Gyaneshwar et al. 2001). En ramas de plantas
cítricas se ha reportado de 103 a 10
4 UFC g
-1 (peso fresco)(Araújo et al. 2002); también
se han reportado en caña de azúcar 102 a 10
6 UFC g
-1 (Mendes et al. 2007).
Se ha reportado que las bacterias endofíticas pueden tener dos efectos
principales (Figura 2). En primer lugar, es posible que, incrementen la capacidad de las
plantas de absorber los nutrientes del suelo, mediante el incremento y desarrollo de
7
raíces, ayudando a la solubilización de los fosfatos y la fijación biológica del nitrógeno
(Li et al. 2007).
En segundo lugar, se documenta el potencial de estos microorganismos como
agentes controladores de patógenos. Este fenómeno de biocontrol se presenta debido a
que los endófitos pueden establecer una relación mutualista con la planta desde su
interior, mediante la cual le confieren protección contra factores bióticos y abióticos
adversos (Schulz & Boyle 2006).
Figura 2. Diagrama de las diferentes interacciones endofíticas planta-bacteria (Ryan et al. 2008). En esta
figura se muestran las funciones de las bacterias endofíticas en la planta.
Los nichos endofíticos ofrecen protección del ambiente a aquellas bacterias que
puedan colonizar y establecerse en las plantas. Estas bacterias normalmente colonizan
espacios intercelulares y se han aislado en todos los componentes de las planta (Posada
Vega; Ryan et al. 2008).
Producción de plantas y promoción
del crecimiento
Promoción del crecimiento en
la planta/ Fitoestimulación
Solubilización de nutrientes/
captación
Pseudomonas sp.
Enterobacter sp.
Staphylococcus sp.
Azotobacter sp.
Azospirillum sp.
Bacterias Endofíticas
Cultivables/no cultivables
Salud de la Planta y protección
Protección contra patógenos
Producción de compuestos
antimicrobianos
Pseudomonas sp.
Serratia sp.
Clavibacter sp.
Bacillus sp.
8
Las bacterias endofíticas se han aislado de plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas, que va desde especies de árboles leñosos, tales como roble o peral, hasta
cultivos de plantas herbáceas como la remolacha y el maíz. Los estudios clásicos de la
diversidad de bacterias endofíticas se han enfocado en la caracterización de los aislados
obtenidos de los tejidos internos tras una desinfestación de la superficie de las plantas
con hipoclorito de sodio o algún agente similar (Miche & Balandreau 2001; Ryan et al.
2008).
Franks et al. (2006) dieron una aproximación molecular para el aislamiento y
caracterización de bacterias endófitas y su asociación con la planta. Las comunidades
bacterianas que no habitan tejidos, raíces o tubérculos de diferentes variedades de
plantas fueron analizadas por técnicas moleculares como, T-RFLP (Terminal Restriction
Fragment Length Polymorphism), DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
usando como marcador molecular para al gen 16S rDNA. Dichas clasificaciones,
demostraron que la mayoría de los microorganismos endófitos promueven la
colonización y fueron identificadas como Cellulomonas sp., Clavibacter sp.,
Curtobacterium sp., Pseudomonas sp. y Mycobacterium sp., además se identifiacron
con otras pruebas de ácidos grasos y utilización de fuentes de carbono (Ryan et al.
2008; Recuenco & Van Vuurde 2000; Zinniel et al. 2002).
El aislamiento de bacterias endofíticas se puede caracterizar por la comparación
de un análisis parcial de la secuencias de los genes 16S rDNA, BOX-PCR y una
caracterización fisiológica con respecto a la utilización de sustratos, producción de
antibióticos, sensibilidad a los metales y resistencia a patógenos (Germaine et al. 2006;
Ryan et al. 2008).
1.7 Bacterias endofíticas como promotoras del crecimiento vegetal
En la rizósfera existe una gran diversidad de bacterias, lo cual ocasiona que en
este ambiente exista una competencia fuerte por los nutrientes y en consecuencia que su
disponibilidad sea limitada. Con base en esos se ha considerado que las bacterias
endófitas pueden tener algunas ventajas competitivas sobre otras bacterias rizosféricas,
ya que la disponibilidad de los nutrientes es mayor en el interior de las plantas y el
9
número de microorganismos endófitos es menor que los rizosféricos (James 2000;
Muñoz Rojas & Caballero-Mellado 2003).
Considerando que las bacterias se ubican en contacto íntimo con las plantas,
estas podrían brindar beneficios más directos hacia su hospedero. Por ejemplo, la
producción de fitohormonas juega un papel muy importante como reguladoras del
crecimiento y desarrollo de las plantas. De acuerdo con la clasificación convencional
existen cinco grupos de fitohormonas: auxinas, giberelinas, citocinas, etileno, y acido
abscícico. Las fitohormonas contribuyen a la coordinación de diversos procesos
fisiológicos en las plantas incluyendo la regulación de la germinación, formación de
raíz, fructificación y maduración del fruto. Estas, además incrementan la resistencia a
factores ambientales e inducen la supresión y expresión de genes, la síntesis de enzimas,
pigmentos y metabolitos (Tsavkelova et al. 2005).
Los inoculantes bacterianos pueden ser generados a base de bacterias endofíticas
que colonizan la rizósfera antes de penetrar a los tejidos (Azevedo 1998). Estas
bacterias, deben presentar algún mecanismo para una de las siguientes funciones:
Control biológico contra fitopatógenos, producción de fitohormonas o suplemento de
nutrientes para la planta (nitrógeno o fosfato). Aunque los endófitos pueden
interaccionar con las plantas a través de diferentes vías, es importante que los endófitos
se relacionen con el crecimiento de la planta y la producción de moléculas como
auxinas.
Las auxinas son las responsables del crecimiento de la planta por división y
alargamiento de sus células en todos los niveles; este grupo estimula la germinación,
incrementa el xilema y la formación de raíces, controlan procesos vegetativos como
crecimiento, tropismo, floración y fructificación en plantas. Su representante principal,
por ser el mas abundante en la naturaleza es el ácido indol acético (IAA) cuyo precursor
es el aminoácido triptófano (Tsavkelova et al. 2005).
El fósforo es uno de los nutrientes esenciales más importantes para el
crecimiento y desarrollo de las plantas en todas sus etapas fisiológicas, además de
formar parte de biomoléculas vitales para la planta, pero es a la vez el elemento que esta
en menor disposición, ya que rápidamente es inmovilizado después de agregarlo al
10
suelo como fertilizante (Días et al. 2008). Es posible que las bacterias endofíticas
incrementen la capacidad de las plantas para absorber los nutrientes del suelo, mediante
la solubilización de los fosfatos (Li et al. 2007).
11
II. ANTECEDENTES
La asociación de los microorganismos endófitos con su hospedero puede ser
mutualista, simbiótica o bien algunos de estos microorganismos son patógenos y estar
en estado de latencia. Actualmente existe un gran interés por estudiar las bacterias
endofíticas, ya que éstas se asocian a una gran cantidad de plantas así como sus posibles
aplicaciones en el área de agrobiotecnología. En la Tabla 2 se muestran algunos cultivos
de los cuales se han aislado dichas bacterias y su posible función dentro de la plantas
(Muñoz & Caballero 2001).
Tabla 2. Bacterias endófitas aisladas de plantas de interés agrícola y función dentro de la planta.
PLANTA REFERENCIA BACTERIAS
ENDOFÍTICAS ORÍGEN FUNCIÓN
Arroz Chantreuli et al. 2000 Bradyrhizobium
japonicum
Rhizobium
leguminosarum
Serratia marcescens
Filipinas
Brasil
México
Bacterias Promotoras del
Crecimiento (PGPB)
Maíz Rosenblueth et al.
2006
Araújo et al. 2001
Burkholderia sp.
Enterobacter sp.
Klebsiella sp.
Bacillus megaterium
México
Brasil
Fitorremediación promueve
resistencia al tolueno
Mayor producción
Papa Azevedo et al. 2008
Sturtz 1995
Sinorhizobium meliloti
Pseudomonas sp.
Brasil
Austria
PGPB
Protección contra patógenos
Cítricos Araújo et al. 2001 Curtobacterium
flacumfaciens
Enterobacter cloacae
Bacillus sp.
Nocardia sp
Brasil Resistencia a infecciones de
patógenos
Caña Jiménez- Salgado et
al. 1997
Gluconobacter
diazotrophicus
Herbaspirillum sp.
México Fijación de nitrógeno
Crecimiento de la planta
La diversidad de las bacterias endofíticas y simbióticas asociadas a las plantas
cultivadas en México y sus interacciones entre sí, son las líneas principales de
investigación en nuestro grupo de trabajo.
En nuestro laboratorio se realizaron investigaciones de los microorganismos
asociados a plantas nativas importantes de México. Se encontró en la leguminosa
arbórea Conzattia multiflora, nativa de México, enterobacterias de los géneros Pantoea
sp., Enterobacter sp., Klebsiella sp., Erwinia sp, y Salmonella sp. como endófitos; las
12
cuales no tienen un efecto claro en el crecimiento del árbol (Wang et al. 2006). En
alfalfa, otra leguminosa importante en México, se aisló Bacillus sp. y Serratia sp. como
las bacterias endofíticas más abundantes (resultados no publicados). En un trabajo del
efecto del hongo micorrízico arbuscular Glomus intraradices sobre la planta de fresa
Fragaria x ananassa, también se encontraron bacterias endofíticas en las raíces y hojas
del orden de 107 y 10
4 UFC g
-1 de tejido fresco, aunque no hubo más caracterizaciones
sobre estas bacterias. La abundancia de éstas en la planta se incrementó con la
inoculación del hongo micorrízico (datos no publicados).
Lo anterior demostró que un gran número de géneros y especies bacterianas se
puede encontrar en diferentes plantas, las cuales son importantes para las actividades
agrícolas de México. Estos resultados y los de otros grupos de investigación han
causado gran interés en nuestro grupo de trabajo sobre la diversidad e impacto de las
bacterias endofíticas asociadas a las plantas en México, además del potencial uso que
pueden tener en la agrobiotecnología.
13
III. JUSTIFICACIÓN
México ocupa uno de los primeros lugares a nivel mundial como productor y
exportador de fresa. Los estados de Baja California, Michoacán y Guanajuato son los
mayores productores de este cultivo.
Se ha demostrado que las bacterias endofíticas pueden promover el crecimiento
de las plantas debido a la producción de fitohormonas y solubilización de nutrientes.
En México existe una gran diversidad de estudios enfocados a las asociaciones
planta-microorganismo en cultivos agrícolas; aún no existe evidencia experimental de
trabajos sobre la interacción de bacterias endofíticas en la planta de la fresa.
Considerando lo anterior este trabajo se realizará con el fin de identificar a las
bacterias que se encuentran eneolíticas de la planta de fresa y el efecto que pueden
ejercer al colonizar los tejidos de plantas, además de que podrían utilizarse como
bacterias promotoras del crecimiento en fresa y otros cultivos de importancia agrícola.
14
IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Aislar, caracterizar e identificar las bacterias endofíticas de Fragaria ×
ananassa Dutch. y evaluar su efecto en plantas de interés agrícola.
4.2 Objetivos particulares
Cuantificar y aislar de bacterias endofíticas de hojas y raíces de la planta de
fresa.
Identificar molecular de las bacterias aisladas basadas en el marcador molecular
16S rDNA.
Evaluar el efecto de la producción de fitohormona en alfalfa y trigo por los
aislados endofíticos de Fragaria × ananassa Dutch.
15
V. MATERIALES Y MÉTODOS
El diseño general del trabajo experimental fue el siguiente.
5.1 Diagrama general de trabajo
Muestreo de
plantas de fresa
Análisis Fisicoquímico
del suelo
Cuantificación de
bacterias endofíticas
pH
Nitrógeno
Fósforo
Potasio
Aislamiento de bacterias en
raíces y hojas
Purificación y conservación
de aislados
Secuenciación
Identificación molecular
de aislados
Caracterización fenotípica de
aislados
Análisis de diversidad
Fijación de Nitrógeno
Producción de IAA
Solubilización de fosfatos
Selección de aislados
Evaluación del efecto de los
aislados en plantas de interés
agrícola
16
5.2 Muestreo
Las plantas se recolectaron de dos estados de la República Mexicana en las
cuales se cultiva fresa.
En el Estado de México: Ixtapan de la sal. Rancho “La Finca”. Municipio Villa
Guerrero.
En el estado de Guanajuato: Irapuato. Rancho “El Cohecillo” carretera rumbo a
Abasolo km6 (Figura 3).
Figura 3. Sitios de muestreo de izquierda a derecha Rancho “La Finca”, Estado de México; Rancho “El
Cohecillo”, Guanajuato.
Se recolectaron 5 plantas de cada lugar; en el mes de febrero 2008, durante la
temporada de cosecha, las plantas pertenecían a la variedad Camino Real; a este cultivo
se adicionaba fertilizantes y en ese campo se lleva a cabo la rotación de cultivos como
sorgo y trigo para alimento de ganado. La planta fue extraída del suelo a una
profundidad de 30 cm aprox.
5.3 Análisis fisicoquímico del suelo
Se realizó un análisis del suelo del área del cultivo bajo las siguientes metodologías:
a) pH: Se pesaron 10 g de suelo y se colocaron en un vaso de precipitado de
150ml, al cual se le agregaron 10 mL de CaCl2 0.01 M se mezcló y
posteriormente se tomaron las lecturas con un potenciómetro previamente
calibrado (Jackson 1970).
17
b) Nitrógeno total, fósforo total y potasio: Estos análisis se realizaron en un
laboratorio externo. Previamente las muestras fueron secadas y tamizado. La
prueba de nitrógeno total se realizo por método de Kjeldahl, el fosforo por el
método de Olsen y el Potasio por la técnica de flavometría.
5.4 Cuantificación y aislamiento de bacterias endofíticas
Para la obtención de bacterias endofíticas se realizó la metodología citada por Wang
et al. (2006). Se realizó un conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en 1g de
muestra de tejido fresco.
Los aislados fueron seleccionados con base en su morfología colonial y agrupados;
se realizó una tinción de Gram para su caracterización morfológica (Vincent 1970).
Para el proceso de purificación los aislados se resembraron hasta la obtención de
un cultivo puro y para la conservación, se sembraron en caldo PY, y después se
adicionó 500 µl de glicerol al 40% v/v, esto se hizo por duplicado. Se almacenaron a -
20ºC y posteriormente se pasaron a -70ºC.
5.5 Identificación molecular de los aislados
5.5.1 Extracción del DNA Genómico
Se extrajo DNA de los aislados por la técnica del CTAB propuesta por Allers &
Lichten 2000 y modificada por Rodríguez Tovar (ver anexo).
Para evaluar la calidad del DNA extraído primero se realizó una electroforesis
colocando 3 µl del DNA en un gel de agarosa al 1% (w/v) corrido a 70 volts durante 45
minutos utilizando un regulador de TBE 1X, después el gel se tiñio con 0.5 µl ml-1
de
bromuro de etidio durante 5 min y se observó bajo luz UV (Sambroock et al. 2002).
18
5.5.2 Amplificación del gen 16sDNA
El gen 16S rDNA se amplificó utilizando los siguientes iniciadores fD1 (5´-
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3´) y rD1 (5´-AAG GAG GTG ATC CAG CC-
3´). Estos iniciadores son universales y están derivados de las regiones conservadas del
gen 16S rDNA (Weisburg et al. 1991).
La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción de 100 μL,
conteniendo 50 μg de DNA molde, 5 μL de regulador (10 mM Tris-Cl [pH 9.0] a 25ºC,
50 μM de KCl, 1% Triton X-500), 1.5 mM de MgCl2, 200 μM de cada dNTP, 0.1 μM
de cada iniciador y 2.5 U de Taq polimerasa. Bajo los siguientes ciclos y temperaturas
primer ciclo de 5 min a 95ºC, 35 ciclos de desnaturalización (2 min a 94ºC),
alineamiento (30 s a 42ºC), y extensión (4 min a 72ºC) y un extensión final (10 min a
72ºC) Los productos de PCR se visualizaron mediante una electroforesis en gel de
agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
,.
Los productos finales de la amplificación del gen 16S rRNA de todas las cepas
se purificaron mediante un kit de purificación, kit PCR DNA purification (Quiagen).
Las secuencias se realizaron externamente por el Laboratorio de Bioquímica Molecular
Unidad de Biología, Tecnología y Prototipos (UBIPRO) FES IZTACALA, UNAM,
mediante el sistema ABI 3100 de 16 capilares que utiliza el MÉTODO BIG DYE
Terminator fluorescence based sequencing para análisis de secuencia y utiliza la Matrix
DS-30 para análisis de los fragmentos.
5.5.3 Análisis filogenéticos
Las secuencias obtenidas se sometieron a una búsqueda en el Gen Bank por
medio del programa BLASTN versión 2.2.3 en la página de la NCBI
(http://ncbi.nlm.nih.gov/).
Posteriormente se realizó un alineamiento múltiple con el programa CLUSTAL
W Múltiple Alignment, las secuencias se editaron con el .programa SEAWIEW, para
finalmente construir un árbol filogenético empleando el programa MEGA utilizando el
método de agrupamiento de “neighboor joining” y un análisis de bootstrap de 1000
19
repeticiones. Se usó el programa MODEL TEST para elegir el modelo de sustitución
más apropiado de acuerdo a los datos (Thompson et al. 1997).
5.6 Caracterización Fenotípica de los Aislados Representativos
5.6.1 Producción de indoles: Ácido Indolacético (AIA)
Se utilizó el protocolo de Glickmann - Dessaux (1994) con medio King B (Peptona
20 g L-1
; K2HPO4 1.15 g L-1
; MgSO4. 7H2O 1.5 g L-1
; Glicerol 1.5% vol/vol) con
triptófano a una concentración de 0.5 g L-1
. Los aislados fueron inoculados y se
incubaron a 28ºC en agitación durante 48 h, posteriormente, se centrifugó a 10000 rpm
durante 5 min y se tomó 1 mL del sobrenadante al cual se le agregó 2 mL del reactivo
de Salkowski (421.1 mL de H2SO4 concentrado; 10.81 g FeCl3) para tener una relación
1:2. La absorbancia fue leída a 530 nm de longitud de onda. Para conocer la
concentración de AIA se realizó una curva patrón a diferentes concentraciones de AIA:
0, 2, 4, 8, 10, 15, 20, 30 µg mL-1
. Con base en esta curva se calculó la concentración de
AIA producido por los aislados.
5.6.2 Solubilización de fosfato inorgánico
Para esta prueba se siguió la metodología citada por Nautiyal 1999 en donde se
utilizó el medio NBRIP el cual contiene: Glucosa 10 g; Ca3(PO4)2 5 g; MgCl2.6H2O 5 g;
MgSO4.7H2O 0.25 g; KCl 0.2 g; (NH4)2SO4 0.1 g; Agar 18 g en 1 L de agua destilada.
Las bacterias se sembraron por picadura en placa y se incubaron durante 7 días a
28ºC hasta la aparición de halos claros alrededor de la colonia. Después se midió el
tamaño de los halos y se calculó el índice se solubilización según la siguiente fórmula:
Índice de Solubilización = A/B
Donde: A= diámetro de la colonia + diámetro del halo
B= diámetro de la colonia (Kumar y Narula 1999)
20
5.6.3 Prueba de fijación biológica de nitrógeno
Para esta prueba se utilizó el medio Bridges, el cual es un medio sin fuente de
nitrógeno y su composición es K2HPO4 6.3 g L-1
; NaH2PO4 1.9 g L-1
; MgSO4 0.1 g L-1
;
Na2MoO4 0.008 g L-1
; Citrato férrico 0.008 g L-1
; Tioglicolato de sodio 0.5 g L-1
;
Glucosa 20 g L-1
.
Se inoculó el medio líquido con cada uno de los aislados y se dejaron incubar
durante 7 días, aquellas que resultaron positivas se volvieron a inocular en este mismo
medio para comprobar su crecimiento.
Después se midió la actividad de la enzima nitrogenasa en un cromatógrafo de
gases mediante la prueba de reducción de acetileno en donde se comprobó la actividad
bioquímica de esta enzima. Para esta prueba se inocularon viales de 20 mL, los cuales
contenían 10 mL de medio Bridges semisólido (2 g L-1
de agar) y se incubaron por 7
días o hasta observar un buen crecimiento. Después se colocó un tapón de goma y se
reemplazó el 10% de aire por el acetileno, se incubó por 48 h para después medir la
actividad en un cromatógrafo de gases. Los testigos utilizados para esta prueba son
Escherichia coli DH5α (control negativo) y Klebsiella varicola 801 (control positivo).
5.7 Evaluación del inóculo en plantas de interés agrícola
5.7.1 Efecto de la producción de fitohormona en trigo y alfalfa
De acuerdo con los resultados obtenidos en base a las pruebas fenotípicas de los
aislados, se seleccionaron los mejores representantes de cada prueba BE048 proveniente
de hoja y BE036 proveniente de raíz; se evaluó su efecto a nivel invernadero en semillas
de trigo y alfalfa. Debido a que la fresa requiere condiciones especiales para su cultivo y
no se contó con la infraestructura adecuada en el laboratorio, se utilizo un modelo
alternativo para evaluar el efecto del inóculo.
21
5.7.1.1 Trigo (Triticum aestivum) y alfalfa (Medicago sativa)
Se determinó el porcentaje de germinación el cual debería ser mayor a 90% para
asegurar el buen estado de las semillas (Beneduzi et al. 2008).
Las semillas se lavaron superficialmente con detergente, posteriormente se
colocaron en etanol al 70% por dos minutos y después hipoclorito de sodio al 1.2%
durante 10 min. Finalmente se realizaron diez lavados con agua estéril y se colocaron
las semillas en placas de Petri con medio agar agua (agar 0.75%) las placas se incubaron
durante 2 días a 28°C.
Preparación de maceteros
En el caso de trigo como maceteros se usaron vasos de unicel de 1L, los cuales se
desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 2% y se dejo secar, estos
fueron llenados hasta 3/4 partes con una mezcla 1:1 de vermiculita y peat-moss
esterilizado (autoclave durante 1 h por dos ciclos) el soporte se hidrato inicialmente con
agua destilada estéril, y se colocaron 4 semillas por macetero, se utilizaron 8 maceteros
por tratamiento para tener un total de 32 plantas por tratamiento.
Para alfalfa se utilizaron contenedores de polietileno con diámetro de 4 cm y una
profundidad de 8 cm (volumen 100.53 cm3) los cuales se desinfectaron de la misma
manera que los del trigo. Por cada contenedor se colocaron 3 plántulas y por cada serie
de tratamiento se utilizaron 12 contenedores para tener un total de 36 plantas por
tratamiento.
Preparación de inóculo
Se inocularon matraces con 25 mL de medio PY y se incubaron a 28°C durante 48 h
en agitación, posteriormente las células se cosecharon y se lavaron con solución salina
isotónica para eliminar el medio de cultivo, se ajustó el inoculo a 107
células mL-1
.
(Wang et al. 2006).
Se inocularon las plántulas directamente con 100 μL de la suspensión celular, se
cubrió con el soporte y se rego hasta 24 horas después de inocular. Se realizaron los
siguientes tratamientos:
T1: Azospirillum sp. (Control positivo)
T2: sin inóculo (Control negativo)
22
T3: Aislado BE048
T4: Aislado BE036
Las plantas se mantuvieron en condiciones de invernadero durante 50 días
(Beneduzi et al. 2008) y se regaron cada 72 h con 200 ml de solución nutritiva completa
para trigo (García 1992) y alfalfa solución Fáhraeus (Somasegaran & Hoben 1994).
Las variables ecofisiológicas en ambas plantas fueron:
Biomasa seca de la planta
Longitud de la parte radicular
Parte aérea
Longitud total
Número de hojas
Los datos obtenidos para los diferentes tratamientos fueron analizados mediante un
análisis de varianza (ANOVA) comparando las medias de los tratamientos mediante la
prueba de Tukey (p ≤ 0.05). Estos análisis se realizaron con el software SAS (SAS
1989). Los datos mostrados son medias de veinte valores (N = 20). Para observar
gráficamente el efecto de los tratamientos en cada variable de las dos plantas se realizó
un análisis descriptivo de cada bioensayo con una gráfica de coplot;. Se utilizó la
función co-plot del paquete graphics del ambiente R (R Development Core Team 2008).
Se realizó un Análisis de Componentes Principales (ACP) para determinar la
relación entre las variables ecofisiológicas evaluadas, y los tratamientos usando una
rotación ortogonal/VARIMAX Las variables se auto escalaron antes del ACP. El
número de componentes se determinó por el criterio del valor propio. Por otra parte, se
realizó una prueba para corroborar los resultados, se conservaron componentes
principales con valores propios >1 y que explicaron > 10% de la variación total. Se
realizó una rotación VARIMAX para realzar la interpretación de los componentes sin
correlación. El ACP revela a menudo asociaciones no previstas entre variables y de tal
modo permite una interpretación que no sería posible de otra manera. Para el efecto de
la fijación biológica de nitrógeno, con una matriz de 200 filas (10 tratamientos, 20
repeticiones) y 5 columnas (variables numéricas).
23
Se utilizó el paquete Ade4 ACP (Chessel et al. 2004) con la función dudi.pca, se
utilizó el ambiente R 2.9 (R Development Core Team, 2008) para cada planta con todas
sus variables más importantes e independientes entre si.
5.7.2 Bioensayo para evaluar la capacidad de los aislados de solubilizar fosfato
tricálcico en plantas de trigo y alfalfa
5.7.2.1 Diseño experimental
El ensayo se estableció bajo un diseño multifactorial en donde los factores a
evaluar fueron: la capacidad de movilización de Ca3(PO4)2 en soporte y fósforo en
solución.
La combinación de estos factores género 10 tratamientos los cuales contaron con
6 repeticiones dando lugar a 60 individuos por tratamiento. Cada macetero tenia 5
plantas, teniendo un total 300 plantas para este análisis.
5.7.2.3 Trigo (Tritricum aestivum) y alfalfa (Medicago sativa)
La germinación de las semillas se siguió según la metodología descrita
anteriormente, así como también la preparación de los maceteros.
Para esta prueba se consultó la cantidad de fósforo que se agrega en campo para
cultivo de trigo; estableciéndose que la dosis recomendada de fosforo para trigo según
el INIFAP son 120 kg por ha. Además se considera como superficie arable de 15 cm de
profundidad; por lo tanto, se removió la capa superficial del macetero y se mezcló con
0.0164 g de Ca3(PO4)2.
Para el cultivo de alfalfa la dosis recomendada de fosforo es de 80 kg por ha del
cultivo (INIFAP 2004). Se aplicó 0.00536 g de Ca3(PO4)2 por cada macetero.
Preparación de inóculo y tratamiento
Se inocularon matraces con 25 mL de medio PY y se incubaron a 28°C durante 48 h
en agitación, posteriormente las células se cosecharon y se lavaron con solución salina
isotónica para eliminar el medio de cultivo, se ajustó el inoculo a 107
células mL-1
.
(Wang et al. 2006).
24
Las plántulas se inocularon directamente con 100 μL de la suspensión celular, se
cubrió con el soporte y se rego hasta 24 horas después de inocular. Se realizaron los
siguientes tratamientos:
T1: regadas con solución nutritiva completa
T2: regadas con solución nutritiva sin fósforo
T3: soporte con Ca3 (PO4)2 regado con solución completa
T4: soporte con Ca3 (PO4)2 regado con solución sin fosforo
T5: aislado BE080 + T1
T6: aislado BE080 + T3
T7: aislado BE080 + T4
T8: aislado BE068 + T1
T9: aislado BE068 + T2
T10: aislado BE068 + T4
5.7 Análisis estadístico
Las variables ecofisiológicas en ambas plantas fueron:
Biomasa seca de la planta
Longitud de la parte radicular
Parte aérea
Longitud total
Número de hojas
Los datos obtenidos para los diferentes tratamientos fueron sometidos a un análisis
de varianza (ANOVA) utilizando un modelo lineal. Estos análisis se realizaron con el
software PROC GLM (SAS 1989), comparando las medias de los tratamientos y
considerando datos significativos mediante la prueba de Tukey (p ≤ 0.05). Los datos
mostrados son medias de veinte valores (N = 20). Para observar gráficamente el efecto
de los tratamientos en cada variable de las dos plantas se realizó un análisis descriptivo
de cada bioensayo con una gráfica de coplot. Se utilizó la función co-plot del paquete
graphics del ambiente R (R Development Core Team 2008).
Se realizó un Análisis de Componentes Principales (ACP) para determinar la
relación entre las variables ecofisiológicas evaluadas y los tratamientos usando una
25
rotación ortogonal/VARIMAX Las variables se auto escalaron antes del ACP. El
número de componentes se determinó por el criterio del valor propio. Por otra parte, se
realizó una prueba para corroborar los resultados, se conservaron componentes
principales con valores propios >1 y que explicaron > 10% de la variación total. Se
realizó una rotación VARIMAX para realzar la interpretación de los componentes sin
correlación. El ACP revela a menudo asociaciones no previstas entre variables y de tal
modo permite una interpretación que no sería posible de otra manera. Para el efecto de
la fijación biológica de nitrógeno, con una matriz de 200 filas (10 tratamientos, 20
repeticiones) y 5 columnas (variables numéricas).
Se utilizó el paquete Ade4 ACP (Chessel et al. 2004) con la función dudi.pca, se
utilizó el ambiente R 2.9 (R Development Core Team, 2008) para cada planta con todas
sus variables más importantes e independientes entre si. Dos ACP se realizaron por
planta: Para el efecto de la FOSFORO, con una matriz de 200 filas (10 tratamientos, 20
repeticiones) y 5 columnas (variables numéricas). Se utilizó el paquete Ade4 ACP
(Chessel et al., 2004) con la función dudi.pca. Para la ejecución de todos los programas
estadísticos se utilizó el ambiente R 2.9 (R Development Core Team, 2008). Para mayor
detalle del programa ver Anexo.
26
VI. RESULTADOS
La plantas recolectadas fueron colocadas en bolsas negras de polietileno junto con
una porción de suelo para poderlas transportar al laboratorio; fueron procesadas
inmediatamente.
6.1 Análisis fisicoquímico del suelo
Para este análisis se obtuvieron dos muestras de suelo de donde provenían las
plantas del Estado de México y la otra de Guanajuato. Se realizó un análisis del tipo de
suelo en para cada región. Estos resultados (Tabla 3) se compararon con los índices ya
reportados en la Norma Oficial Mexicana NOM-021-SEMARNAT-2000.
Tabla 3. Características fisicoquímicas de los suelos.
Características fisicoquímicas del suelo
Determinación Edo. México Guanajuato NOM-021
pH 5.7 6.4 ligeramente ácido a
medio
Nitrógeno total
(método de
Kjeldahl)
0.13% 0.13% Bajo
Fósforo (método
Olsen) 9.5 mg kg
-1 7.34 mg kg
-1 Medio
Potasio
(flavometría) 4,193.4 mg kg
-1 224.7 mg kg
-1 Suelo salino
Se puede apreciar que las plantas provienen de un suelo ligeramente ácido, con baja
concentración de nitrógeno y fósforo; estos resultados no varían mucho en cuanto a la
procedencia de la planta sólo se observa una mayor cantidad de potasio en el suelo del
Estado de México (Tabla 3).
6.2 Cuantificación y aislamiento de bacterias endofíticas
Se realizó un conteo de UFC g-1
de bacterias endofíticas cultivables en tejido fresco
de hojas y raíces. Se obtuvieron valores 102 y 10
3 de UFC g
-1 para hoja, mientras que
para raíz se obtienen valores de 105 hasta 10
7 UFC g
-1, siendo estas las que presentan
una mayor colonización de bacterias endofíticas (Tabla 4).
27
En total se obtuvieron 39 aislados provenientes de tejidos de la planta de fresa. Estos
fueron agrupados de acuerdo a sus características morfológicas donde se observaron 10
morfotipos. Los aislados se nombraron con las siglas BE0 y el número del 01, 02, 03,
etc; la observación microscópica de los aislados muestra que el 45% pertenecen a
Bacilos Gram positivos, 46% de Bacilos Gram negativos, 9% Cocos Gram positivos.
Tabla 4. Abundancia de bacterias endofíticas provenientes de hojas y raíces de la planta de fresa.
Estado de México (UFC g-1
tejido fresco)
Estado de Guanajuato (UFC
g-1
tejido fresco)
Planta Hoja Raíz Hoja Raíz
1 8 ×102 6.7 × 10
5 2 × 10
2 1.3 × 10
5
2 6 ×102 5.3 × 10
7 2.5 × 10
2 2.3 ×10
5
3 2.5 ×103 2 × 10
5 3 ×10
2 6 ×10
4
4 3 × 102 4 × 10
5 7 × 10
3 5.3 × 10
7
5 2 × 103 1.1 × 10
7 1 ×10
3 7.6 × 10
6
6.4 Identificación molecular mediante la amplificación del gen 16S rDNA
Se extrajo DNA con la técnica de Allers & Lichten 2000 y se uso para amplificar
el gen 16S rDNA; en la Figura 4, se muestra un gel representativo donde se obtuvo un
amplificado específico de 1500 pares de bases (pb) el cual corresponde a el gen 16S
rDNA.
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa 1% 70 Volts durante 1h, mostrando el amplificado del gen 16S
de la talla esperada. Carril 1 MTM, Carril 2 BE008, Carril 3 BE021, Carril 4 BE064, Carril 5 BE080, Carril 6
BE088, Carril 7 BE028, Carril 9 BE030.
Con las secuencias obtenidas a partir del producto purificado de la amplificación
del gen 16S rRNA, con los iniciadores FD1 y RD1 se han identificado siete géneros
bacterianos en donde predomina Pseudomonas (Tabla 6).
1500 pb
28
Rhodococcus erythropolis (GU991529) Rhodococcus sp. (GU944775)
BE037R Uncultured bacterium (HM341193)
BE004R Uncultured bacterium (HM341194) Staphylococcus sp. (FJ897492) Staphylococcus haemolyticus (FJ999931)
BE012H Staphylococcus sp. (AB558502)
BE003H Staphylococcus pasteuri (DQ298129)
BE011H Bacillus sp. (EU571157) Bacillus senegaliensis (EF690434)
BE097R BE042H
BE023H Bacillus simplex (FJ644693)
Brevibacterium sp. (AB536974) BE002H
Bacillus pumilus (EU379282) BE008R
BE017R Bacillus sp. (HM103322) BE073H
Bacillus megaterium (GQ889251) BE016R
Paenibacillus polymyxa (EU362606) Paenibacillus sp. (GU328694)
BE013R Stenotrophomona sp. (GQ985466)
Stenotrophomona maltophilia (GQ861457) BE068R Pseudomonas tolaasii (AF348507) Pseudomonas sp. (AF348508)
BE086R BE070H
Pseudomonas fluorescens (FN675867) BE064R
Pseudomonas sp. (DQ885950) BE0101R Pseudomonas brassicacerum (EU195810) Pseudomonas mediterraneum (EF673038)
BE0105H BE043H
BE047R Pseudomonas trivialis (HM134251) Pseudomonas trivialis (HM134248)
BEO48R Pseudomonas sp. (AY700023)
Pseudomonas brenneri (EU169146) BE036R
BE026R Burkholderia cepacia (GQ149776)
Rhizobium sp. (GU128887) Rhizobium sp. (EF437250)
BE028R Agrobacterium tumefaciens (GQ140317) Agrobacterium tumefaciens (GU902302)
50 100
47
100
100
69 100
45 100
54 100
49 99
52 68
100
60 100
43 100
88
100
42 94
99
44 82
99
48
45
91
100
99
100 78
61 60
59
49
100
36
0.02
29
Figura 5. Dendograma de las secuencias parciales del gen 16s rRNA con el iniciador fD1. Análisis
basado en los datos de las secuencias parciales del gen 16S rRNA con 1000 repeticiones tipo “Bootstrap”,
por el método de agrupamiento “Neighbor Joining” usando el índice de distancia Kimura 2 parámetros.
La barra indica el número de cambios en todas las secuencia.
6.5 Caracterización fenotípica de los aislados
6.5.1 Producción de indoles: Ácido Indolacético (IAA)
Se realizó una curva de calibración de IAA. Los datos obtenidos se interpolaron en
dicha gráfica para cuantificar la concentración de fitohormona producida por aislados.
(Figura
Figura 6. Aislados de hoja que presentaron producción de IAA
Figura 7. Aislados que se obtuvieron de raíz con producción de IAA
30
6.5.2 Solubilización de Fosfatos
Algunos aislados formaron un halo de solubilización dentro de los que destacan
BE080, BE018, BE068, BE087, BE086 y BE002 que presentan índices de
solubilización mayores a 5 (Tabla 6). En la Figura 8(a) se muestra el porcentaje de
bacterias solubilizadoras fosfato de acuerdo a tejido de donde se aislaron, donde la
mayoría corresponden a bacterias provenientes de raíz.
15%
9%
4%
8%
Estado de México
Guanajuato
raíz hoja
Figura 8. Solubilización de fosfato. (a)Porcentaje de bacterias endofíticas solubilizadoras de fosfato. (b)
formación de halos de solubilización
Tabla 6. Resumen de los aislados identificados y sus características fenotípicas
AISLADO 16S rDNA %
SIMILITUD PHYLUM
IAA
(µgml-1
) I.S.
BE008R Bacillus pumilus Firmicutes 3.48 -
BE013R Stenotrophomona maltophillia 94% γ Proteobacteria 0.64 -
BE016R Paenibacillus polymyxa 100% Firmicutes 3.37 -
BE017R Bacillus sp. Firmicutes 3.29 -
BE026R Burkholderia cepacia 97% β proteobacteria - 4
BE028R Agrobacterium tumefaciens 97% α Proteobacteria 5.45 -
BE030R Pseudomonas sp. γ Proteobacteria 3.10 -
BE036R Pseudomonas fluorescens 98% γ Proteobacteria 7.05 3.3
BE045R Pseudomonas brenneri 92% γ Proteobacteria 4.88 -
BE047R Pseudomonas trivialis 98% γ Proteobacteria 5.51 -
BE064R Pseudomonas fluorescens 98% γ Proteobacteria 0.86 4.5
BE066R Pseudomonas fluorescens 98% γ Proteobacteria 1.51 4.5
BE068R Pseudomonas corrugata 99% γ Proteobacteria 1.02 7
(a) (b)
31
BE080R Pseudomonas fluorescens γ Proteobacteria 0.32 8
BE086R Pseudomonas fluorescens 95% γ Proteobacteria 0.24 5.5
BE097R Bacillus slirevahn 94% Firmicutes 1.02
BE101R Pseudomonas sp. γ Proteobacteria - 1
BE002H Bacillus pumilus 94% Firmicutes - 5
BE003H Sthapylococcus pasteuri 99% Firmicutes - -
BE004H Uncultured (kocuria) 96% Actinobacteria 0.51 -
BE007H Rhodococcus erytrhopolis 95% Actinobacteria 1.70 -
BE011H Bacillus dentrensis 99% Firmicutes 2.53 -
BE012H Staphyloccus haemolyticus 98% Firmicutes 2.10 -
BE021H Arthrobacter sp. 93% Actinobacteria - -
BE023H Bacillus simplex 96% Firmicutes 1.59 -
BE042H Bacillus sp. 99% Firmicutes 2.61 -
BE043H Pseudomonas trivialis 96% γ Proteobacteria - -
BE048H Pseudomonas fluorescens 94% γ Proteobacteria 7.37 -
BE062H Rhizobium sp. 90% α Proteobacteria - -
BE063H Bacillus subtilis 95% Firmicutes 1.29 -
BE070H Pseudomonas corrugata 97% γ Proteobacteria 4.43 -
BE073H Bacillus megaterium 99% Firmicutes 0.53 1
BE088H Rhodococcus sp. Actinobacteria - -
BE093H Pseudomonas sp. γ Proteobacteria 2.43 -
BE105H Pseudomonas thivervalensis 98% γ Proteobacteria - 1
BE107H Bacillus amyloliquefaciens 92% Firmicutes - 1
NOTA: R (aislado proveniente de raíz); H (aislado proveniente de hoja); I.S. (índice de solubilización de fosfato tricálcico); -
negaitvo
6.5.3 Fijación de Biológica de nitrógeno: Reducción de Acetileno (ARA)
Para esta prueba 40 aislados tuvieron la capacidad de crecer en medio de cultivo
sin nitrógeno. Después los positivos se inocularon en viales con agar semisólido en
donde 17 viales tuvieron un crecimiento microaerofílico.
Se realizó la prueba de reducción de acetileno a los aislados positivos pero no se
detecto actividad de la enzima nitrogenasa en el cromatógrafo de gases, utilizando este
medio.
32
6.6 Evaluación de la producción de fitohormona en plantas
Los resultados del análisis estadístico mediante un ANOVA se muestran en la
Tabla 7. En donde se evalúa el efecto de la producción de fitohormona por bacterias
endofíticas sobre plantas de alfalfa con el análisis de Tukey (P≤0.05) donde muestra la
diferencia significativa de cada variable.
En este bioensayo se utilizaron los aislados BE048 y BE036 identificados como
Pseudomonas fluorescens los cuales produjeron mayor cantidad de IAA en la
caracterización fenotípica.
Para el caso de BTS (Biomasa Total Seca) solo existe diferencia del tratamiento T3
(aislado BE048) en comparación con los demás tratamientos. En cuanto a la longitud de
raíz y longitud total no existe diferencia significativa entre T1 y T3 pero si de estos con
respecto a T2 y T4. Para el tallo los tratamientos T1, T3, T4 presentan diferencia en
comparación con T2 (control negativo); el número de hojas el T3 muestra una
diferencia significativa en comparación con los demás tratamientos.
Tabla 7. Evaluación del efecto de la producción de fitohormona en alfalfa. Resumen de los
resultados de ANOVA y prueba de Tukey.
TRATAMIENTO BTS*
(g)
LONGITUD NÚMERO DE
HOJAS RAIZ
(cm)
TALLO
(cm)
TOTAL
(cm)
T1 0.00897b 11.07b
a 9.33
a 20.68
a 13.78
b
T2 0.00775b 8.22
c 7.25
b 15.46
b 13.75
b
T3 0.04321a 11.74
a 9.37
a 21.39
a 16.65
a
T4 0.01654b 9.69b
c 9.11
a 17.31
b 14.60
ba
Nota: *=Biomasa Total Seca; T1= control positivo Azospirillum; T2= sin inóculo; T3= inóculo
B048; T4= Inóculo B036.
Letras minúsculas señalan diferencias significativas entre los tratamientos.
En la figura 7, la gráfica (a) las variables que se utilizaron para hacer el Análisis
de los Componentes Principales (ACP), tres de las cuales se relacionan entre si: Hoja,
Biomasa Total Seca (BTS) y longitud de raíz (LR) que no fue el caso para la tallo. En la
gráfica (b) se observan las mismas variables pero con todas las repeticiones de los
33
tratamientos. Según el esquema (c) el tratamiento T3 tuvo influencia en cuanto al
número de hojas, BTS y LR, mientras que el T1 y T4 influyen en la longitud del tallo.
Figura 7. Análisis de los componentes principales (ACP) para fitohormona en alfalfa. (a) las variables y
los tratamientos (b) los eigen values y la dispersión de los datos con las variables analizadas (c)
diferentes tratamientos.
Según los resultados obtenidos en la Tabla 7.1 la cual evalúa el efecto de la
producción de fitohormona en trigo, se puede decir que al igual que en alfalfa en BTS
T3 tiene diferencia significativa en comparación con los demás tratamientos al igual que
BAS. Según las variables BRS y raíz no existe diferencia significativa. Hay diferencia
significativa en cuanto al número de hojas con T3 y T4 en comparación con T1.
Tabla 7.1 Evaluación del efecto de la producción de fitohormona en trigo. Resumen de los resultados de
ANOVA y prueba de Tukey (P<0.05).
TRATAMI
ENTO
BTS*
(g)
BAS**
(g)
BRS***
(g)
LONGITUD NÚMERO
DE
HOJAS RAIZ
(cm)
TALLO
(cm)
TOTAL
(cm)
T1 0.210ba
0.162ba
0.0466a 17.98
a 36.95
b 53.61
b 6.73
ba
T2 0.189ba
0.142ba
0.0469a 16.23
a 38.60
ba 54.72
ba 6.36
b
T3 0.220aa
0.174a 0.0699
a 18.68
a 40.0
ba 59.03
a 7.03
a
T4 0.178bb
0.134b 0.0571
a 18.56
a 38.71
ba 55.76
ba 6.73b
a
Nota: *=Biomasa Total Seca, **=Biomasa Aérea Seca, ***=Biomasa Radical Seca, T1= control positivo
Azospirillum; T2= sin inóculo; T3= aislado B048; T4= aislado B036.
Letras minúsculas señalan diferencias significativas entre los tratamientos.
(a) (b) (c)
34
En la figura 7.1, la gráfica (a) indica que BAS, Tallo y hoja se relacionan entre si
pero distan de raíz y BRS. Según la gráfica (c) el tratamiento T3 tuvo influencia en con
todas las variables excepto BRS.
Figura 7. ACP para fitohormona en trigo. (a) las variables y los tratamientos (b) los eigen values y la
dispersión de los datos con las variables analizadas (c) diferentes tratamientos.
6.6. Movilización de fósforo inorgánico a nivel de invernadero
En este bioensayo se utilizaron los aislados que solubilizaron el Ca3(PO4)2 y
presentaron un mayor índice de solubilización BE080 y BE068 los cuales son
Pseudomonas fluorescens, los cuales fueron sometidos a diferentes tratamientos como
se describió en la metodología.
En la Tabla 7.2 se muestra que para BTS, raíz, tallo existe diferencia
significativa en cuanto a T1 y T4. En cuanto al número de hojas existe diferencia entre
el T4 y T5 respectivamente.
Tabla 7.2 Evaluación del efecto de la Solubilización de fosfato en alfalfa. Resumen de los resultados de
ANOVA y prueba de Tukey
TRAT BTS*
(g)
LONGITUD NÚMERO DE
HOJAS RAIZ
(cm)
TALLO
(cm)
TOTAL
(cm)
(a) (b) (c)
35
T1 0,030a 13,6
a 13,50
a 26,96
a 14,85
bc
T2 0,019bdec
10,55ba
11,15bdac
21,45bdc
14,95bc
T3 0,018dec
12ba
12,35bac
23,35bac
16,65bac
T4 0,013e 9,8
b 8,65
d 18,45
d 13,75
c
T5 0,029ba
13,15ba
12,95ba
25,6ba
19,3a
T6 0,014de
11,57ba
9,95dc
19,92dc
15,75bc
T7 0,018bdec
11,2ba
10,85bdc
21,45dbc
15,55bc
T8 0,026bac
11,4ba
13,1ba
24,6ba
16,1bac
T9 0,024bdac
10,85ba
11,7bac
22,25bdc
15,65bc
T10 0,026bac
11,1ba
13,45a 24,55
ba 17,1
ba
Nota: *=Biomasa Total Seca, T1= solución completa, T2= sin fósforo, T3= soporte Ca3(PO4)2 regado con completa,
T4= soporte Ca3(PO4)2 regado sin fosforo, T5 (aislado BE080+ T1); T6 (aislado BE080 + T3); T7 (aislado BE080 +
T4); T8 (aislado BE068+ T1); T9 (aislado BE068 + T3); T10 (aislado BE068 + T4).
Letras minúsculas señalan diferencias significativas entre los tratamientos.
Según la Figura 7.2 la gráfica (a) muestra las variables que se relacionan entre si
como lo son Hoja, BTS y Tallo; que no fue el caso para raíz. En la gráfica (b) se
observan las mismas variables pero con todas las repeticiones de los tratamientos en
donde casi todos los tratamientos se ubicaron en el centro. En este caso solo se podría
argumentar que los tratamientos T5, T1, T10, T8 favorecen al desarrollo del tallo hoja y
BTS principalmente. En cuanto a la raíz el tratamiento T1 tuvo mayor influencia en el.
Por otro lado el tratamiento T4 fue el que presentó el menor beneficio a la Alfalfa en la
medición de estas variables.
Figura 7.2 ACP para solubilización de fosfatos en alfalfa. (a) las variables y los tratamientos (b) los eigen
values y la dispersión de los datos con las variables analizadas (c) diferentes tratamientos.
Para la solubilización de fósforo en el caso del trigo los resultados se muestran
en la Tabla 7.3; en donde existe diferencia entre T1 y T9 en cuanto BTS. Existe
diferencia entre T1 y los T9, T10 para el caso de BAS; en BRS existe diferencia en
(a) (b) (c)
36
cuanto T8 con respecto a T3. No existe diferencia entre tratamientos en cuanto a la
longitud de raíz, total y número de hojas.
Tabla 7.3 Evaluación del efecto de la Solubilización de fosfato inorgánico en trigo. Resumen de los
resultados de ANOVA y prueba de Tukey.
TRAT BTS*
(g)
BAS**
(g)
BRS***
(g)
LONGITUD NÚMERO
DE
HOJAS RAIZ
(cm)
TALLO
(cm)
TOTAL
(cm)
T1 0.247a 0.192
a 0.056
ba 18.02
a 45.52
ba 63.95
a 5.45
a
T2 0.170cd
0.122bc
0.046ba
17.25a 44.85
ba 61.25
a 5.1
a
T3 0.159cd
0.123bc
0.040b 17.2
a 43.55
b 61.35
a 5.25
a
T4 0.18bcd
0.176ba
0.042ba
18.5a 44.12
ba 62.9
a 5.5
a
T5 0.198bc
0.153bac
0.041ba
15.55a 47.95
ba 62.9
a 5.7
a
T6 0.201bc
0.160bac
0.045ba
16.65a 44.95
ba 61.32
a 5.45
a
T7 0.201bc
0.160bac
0.045ba
16.65a 44.95
ba 61.32
a 5.45
a
T8 0.218ba
0.159bac
0.058a 15.6
a 48.15
a 63.85
a 5.4
a
T9 0.152d 0.112
c 0.041
ba 17.75
a 46.2
ba 63.6
a 5.4
a
T10 0.170cd
0.115c 0.055
ba 16.15
a 44.75
ba 61.5
a 5.15
a
Nota: *=Biomasa Total Seca;**= Biomasa Aérea Seca; ***= Biomasa Raíz Seca; T1= solución completa, T2= sin fósforo, T3=
soporte Ca3(PO4)2 regado con completa, T4= soporte Ca3(PO4)2 regado sin fosforo. T5 (aislado BE080+ T1); T6 (aislado BE080 +
T3); T7 (aislado BE080 + T4); T8 (aislado BE068+ T1); T9 (aislado BE068 + T3); T10 (aislado BE068 + T4). Letras minúsculas señalan diferencias significativas entre los tratamientos.
En las Figura 7.3 de ACP para trigo se puede decir que existe relación entre las
variables de BAS, BRS y Tallo. En (c) todos los puntos se encuentran en el centro y se
puede apreciar ligeramente que T2, T3, T10 y T9 no influyen en ninguno de los
tratamientos. En cambio el T1 tiene influencia en cuanto a Raíz, BRS, BAS, y tallo. El
T5 es se relaciona mas con el número de hojas.
Figura 7.3 ACP para solubilización de fosfatos en trigo. (a) las variables y los tratamientos (b) los eigen
values y la dispersión de los datos con las variables analizadas (c) diferentes tratamientos.
37
VII. DISCUSIÓN
Las condiciones óptimas para el cultivo de fresa se ven influenciadas por las
características del suelo, su estructura física y contenido químico es una de las bases
para el desarrollo de la planta, ésta requiere suelos equilibrados, ricos en materia
orgánica, aireados y bien drenados (Parker 2000).
Los resultados indican que este suelo se encuentra cerca del pH óptimo para el
desarrollo de este cultivo, además según la norma NOM-021-SEMARNAT-2000 se
encuentra dentro de la clasificación de un suelo de moderadamente ácido a medio, no
existe diferencia en los pH de ambas estados ya que entran en esta clasificación.
El contenido de nitrógeno analizado comparado con la NOM-021-SEMARNAT-
2000 se clasifica como muy bajo; tal vez, esto se deba al periodo en que se recolectó la
muestra, ya que fue durante la época de cosecha donde la planta ya utilizó los nutrientes
necesarios para su desarrollo, ya se ha reportado que esta planta se desarrolla muy bien
en suelos con altos niveles de nitrógeno. Según la NOM-021-SEMARNAT-2000 el
contenido de fósforo de estos suelos se encuentra dentro de la clasificación de un suelo
medio.
Los cultivos de fresa en México se concentran en los estados de Michoacán,
Guanajuato, Baja California Norte y Estado de México (Fundación PRODUCE 2003),
estos reportes se tomaron en cuenta para seleccionar los estados de la recolección de las
muestras, además la planta es muy susceptible al manejo y transporte de la muestra
hacia el laboratorio para su análisis.
Generalmente, se considera que las bacterias endofíticas tienen una abundancia
de 104 a 10
7 UFC por g de tejido fresco (Rosenblueth & Martínez 2006). Existen
reportes de poblaciones de organismos endofíticos diazotróficos en el cultivos de arroz
de 102 a 10
3 UFC g
-1 (peso fresco) de raíces y tejidos (Gyaneshwar et al. 2001), también
en la parte aérea de plantas cítricas se ha reportado de 103 a 10
4 UFC g
-1 (peso fresco)
(Araújo et al. 2002) y se han reportado en cultivos de caña de azúcar 102 a 10
6 CFU g
-1
(Mendes et al. 2007). Nuestros resultados coinciden con los valores reportados en otros
cultivos de interés agrícola en la cuantificación de microorganismos presentes en la
38
planta, ya que la mayor proporción de bacterias endófitas obtenidas fue aislada de las
raíces, esto se atribuye a que en la rizósfera hay una mayor cantidad de
microorganismos y actividad microbiana que en todo el suelo y por lo tanto mayor
competencia por los sustratos, lo cual favorece a que las bacterias penetren en estos
tejidos para la obtención de fuentes de carbono u otros nutriente, además dentro de la
raíz la condiciones de humedad y temperatura son más favorables que en las hojas.
Los aislados se seleccionaron con base en su morfología colonial y se realizó
una tinción de Gram para su caracterización microscópica con base en la composición
de su pared celular; en donde la mayor proporción de aislados son bacilos Gram (-) y
bacilos Gram (+).
La estimulación del crecimiento de la planta por los microorganismos
endofíticos puede ser consecuencia de la fijación biológica de nitrógeno (Rosenblueth et
al. 2006; Hurek et al. 2002), ya que se ha sugerido que en el interior de las plantas se
presenta un ambiente propicio para que se lleve a cabo la fijación biológica de nitrógeno
(FBN), ya que en este ambiente se presentan tensiones de oxígeno bajas y una gran
cantidad de moléculas que funcionan como fuentes de carbono (James 2000); por esta
razón se realizaron pruebas fenotípicas como la fijación biológica de nitrógeno en donde
los resultados obtenidos nos muestran que algunos aislados son capaces de crecer en un
medio sin fuente de nitrógeno, sin embargo frecuentemente se ha observado que aunque
puedan crecer sin nitrógeno, no siempre dan resultados positivos en la prueba de
reducción de acetileno, lo cual puede ser debido a que no sea el medio adecuado para
que se realice la actividad enzimática de la nitrogenasa o bien pueden llevar a cabo la
reducción del dinitrógeno de otra forma usando una nitrogenasa alternativa o diferente.
También pueden ser microorganismos oligonitrofilos que crecen en
concentraciones muy bajas de nitrógeno aprovechando la mínima presencia de
nitrógeno en diferentes formas que tenga el medio de cultivo como derivados de sus
componentes principales.
El fósforo después del nitrógeno, es el nutriente inorgánico más requerido por
plantas y microorganismos y además, en el suelo es el factor limitante del desarrollo
vegetal a pesar de ser abundante tanto en formas inorgánicas como orgánicas
39
(Alexander 1980). Las plantas deben absorberlo del suelo, donde se encuentra en muy
baja concentración, normalmente en niveles que varían entre 5 y 30 mg kg-1
. Estos
índices bajos del nutriente se deben a que el fósforo soluble reacciona con iones como el
calcio, el hierro o el aluminio que provocan su precipitación o fijación, disminuyendo su
disponibilidad para los vegetales (Rodríguez & Fraga 1999). Los fosfatos inorgánicos
aplicados como fertilizantes químicos también son inmovilizados en el suelo y como
consecuencia no son solubles para ser aprovechados por los cultivos (Peix et al. 2001).
Por lo tanto se considera, que la solubilización de distintas rocas fosfatadas y de otras
fuentes de fósforo inorgánico por los microorganismos del suelo es una alternativa
fundamental para incrementar la cantidad de nutriente disponible para las plantas
(Illmer & Schinner 1992). Es posible que las bacterias endofíticas incrementen la
capacidad de las plantas de absorber este nutriente del suelo, mediante la solubilización
de los fosfatos (Li et al. 2007). Con respecto a los resultados obtenidos se encontraron
un 40% de bacterias endofíticas que son solubilizadoras de fosfato, dentro de la planta
ya que estos iones fosfato y ortofosfato se almacenan en raíz, por lo tanto es de
esperarse que las bacterias endofíticas presenten mecanismos de solubilización de
fosfatos debido a que es una fuente rica de dichos compuestos no asimilables que se
encuentran en un ambiente propicio para la solubilización y transferencia de los
macronutrientes.
El ácido indolacético es una auxina natural presente en la mayoría de las plantas.
Las auxinas son hormonas vegetales que regulan diversos procesos del desarrollo
vegetal (Castillo et al 2005). Algunas auxinas, como el AIA, son sintetizadas por
algunos microorganismos como Azospirillum sp., Azotobacter sp., Pseudomonas sp.,
Rhizobium sp., etc. (Patten & Glick 1996). Considerando que las bacterias endófitas se
ubican en contacto íntimo con las plantas, ellas podrían brindar beneficios más directos
a su hospedero en comparación con las bacterias rizosféricas. Se ha demostrado que
algunas fitohormonas como el ácido indolacético, producidas por los microorganismos
rizosféricos pueden provocar un aumento de la superficie de contacto de la raíz con el
suelo, permitiendo a la planta una mayor absorción de nutrientes (Okon et al 1994). Los
aislados que tienen una mayor producción de AIA se encuentran en raíz considerándose
como importantes los aislados BE036, BE028, BE047, BE47.2, BE045, BE005 y
BE048, BE070 en hoja. Es importante señalar que aquellos aislados con altos índices de
solubilización no se comparten con las bacterias productoras de fitohormona; esto nos
40
lleva a suponer que quizá el aumento en el crecimiento en las plantas se no es exclusivo
de un género sino de la relación sinérgica que existe entre diferentes géneros de
microorganismos endofíticos en las plantas.
Con base en la secuencia parcial del gen 16s rDNA que ha funcionado como
marcador molecular se logró identificar a cuatro grupos de: Alfaproteobacterias,
Gammaproteobacteria, Firmicutes y Actinomicetos dentro de los cuales se encuentran
géneros como Pseudomonas, Bacillus, Staphylococcus, Rhizobium, Rhodococcus,
Arthrobacter.
El género que con mayor abundancia en el Bacillus sp., el cual se ha encontrado
como endófito en raíces de papa (Sturtz 1995), hoja de uva (Bell et al. 1995), maíz,
algodón (Brooks et al. 1994), cítricos, zanahoria (Araújo et el 2001) este género se
conoce también por su capacidad de solubilizar fosfatos y producir sustancias que
ayuden a promover el crecimiento de las plantas.
Otro género Pseudomonas se ha encontrado como endófito de mayor abundancia en
zanahoria, soya (Araujo et al. 2001), papa (Sturtz 1995) y guisantes (Recuenco E.
&Vuurde van 2000), las especies mas comunes son Pseudomonas fluorescens y P.
viridiflava como principales colonizadores de plantas de guisantes (Elvira-Recuenco &
Vuurde van 2000). Este género solubiliza el fosfato inorgánico, coincide con nuestros
resultados siendo este el que produce un mayor índice de solubilización, además de que
también se ha encontrado en estudios que produce fitohormonas (González et al., 2000)
que también en nuestro trabajo fue el que produjo mayor cantidad de AIA; de ahí que se
utilizaron los aislados BE036 y BE048 para la prueba de producción de fitohormona;
BE080 y BE048 para la prueba de movilización de fosfato en plantas.
En la evaluación de la solubilización de fosfato por parte de los aislados BE068 y
BE080 no se observa diferencia significativa entre cada uno de los tratamientos, quizá a
que las características de los exudados radicales o bien la interacción planta
microorganismo no se pudo establecer.
Finalmente en el bioensayo para evaluar la producción de AIA por parte de los
aislados BE048 y BE036 (Pseudomonas fluorescens) uno proveniente de hoja y otro de
41
raíz; los cuales habían producido una buena cantidad de fitohormona. Se observa que el
aislado BE048 regado como solución nutritiva completa tuvo un efecto significativo en
comparación con el control positivo (Azospirillum sp.) lo cual indica que este aislado
dentro de la planta se podría comportar como una PGPB, para esto es necesario realizar
mas estudios sobre las interacciones planta- bacterias endofíticas.
42
VIII. CONCLUSIONES
En la raíz se encuentran el mayor número de microorganismo endófitos aislados
que en las hojas de la planta de fresa.
El análisis del gen 16S rDNA de los aislados revela que existe una gran
diversidad de bacterias endofíticas tales géneros como, Pseudomonas,
Staphylococcus, Bacillus, Rhizobium, Rhodococcus, Paenibacillus,
Burkholderia, Caulobacter, Stenotrophomonas, Agrobacterium, en la planta de
fresa.
El género predominante dentro de los microorganismos endofíticos es el de
Pseudomonas que demostró ser capaz de solubilizar nutrientes y producir
fitohormonas.
Se puede considerar a BE048 quien fue identificada como Pseudomonas
fluorescens presentan efecto significativo en la prueba de AIA para ambas
plantas, por lo que pudiera ser utilizada como PGPB, sin embargo se requieren
mas estudios.
43
IX. REFERENCIAS
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50
VIII. ANEXOS
Aislamiento de bacterias endofíticas
Se seleccionaron de hojas y raíces; se lavaron con agua corriente para eliminar el
exceso de suelo,
Se pesaron 1 g de muestra de raíz y hoja; se desinfestaron con etanol (EtOH)
70% durante 40 s y con un tratamiento de Hipoclorito de sodio 1% durante 5
min; Se lavaron con agua estéril 4 veces para eliminar el exceso de hipoclorito .
Para comprobar la efectividad de éste proceso se sembró el agua del último
lavado en placas con medio PY (extracto de levadura 3 g, peptona de caseína 5
g, CaCl2 0.6 g, agar 18 g en un litro de agua destilada) y se incubaron a 28 ºC
durante 24hr.
Cuantificación de Bacterias endofíticas
Colocar 1g de hoja o raíz previamente desinfestadas en un mortero con 9 ml de
agua destilada estéril y se maceró por 10 min hasta tener un buen rompimiento
del tejido y obtener una consistencia uniforme.
Realizar diluciones seriadas de 10-1
hasta 10-5
.
100 μl de cada una de las diluciones de 10-1
hasta 10-3
para hojas y de 10-3
hasta
10-5
en raíces fueron sembradas en placas de medio PY. Estas diluciones se
sembraron por duplicado.
Se incubó a 28ºC durante 48hr.
Técnica de extracción de DNA genómico usando CTAB (Bromuro de cetil metil
trimetil amonio):
1. Se hizo un cultivo masivo de la colonia bacteriana, se cosecho la biomasa y se
congeló con N2 líquido, se maceró en un mortero estéril, hasta la obtención de
un polvo fino.
2. Se adicionó de 1 a 2 mL de CTAB nuclear (CTAB al 2%, EDTA 50 mM,
Trisma base 200 mM pH 8.0, NaCl 2 M y Polivinil pirrolidona 0.5%) y se
mezcló hasta obtener una suspensión homogénea.
3. La muestra se separó en tubos de 1.5 mL y se adicionó 2 L de RNAasa 10
mg/mL, posteriormente se incubó a 65°Cpor 1 h.
4. Se dejó que la muestra alcanzará temperatura ambiente,
51
5. Se adicionó 1 volumen (500 L) de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se
mezcló en vortex hasta que se formo emulsión. Se centrifugó a 13000 g/10 min.
a temperatura ambiente y la fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo.
6. Se adicionó 1/10 de volumen de CTAB 10% (CTAB al 10% y NaCl 0.7 M) y se
remitieron tres extracciones con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se
conservó la fase acuosa.
7. Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y se adicionó un volumen de
isopropanol (para favorecer la precipitación del DNA) y se mezcló por
inversión, se incubó a –20°C por 2 horas o toda la noche.
8. El DNA se recuperó por centrifugación a 13000 g/10 min. a 4°C. La pastilla se
lavó dos veces con etanol al 70% y se dejó secar la pastilla.
9. El DNA se resuspendió en 30 ó 50 L de agua desionizada estéril.
Para evaluar la calidad del DNA extraído primero se realizó una electroforesis
colocando 3 µL del DNA en un gel de agarosa al 1% (w/v) corrido a 70 volts durante 45
minutos utilizando un regulador de TBE 1X, después el gel fue teñido con 0.5 µg/mL de
bromuro de etidio durante 5 min y se observó bajo luz UV (Sambroock et al. 2002).
Análisis estadístico para los bioensayos realizados
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_________
#Trabajo para Fito1
dim(Fito1)
Fito1.Trigo <- Fito1[1:120,]
dim(Fito1.Trigo)
Fito1.Trigo1 <- na.omit(Fito1.Trigo)
dim(Fito1.Trigo1)
names(Fito1.Trigo1)
Lista.Fito1.Trigo<- list(var=Fito1.Trigo1[,1:3],species=Fito1.Trigo1[,c(7,9:11,13)])
#El mismo trabajo pero para Alfalfa
Fito1.Alfalfa <- Fito1[121:200,c(1:3,5,10,11,13)]#Aqui ya se eliminaron las columnas
con NA's
dim(Fito1.Alfalfa)
Fito1.Alfalfa1 <- na.omit(Fito1.Alfalfa)
dim(Fito1.Alfalfa1)
names(Fito1.Alfalfa1)
Lista.Fito1.Alfalfa<- list(var=Fito1.Alfalfa1[,1:3],species=Fito1.Alfalfa1[,4:7])
par(mfrow=c(1,3))
Trigo.pca <- dudi.pca(Lista.Fito1.Trigo$species[,], scannf=F)
s.corcircle(Trigo.pca$co, sub="Variables", possub="topleft", csub=1.5)
scatter(Trigo.pca, sub="PCA")
#s.arrow(Trigo.pca$co, sub="VARIABLES")
#s.class(Trigo.pca$li, Lista.Fito1.Trigo$var$TRATAMIENTO, xax=1, yax=2,
cellipse=1)
s.class(Trigo.pca$li, Lista.Fito1.Trigo$var$TRATAMIENTO, xax=1, yax=2, xlim =
c(-2,2) , ylim = c(-2,2), cellipse=1, col=c(1:4),clab=1.2,cstar=0.7, pch=30,
add.p=F,sub="Tratamiento de fitohormonas en trigo", possub="topleft", csub=1.5)
par(mfrow=c(1,3))
Alfalfa.pca <- dudi.pca(Lista.Fito1.Alfalfa$species[,], scannf=F)
s.corcircle(Alfalfa.pca$co, sub="Variables", possub="topleft", csub=1.5)
scatter(Alfalfa.pca, sub="PCA")
s.class(Alfalfa.pca$li, Lista.Fito1.Alfalfa$var$TRATAMIENTO, xax=1, yax=2, xlim =
c(-2.5,2) , ylim = c(-2,2), cellipse=1, col=c(1:4),clab=1.2,cstar=0.7, pch=30,
add.p=F,sub="Tratamiento de fitohormonas en Alfalfa", possub="topleft", csub=1.5)
##Trabajo para Fito2
dim(Fito2)
names(Fito2)
summary(Fito2)
Fito2[1:200,1]
54
Fito2.Trigo <- Fito2[1:200,]
dim(Fito2.Trigo)
Fito2.Trigo1 <- na.omit(Fito2.Trigo)
dim(Fito2.Trigo1)
names(Fito2.Trigo1)
Lista.Fito2.Trigo<- list(var=Fito2.Trigo1[,1:3],species=Fito2.Trigo1[,c(7,9,10,11,13)])
#El mismo trabajo pero para Alfalfa
names(Fito2)
Fito2.Alfalfa <- Fito2[201:400,c(1:5,10,11,13)]#Aqui ya se eliminaron las columnas
con NA's
names(Fito2.Alfalfa)
dim(Fito2.Alfalfa)
Fito2.Alfalfa1 <- na.omit(Fito2.Alfalfa)
dim(Fito2.Alfalfa1)
head(Fito2.Alfalfa1)
str(Fito2.Alfalfa1)
Lista.Fito2.Alfalfa<- list(var=Fito2.Alfalfa1[,1:3],species=Fito2.Alfalfa1[,c(5:8)])
par(mfrow=c(1,3))
Trigo.pca1 <- dudi.pca(Lista.Fito2.Trigo$species[,], scannf=F)
s.corcircle(Trigo.pca1$co,sub="Variables", possub="topleft", csub=1.5)
scatter(Trigo.pca1, sub="PCA")
s.class(Trigo.pca1$li, Lista.Fito2.Trigo$var$TRATAMIENTO, xax=1, yax=2,xlim =
c(-2.5,2.5) , ylim = c(-2,2), cellipse=1, col=c(rep(1:4,2),1,2), clab=1.2,cstar=0.5,
pch=30,sub="Tratamiento de Fósforo en trigo", possub="topleft", csub=1.5)
par(mfrow=c(1,3))
Alfalfa.pca1 <- dudi.pca(Lista.Fito2.Alfalfa$species[,], scannf=F)
s.corcircle(Alfalfa.pca1$co,sub="Variables", possub="topleft", csub=1.5)
scatter(Alfalfa.pca1, sub="PCA")
s.class(Alfalfa.pca1$li, Lista.Fito2.Alfalfa$var$TRATAMIENTO, xax=1, yax=2,xlim
= c(-3,3) , ylim = c(-2,2), cellipse=1, col=c(rep(1:4,2),1,2), clab=1.3,cstar=0.5,
pch=30,sub="Tratamiento de Fósforo en Alfalfa", possub="topleft", csub=1.5)
ls()
55