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Evaluación de la diversidad genética de bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas

de suelos en sistemas ecológicos de las cuencas de los ríos Otún y la Vieja.

HABIB FERNANDO YANINE Candidato a Maestría en Ciencias en Microbiología

Director: Fabio Roldán Ph.D. Director asociado: Daniel Uribe Vélez Ph.D.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS

POSTGRADO MICROBIOLOGIA INTERFACULTADES BOGOTA D.C., JULIO DE 2007

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Evaluación de la diversidad genética de bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas

de suelos en sistemas ecológicos de las cuencas de los ríos Otún y la Vieja.

HABIB FERNANDO YANINE Candidato a Maestría Ciencias en Microbiología

Trabajo de grado presentado como requisito Final para optar al titulo de Magister Scientiae en Microbiología

Director: Fabio Roldán Ph.D. Director asociado: Daniel Uribe Vélez Ph.D.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS

POSTGRADO MICROBIOLOGIA INTERFACULTADES BOGOTA D.C., JULIO DE 2007

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TABLA DE CONTENIDO Pág.

INTRODUCCION 7 1. TITULO 11

2. OBJETIVO GENERAL. 11

3 OBJETIVO ESPECIFICO. 11 4 PROBLEMA. 12 4.1 Formulación. 12 4.2 Planteamiento. 12 5 HIPOTESIS. 12 6 JUSTIFICACION. 14 7. MARCO TEORICO Y ANTECEDENTES 16 7.1 Diversidad bacteriana 16 7.1.1 Diversidad bacteriana y ambiente 17 7.1.2 Diversidad bacteriana en el suelo 18 7.2 Métodos de estudio de la diversidad bacteriana. 20 7.2.1 Cronómetros moleculares, diversidad y filogenia bacteriana. 23 7.2.2 Electroforesis en gel de gradiente denaturante (DGGE) en el estudio de la diversidad bacteriana. 25 7.2.3 Sales de tetrazolio en recuentos de viabilidad celular 25 8 MATERIALES Y METODOS. 27 8.1 Área de estudio 27 8.2 Diseño de muestreo 28 8.3 Determinación de características fisicoquímicas 30 8.3.1 Determinación de pH del suelo 30 8.3.2 Determinación de humedad del suelo 30

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8.3.3 Determinación de carbono orgánico total. 30 8.3.4 Determinación del contenido de hidrocarburos totales de petróleo de las muestras compuestas de suelo. 31 8.4 Recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos totales de petróleo. 31 8.4.1 Estandarización de la técnica de número más probable con XTT para el recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos totales de petróleo. 31 8.4.2 Recuento de microorganismos degradadores hidrocarburos mediante la técnica de número más probable. 32 8.5 Aislamiento y recuperación de bacterias degradadoras de hidrocarburos totales de petróleo. 33 8.6 Extracción de DNA a partir de cultivos puros de aislados procedentes de muestras de suelo. 33 8.7 Amplificación de genes de rDNA 16S por PCR. 34 8.8 Diferenciación de ribotipos por separación diferencial mediante electroforesis en gel de gradiente denaturante (DGGE). 35 8.9 Secuenciación de productos de amplificación. 35 8.10 Determinación de los índices de diversidad y similitud. 36 8.11 Evaluación de la relación entre la capacidad degradadora de hidrocarburos totales de petróleo y diversidad genética en muestras de suelo. 36 8.12 Elaboración de dendrogramas y determinación de afiliación taxonómica 37 8.13 Análisis estadísticos. 37 PRESUPUESTO 39 CRONOGRAMA 42 ANEXO A Caldo y medio de cultivo Bushnell y Hass 43 ANEXO B Soluciones y reactivos para DGGE 44 ANEXO C Ecuaciones para determinación de humedad, e índices de riqueza equitabilidad y similitud. 47 ANEXO D Mapas de ubicación de las ventanas La Vieja y Otún-Quimbaya 49 BIBLIOGRAFIA 51

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LISTA ABREVIATURAS

ARDRA: análisis de restricción de DNA ribosomal amplificado, del inglés: amplified ribosomal DNA restriction analysis. DGGE: electroforesis en gel de gradiente denaturalizante, del ingles denaturing gradient gel electrophoresis DNA: ácido desoxirribonucleico, del ingles: desoxyribonucleic acid EM: evento de muestreo FAME: análisis de ácidos grasos metil éster, del inglés Fatty acid methyl ester analysis. INT: 2-p-iodophenyl-3-p-nitrophenyl-5-phenyl cloruro de tetrazolio HC: hidrocarburos NMP: número más probable OTU: unidad taxonómica operativa, del inglés: operational taxonomic unit. PCR: reacción en cadena de la polimerasa, del inglés polymerase chain reaction pb: pares de bases de DNA PAH: hidrocarburos policíclicos aromáticos, del inglés: polycliclic aromatic hydrocarbons. PLFA: análisis de fosfolípidos de ácidos grasos, del inglés phospholipid fatty acid analysis RAPD: polimorfismos de DNA amplificado al azar, del inglés: random amplified polimorfic DNA rDNA : genes que codifican para RNA ribosomal (rRNA). RISA: análisis de secuencia espaciadora intergénica ribosomal, del inglés; ribosomal intergenic spacer analysis. RNA: ácido ribonucleico, del inglés: ribonucleic acid. rRNA: RNA ribosomal SSCP: polimorfismo conformacional de cadena sencilla, del inglés: single strand conformation polymorphism. SSU: subunidad pequeña del ribosoma bacteriano, del inglés small subunit

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sp.: especie. TGGE: electroforesis en gel con gradiente de temperatura, del inglés temperature gradient gel electrophoresis. TPH: Hidrocarburos totales de petróleo. t-RFLP: polimorfismo de tamaño de fragmentos de restricción terminal, del inglés: terminal restriction fragment length polymorphism. UFC: unidad formadora de colonia. XTT:sodio-2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxanilida.

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INTRODUCCIÓN

Para el entendimiento de la dinámica de los sistemas ecológicos y del ciclaje de materia y energía, es clara la necesidad del reconocimiento y descripción de los organismos que están implicados en estos procesos. A su vez, es necesario el conocimiento de cuántos están implicados, en qué momentos, junto con quiénes lo realizan y los cambios que los factores externos ejercen sobre la estructura y composición de las comunidades. La necesidad del estudio de la composición y estructura de poblaciones bacterianas en el suelo se ve justificado ya que las bacterias son un componente muy importante de los sistemas ecológicos, dada su alta abundancia (cerca de 109 individuos por gramo de suelo), su alta diversidad aparente (un mínimo de 4000 a 7000 genomas por gramo) y la multiplicidad de rutas metabólicas en las cuales están implicadas (Torsvik, et. al.,1990; Whitman, et al., 1998), rutas que en muchos casos son realizadas exclusivamente por bacterias. Para el estudio de las comunidades microbianas se han empleado diversas estrategias que pueden basarse en métodos de cultivo de los organismos o más recientemente en herramientas moleculares independientes del cultivo de los mismos. Las técnicas dependientes de cultivo son reconocidas por su selectividad, reflejando en ocasiones microorganismos con fenotipos muy diferentes a los presentados in situ. Esto puede ser debido a la limitación del cultivo en reproducir las condiciones variables específicas de disponibilidad de nutrientes, así como de las múltiples interacciones con otros organismos. Esto puede tener como consecuencia una subestimación de la riqueza y abundancia tanto de las especies como de su funcionalidad, dada la existente imposibilidad de cultivar muchos tipos de bacterias. Se calcula que el porcentaje de organismos cultivables conocidos representa aproximadamente el 0,1% a un máximo de 10% del total de especies en todos los hábitats (Davis, et. al., 2005). Es así como el aislamiento de cepas o clones y su caracterización feno y genotípica conlleva a un conocimiento limitado y erróneo de la composición de las comunidades. Por ello se han planteado estrategias de estudio a nivel de comunidades y no de poblaciones, como el análisis de uso de múltiples sustratos (Biolog)(Gamo y Shoji, 1999) o el análisis de perfil lipídico (PFLA[análisis de fosfolipidos de ácidos grasos], FAME[análisis de ácidos grasos metil éster]), que proporcionan una aproximación a la composición de la comunidad, pero que no dejan de incluir desviaciones debido al error inherente a las

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condiciones de cultivo que plantea la primera estrategia y la inespecificidad de la segunda (Sylvia, 2005). Los análisis moleculares usando ácidos nucleicos han permitido el desarrollo de técnicas que ya no necesitan del aislamiento y cultivo de organismos, reduciendo la subestimación inherente al cultivo in vitro. Estas técnicas implican la lisis celular, extracción de ácidos nucleicos y el análisis de genes específicos o el análisis a nivel de genoma, ya sea de muestras ambientales o de cultivos puros. En este tipo de análisis se puede hacer uso de la hibridación con sondas de DNA o RNA, la digestión con enzimas de restricción o la amplificación selectiva de genes por PCR. Estas estrategias son generalmente proseguidas por la clonación y posterior secuenciación de sus productos de reacción, lo que permite la identificación taxonómica (Petti, et al., 2005). Estas herramientas moleculares pueden igualmente proporcionar información que permite conectar las diferentes medidas de diversidad ambiental (riqueza y abundancia) con los análisis de ecología de las poblaciones implicadas (Ranjard, et al., 2000). Dentro de los estudios de la dinámica de los sistemas ecológicos, el entendimiento de la estructura y composición de las comunidades, constituye un requisito fundamental, siendo la biodiversidad definida en su concepción más simple, como la variedad y distribución de especies o biotipos dentro de un espacio y tiempo determinados, un componente más de estos sistemas y no simplemente un concepto descriptor (Gaston, 1996). Los estudios de diversidad microbiana pueden bien enfocarse en una descripción funcional de las comunidades, caracterizando grupos específicos (fijadores de nitrógeno, denitrificantes, nitrificantes, sulfato reductores y sulfuro oxidadores o degradadores de hidrocarburos) (Muyzer, 1999); para ello se vale del estudio de genes implicados en rutas metabólicas específicas y que sean lo suficientemente conservadas dentro del grupo para identificar taxonómica y filogenéticamente a las poblaciones implicadas. También puede seguirse una descripción general de la comunidad, caracterizando genes implicados en procesos o estructuras con función esencial, distribuida universalmente, cuyo cambio en la secuencia refleje la historia evolutiva del organismo y que sea altamente conservado. Varios genes se han propuesto como “cronómetros moleculares”, incluyendo genes que codifican proteínas de la cadena de transporte de electrones, proteínas implicadas en la replicación génica (polimerasas de DNA) o los RNA ribosomales en la producción de péptidos (rDNA). De éstas la secuencia más utilizada ha sido la que codifica para el rRNA 16S que hace parte del complejo ribonucleoproteico que conforma la subunidad menor de los ribosomas bacterianos (Pace, 1997; Ford, 1999). Dentro de las estrategias para la

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caracterización del ARN SSU, se encuentra la evaluación de perfiles electroforéticos generadas por separación diferencial en geles de agarosa o poliacrilamida dependiendo de su tamaño como en las técnicas ARDRA, t-RFLP, RISA o RAPD o por su secuencia como en DGGE (Nakatsu, et al., 2000; Schafer y Muyzer, 2001; Green, 2005; Nakatsu, 2007), TGGE (Cheung y Kinkle, 2001) o SSCP (Schwieger, F. and Tebbe, C, 2000). Estas últimas estrategias se han convertido en las más utilizadas dada su capacidad de discriminar diferencias incluso de un solo nucleótido, sin incluir el uso de enzimas de restricción o sondas ligadas a isotopos radiactivos o fluorocromos. La información proporcionada por los perfiles electroforéticos permiten distinguir a las comunidades por patrones electroforéticos exclusivos, los cuales pueden ser evaluados mediante índices de diversidad ecológicos. Algunos índices ecológicos como: la estadística Q, índice alfa serie log, índices de Berger-Parker, Simpson, Shannon-Wiener e índice Chao 1, han sido adaptados para la interpretación de datos moleculares, lo que ha permitido la generación de una aproximación al comportamiento de las comunidades frente a cambios externos ambientales o antrópicos (Gaston , 1996; Hill, et. al., 2003). Acogiéndose al concepto de áreas estratégicas aprobadas por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, en el año 2004, el centro de investigación y estudios en biodiversidad y recursos genéticos (CIEBREG), presenta un proyecto enmarcado en el conocimiento, valoración y desarrollo de bienes y servicios ambientales de la biodiversidad para el desarrollo sostenible de paisajes rurales colombianos específicamente del complejo ecorregional Andes del Norte, del cual hacen parte las cuencas de los ríos la Vieja y Otún1, tanto en sus componentes de bioma, ecosistema, y cobertura vegetal, a nivel de macro y microorganismos.

Enmarcados dentro del primer objetivo específico del CIEBREG mediante el cual se desea “caracterizar, evaluar y monitorear la biodiversidad en paisajes naturales asociada a sistemas productivos para el mantenimiento de la funcionalidad ecológica”, la unidad de saneamiento y biotecnología ambiental (USBA), ha planteado contribuir a la caracterización de la diversidad microbiana de suelos de las cuencas de los ríos la Vieja y Otún. En el presente estudio se pretende evaluar la diversidad genética de organismos degradadores de hidrocarburos, a partir de muestras de suelo provenientes de biomas de las cuencas de los ríos La Vieja (Departamentos del Quindío, Valle del Cauca, Risaralda) y 1 Rodríguez, D. Diseño de la estructura organizacional del CIEBREG. Disponible en línea en: <<http://ciebreg.utp.edu.co/Plone/Ciebreg/estrctura/ >>. Abril 10 2007

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Otún (Departamento de Risaralda) y su relación con el uso del suelo en sistemas productivos agrícolas y pecuarios, mediante cultivo y recuento selectivo por la técnica de número más probable(NMP), discriminación de ribotipos por PCR-DGGE del DNAr 16S y su afiliación taxonómica y filogenética por secuenciación. De igual manera se pretende evaluar la relación entre diversidad y capacidad de degradación potencial de hidrocarburos totales de petróleo.

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1. TITULO

Evaluación de la diversidad genética de bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas de suelos en sistemas ecológicos de las cuencas de los ríos Otún y la Vieja.

2. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto del uso del suelo sobre la diversidad genética de bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas de suelos de las coberturas vegetales más representativas de las cuencas de los ríos Otún y la Vieja y la relación de ésta diversidad con la capacidad degradadora de hidrocarburos totales de petróleo.

3. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Estandarizar las condiciones para el recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos mediante el uso de la técnica de número más probable.

Estimar y comparar la diversidad genética y composición de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos aisladas de suelos que soportan diversos tipos de coberturas vegetales asociadas a diferentes usos del suelo.

Evaluar los cambios temporales de la diversidad genética y de la composición de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos.

Analizar la relación entre la diversidad genética de bacterias degradadoras de hidrocarburos y la capacidad degradadora de hidrocarburos totales de petróleo, en suelos de sistemas ecológicos asociados a diferentes coberturas vegetales.

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4. PROBLEMA

4.1 Formulación. ¿Las prácticas agrícolas generan un impacto sobre la diversidad genética y la actividad potencial de bacterias degradadoras de hidrocarburos ?. 4.2 Planteamiento. Frecuentemente se menciona el aparente impacto que suponen sobre la diversidad biológica (evaluada ésta por taxones o por la funciones que éstos taxones cumples) los manejos intensivos y en ocasiones excesivos de los sistemas ecológicos. En la mayoría de los casos esto se ve reflejado en la reducción o la desaparición de los hábitat y nichos de especies animales y vegetales, justificando su conservación y protección con fines paisajísticos y ecológicos. Sin embargo a pesar del conocimiento general del papel que cumplen los microorganismos en la productividad de los sistemas ecológicos naturales o artificiales, en el ciclaje de nutrientes, y hasta en la regulación climática global (Atlas y Bartha, 2002), poco se conoce, no solo acerca de la diversidad especifica de microorganismos asociados a suelos tropicales andinos, sino también acerca del efecto que los cambios hechos en el uso del suelo tienen en la diversidad de microorganismos, ni si estos cambios se corresponden con pérdidas de la funcionalidad y amortiguamiento propios de sistemas sucesionales.

5 HIPOTESIS

HO: La diversidad genética y composición de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos no presentará diferencias entre suelos sometidos a diferentes usos del suelo.

HA: La diversidad genética y composición de especies de bacterias degradadoras de hidrocarburos presentará diferencias entre suelos sometidos a diferentes usos del suelo.

HO: La diversidad y composición de especies bacterianas degradadoras de hidrocarburos será igual en suelos sometidos a un mismo tipo de uso. HA: La diversidad y composición de especies bacterianas degradadoras de hidrocarburos diferirá entre suelos sometidos a una mismo tipo de uso.

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HO: La diversidad y composición de especies bacterianas degradadoras de hidrocarburos será igual entre eventos de muestreo. HA: La diversidad y composición de especies bacterianas degradadoras de hidrocarburos será diferente entre eventos de muestreo.

HO: En las muestras de suelo no se presentará predominancia de ninguna división, género o especie del dominio Bacteria.

HA: En las muestras de suelo se presentará dominancia de algunas divisiones, géneros y especies del dominio Bacteria.

HO: Suelos con número y abundancia de filotipos bacterianos diferente presentarán igual capacidad degradadora de hidrocarburos. HA: Suelos con número y abundancia de filotipos bacterianos diferente presentarán diferente capacidad degradadora de hidrocarburos.

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6 JUSTIFICACION

Son múltiples los estudios en diversidad y biología de la conservación de especies y de sistemas ecológicos, basados en macro-organismos (generalmente animales, plantas y algunos hongos filamentosos macroscópicos); dada la relativa facilidad en la descripción de este tipo de organismos, su ubicación en la redes tróficas y en los procesos de dinámica de los ecosistemas de los cuales hacen parte, esto ha permitido entender e incluso predecir los efectos que ocasionaría la desaparición de gran número de poblaciones de una especie o incluso de toda una especie en una región dada, generando alarma por las consecuencias que esto puede generar en la productividad primaria o secundaria de estos ecosistemas. Sin embargo este tipo de estudios, desconocen totalmente el papel de los microorganismos en los procesos productivos y de ciclaje de materia, sin los cuales la vida de los macro-organismos seria casi imposible. La determinación de la diversidad biológica se ha basado históricamente tanto en sus métodos como en su análisis, en los alcances hechos en la áreas de zoología y botánica. En estas áreas la descripción de los hábitats, nichos y características anatómicas y fisiológicas, ha facilitado no sólo la definición de lo que es una especie, sino el conocimiento claro y extenso de la distribución y composición vegetal y animal de gran parte de los biomas terrestres y de algunos acuáticos, hasta tal punto que se reconocen aquellas poblaciones o especies tanto extintas, como en peligro o amenaza de extinción. El estudio de los microorganismos como componentes esenciales de los sistemas biológicos, se ve además justificado por su alta diversidad. Los arboles filogenéticos basados tanto en genes ribosomales como metabólicos indican que la minoría de las formas de vida conocidas es macroscópica y que dentro de los organismos microscópicos se incluyen todas las formas metabólicas conocidas. A pesar de todos las esfuerzos para caracterizar la multiplicidad de bacterias, arqueas y eucariotas microscópicos, se ha imposibilitado el cultivo in vitro de la gran mayoría de organismos, dadas las complejas relaciones entre los microorganismos y el desconocimiento de las condiciones nutricionales in situ, reflejando que tan sólo conocemos una pequeña fracción de todos los procariotas presentes en la biosfera. Esta falta de información significa que desconocemos la base productiva de la mayoría de biomas mundiales, la cual sin duda está basada en las interacciones microbianas. En

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algunos casos los procariotas constituyen las únicas formas de vida en ambientes extremos y conforman las primeras poblaciones colonizadoras en ambientes intervenidos severamente por el hombre o por eventos naturales de gran magnitud. Es claro que sin la presencia de microorganismos en el suelo, el ciclaje de nutrientes se interrumpiría y llegaría al punto que o bien los reservorios naturales de estos elementos se agotarían o no quedarían disponibles. Este impacto podría reflejarse en la desaparición de poblaciones de macro organismos dependientes de estos reservorios. Puede ser entonces, que la extinción de algunas poblaciones de plantas o animales que son atribuidas a la explotación agrícola intensiva, sea en realidad un evento posterior al impacto generado en las comunidades microbianas. Es así como el estudio de poblaciones microbianas edáficas específicas, de la estructura de las comunidades, de la función que éstas cumplen y del impacto generado sobre éstas con las actividades pecuarias y agrícolas, constituye una prioridad. Estos estudio no son sólo claves para el conocimiento básico de la dinámica ecológica sino como información base para la aplicación de herramientas que permitan aumentar o estabilizar la productividad y el rendimiento sostenible en sistemas agrícolas y de servicios ambientales de la ecorregión cafetera a nivel de las cuencas de los ríos Otún y La Vieja.

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7. MARCO TEORICO Y ANTECEDENTES

7.1 DIVERSIDAD BACTERIANA La diversidad bacteriana puede ser definida como el número de especies o biotipos y su abundancia relativa en un espacio y tiempo determinados dentro de una comunidad o también puede ser definida como la cantidad y distribución de información (e.g. genética, funcional) dentro de la comunidad (i.e. comunidades complejas poseen mayor información). Esto incluye la diversidad de genes, de hábitats, nichos y la diversidad funcional de las poblaciones; de esta forma la diversidad puede considerarse un atributo de la comunidad, relacionada con estabilidad, productividad y estructura trófica (Stirling y Wilsey, 2001). A pesar del conocimiento que en los dominios Arquea y Bacteria se pueden encontrar todos los sistemas biológicos de conversión de energía conocidos por el hombre, nuestro conocimiento sobre la estructura y composición de las comunidades procariotas responsables en gran parte del ciclaje de materia y energía de compuestos orgánicos e inorgánicos mínimo. Este fenómeno no solo puede ser atribuido a las limitaciones de las herramientas técnicas y teóricas para medir, evaluar e interpretar la diversidad de especies, sino también en parte por la falta de acuerdo en la definición misma de especie bacteriana. La definición actual de especie propuesta por Rosello-Mora y Amann (2001) y reconocida por el comité ad-hoc para la re-evaluación de la definición de especie en bacteriología: “es un grupo monofilético y genómicamente coherente de organismos individuales que muestran un alto grado de similaridad en muchas características independientes, diagnosticables por una propiedad fenotípica discriminativa”, referido por los autores como el concepto polifásico de especie, afirmando que una especie procariota debe ser clasificada después de analizar y comparar tantos parámetros como sea posible incluyendo caracteres feno y genotípicos. A pesar del acuerdo sobre este concepto de especie y del conocimiento que las comunidades bacterianas no se comportan de igual manera que las comunidades vegetales o animales, los estudios de diversidad bacteriana se basan aun en índices y modelos de diversidad diseñados para el estudio ecológico de comunidades de macro-

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organismos. Estos índices de valoración de diversidad podemos dividirlos en tres grupos: a) índices de riqueza de especies, como los índices de Shannon-Wiener, índice de Margalef, estadística Q y estimadores de la riqueza de OTU’s; b) índices basados en abundancias proporcionales de especies (medidas de equitabilidad/dominancia), como el índice de equitabilidad de Shannon, índice de Simpson, índice de Berger-Parker e índice de Lloyd y Ghelardi; y c) modelos de abundancia de especies como el modelo serie log, modelo log normal, modelo de la “vara rota (broken stick)” y modelo de nicho sobrelapante (Magurran, 1988; Hill, 2003) Existen también herramientas como la rarefacción, que permite comparar y estimar la riqueza entre lugares, hábitats o tratamientos muestreados inequitativamente (Hugues, et al., 2001); sin embargo estos índices, no siempre son tan sensibles a cambios en la comunidad como el análisis con herramientas moleculares como lo afirman Hartmann y Widmer (2006). Muchos de estos índices se han adaptado para su aplicación con datos discretos como los proporcionados por técnicas moleculares, pero el uso e interpretación de estos índices debe ser cuidadoso pues cada uno así como tiene ventajas tiene limitaciones. La extensión de su utilidad depende tanto del tipo de muestreo, tamaño de la muestra, así como de la sensibilidad inherente que algunos índices poseen respecto a la dominancia o equitabilidad de las poblaciones. Existen propuestas alternas para la determinación de la diversidad que no utilizan los índices antes mencionados; Curtis, y cols (2002), afirma que es suficiente conocer el área bajo la curva de abundancia de especies para un ambiente dado para determinar la diversidad de especies, demostrando que la diversidad de procariotes puede estar relacionada solo con la proporción del número total de individuos y la abundancia del grupo mas abundante de esa comunidad. 7.1.1 Diversidad bacteriana y ambiente. La conexión entre la diversidad y la función de los sistemas biológicos es aún un tema de discusión abierto. Para algunos una mayor diversidad implica un detrimento para el sistema ya que como afirman Atlas y Bartha (2002), las comunidades que poseen una estructura compleja generalmente poseen tasas de producción primaria menor debido a que se necesitan menor cantidad de energía para mantener la estabilidad de la comunidad, sin embargo estas las comunidades diversas poseen un mayor rango de respuestas ante una perturbación (Atlas y Bartha, 2002). A pesar de esta flexibilidad, las comunidades expuestas a un factor unidireccional fuerte (e.g. estrés fisicoquímico) tienden a ser menos diversas debido a los procesos de selección asegurando con esto la estabilidad con pocas especies especializadas. Este fenómeno lo

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han reportado Rainey, y cols. (2005), en bacterias resistentes a ionización, reduciéndose la diversidad taxonómica a medida que la dosis ionizante aumentaba y Leys, et al., (2004) y Nakatsu, y cols (2000) para suelos contaminados con fenantreno y PAH respectivamente; cuando el control de la comunidad deja de ser abiótico, dejando paso al predominio de las interacciones biológicas, la diversidad aumenta y la estabilidad de la comunidad se asocia al alto número de especies. En general tanto el grado de relación entre diversidad y estabilidad de la comunidad, como el grado de relación entre diversidad y funcionalidad del sistema ecológico, son aspectos que se desconocen (Saville, 1999). Aunque una alta diversidad pueda significar una amplia flexibilidad frente a cambios ambientales, esto no quiere decir que pueda soportar alteraciones crónicas extremas y conocida la alta redundancia funcional de los microorganismos en el suelo se desconocen los efectos de la ausencia de algunas poblaciones en la función total de la comunidad (Andren y Balandreau, 1999; Bardgett, et. al., 2005). Teóricamente la diversidad debería aumentar con la sucesión ecológica, generalmente en sus primeras etapas y etapas intermedias, tendiendo a la estabilidad con una disminución de especies en la comunidad clímax. En ocasiones sin embargo el impacto de las actividades antrópicas ejercidas en forma crónica sobre comunidades diversas puede no verse reflejado en cambios en la estructura de la comunidad (Hartmann y Widmer, 2006). 7.1.2 Diversidad de procariotas en el suelo. Dada la multiplicidad de microambientes disponibles en el suelo y las múltiples interacciones con organismos animales y vegetales, la diversidad esperada de microorganismos en el suelo es grande. Curtis, y cols.(2002), estimaron usando curvas de abundancia de especies que en el suelo pueden encontrarse de 6.000 a 38.000 taxa por gramo, una cantidad enorme comparada con las cerca de 5000 especies de bacteria reportadas hasta ahora, indicando el gran desconocimiento de la composición de las comunidades. Por su parte Whitman, y cols (1998), estimaron el número total de procariotes en 4-6 x1030 células, de las cuales 2,6 x1029 células corresponden a procariotas en hábitat de suelo, siendo la mayor abundancia la de suelos de matorrales desérticos (63.2 x1027 células) y la menor la de bosques tropicales estacionales (1x1027 células). Estos grandes tamaños poblacionales pueden implicar que eventos que ocurren rara vez en el laboratorio (i.e. interacciones con otros organismos), sean frecuentes en la naturaleza, reflejándose en un número limitado de taxa cultivables reconocidos. En un gran esfuerzo por catalogar la biodiversidad en suelo a escala continental, así como los factores ambientales que los influencian, Fierer y Jackson (2006), basándose el la comparación de secuencias de rDNA, colectaron muestras a lo largo de norte y sur

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América y encontraron que la diversidad no estaba relacionada con factores biogeográficos como la temperatura, latitud y otras variables que predicen típicamente la diversidad de plantas y animales. La composición de especies tampoco se relacionó a la posición geográfica, aunque si encontraron que la riqueza de las comunidades difería entre tipos de ecosistema, pudiendo ser explicados estos cambios, por diferencia en pH del suelo, siendo mayor en suelos neutros y menor en ácidos, sugiriendo que la biogeografía es un factor irrelevante en la definición de la composición y diversidad. Esto es corroborado por otros autores como Buckley, (2006) que asocian las variaciones en composición de filotipos con variaciones en el contenido de materia orgánica, Ca+2 , pH y distribución espacial del aceptor final de electrones y Øvreas y Torsvik (1998) quienes asocian una mayor diversidad bacteriana a suelos orgánicos en comparación a suelos arenosos. Estos hallazgos son corroborados por Neufeld y Mohn (2005), quienes reportan un incremento en la diversidad en un suelo de tundra localizado en una posición extrema hacia el norte (82oN), sin relación alguna a la latitud. Sin embargo si hallaron una relación dependiente del grado de compactación del suelo y a la profundidad de hallazgo de los organismos, situaciones en las cuales la diversidad disminuye La composición de las comunidades bacterianas no sólo está determinada por las características fisicoquímicas del suelo, sino también por las poblaciones vegetales que éste sustenta (Garveva, et al., 2004), siendo la rizósfera un ambiente propicio para la proliferación de poblaciones de heterótrofos. En algunos casos, la presencia de ciertas especies vegetales puede ser un factor predictor de la presencia de grupos bacterianos específicos, como lo demuestra Hackl, y cols. (2004), para bosques de picea y roble, donde predominan grupos de α Proteobacteria, Holophaga/Acidobacterium y Verrumicrobia en diferencia a bosques de pino donde predominan Gram positivos ricos en G+C. Otro factor predominante en la composición de las comunidades lo constituye las interacciones con otros microorganismos, como lo demuestra la reducción en miembros de la división β-Proteobacteria y el aumento en Gram positivos con bajo contenido G+C debido a la predación por protistos en suelos de arrozales, aunque paradójicamente la diversidad presentó un aumento en la presencia de esta población de predadores (Murase, et al. 2006). A pesar de la propiedad dinámica inherente a las comunidades bacterianas en el suelo, es posible sin embargo encontrar poblaciones persistentes tanto en el tiempo (i.e. durante cambios estacionales), como espacialmente. Esto lo demuestra Smit, y cols.(2001), para especies de los géneros Micrococcus, Arthrobacter y Corynebacterium detectadas todo el

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año para cultivos estacionales, mientras que otras poblaciones como Bacillus sp. son más representativas en ciertas épocas del año. Es posible igualmente encontrar taxa bacterianos cosmopolitas, como miembros de las divisiones α, β, y γ Proteobacteria, Holophaga/Acidobacterium, Firmicutes, y Chloroflexi (Janssen, 2006), o especies endémicas y especificas de ciertas regiones como Cytophaga, reportado por Furlang, y cols.(2002) para suelos agrícolas y en cortezas de suelo desértico, o especies de los grupos Bacteriodetes, Chloroflexi y Gemmatinonadetes, como lo reporta Nagy, y cols.(2005), para cortezas de microorganismos en desiertos. 7.2 METODOS DE ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA.

Dentro de los métodos de análisis de comunidades y su diversidad, se han utilizado para la determinación de la abundancia tanto técnicas de recuento directo microscópico con coloraciones diferenciales. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo en cámaras de recuento, o mediante el uso de epifluorescencia acoplada al uso de colorantes como naranja de acridina, DAPI (4’-6-diamono-2-fenilindol), isotiocianato de fluoresceína (FITC) y la bisbenzimida (Hoeschst 33258), compuestos que poseen gran afinidad por acidos nucleicos. Estos colorantes pueden ser usados individualmente o en combinaciones, para la evaluación de las poblaciones presentes en una muestra o solo para grupos específicos de organismos, evidenciando incluso aquellos grupos metabolicamente activos, dada la propiedad de tinción diferencial del DNA y el RNA, de algunos de estos colorantes. La técnica de conteo por epifluorescencia ha mostrado ser mas sensible que el recuento por cultivo en placa, microplaca, o en tubos con atmosfera anaerobia, ayudando a identificar bacterias que por resolución de microscopio óptico son imperceptibles. Otra ventaja del uso de epiflorescencia para recuento total es que puede aplicarse a diferentes tipos de hábitats sin las desviaciones propias del recuento en placa, permitiendo registrar tanto poblaciones de organismos cultivables como no cultivables (Atlas, y Bartha, 2002). Una modificación de este tipo de conteo llamado FISH (hibridación fluorescente in situ, del inglés: fluorescent in situ hibridization), contempla el recuento de poblaciones especificas mediante el uso de hibridación con sondas u oligonucleótidos de DNA acoplados a fluorocromos, con el fin de describir la estructura y tamaño de poblaciones especificas en muestras ambientales (Kirk, et. al., 2004).

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En ocasiones se desea evaluar la presencia de grupos funcionales específicos recurriendo a métodos ya sea dependientes de cultivo o independientes de cultivo. Dentro de los métodos dependientes de cultivo, las técnicas más utilizadas son el recuento el placa, en el cual se seleccionan y se registra el número de colonias de organismos viables bajo condiciones específicas de nutrientes, temperatura, humedad, pH o resistencia a biostáticos o a biocidas. Otros métodos dependientes del cultivo hacen uso del cultivo líquido en microplacas, como los cultivos Biolog y la técnica de número más probable (Song, et al., 2001). En la técnica Biolog, se evalúan patrones de uso que hace una comunidad microbiana ya sea de una fuente única de carbono o de múltiples fuentes de carbono. La técnica de número más probable, es una alternativa al recuento en placa para conteo de organismos viables, en la cual se hace uso del cultivo en liquido en microplacas, de diluciones seriadas de una muestra, conteo basado en modelos de distribución estadística binaria (distribución de Poisson) del número probable de organismos en una muestra. Estos conteos se realizan ya sea valiéndose simplemente del grado de turbidez del medio como indicador de crecimiento o mediante el uso de indicadores de crecimiento, por cambio de pH (e.g. fenolftaleína, naranja de metilo), por el uso o extinción de nutrientes (e.g. reactivo de Griess-Illosvays, reactivo de Nessler, difenilamina), por la presencia de metabolitos o productos finales (p.e. α−naftol), o por indicadores de actividad bacteriana aerobia o anaerobia, heterotrófica o autotrófica (i.e. sales de tetrazolio, ver Sales de tetrazolio y recuentos de viabilidad). Sin embargo todas estas técnicas dependientes de cultivo tienen limitaciones, las cuales incluyen la dificultad para separar a bacterias y esporas de los gránulos de suelo y/o biopeliculas, desviaciones por la escogencia del medio y condiciones de cultivo, así como la ausencia o presencia de inhibiciones entre colonias y la dispersión de las mismas. Todas estas situaciones pueden enmascarar y subestimar los conteos (Schoenborn, et. al., 2004) o en algunos casos sobrestimar los conteos por favorecimiento de organismos de rápido crecimiento (Kirk, et. al., 2004). Las técnicas dependientes de cultivo muy a menudo representan una desviación de la composición real de las comunidades dado que suelen proporcionarse condiciones que distan de las presentes en el medio del cual fueron extraídas. En la mayoría de los casos la ausencia de interacciones con otras poblaciones, implica que sólo presenten crecimiento miembros de aquellas poblaciones con mayor representatividad o cuyo nicho incluye las condiciones representadas in vitro. Para resolver este tipo de problemas se ha planteado el uso de técnicas independientes del cultivo para el estudio de comunidades bacterianas complejas. Este tipo de estudios puede involucrar el análisis de componentes de la membrana celular, como lo son los análisis de PLFA (Ranjard, et al., 2000; Liu, y Stahl,

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2001; Kirk, et. al., 2004 ) , el análisis FAMES (Atlas y Bartha, 2002) o el análisis de las secuencias de ácidos nucleicos. Los análisis de ácidos nucleicos en especial del DNA, pueden enfocarse ya sea en toda la información genética del DNA extraído (análisis completo de DNA comunitario) o en secuencias genómicas especificas (análisis parcial del DNA comunitario), de una muestra ambiental o de cepas puras. Los métodos de análisis del DNA pueden ser basados en la diferencia de tamaño de fragmentos generados por restricción enzimática de productos de PCR tanto de DNA como cDNA (e.g. ARDRA [análisis de restricción de DNA ribosomal amplificado], RISA[análisis de secuencia espaciadora intergenica ribosomal,], tRFLP[polimorfismo de tamaño de fragmentos de restricción terminal], RFLP[polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción]), o por amplificación aleatoria de una región del genoma (RAPDs); otro grupo de técnicas que también permiten realizar el análisis basado en las diferencias en la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA son DGGE(electroforesis en gel de gradiente denaturalizante), TGGE(electroforesis en gel con gradiente de temperatura) y la secuenciación (Muyzer, 1999; Nakatsu, et al., 2000; Garcia-Pichel, et al., 2001). En éstas de estas técnicas, las diferencias en la migración electroforética permiten obtener perfiles de bandas (genetic fingerprinting) que proporcionan una visión global de la estructura genética de la comunidad microbiana. Estos datos permiten finalmente la estimación y evaluación de la diversidad de la comunidad y en menor medida la abundancia de poblaciones específicas en el caso de DNA total procedente de muestras ambientales. Sin embargo, estos perfiles no deben ser interpretados directamente como indicadores de riqueza y equitabilidad dado que una banda en el gel, puede representar ribotipos de especies diferentes que comigran en el gel o varias bandas en un carril pueden representar las copias del operón ribosomal de un mismo organismo (caso muy poco frecuente en bacterias pero posible siempre), fenómenos que se reducen al partir de cultivos puros. Las técnicas de análisis de ácidos nucleicos, se han enfocado principalmente en el análisis de los genes del operón ribosomal particularmente en los genes rrs (RNAr 16S), rrl (RNAr 23S) y en la región espaciadora intergénica (IGS) entre los genes rrs y rrl. En el caso de ARDRA, el análisis de los genes rrs y rrl implica la amplificación y discriminación de diferencias en la secuencia nucleotídica por el uso de enzimas de restricción, que en si mismo representa una limitación debido a la escogencia de las enzimas adecuadas que sean lo suficientemente informativas pero a su vez no generen patrones de bandeo muy complejos para ser interpretados. Una alternativa lo constituye la técnica t-RFLP, en la cual se hace uso de iniciadores marcados con fluorocromos, lo que permite ver no todo el conjunto de bandas generado en la digestión enzimática sino solo aquellos fragmentos

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unidos al iniciador marcado, facilitando la interpretación de los perfiles (Ranjard, et. al., 2000; Liu, y Stahl, 2001). En el caso de la técnica RISA, no son los genes rrs y rrl el objetivo sino la región intergénica entre estos, región cuyo tamaño varía desde 50pb hasta 1500pb, y la cual posee una alta variabilidad. Esta variabilidad permite clasificaciones taxonómicas más específicas, sin embargo las bases de datos de secuencias intergenicas ribosomales son aún muy pequeñas, lo que limita la identificación (Ranjard, et. al., 2000). Existen algunas dificultades inherentes al uso de técnicas basadas en amplificación de genes por PCR y su interpretación; estas incluyen, los iniciadores escogidos que pueden presentar diferencias en cuanto a su hibridación preferencial por ciertas secuencias en la comunidad; también, a pesar de de la alta sensibilidad de la técnicas basadas en PCR, éstas pueden no reflejar la presencia de comunidades con baja representación, debido a los problemas inherentes a la lisis y extracción de ácidos nucleicos, así como a la presencia de sustancias inhibitorias como los ácidos húmicos y fúlvicos, los cuales están presentes en grandes cantidades en muestras de suelo y sedimento. Existe también la posibilidad de generación de moléculas heteroduplex que pueden formarse entre cadenas sencillas de dos moléculas similares pero no idénticas del DNA o la generación de artefactos sobretodo en técnicas como RAPD dada la naturaleza aleatoria de este tipo de amplificación, lo que conduce a conclusiones erróneas acerca de la composición de la comunidad (Friedrich, et al., 1997; Ranjard, et al., 2000; Liu, y Stahl, 2001 ). El uso de las técnicas moleculares basadas en el análisis de genes ribosomales, ha permitido evidenciar la presencia de grupos de bacterias que se creían exclusivos de ambientes acuáticos como Plantomyces (Buckley, 2006) y la identificación de grupos y especies nuevas (Garcia-Pichel, et al., 2001; Janssen, et al., 2002; Leys, et. al., 2004; Rainey, 2005). Igualmente han mostrado ser útiles en el seguimiento de la diversidad y sucesión bacteriana en sistemas de bioremediación (Popp, et al., 2006), así como el reconocimiento de miembros del dominio Arquea como componentes ecológicos significativos en el suelo (Bintrim, et. al., 1997).

7.2.1 Cronómetros moleculares, diversidad y filogenia bacteriana. Una molécula cuya secuencia cambia en forma aleatoria a través del tiempo evolutivo, es considerada como un cronómetro molecular. La cantidad de los cambios acumulados en la secuencia es resultado del producto de la tasa a la cual las mutaciones son fijadas, por el tiempo que estos cambios han ocurrido. Para que una molécula sea un cronometro útil, debe cumplir con ciertas características como: tener un comportamiento tipo “reloj” (i.e. los cambios en la secuencia debe ser tan al azar como sea posible), tener rango (i.e. las tasas del cambio

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deben ser conmensurables con el espectro de distancias evolutivas siendo analizadas) y poseer el tamaño apropiado (i.e. lo suficientemente grande para proporcionar suficiente información)( Woese, 1987). Muchas moléculas han sido utilizadas como cronómetros moleculares para establecer relaciones filogenéticas; entre éstas se encuentran algunos citocromos, ferredoxinas, RNA polimerasas (Case, et. al., 2007; Dahllöf, 2000), factores de elongación de la traducción de mRNA, y factores de transcripción; sin embargo, el uso del rRNA se ha expandido tanto en estudios evolutivos como en estudios de estructura de comunidades in situ.

Entre las razones que respaldan el uso del rRNA como cronómetro molecular son: a) su abundancia intracelular y la relativa facilidad en su aislamiento, b) el hecho que es codificado tanto por genomas nucleares, de organelos, y genomas procariotas, c) muestra un alto grado de conservación en su funcionalidad y en su estructura en los tres dominios, d) se encuentra en todos los organismos, e) diferentes regiones de su secuencia cambian a tasas distintas, permitiendo que la mayoría de relaciones filogenéticas puedan ser medidas (i.e. amplio rango) (Gutell, et al., 1994). Otras razones para ser escogido como cronómetro incluyen que contiene varios dominios, lo que reduce el riesgo que cambios no aleatorios en un dominio, afecten a toda la molécula (Woese, 1987); adicionalmente su interacción con más de otros 100 RNA y proteínas con las cuales ha coevolucionado, permite que los genes que codifican para rRNA sean los menos propensos a experimentar transferencia horizontal (Pace, 1997). Una ventaja adicional la constituye el hecho que la base de datos de secuencias de los genes ribosomales (RDB2) que codifican para las subunidades 16S y 23S son bastante amplias en número de entradas, lo que permite una mayor seguridad en la identificación de organismos procariotas tanto cultivables como no cultivables.

Aunque el árbol filogenético universal basado en las secuencias de los genes ribosomales micro subunitarios es muy similar a los elaborados basados en genes que codifican proteínas, se debe tener en cuenta que a pesar de esto no es lógico hacer equivalentes la filogenia de genes con la filogenia de los organismos (Fox, et al., 1992). Sin embargo, los arboles filogenéticos basados en proteínas usualmente difieren en las ramificaciones intra dominios con respecto a los arboles basados en genes rDNA muy posiblemente evidenciando episodios de transferencia horizontal de los genes no ribosomales (Pace, 1997; Young, 2001).

2 Disponibles en línea en: <<rdp.cme.msu.edu>> y <<rrna.uia.ac.be/ssu>>

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7.2.2 Electroforesis en gel de gradiente denaturalizante (DGGE) en el estudio de la diversidad bacteriana. En la electroforesis en gel de gradiente denaturante descrito por primera vez por Fisher y Lerman, (1983), el DNA de doble cadena está sujeto a un ambiente denaturalizante creciente en el cual la doble cadena de DNA se separa en segmentos discretos llamados ‘dominios de denaturación”. Las condiciones de denaturación de estos segmentos son específicos de su secuencia, así cuando la temperatura del dominio con mas baja temperatura de denaturación o con menor resistencia al ambiente iónico presente es alcanzado, el DNA se volverá parcialmente denaturado creando moléculas ramificadas lo cual reduce su movilidad en un gel. Dado que esta denaturación es dependiente de secuencia, la presencia de mutaciones alterará la migración de la molécula en el gel, permitiendo de este modo la discriminación de secuencias que se diferencian en tan solo una base. Debido a que cuando las moleculas de DNA se denaturan completamente la migración vuelve a ser función del tamaño y no de su secuencia, los iniciadores utilizados en los procesos previos de amplificación poseen una secuencia de 30 a 40 guaninas-citocinas (GC), lo que permite que la molécula no se denature completamente (Green, 2005). El proceso de DGGE transcurre a temperatura constante en un gradiente lineal de denaturación con urea y formamida (usualmente se utilizan rangos de denaturación amplios como 0 a 100% o 20-70%), el cual puede es paralelo al sentido de la corriente aplicada. La técnica de separación en gradiente denaturante es muy útil cuando se pretende evidenciar diferencias de secuencia entre fragmentos de DNA de igual tamaño, los cuales en un gel no denaturante de poliacrilamida o agarosa, serian indistinguibles. La presencia de diferentes secuencias en un perfil electroforético en un gel DGGE puede evidenciar la existencia de poblaciones diferentes que procedan de una muestra ambiental, de un sistema cerrado o de un banco de cepas morfológica y/o funcionalmente indistinguibles. La técnica DGGE ha sido ampliamente usada ligada a amplificación previa por PCR para el estudio de comunidades complejas de ambientes naturales (Muyzer, et al.,1993) tanto en sistemas terrestres como acuáticos (Schafer, y Muyzer, 2001), o en sistemas controlados (Amador, 2006), basado en el análisis de genes específicos como genes ribosomales, genes de metabolismo del nitrógeno (Muyzer, 1999) o del metabolismo del azufre (Dar, et. al., 2007). 7.2.3 Sales de tetrazolio en recuentos de viabilidad celular. Las sales de tetrazolio han sido ampliamente usadas para evidenciar actividad biológica tanto en sistemas procarióticos (Roslev y King, 1993; Zhang y Liu, 2002; Berrige, et al., 2005), como

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eucarióticos (Roehm, et. al., 1991). Dada su facultad de competir con las moléculas de la cadena de transporte de electrones, por electrones procedentes de fuentes de energía orgánica o inorgánica, permiten evidenciar actividad deshidrogenasa (Dunigan, et. al., 1995), extendiendo su utilidad no solo para sistemas aerobios, sino también para sistemas anaerobios (Bhupathiraju, et. al., 1999) e incluso autotróficos. Cuando este tipo de las sales son reducidas experimentan cambio de coloración (estructura formazán), en algunos casos dando lugar a precipitados coloreados como es el caso al utilizar las sales CTC (5-ciano-2,3-ditoliltetrazolio cloruro), INT (2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-5-fenil cloruro de tetrazolio), MTT [3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro] o formas solubles en agua al usar las sales XTT (sodio-2,3-bis-[2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenil]-2H-tetrazolio-5-carboxanilida), WST-1 {4-[3-(4-Idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]- 1,3-benzene disulfonate}(Johnsen, et al., 2002). Estos cambios en coloración pueden ser registrados cualitativamente o cuantitativamente, por espectrofotometría del medio de cultivo (Johnsen, et al., 2002; McCluskey, et al., 2005). Sin embargo se debe ser precavido en la interpretación de los resultados cuando se utilizan estas sales como indicadores, ya que se ha evidenciado su reducción en condiciones abióticas por iones ferrosos (Fe+2) o cuando la sal se encuentra en exceso (>5mM). Este tipo de reducción abiótica ha mostrado ser dependiente del pH del medio, del tiempo de incubación y de la concentración de la sustancia reductora (Thom, et al., 1993), e incluso hay evidencia que apoya el hecho de especies como Pseudomonas fluorescens que puede usar la sal XTT como sustrato (Thom, et. al., 1993 ; Bensaid, et. al., 2000). También debe tenerse en cuenta que este tipo de sales han mostrado cierto grado de toxicidad. En un estudio reportado por Hatzinguer, y cols.(2003), la utilización de XTT a una concentración de 3mM causó el descenso en más de 4 órdenes de magnitud en los conteos de células, como lo hicieron también las sales INT y CTC, causando declinación en la viabilidad, con la particularidad que las células susceptibles mostraron acumulación intracelular de cristales de formazán. A pesar de estas dificultades el uso de este tipo de indicadores ha facilitado la evaluación de comunidades tanto en sistemas cerrados, como en muestras ambientales (Hatzinger, et. al., 2003). Ventajas que apoyan el uso del XTT aparte de su solubilidad y facilidad en la interpretación, es que no precipita dentro de la célula, su uso es más simple y los costos son menores a los costos de medir las tasas de consumo de O2, contenido de ATP o conteo en placa.

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8 MATERIALES Y METODOS

8.1 Área de estudio. El área donde se ubican los sitios de muestreo corresponde al Complejo Ecorregional Andes del Norte (CEAN) que incluye las cuencas de los ríos Otún y la Vieja. El rio Otún tiene su origen en la laguna del mismo nombre en el parque de Los Nevados, con una trayectoria este-oeste de 67 Km, un área de cuenca de 499.000.000 m2, que incluye el municipio de Pereira. Presenta un óptimo de precipitación de 2700 mm/año en la parte media, 1000mm/año en la parte alta y 1600mm/año en su parte baja, desembocando finalmente en el rio Cauca. En la cuenca se encuentran los parques nacional natural de Los Nevados, Ucumani y el santuario de fauna y flora (SFF) Otún-Quimbaya, localizado este ultimo sobre el flanco occidental de la cordillera central zona media-alta del rio Otún en la vertiente izquierda de la verada La Suiza, corregimiento de La Florida, con 4,89 Km2 de extensión, localizado entre los 1815-2300 msnm, temperatura media de 15oC y precipitación media anual de 2638,5 mm. Por su ubicación 4o 40’ a 5o36’ latitud norte las cuencas hidrográficas que constituyen el departamento de Risaralda están comprendidas en la zona del ecuador climático, que esta influenciado por la zona intertropical de convergencia (ZIC) con lluvias cenitales y calmas sofocantes en los meses de Abril-Mayo-Junio y Septiembre-Octubre-Noviembre con un patrón de lluvias típico bimodal, después de los equinoccios de primavera y otoño en los meses de Abril y Octubre respectivamente, con épocas secas en los meses de Enero-Febrero y Junio-Agosto3.

En el área existe el ecosistema andino, con bosques montano altoandinos (bosques de niebla), siendo especies vegetales representativas la ceiba (Ceiba pentandra), cedro negro (Juglans neotropica), cedro rosado (Cedrela odorata), higuerón (Ficus sp.), el abrazapalos (Anthurium crassinervium), el comino laurel (Aniba perutilis Hemsley), el pino colombiano (Decussocarpus rospigliosii), la palma macana (Euterpe precatoria) y la palma de cera (Ceroxylon quindiuense), caracterizados en su mayoría por su gran altura, fustes rectos y corpulentos, con ramificaciones por encima de los 10 m y copas bien desarrolladas. Los suelos se caracterizan por la presencia de Andisoles, siendo los factores predominantes de su formación el clima húmedo sin periodos secos, la presencia de material mineral de

3 CIEBREG. 2005. Documento interno, características de ventanas y subventanas del área de estudio. p.

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origen volcánico, rico en productos amorfos silicoluminosos hidratados y asociado a materia orgánica4. El rio La Vieja se origina por la confluencia de los ríos Quindío y Barragán y en su cuenca formada por 17 subcuencas se incluyen municipios de los departamentos de Quindío, Risaralda y Valle del Cauca; está localizada en la zona hidrográfica Magdalena–Cauca con un área de 2.836 Km2 un recorrido de 102 Km; cuenta con un clima caracterizado por precipitaciones anuales mayores a 2000 mm/año a alturas superiores a los 1400 msnm, con humedad relativa de 80%, una temperatura media anual de 20oC, y gran variabilidad climática, dado el gran número de zonas de vida que sustenta y que van desde los 950 hasta los 4600 msnm. La cuenca del rio La Vieja (ventana), definida como escenarios representativo de transformación cuenca bioma, las cuales son a su vez unidades especiales de análisis, se encuentra, para su estudio, dividida en dos subventanas cada una con una extensión de 75 Km2, representativas de la heterogeneidad ambiental de la cuenca. La primera llamada Cartago comprende los municipios de Quimbaya, Cartago y Montenegro, localizada sobre el margen derecho del rio la Vieja e incluye 18 fincas, correspondiente al bioma basal, donde predominan las consociaciones Guadua-Bosque y pastizales para ganadería de carne y leche. La subventana 2 llamada Montenegro localizada en centro de la cuenca, corresponde el bioma subandino (1200 a 1400 msnm), donde los ecosistemas naturales están seriamente transformados, con una pobre cobertura de ecosistemas naturales de guadua en medio de una matriz dominante de monocultivos de café, caña de azúcar y plátano. 8.2 Diseño de muestreo. Se realizarán dos eventos de muestro (EM) en los meses de Abril y Julio respectivamente, tanto en la cuenca del rio la Vieja como en la cuenca del rio Otún. En cada cuenca se seleccionará una región denominada para el estudio, ventana (unidades cuenca-bioma), la cual cumple con ciertas características especificas respecto a: integridad ecológica de la cuenca, índice de fragmentación de la ventana, índice de importancia biológica e índice de amenaza de transformación por presión antrópica. En cada una de estas ventanas se eligirán tres coberturas vegetales diferentes, siempre con una cobertura con baja intervención antrópica, como referencia y otras dos coberturas en representación de monocultivos propios de la región. Las coberturas elegidas por cada ventana se muestran en la Tabla 1. 4 Parques Nacionales de Colombia. Santuario de fauna y florea Otun-Quimbaya. Disponible en línea en: <<http://www.parquesnacionales.gov.co/areas/lasareas/otun/otunintro.htm>>. Abril 10 de 2007.

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Tabla 1. Coberturas vegetales y fincas de muestro de las ventanas la Vieja y Otún-Quimbaya.

Ventana Cobertura Finca

La Vieja

Bosque Lusitania Veraguas La Ilusión

Pastizal La Ramada

Villa Ximena Tesalia baja

Cafetal sin sombrío El Descanso

La Aldea Buenos Aires (platanal)

Otún-Quimbaya

Bosque Manzano Bejucos La Selva

Cebollal Manzano Macarena Bella Vista

Plantación forestal Playa Rica La Selva Lisbrán

Por cada cobertura se eligirán 3 fincas que posean ese tipo de cobertura y dentro de cada finca se demarcarán 3 cuadrantes en los cuales se realizará la toma de la muestra compuesta. Con el fin de obtener muestras de suelo que presenten características homogéneas y reflejen la composición bacteriana más probable del lugar, se procederá a conformar una muestra compuesta de cada punto de muestreo. Para ello en el área de suelo seleccionada, se demarcará un cuadrante de 2,5 m x 2,5 m con estacas y soga, siendo las áreas de toma de submuestras, los vértices y centro dentro del cuadrante. Previo a la toma de muestra, se procederá a la medición de la altura de la hojarasca, temperatura del suelo, índice de cobertura vegetal en cada sección del cuadrante, así como el registro de la temperatura máxima y mínima para cada cuadrante mediante el empleo de un termómetro de temperaturas máxima y mínima. Las muestras de suelo se tomarán por medio de un barreno de torsión de 20 cm de altura por 5 cm de diámetro para un volumen individual de aproximadamente 1500 cm3. Las

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muestras individuales de los cinco puntos se depositarán sobre un plástico de calibre grueso, donde los conglomerados de suelo se disgregarán, las ramas, raíces y raicillas serán retiradas a mano utilizando guante de látex, para reducir contaminación cruzada con la toma previa o posterior de otras muestras; aproximadamente 250 g de esta muestra compuesta son depositados en bolsas herméticas resellables estériles evitando al máximo la incorporación de aire dentro de las mismas. Todos los instrumentos incluido el barreno y las palas se limpiarán lo máximo posible antes de proceder al muestro de otro punto dentro de cada cobertura y entre coberturas. Las muestras compuestas se mantendrán en nevera con pacas de hielo hasta su depósito en nevera a 4oC. 8.3 Determinación de características fisicoquímicas. 8.3.1 Determinación de pH del suelo. 5 g de muestra compuesta de suelo se mezclarán con 5 ml de agua destilada deionizada, por agitación durante 15 min; esta mezcla se dejará decantar durante una hora a temperatura ambiental. Posteriormente se realizará la medición del pH del líquido sobrenadante, equivalente al pH del suelo precipitado (EPA, 1995). 8.3.2 Determinación de humedad del suelo. 10 g de muestra compuesta de suelo serán depositados sobre una bandeja de aluminio (el cual ha sido previamente pesado en balanza analítica) y secados en horno a 150oC durante 24 h. El suelo será vuelto a pesar y el porcentaje de humedad será determinado según la ecuación 1 (Anexo C) . Se debe aclarar que dado que para efectos de comparación entre muestras de suelo, todas las determinaciones deben ser expresadas por gramo de peso seco, así que las determinaciones de NMP (número más probable) o UFC (unidad formadora de colonia según sea el caso, deberán ser multiplicados por el factor de corrección (peso suelo seco/peso suelo húmedo). 8.3.3 Determinación de carbono orgánico total. Siguiendo el procedimiento de pérdida de peso por ignición sugerido por Combs y Nathan (1998), 10 g de muestra compuesta de suelo serán secados por dos horas a 105oC en crisol previamente pesado; el crisol se dejará enfriar y se registrará el peso (hasta 4 cifras significativas, p.e. +0.001 g); posteriormente el crisol con el suelo se llevará a calentamiento en mufla a 360oC por dos horas después que la temperatura ha llegado a ese valor. Después de este tiempo la temperatura se disminuye a 150oC y se dejará enfriar en desecador, tras lo cual se registrará el peso (ecuación 5, Anexo C). La estimación de la materia orgánica es hecha por

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análisis de regresión de la pérdida de peso por ignición en una ecuación de pérdida de peso por ignición versus contenido de materia orgánica en suelos con contenido de carbono conocido. 8.3.4 Determinación de hidrocarburos totales de petróleo de las muestras compuestas de suelo. La determinación de hidrocarburos totales en muestras de suelo se realiza por extracción con solventes orgánicos. Para ello se mezclará en un tubo plástico tapa rosca, 1 g de muestra compuesta con 10ml de diclorometano:acetona (1:1, v/v) y se somete a agitación horizontal a 120 rpm por 30 min, luego de lo cual la mezcla es centrifugada a 1100 rpm por 10 min, tras lo cual se extrae el sobrenadante y se filtrará a través de papel Whatman No. 40 conteniendo silica gel (previamente secada en horno en cajas Petri) y se reservará en un tubo vidrio limpio previamente pesado; el proceso de adición de diclorometano : acetona y centrifugado se repetirá 2 veces más, filtrando y agregando el sobrenadante al ya reservado. El tubo con el filtrado será puesto en baño serológico a 50oC temperatura a la cual el diclorometano y la acetona se volatilizan, pero los TPH no; así, los tubos abiertos serán incubados hasta que todo el solvente desaparezca, tras lo cual los tubos son pesados nuevamente, siendo la diferencia entre peso inicial y final el contenido en hidrocarburos totales, expresado en mg/Kg de peso seco (ASTM, 1995; Sadler y Cornell, 2003). 8.4 Recuento de microorganismos degradadores de hicdrocarburos totales de petroleo. El recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos se realizará mediante el método de número más probable en microplacas de 96 pozos como lo sugieren Haines, y cols. (1996), y Wrenn, y Venosa, (1996), modificado usando la sal soluble de tetrazolio XTT como indicador de metabolismo activo como lo sugieren Roslev y King, (1993), Hatzinguer, y cols. (2003), y McCluskey, cols. (2005), y adaptado para el recuento de micrrorganismos degradadores de hidrocarburos como lo sugiere Vallejo y cols (2007). 8.4.1 Estandarización de la técnica de número más probable con XTT para el recuento de microorganismos degradadores de hidrocarburos. En este estudio se hará uso de la sal de tetrazolio XTT, la cual es soluble tanto en su forma oxidada como reducida, lo cual facilita la interpretación de los resultados. Como fuente de carbono única se utilizará diesel filtrado a través de membrana de 0,22 µm, lo cual permitirá la selección de organismos degradadores de hidrocarburos alifáticos y/o aromáticos. Dado que se ha reportado la toxicidad intracelular de las sales de tetrazolio, es necesario determinar no solo la concentración óptima de XTT que permita una máxima recuperación y una lectura

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segura de actividad degradadora, sino la concentración mínima de células que pueda ser determinada(sensilbilidad) y el tiempo de incubación óptimo con la sal de tetrazolio. Para ello primero se determinará una curva de crecimiento para la cepa Acinetobacter sp, PUJ-M-Bio-USBA-98, (microorganismo degradador comprobado de hidrocarburos aislado a partir de un suelo contaminado con petróleo crudo). Para ello se permite el crecimiento de la cepa en caldo Bushnell & Hass (Anexo A), suplementado con 2,5% (v/v) de diesel, y se realizarán lecturas de absorbancia en espectrofotómetro a 600nm de longitud de onda; en forma paralela se realizará cada 30 minutos durante un periodo de 4 horas, la siembra en placa en el mismo medio solidificado al 1,5% (p/v), con el fin de realizar el recuento de UFC. Con estos datos se realizarán posteriormente diluciones de UFC hasta obtener concentraciones de 102, 103 y 104 y 105 UFC/ml. Los cultivos con diferentes concentraciones celulares se realizarán en microplacas de 96 pozos, variando las condiciones de concentración de la sal XTT (1mM, 1,5mM 2mM y 2,5mM), y tiempo de incubación con la sal de tetrazolio (12h, 14h, 16h y 18h). Como controles se establecerán tres: a) medio de cultivo, b) medio de cultivo + fuente de carbono (diesel) y c) medio de cultivo + fuente de carbono + Bacillus cereus cepa PUJ-M-Bio-USBA-121 (como control negativo, por ser éste un microorganismo no degradador de hidrocarburos). Luego del tiempo de incubación respectivo se realizará lectura en espectrofotómetro para placas (Labsystems Multiscan; MCC/340) a 492nm. Se establecerá como punto de corte, el valor promedio mas dos desviaciones estándar de las lecturas de absorbancia de los pozos de los controles negativos, siendo positivas todas las lecturas cuya absorbancia sea mayor al punto de corte. 8.4.2 Recuento de microorganismos degradadores de HC por técnica de número más probable. Inicialmente de una muestra de suelo fragmentada manualmente para disgregar gránulos (con el fin de minimizar las interacciones negativas entre microorganismos) como lo sugiere Grundmann (1999), se pesarán 10 g de suelo y se diluirán en 90 ml de solución salina estéril; esta mezcla se agitará durante 15 min a 160 rpm y a partir se esta dilución (10-1) se preparan diluciones seriadas hasta 10-6; las microplacas de PVC o poliestireno serán esterilizadas por exposición a luz ultravioleta durante 1h; en cada uno de los pozos de la misma se agregarán 180µl de medio sales mínimas Busnell & Hass recomendado por Atlas y Bartha (1995) (ver Anexo A), 20µl de cada una de las diluciones y finalmente 5µl de diesel como fuente de carbono y energía (previamente filtrado a través de membrana de 0,22µm con 5 repeticiones por cada dilución (Maldonado, 2003). Las placas son cubiertas con plástico vinipel para evitar pérdidas de hidrocarburos por evaporación y se incubarán las placas en oscuridad a

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temperatura ambiental durante 15 d, en condiciones aerobias. Después de la incubación, se añadirán 50 µl de XTT a la concentración óptima estandarizada por el tiempo de incubación determinado como óptimo, cubriendo las placas con papel aluminio e incubadas a 22± 3°C en agitación a 150rpm. La lectura de intensidad de color se realizará en un espectrofotómetro para microplacas (Labsystems Multiscan MCC/340), a una longitud de onda de 492nm; los pozos que presenten un valor de absorbancia superior al punto de corte serán considerados como positivos y estos resultados junto con los resultados negativos, serán analizados en el programa Most Probable Number Calculator v.4.0, que proporciona el valor del número más probable de microorganismos por gramo de suelo; este cálculo también puede realizarse con el uso de Office Excel como lo recomiendan Briones y Reichardt, (1999). Como controles se establecerán tres: a) medio de cultivo, b) medio de cultivo + fuente de carbono (diesel) y c) medio de cultivo + fuente de carbono + Bacillus cereus cepa PUJ-M-Bio-USBA-121 (como control negativo, por ser éste un microorganismo no degradador de hidrocarburos). Como control positivo se incluye un pozo al que se adicionan 20µl de cultivo de una cepa control degradadora de hidrocarburos (Acinetobacter sp, PUJ-M-Bio-USBA-98). Para el caso de los organismos control se tomarán las diluciones 10-2 preparadas apartir de una dilución de un cultivo en solución salina esteril con absorbancia entre 0,7-0,8 medida a una longitud de onda de 600nm. Las diluciones menores que no se hayan incluido en el ensayo de NMP se considerarán como positivas.

8.5 Aislamiento y recuperación de bacterias degradadoras de TPH. Las bacterias degradadoras de HC son aisladas directamente de los pozos positivos de las diluciones más altas en el recuento de NMP como lo sugieren Wrenn y Venosa (1996). Esto se realizará mediante siembra en superficie en agar Bushnell-Hass, y estableciendo una atmosfera saturada de hidrocarburos mediante la aplicación de 20µL de diesel en discos de papel filtro (0,5 cm de diámetro) fijados en la tapa de la caja Petri como lo sugiere Margesin, y cols. (2003); las cajas serán incubadas durante 15 días en un cuarto oscuro a temperatura ambiental. Las colonias macroscópicamente visibles son repicadas y aisladas en agar nutritivo e incubadas a temperatura ambiental por 24 h tras lo cual se registran las características macroscópicas de las colonias así como las características microscópicas por tinción diferencial de Gram, hasta asegurar la obtención de cepas puras con características uniformes.

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8.6 Extracción de DNA a partir de cultivos puros de aislados de muestras compuestas de suelo. A partir de colonias de cultivos puros de los aislamientos de suelo, se realizará la liberación de ácidos nucleicos, suspendiendo una asada de una colonia de cada aislamiento en 50 µl de agua destilada deionizada estéril (MiliQ) o búfer TE (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) pH 8.0 (según sea la resistencia al rompimiento), en tubos de PCR de 200µl. Se someterán a calentamiento a 100oC por 15 min., tras lo cual los tubos son colocados inmediatamente en baño de hielo. Con el fin de determinar que el proceso permitió la liberación del DNA cromosomal y para evaluar su integridad, se realizará electroforesis de 10 µl de los lisados bacterianos, en agarosa al 1% (p/v) adicionado con 1 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml), a 120 V por 40 min. (Sambrook, 2000). 8.7 Amplificación de genes de DNAr 16S por PCR. Para la identificación y diferenciación de ribotipos procedentes de los aislamientos de muestras de suelo, se realizará la amplificación selectiva de la región variable V3 del rDNA, que codifica para el rRNA 16S. Para esto y siguiendo las recomendaciones del protocolo sugerido por Casamayor, y cols.(2000), se prepara la mezcla de reacción para amplificación para volumen final de 50 µl con concentraciones finales de 1X de GoTaq Flexi búfer PCR 5X (Promega), 2,5 mM de MgCl2 25 mM (Promega), 0.2 mM de cada deoxinucleótido trifosfato (dATP, dTTP, dCTP, dGTP-PCR Nucleotide Mix Promega), 0.1 µM de cada iniciador universal (341F GC5 y 907R6), 0,025 U/µl de polimerasa recombinante (GoTaq DNA Polymearse, Promega) y 1 µl de mezcla de ácidos nucleicos liberados por ebullición. El programa secuencial de ciclos de amplificación se muestra en la Tabla 2 (Muyzer, et.al, 1993). El producto de amplificación con los iniciadores antes mencionados tiene un tamaño molecular de 535pb. Estos productos de amplificación serán separados y visualizados inicialmente cargando 5µl de producto de PCR + 3µl de búfer de carga en un gel de agarosa al 1% (p/v) adicionado con 1 µl bromuro de etidio (10 mg/ml) para su coloración, corrido a 120 V por 40 min. Como control negativo de reacción se incluirá una muestra que utiliza agua MiliQ en lugar de DNA y como positivo DNA purificado de Acinetobacter sp, PUJ-M-Bio-USBA-92. Tabla 2. Programa de ciclos de amplificación de región V3 de rADN 16S para los iniciadores 341F GC y 907R.

Numero de ciclos Denaturación Anillamiento Extensión 1 940C x 5 min. - -

5 GC es una secuencia de 40 nucleótidos rica en GC añadida al extreme 5’. La secuencia es 5’-CGC CCG CCG CGCCCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G. 6 El iniciador 341F GC esta dirigido a los nucleótidos 341 a 357 del DNAr y el iniciador 907R a los nucleótidos 907 a 926 del DNAr.

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20 940C x 1 min. 650C x 1min. 720C x 3min. 15 940C x 1 min. 550C x 1min. 720C x 3min. 1 - - 720C x 7min.

8.8 Diferenciación de ribotipos por separación diferencial mediante electroforesis en gel de gradiente denaturante (DGGE). 10 µl de producto de amplificación correspondiente a cada cepa, son cargados por pozo, en un gel de poliacrilamida al 6% p/v (acrilamida-bisacrilamida 37.5:1 40% p/v, Anexo B) en bufer TAE 1X (Anexo B), con dimensiones de 16cm x 16cm y 0,75mm de grosor, donde inicialmente se establece un gradiente denaturante de urea-formamida amplio (20%-90%) con el fin de explorar el rango de separación óptimo; este rango puede ser reducido paulatinamente tal que permita la discriminación de la mayoría de filotipos. El gel será corrido en cámara de electroforesis vertical (Bio-Rad Dcode Universal Mutation Detection System), en inmersión en búfer TAE 1X (Anexo B), a voltaje constante de 100V, y 60oC durante 12h. Posteriormente los geles serán sometidos a tinción en solución de bromuro de etidio a concentración final de 10 mg/l en agitación a 70 rpm por 30 min.; los patrones de electroforesis serán visualizados en transiluminador mediante luz ultravioleta. 8.9 Secuenciación de productos de amplificación. Dado que el análisis de perfiles electroforéticos solo permite evaluar cambios inespecíficos en la estructura de las poblaciones de organismos, en este caso, degradadores de HC, pero no nos proporciona información sobre que tipo de organismos son los implicados en ese cambio ni cuales son los más prevalentes y persistentes, la estrategia más directa para este conocimiento es la secuenciación enzimática de los amplificados de genes ribosomales. Para esto, los productos de amplificación de aquellos aislados que según el perfil electroforético en el gel denaturante, no son redundantes (esto es representan ribotipos diferentes), serán enviados a un servicio de secuenciación externo (Macrogen Global Genome Center)7. Una vez obtenidos los resultados de la secuenciación se debe estar seguro que las secuencias no contengan artefactos de clonación y/o secuenciación usados y que deben ser removidos para análisis posteriores; para esto, se realizará una búsqueda de similitud de nuestras secuencias en bases de datos como VecScreen8.

7 Global Genome Center. Macrogen LIMS Manual. Archivo pdf. Disponible en línea <http://dna.macrogen.com>. Febrero 20 de 2007. 8 Disponible en línea: www.ncbi.nml.nih.gov/VecScreen/VecScreen..html

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8.10 Determinación de los índices de diversidad y similaridad. Partiendo de los perfiles de electroforéticos de cada aislado y asumiendo que cada banda visualizada en los geles revelados provienen cada una de una sola población, el número de bandas distintivas individuales por cada muestra compuesta corresponderá a la riqueza de filotipos. Teniendo en cuenta este valor se pueden calcular índices de diversidad basados en riqueza como el de Shanon-Wiener (Ecuación 2, Anexo C), con valores en el rango de 1 y 6, siendo 1 el valor más bajo y seis el más alto y de equidad como el índice de equitadad de Shannon (Ecuación 3, Anexo C). Con el fin de determinar la similaridad en ribotipos entre puntos dentro de una misma finca y entre fincas de una misma cobertura, se utilizará el cociente de similitud de Søerensen (ecuación 4, ver Anexo C)(Shafer y Muyzer, 2001). Para la definición de las unidades taxonómicas operacionales y la estimación de la diversidad se utilizara el programa de acceso libre DOTUR9 (Schloss y Handelsman, 2006). 8.11 Evaluación de la relación entre la capacidad degradadora de hidrocarburos totales de petróleo y diversidad genética en muestras de suelo. Se desea establecer si las diferencias en diversidad genética se relacionan o no con cambios en la capacidad degradadora de TPH’s en las muestras de suelo. Para esto se pretende evaluar la capacidad de degradación de TPH por parte de los microorganismos procedentes de muestras con índices bajos de diversidad y comparla con la capacidad degradadora en muestras con índices altos de diversidad, mediante un diseño completamente al azar. Los tratamientos corresponden a las muestras de suelo con índices de diversidad diferentes, elegidos con base en criterios basados en estudios previos de abundancia total de organismos heterótrofos. Para esto se agregarán 10 g de la muestra de suelo elegida a un frasco de vidrio de 50 ml, ajustando la humedad a 20% con agua desionizada estéril y agregando diesel (filtrado por membrana 0,22µm) a una concentración final de 40 mg/g (40 ppm) suelo peso seco. Cada unidad experimental tendrá tres replicas que representan las muestras de suelo de los puntos en una finca. La cantidad de nitrógeno y fosforo dentro de las unidades experimentales será ajustado con NH4NO3 y K2HPO4, según la relación recomendada C:N:P de 100:10:1 (Wrenn y Venosa, 1993). Los frascos son cerrados e incubados durante 45 días en lugar oscuro a temperatura ambiental; se determinarán las cantidades de TPH iniciales y finales mediante extracción con solventes orgánicos. Las diferencias entre las cantidad de TPH degradado entre unidades experimentales, será evaluada mediante una prueba de comparación múltiple de medias como ANOVA o Kruskal-Wallis, (dependiendo de la distribución de probabilidad seguida por los datos con pruebas como Kolmogorov-Smirnov o Shapiro Wilks), utilizando el 9 disponible en línea en: <<http://www.plantpath.wisc.edu/fac/joh/dotur.html>>

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programa estadístico MiniTAB v.14. El grado de correlación entre diversidad (índices) y potencial de degradación (cantidad de TPH’s degradados) se determinara mediante la prueba de correlación lineal r de Pearson. 8.12 Elaboración de dendrogramas y determinación de afiliación taxonómica. Basados en las secuencias de nucleótidos de los ribotipos, y dada la alta conservación de las secuencias que codifican para rRNA, podemos no solo obtener la afiliación taxonómica de los aislados sino que podemos también obtener una visión de cómo estos ribotipos se relacionan entre si en cada cobertura, mediante la generación de dendrogramas. Se procederá a realizar una búsqueda de similitud de las secuencias de los aislados no redundantes en bases de datos ribosomales (RDB) de organismos conocidos, usando programas de alineamiento como BLAST(Basic local Alignment Search Tool)10, específicamente con algoritmos como el blastn; los resultados de la búsqueda más similares a la secuencia del aislado, serán aquellos con valores E más bajos; estos resultados casi siempre permiten encontrar la afiliación taxonómica con respecto a género y especie al que corresponde nuestra secuencia(Claverie, y Notredame, 2003). Adicionalmente se elaborará un grafico o árbol de agrupación de los aislados mediante las herramientas de alineamiento múltiple NAST (De Santis, et al., 2006) y ClustalW, utilizando el algoritmo NJ (Neighbor Joining), y coeficientes de similaridad como el coeficiente de Dice (Schafer y Muyzer, 2001). La comparación de la diversidad entre las comunidades (basada en arboles filogenéticos) se realizará utilizando los programas UniFrac11 (Lozupone, et al., 2006) y SONS (Schloss y Handelsman, 2006) disponibles en la red Internet. 8.13 Análisis estadísticos. Además del uso de los índices y coeficientes mencionados para el tratamiento e interpretación de los datos de perfiles electroforéticos y de secuencias de nucleótidos de los filotipos amplificados, las diferencias entre los datos obtenidos de los ensayos de NMP entre coberturas y puntos será evaluada mediante una prueba de comparación múltiple de medias como ANOVA o Kruskal-Wallis, dependiendo de la distribución de probabilidad seguida por los datos evaluada por pruebas como Kolmogorov-Smirnov o Shapiro Wilks, utilizando el programa estadístico MiniTAB v.14. La diferencia entre eventos de muestreo para los datos fisicoquímicos de pH, porcentaje de humedad y contenido de carbono orgánico y para los datos microbiológicos de NMP, será evaluada mediante prueba t-pareada para muestras dependientes. 10 Disponible en línea <www.ncbi.nlm.nih.org/BLAST> 11 Disponible en linea en: http://bmf.colorado.edu/unifrac/index.psp.

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La correlación entre los datos de recuento por NMP y los datos fisicoquímicos de pH, porcentaje de humedad y contenido de carbono orgánico se evaluara mediante correlación lineal r de Pearson. Para el análisis de la relación entre diversidad y funcionalidad potencial, se evaluará la correlación entre los datos de los índices de diversidad y los valores de TPH mediante correlación lineal r de Pearson.

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PRESUPUESTO

Equipos 8.204.400Servicios tecnicos 1.500.000Material bibliografico 25.000Salidas de campo 2.000.000Gastos personal 9.309.000Articulo en revista indexada 2.000.000Vidrieria 354.000Reactivos 5.335.636 3.386.146 Material Molecular 3.873.012 Subtotal 13.894.036 22.093.158Total 35.987.194

CIEBREG-COLCIENCIASUSBAReferencia de gastos

Agitador Orbital 525.000Autoclave Steriloff 375.000Balanza analitica 225.000Balanza precision 225.000Bano serologico Presicion Scientific 119.800Camara flujo laminar horizontal Steriloff 525.000Camara de extraccion Labconco 400.000Camara de electroforesis 500.000Centrifuga 375.000Espectrofotometro PR125000 HACH 675.000Fuente de poder Power PAC 3000 BioRad 500.000Horno Sanyo Gallenkamp 356.000Incubadora Sanyo gallenkamp Plus II 466.700Incubadora Shaker marca labLine 641.900Microscopio binocular narca Carl Zeiss 525.000Neveras Whirlpool 350.000Plancha magnetica 220.000Termociclador MyCycler BioRad 1.000.000Vortex Maxi mix II Barnsted 200.000TOTAL 8.204.400

Equipo-USBA Valor depreciacion

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Material y reactivos -Ciebreg Colciencias CANTIDAD Valor unitario Valor TotalLáminas Cubre-Objetos 22x22mm Caja 100 5 1.900 9.500 Cajas de Petri desechables de 100 x 15 mm Caja 600 2 229.000 458.000 Guantes Talla S látex Caja 100 8 9.250 74.000 Guantes Talla S de Nitrilo Caja 100 2 17.250 34.500 Tubo de ensayo de 16 X 100 mm Fondo plano. tapa rosca 1 100 2.100 210.000 Crioviales pk 500 1 200.000 200.000 Cajas de Petri vidrio de 100 x 15 1 300 2.100 630.000 Gradilla plástica 40 tubos hasta 20mm 1 5 31.700 158.500 Frascos Schott de 100 mL Frasco 4 8.450 33.800 Frascos Schott de 500 mL Frasco 4 11.570 46.280 Frascos Schott de 1000 mL Frasco 1 15.300 15.300 Tubos Corning 50 mL 20 bolsas * 25 Unidades 1 347.266 347.266 Placas 96 pozos fondo en U sin tapa Marca FALCON 1 Caja * 50 U 2 300.000 600.000 XTT 100 mg 1 530.000 530.000 Frascos Tapa azul 250 mL 1 Fco 4 9.750 39.000

3.386.146

Valor unitario

ácido acético glacial 49.700ácido bórico 102.500agar bacteriológico 311.000azul de bromofenol 141.000Diclorometano 190.000formamida 253.000Kit de tincion Gram 513.000micropipeta 0,1-10ul 830.000micropipeta 20-200ul 830.000micropipeta 200-1000ul 830.000Papel filtro Whatman No.40 151.000persulfato de amonio 302.600Silica gel 391.500Urea 114.376Temed 180.960Xylene cyanol 145.000TOTAL 5.335.636

Reactivos y materiales USBA

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Reactivos y materiales molecular-CIEBREG Referencia Cantidad Valor Unitario Valor totalIniciador 341F-GC 1 1 622.224 622.224 Iniciador 907R 1 1 120.640 120.640 Puntas naturales (10 ul) 1 Rack * 96 1 18.700 18.700 Micropuntas naturales 10ul 1 Pkte * 1000 3 46.200 138.600 Puntas amarillas 200 ul 1 Pkte * 1000 2 25.300 50.600 Tubos para PCR, 0.2 mL tapa plana Bolsa*1000 2 160.000 320.000 Acrilamida ultrapura 1 Fco* 500g 1 479.000 479.000 N/N Metalbisacrilamida Ultrapura 1 Fco* 100g 1 292000 292.000 Tris (Base) Ultrapure 1 Fco*Kilo 1 280.000 280.000 Rack para 80 tubos de 1,5 y 2,0 mL 1 Pkete * 7 cajas 1 37.278 37.278 Bromuro de etidio (10 mL) 1Fco 1 85.500 85.500 GoTaq Polimerasa Flexi 100U 1 2 236.735 473.470 Hyperlader IV Quantitative 1 1 315.000 315.000 dNTPs set 100 mM 1 1 360.000 360.000 EDTA (Na2EDTA* 2 H2O) Ultrapuro 1 Fco * 500g 1 280.000 280.000

3.873.012

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CRONOGRAMA

MESESActividad

Toma de muestras de sueloRevision Bibliografica

Determinacion TPH, pH, HumedadEstandarizacion recuento NMPRecuento crecimiento por NMP

Estandarizacion DGGERecuperacion y asilamiento

Extraccion de ADN bacterianoDeteccion de filotipos por PCR-SSU16SDiscriminacion amplificados por DGGE

Envio muestras a secuenciacionConstruccion de dendrogramas, calculo

de indices y analisis de datosPresentacion informe finalSocializacion de resultados

JULFEB MAR ABR MAY JUN AGO SEP OCT NOV DIC

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ANEXO A

Caldo Bushnell & Hass (Wrenn, y Venosa12) para 1 litro :

KH2PO4 1g NH4NO3 1g CaCl2 2H2O 0,02g FeCl3 0,05g K2HPO4 1g MgSO4 0,2g

Medio sólido Bushnell & Hass (Wrenn, y Venosa13 ) para 1 litro:

KH2PO4 1g NH4NO3 1g CaCl2 2H2O 0,02g FeCl3 0,05g K2HPO4 1g MgSO4 0,2g Agar Bacteriologico 15g

Calentar en plancha con agitación magnética hasta la disolución completa del agar. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos.

12 Wrenn, B. and Venosa, A..Selective enumeration of aromatic and aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number procedure. En: Can J Microbiol, Mar 1996; 42(3): 252-8. 13 Ibid

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ANEXO B

Porcentaje de acrilamida:bisacrilamida 37.5:1 al 40% requerido de acuerdo al rango de longitud del fragmento de DNA amplificado. Porcentaje del gel(%) Rango de longitudes 6 300-1000 8 200-400 10 100-300 Preparación de soluciones denaturantes de acrilamida:bisacrilamida, alta (80%), baja(20%) y tapón (plug) para un gel en sándwich de 16 x 16cm

Reactivo Alta Baja No denaturante Solucion 0% denaturante - 9,75ml 7ml

Solucion 80% denaturante 13ml 3,25ml - TEMED 13µl 13µl 11µl

Persulfato amonio 10% 43µl 43µl 20µl Recuerde adicionar el persulfato de amonio en el momento en que se va a servir preparar el gel y recuerde actuar con rapidez para evitar que el sistema de llenado se obstruya. Solución acrilamida:bisacrilamida al 40%(p/v) 37.5:1. Recuerde que el pesaje y preparado de esta solución debe realizarse en la cámara de extracción de vapores, utilizando guantes de nitrilo, mascarilla y gafas de protección.

Reactivo Cantidad Acrilamida 19,465g Bisacrilamida 0,535g

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Adicionar en un volumen de agua desionizada menor a 50ml, agitar constantemente hasta disolución completa, aforar a 50ml y filtrar por membrana de 0,45µm. Almacenar en frasco ámbar a 4ºC. Solución 0% denaturante

Reactivo Cantidad Acrilamida:bisacrilamida 37.5:1 al 40% 4,5ml Buffer TAE 50X 0,6ml Glicerol* 0,6ml *el glicerol solo se añade si la tinción posterior del gel se realiza con nitrato de plata. Disuelva en agua desionizada completamente y afore a 30ml, filtre por membrana 0,45um y almacene en frasco ámbar a 4ºC. Solución 100% denaturante

Reactivo Cantidad Acrilamida:bisacrilamida 37.5:1 al 40% 4,5ml Buffer TAE 50X 0,6ml Formamida* 12,0ml Glicerol** 0,6ml *La formamida es un reactivo toxico, sea precavido al dispensar en la solución. **Solo se añade cuando se realiza tinción con nitrato de plata. Mezclar todo los componentes, excepto la acrilamida:bisacrilamida, con el fin de disminuir al máximo la manipulación y reducir el riesgo de derrames en el momento del filtrado. Filtre la solución por membrana de 0,45um y adicionar la acrilamida:bisacrilamida, almacenar en frasco ámbar a 4ºC.

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Búfer TAE 50X

Reactivo Cantidad Concentración final

Base Tris 242g 2M Acido acético glacial 57,1ml 1M EDTA 0,5M(pH 8.0) 100ml 50mM Mezclar todo en agua deionizada y agitar hasta disolver completamente la base Tris, aforar a 1000ml con agua desionizada y filtrar por membrana de 0,45um. Esterilizar a 121ºC y 15psi por 15 minutos. Almacenar en lugar no refrigerado. Búfer de carga 2X

Reactivo Concentración final XilenCyanol 2% p/v 0,05% Azul de bromofenol 2% p/v 0,05% Glicerol 70% Lleve a volumen deseado con agua MiliQ y almacene en oscuridad en lugar no refrigerado.

47

ANEXO C

Ecuación para determinar porcentaje de humedad en una muestra de suelo

% ������� � ���� ����� �ú�������� ����� �� ����� ����� ����� � 100 Ecuación 1

Índice de riqueza de Shannon-Weaver

Ecuación 2

Donde pi, es la proporción de clones del i-esimo OTU (estimado usando ni/N), ni es el número de clones en un OTU, N es el número total de clones de la muestra.

Índice de equitabilidad de Shannon Ecuación 3 Donde S es el número de OTUs en la muestra y H’ el índice de riqueza de Shannon.

Cociente de similitud de Søerensen-Dice SQ = ��

��� Ecuación 4 Donde A: es número de especies en sitio X, B: número de especie en sitio Y y J: número de especies común a ambos sitios.

48

Ecuación para determinar la pérdida de peso por ignición para estimación de carbono orgánico total.

� ���� � ��º � ���� � � �º ���� � ��º � 100 Ecuación 5

49

ANEXO D

Fuente: CIEBREG. Disponible en línea en : <http://ciebreg.utp.edu.co/Plone/Ciebreg/sig/vieja/> Figura 1. Mapa de ubicación ventana y subventanas cuenca rio La Vieja.

50

Fuente: CIEBREG. Disponible en línea en : <http://ciebreg.utp.edu.co/Plone/Ciebreg/sig/otun/>

Figura 2. Mapa de localización de ventana y fincas de la cuenca rio Otun.

51

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