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DISEÑO Y SÍNTESIS DE UN PÉPTIDO CON Y SIN

RESTRICCIÓN CONFORMACIONAL DE UNA

PROTEÍNA EXPRESADA POR EL GEN Pb-1 DE Oryza

sativa INVOLUCRADA EN EL MECANISMO DE

DEFENSA CONTRA LA PYRICULARIA

DIANA MILENA GÓMEZ MORENO

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

Facultad de Ciencias y Educación Proyecto Curricular de Licenciatura en Química

Bogotá, D.C. Colombia

2016

II Título de la tesis o trabajo de investigación

DISEÑO Y SÍNTESIS DE UN PÉPTIDO CON Y SIN

RESTRICCIÓN CONFORMACIONAL DE UNA

PROTEÍNA EXPRESADA POR EL GEN Pb-1 DE Oryza

sativa INVOLUCRADA EN EL MECANISMO DE

DEFENSA CONTRA LA PYRICULARIA

DIANA MILENA GÓMEZ MORENO

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de:

Licenciado en Química

Director: JULIO CESAR CALVO MOZO Qco., Dr.Sc.

Director del Grupo de Investigación de PROTEOMA UD

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

Facultad de Ciencias y Educación Proyecto Curricular de Licenciatura en Química

Bogotá, D.C. Colombia

2016

III

NOTA DE ACEPTACIÓN

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JURADO

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JURADO

---------------------------------------------------

DIRECTOR

Ciudad y Fecha

IV Título de la tesis o trabajo de investigación

DEDICATORIA

Dedico este trabajo en primer lugar a DIOS por darme salud

y vida para culminar un objetivo y un sueño más, por los triunfos

y los momentos difíciles que me han enseñado a valorarlo cada día más.

A mi mamá María Moreno, por la inmensidad de su amor, por la incansable

solicitud de sus cuidados, por enseñarme paso a paso con sabios consejos y profundos valores

el camino de la vida, y que la fe y la constancia pueden hacer de los sueños una realidad.

A mi papá Humberto Gómez por ser mi guía y ejemplo a seguir, por su apoyo incondicional, amor

invaluable y por enseñarme a creer que “no hay cosas imposibles si no personas incapaces”.

A mi hermanito Nicolás Gómez, por ser mi camarada de aventuras, por compartir memorias de

infancia y sueños de adulto, por ser mi confidente y amigo para toda la vida.

A mi abuelito Darío Moreno, por que espero que en lo más alto del cielo se sienta orgulloso de mí.

A mi novio Fernando Varela por enseñarme a creer que el amor existe y que un esfuerzo genuino

supera mi propia imaginación y a mis profesores gracias por su tiempo, su apoyo y por la

sabiduría que me trasmitieron en el desarrollo de mi formación profesional.

“A todas las manos que me han abierto, a las que he visto y a las que no”

Madre Teresa de Calcula

V

AGRADECIMIENTOS

Durante el desarrollo de este trabajo muchas personas se vieron involucradas por tanto

debo agradecer con gran sinceridad, hacer de este proyecto una realidad.

A DIOS por protegerme, guiarme durante todo el camino y darme fuerzas para sortear

obstáculos y ver con alegría un paso más en mi vida.

A mis queridos padres, por ser la columna vertebral de mi crecimiento personal, espiritual

y profesional. A mi hermanito por ser un ejemplo de amistad, esfuerzo y emprendimiento.

A mi abuelito por darme los concejos necesarios en el momento indicado. A mi novio por

ser un ejemplo a seguir como persona y profesional.

A mi mentor y director de tesis, el profesor Julio Cesar Calvo por guiarme, aconsejarme,

enseñarme y permitirme realizar este proyecto a su lado. Por haber creído en mis

capacidades y compartir con migo su gran conocimiento.

A mi guía en el exterior, la profesora Fanny Guzmán y su grupo de investigación en la

Universidad Pontificia Católica de Valparaíso en Chile, por abrirme sus brazos y las puertas

a un mundo nuevo de conocimiento e investigación.

A mi querida y gran amiga Erika Niño, por compartir con migo una gran aventura de

conocimiento, aprendizaje y vivencias donde un “hacer las cosas con amor” marca la

diferencia y por apoyarme en esta etapa tan valiosa.

Al Centro de Relaciones Interinstitucionales (CERI) y al Centro de Investigaciones y

Desarrollo Científico (CIDC) de la Universidad Distrital por permitirme hacer la pasantía

de investigación en el exterior.

A todos GRACIAS.

VI Título de la tesis o trabajo de investigación

RESUMEN

El hongo Pyricularia Oryzae es el agente causante de la piriculariosis, enfermedad de alto

impacto en la producción de arroz (Oryza sativa) en el mundo, causando graves lesiones en

la planta y pérdida parcial o total del grano. La reacción natural de las plantas a especies

patógenas es de corta duración debido a las condiciones bióticas y abióticas del cultivo; sin

embargo, este mecanismo de defensa ha fomentado el estudio y desarrollo de variedades

resistentes, que se emplean para el control de la enfermedad. Con la visión de aportar a la

ampliación del germoplasma en variedades de resistencia de este cereal, la Federación

Nacional de Arroceros de Colombia (1) y los grupos de investigación Biomolc y Proteoma

UD de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, han estudiado genes que confieren

resistencia a la Pyricularia, como es el caso del Gen Pb-1 de Oryza sativa, el cual expresa

una proteína de resistencia involucrada en el mecanismo de defensa ante esta enfermedad.

En este trabajo se seleccionaron los fragmentos LHEDQYAQILQE y DEEEKDNDDN con

tendencia alfa helical de dicha proteína, se sintetizaron las secuencias lineales y sus

correspondientes análogos con restricción conformacional a alfa hélice siguiendo el modelo

de doble dímero (en proceso de patente). Los resultados por cromatografía Liquida de Alta

eficiencia en fase reversa (RP-HPLC), espectrometría de masas (EM) y dicroísmo circular

(CD) muestran que se pudo obtener los productos propuestos y se demostró la utilidad del

sitio de nucleación JAZ (en proceso de patente) para estabilizar fragmentos de proteínas con

tendencia helical

Palabras clave: Síntesis de Péptidos en fase sólida, Pyricularia, Gen Pb-1 de Oryza sativa,

Restricción conformacional, sitio de nucleación.

VII

Contenido

Pág.

RESUMEN ...................................................................................................................... VI

Lista de Ilustraciones........................................................................................................ IX

Lista de Tablas ................................................................................................................. IX

Lista de Figuras ................................................................................................................ X

Lista de Símbolos y abreviaturas ........................................................................................ 1

Introducción ...................................................................................................................... 3

1. Marco teórico .......................................................................................................... 7 1.1 Generalidades del Arroz ...................................................................................... 8 1.2 Enfermedades del Arroz ...................................................................................... 9 1.3 Genes de Resistencia: variedades resistentes ........................................................ 11 1.4 Síntesis de péptidos en fase sólida ...................................................................... 12

1.4.1 Matrices Poliméricas. ............................................................................. 15 1.4.2 Activadores ........................................................................................... 16 1.4.3 Dificultades Sintéticas ............................................................................ 17 1.4.4 Péptidos estructurados ............................................................................ 17 1.4.5 Formas de Presentación Peptídica ............................................................ 19

2. Metodología .......................................................................................................... 22 2.1 Búsqueda de la estructura secundaria y terciaria de una proteína expresada por el Gen

Pb-1 de Oryza sativa, involucrada en el mecanismo de defensa contra la Pyricularia. ......... 22 2.2 Selección de las estructuras de la proteína expresada por el Gen Pb-1 de Oryza

sativa, candidatas para estudio. ..................................................................................... 22 2.3 Diseño y síntesis de un péptido con y sin restricción conformacional que imite un

fragmento de la proteína nativa. .................................................................................... 22 2.4 Síntesis del péptido con Restricción Conformacional ............................................ 23 2.5 Síntesis del péptido con presentación de Dendrímero de doble constructo (DCC): .... 24 2.6 Desalinización de los péptidos crudos por Sephadex ® G-10: ................................ 24 2.7 Caracterización de los compuestos sintetizados: ................................................... 24

2.7.1 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia en Fase Reversa (RP-HPLC) ....... 24 2.7.2 Espectrometría de Masas ........................................................................ 25 2.7.3 Dicroísmo Circular ................................................................................ 25

3. Resultados y Discusión ...................................................................................... 26 3.1 Búsqueda de la estructura secundaria y terciaria de una proteína expresada por el Gen

Pb-1 de Oryza sativa, involucrada en el mecanismo de defensa contra la Pyricularia. .......... 26 3.2 Selección de las estructuras de la proteína expresada por el Gen Pb-1 de Oryza sativa,

candidatas para estudio. ............................................................................................... 27 3.3 Diseño y síntesis de un péptido con y sin restricción conformacional que imite un

fragmento de la proteína nativa. .................................................................................... 29

4. Conclusiones y recomendaciones ...................................................................... 43

VII

I

Título de la tesis o trabajo de investigación

4.1 Conclusiones ................................................................................................... 43 4.2 Recomendaciones ............................................................................................ 43

A. Anexo 1. Tabla de los 20 aminoácidos naturales ....................................................... 44

B. Anexo 2. Solución de Ninhidrina y Azul de Bromofenol ............................................ 45

C. Anexo 3. Grupos Protectores, Resinas y Brazos Espaciadores ................................... 47

Bibliografía ..................................................................................................................... 48

IX

Lista de Ilustraciones

Pág.

Ilustración 1. Morfología de la planta de arroz. Tomado de: “El cultivo del Arroz (Oryza Sativa

L.)” (15). ........................................................................................................................... 9

Ilustración 2. Ciclo de vida de la Pyricularia Oryzae en la planta de arroz (28) ........................ 10

Ilustración 3. Esquema general de la síntesis de péptidos en fase sólida. .................................. 13

Ilustración 4. Mecanismo de desprotección de t-Boc ............................................................. 14

Ilustración 5. Mecanismo de desprotección de Fmoc ............................................................. 14

Ilustración 6. Mecanismo de acople DCC/HOBt ................................................................... 14

Ilustración 7. Estructura de resinas utilizadas como soporte sólido. ......................................... 15

Ilustración 8. Racemización de del carbono terminal de un aminoácido durante el proceso de

acople, a) enolización y b) formación de oxazolonas. ............................................................ 16

Ilustración 9. Estructuras peptídicas; primaria secundaria y terciaria. ....................................... 18

Ilustración 10. La gráfica muestra espectros de dicroísmo circular en el UV lejano asociados con

diversos tipos de estructuras secundarias. Linea sólida: α-hélice, líneas discontinuas largas: hojas β

....................................................................................................................................... 19

Ilustración 11. Representación de las diferentes especies formadas para la síntesis de un polímero

peptídico de cisteínas, cada flecha representa una unidad peptídica; donde n=1 es el monómero

cíclico, n=2 son las especies diméricas que presentan diferente direccionamiento. Se omite las

moléculas cíclicas del dímero, y moléculas de mayor número de unidades. .............................. 20

Ilustración 12. Presentación de un MAP con cuatro unidades peptídicas incorporadas en los grupos

funcionales del amino de la lisina. ....................................................................................... 20

Ilustración 13.Constructos de Doble Dímero (DDC) los cuales contienen cuatro copias de un

mismo péptido. Tomada de la referencia (58) ....................................................................... 21

Ilustración 14. Inserción de ligandos J`y Z` en una secuencia peptídica para dar alfa-hélice (a.) o

“loop” (b.) Proteoma UD. .................................................................................................. 24

Lista de Tablas

Pág.

Tabla 1. Péptidos lineales y sus correspondientes péptidos restringidos sintetizados. ................. 28

Tabla 2. Tendencia de loa aminoácidos a formar estructuras secundarias ................................. 42

X Título de la tesis o trabajo de investigación

Lista de Figuras

Figura 1. Proteína secuenciada de N—C terminal con 1296 aa, con número de acceso BAJ25849.

(9) ................................................................................................................................... 26

Figura 2. Proteína S210084, modelo 1 C-Score = -1.64 S210084_results.tar.bz2, Swiss-

PdbViewer 4.1.0. a) cadena principal de la proteína b) representación de estructura secundaria en

cinta, lamina-β amarillo, α-hélice rojo c) volumen de la proteína superpuesta a la estructura de

cintas d) probabilidad de acceso de cada residuo al solvente, azul menos accesible hasta el rojo más

expuesto. .......................................................................................................................... 27

Figura 3. Péptido lineal (3) (LHEDQYAQILQE; PM: 1484.71 Da). ........................................ 30

Figura 4. Péptido dendrimérico con restricción (4) (JAZ- LHEDQYAQILQE)2-KGC; PM: 3778.2

Da). a) estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas MALDI-TOF

....................................................................................................................................... 31

Figura 5. Dicroísmo circular y deconvolución de: a) péptido lineal (3) b) péptido restringido (4) c)

Grafica superpuesta de cada dicroísmo. ................................................................................ 32

Figura 6. Péptido lineal (5) (DEEEKDNDDN; PM: 1222.1 Da), a) estructura de la secuencia. b)

cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas ESI ............................................................... 33

Figura 7. Péptido dendrimérico con restricción (6) (JAZ- DEEEKDNDDN)2-KGC; PM: 3249.18

Da), a) estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas ................. 34

Figura 8. Dicroísmo circular y deconvolución de: a) péptido lineal y b) péptido restringido c)


Figura 9. Péptido lineal (7) (EDQYAQILQEVF; PM: 1482.62 Da), a) estructura de la secuencia. b)

cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas ESI ................................................................ 36

Figura 10. Péptido dendrimérico con restricción (r-1) (JAZ- EDQYAQILQEVF)2-KGC; PM:

3770.22 Da), a) estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas

MALDI-TOF .................................................................................................................... 37



Figura 12. Péptido lineal (10) (VEDEEEKDND; PM: 1221.16 Da), a) estructura de la secuencia. b)

cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas ESI ............................................................... 39

Figura 13. Péptido dendrimérico con restricción (r-2) (JAZ- VEDEEEKDND)2-KGC PM: 3247.3

Da), a) estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas MALDI TOF.

....................................................................................................................................... 40



Marco Teórico

Lista de Símbolos y abreviaturas

abreviatura nombre

1-HOBt 1-Hidroxibenzotriazol

ACN Acetonitrilo

DC Dicroísmo Circular

DCC N,N’-diciclohelxilcarbodiimida

DCM Diclorometano

DDC Contructo de doble dendrimero

DIC Diisopropilcarbodiimida

DIEA N,N´-di-isopropiletilamina

DMF N,N´-dimetilformamida

DOTA 2,2′-(Ethylenedioxy)diethanethiol

1,2-Bis(2-mercaptoethoxy)ethane, 3,6-Dioxa-1,8-octane-dithiol

EDT Etanoditiol

9-Fmoc 9-Fluorenilmetiloxicarbonilo

Fmoc-Ala-OH Fmoc-Alanina-OH

Fmoc-Arg(Pbf)-OH Fmoc-Arginina(Pbf)-OH

Fmoc-Asn(Trt)-OH Fmoc-Asparagina(Trt)-OH

Fmoc-Asp(OtBu)-OH Fmoc-Aspártico(OtBu)-OH

Fmoc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Glutamina(Trt)-OH

Fmoc-Glu(OtBu)-OH Fmoc-Glutámico(OtBu)-OH

Fmoc-Gly-OH Fmoc-Glicina-OH

Fmoc-His(Trt)-OH Fmoc-Histidina(Trt)-OH

Fmoc-Ile-OH Fmoc-Isoleucina-OH

Fmoc-Leu-OH Fmoc-Leucina-OH

Fmoc-Lys(t-Boc)-OH Fmoc-Lisina(t-Boc)-OH

Fmoc-Lys(Dde)-OH Fmoc-Lisina(Dde)-OH

Fmoc-Met-OH Fmoc-Metionina-OH

Fmoc-Phe-OH Fmoc-Fenilalanina-OH

Fmoc-Pro-OH Fmoc-Prolina-OH

Fmoc-Ser(tBu)-OH Fmoc-Serina(tBu)-OH

Fmoc-Thr(tBu)-OH Fmoc-Treonina(tBu)-OH

Fmoc-Trp(t-Boc)-OH Fmoc-Triptófano(t-Boc)-OH

Fmoc-Trp-OH Fmoc-Triptófano-OH

Fmoc-Tyr(tBu)-OH Fmoc-Tirosina(tBu)-OH

Fmoc-Val-OH Fmoc-Valina-OH

HBTU

N-((1-H-benzotriazol-1-il)-dimetilamino-metilen)-N-

metilmetanaminio

HOBT 1-Hidroxibenzotriazol

HCCA Ácido a-ciano-4-hidroxicinámico

HF Ácido Fluorhídrico

2

IPA Isopropanol

KCN Cianuro de potasio

MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption of Ions Time of Flight

MAPs Multiple Antigen Peptides

MeOH Metanol

NaHCO3 Bicarbonato de sodio

NaOH Hidróxido de sodio

NMP 1-metil-2-pirrolidona

OXIMA Oxima

Reactivo de Ellman Ácido ditionitrobenzoico

Ninhidrina 2,2-Dihidroxiindano-1,3-diona

RP-HPLC Reversed phase High performance liquid chromatography

TBTU

Tetrafluoroborato de O-(1H-Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-

tetrametiluronio

t-Boc Tert-butoxicarbonilo

TFA Ácido trifluoroacético

TFE 2,2,2-Trifluoroetanol

TIS Triisopropil silano

Tritón X100 Polioxietilenoctilfenileter

TCTU

O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium

tetrafluoroborate

3

Introducción

El arroz es uno de los productos fundamentales en la dieta alimenticia de la población

mundial por su bajo costo y alto valor nutricional, por esta razón, se ha incrementado

gradualmente la demanda y siembra de este cereal; así mismo, ha aumentado el esfuerzo por

optimizar su producción y métodos de cultivo. La siembra de esta semilla constituye el

ambiente idóneo para el establecimiento y dispersión de numerosas plagas como bacterias,

hongos y virus; afectando negativamente los arrozales, llegando a constituir su control uno

de los principales problemas económicos en el cultivo del arroz (2) (3).

La enfermedad causada por el hongo Pyricularia Oryzae o quemazón del arroz es de las más

perjudiciales en las regiones arroceras con pérdidas de hasta el 90 % de la producción; su

incidencia aumenta en climas húmedos y lluviosos donde se favorece el cultivo, afecta

directamente a las hojas y panícula de la planta dejando inservible la semilla de arroz (4). El

control químico es uno de los métodos más utilizados para combatir esta enfermedad, sin

embargo, aspectos económicos y medioambientales han disminuido su uso.

Por otro lado, las diferentes prácticas de cultivo, como el control de riego, adecuada

fertilización y elección de una variedad resistente, desempeñan un papel importante en el

control de esta enfermedad (5). Como alternativa de control está la búsqueda de tolerancia

a enfermedades, la cual aumenta la variabilidad genética del cultivo y potencia nuevos

mecanismos que interactúan con los agentes patógenos, denotando la importancia en el

mejoramiento de las plantas (6).

De acuerdo con estas consideraciones los grupos de investigación Biomolc y Proteoma UD

de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, en convenio con la Federación

Nacional de Arroceros de Colombia (FEDEARROZ), propuso emplear la estrategia de

síntesis de péptidos en fase sólida por medio de la química Fmoc para diseñar y sintetizar

secuencias peptídicas perteneciente a la proteína expresada por Gen Pb-1 de la especie

Oryza sativa, el cual se ve involucrado en el mecanismo de reacción contra la Pyricularia,

con vistas a su posible empleo en generar anticuerpos antipéptido que identifiquen dicha

secuencia en un extracto de plantas de arroz.

4

Planteamiento del problema

La demanda mundial de arroz, exige que se obtengan variedades resistentes a enfermedades

como la Pyricularia, uno de los agentes más conocidos causantes del añublo o quemazón

del arroz el cual disminuye la producción, rendimiento y calidad del grano, afectando la

mayor parte de las zonas tropicales productoras en el mundo.

Por tanto, es de vital importancia la identificación de proteínas que expresen resistencia a

esta enfermedad, por medio del estudio sintético de fragmentos que imiten la proteína nativa

cuyo enfoque en caso de ser eficiente aminoraría el tiempo de selección de una variedad

determinada y a su vez costos frente a los estudios convencionales. Por consiguiente es de

importancia evaluar si es posible sintetizar un péptido con restricción conformacional en

una presentación de constructo de doble dímero que imite un fragmento estructurado de la

proteína nativa expresada por el Gen Pb-1 de Oryza sativa involucrada en el mecanismo de

defensa contra la Pyricularia.

5

Justificación

La Universidad Distrital, a través de los grupos Biomolc y Proteoma UD formaron un

convenio con la Federación Nacional de Arroceros de Colombia – FEDEARROZ, para

desarrollar el macro proyecto de Cooperación Internacional COL 5024 financiado por la

Agencia Internacional de Energía Atómica (AIEA), que busca ampliar la variedad en

germoplasma con el fin de contar con herramientas para enfrentar los efectos del cambio

climático global que han incidido en la reaparición y/o ampliación de enfermedades tales

como la Pyricularia y la Hoja Blanca, así como el estrés abiótico producido por la sequía

en algunas regiones arroceras del país.

En este macro proyecto, se trabajan cuatro aspectos: la generación de mutantes por

irradiación, el estudio de genes involucrados en la respuesta al estrés biótico y abiótico, el

análisis proteómico de las proteínas relacionadas con la respuestas de la planta al estrés y el

diseño de vías alternas para identificar dichas proteínas. Por tanto la importancia de este

estudio radicó en la síntesis de una secuencia de una proteína expresada por el Gen Pb-1 de

Oryza sativa involucrada en el mecanismo de defensa contra la Pyricularia, por medio de

un constructo complejo de doble dímero que pueda generar anticuerpos antipéptido en

futuros estudios, para reconocer las proteínas que intervienen en la protección de la planta

ante dicha enfermedad.

Hipótesis

Es posible el diseño y síntesis de un péptido con restricción conformacional, que imite

fragmentos de una proteína expresada por el Gen Pb-1 de Oryza sativa, por medio de la

estrategia de síntesis de péptidos en fase sólida extrapolable en la síntesis de moléculas

dendriméricas tipo DDC.

6

Objetivo General

Diseñar y sintetizar un péptido con y sin restricción conformacional de una proteína

expresada por el GEN Pb-1 de Oryza sativa, involucrada en el mecanismo de defensa contra

la Pyricularia.

Objetivos Específicos

- Encontrar la estructura secundaria y terciaria de una de las proteínas expresadas por

el Gen Pb-1 de Oryza sativa, involucrada en el mecanismo de defensa contra la

Pyricularia.

- Seleccionar los fragmentos en la proteína expresada por el Gen Pb-1 de Oryza

sativa, candidatos para el estudio.

- Diseñar y sintetizar un péptido con y sin restricción conformacional que imite un

fragmento de la proteína nativa.

- Caracterizar el producto obtenido.

Marco Teórico

1. Marco teórico

Antecedentes: El arroz es el nombre común para una especie (Oryza sativa) de la familia de

las gramíneas, este cereal es uno de los alimentos más consumidos y el sustento principal

de más de la mitad de la población mundial. Desde tiempos milenarios este grano fue el

alimento primordial en los países asiáticos y hoy es cultivado en los cinco continentes en

diferentes entornos climáticos, ya sea templado, cálido o húmedo, adaptándose a su vez a

todo tipo de terreno seco; estas condiciones han contribuido a la enorme variedad de semillas

de arroz que existen en los distintos mercados del mundo. La evolución en los métodos de

siembra ha provocado alteraciones físicas y biológicas en la planta de arroz generando

cambios que se reflejan en los mecanismos de defensa contra gran variedad de plagas y

enfermedades (7).

De las enfermedades que padece el arroz, la más sobresaliente es la Pyricularia Oryzae,

originada por un hongo microscópico perteneciente a la familia Magnaporthe Oryzae. El

micelio del hongo produce una sustancia tóxica conocida como pericularina la cual inhibe

el crecimiento de los tejidos y los desorganiza, causando un crecimiento parcial o nulo del

grano (8). Por tal razón, organismos internacionales de investigación como la IRRI

(International Rice Research Institute, en Asia), WARDA (West Africa Rice Development

Association, en África), CIAT (International Center for Tropical Agriculture, en América)

y FEDEARROZ (Federación Nacional de Arroceros, en Colombia) estudian y desarrollan

especies genéticamente resistentes a esta enfermedad (1).

En estudios previos se ha caracterizado variedades de este cereal (Oryzae sativa) las cuales

expresan un gen de resistencia durante el mecanismo de reacción frente al hongo del añublo

o quemazón de arroz, denominado gen Pb-1; este gen proveniente del Panicle-Blast-1 se

caracteriza por la durabilidad en el mecanismo de acción contra la enfermedad y ha sido

introducido en variedades de alta calidad para cultivo como gen clonado (9), (10).

FEDEARROZ en convenio con el grupo de investigación de Biología Molecular

(BIOMOLC) de la Universidad Distrital ha estudiado proteínas derivadas de este gen

empleando herramientas bioinformáticas, para seleccionar fragmentos proteicos que

presentan resistencia ante dicha enfermedad (11). Como ejemplo, el uso de estas

herramientas ha permitido determinar zonas proteicas con actividad biológica en contra del

virus de la hoja blanca, otra enfermedad que afecta agresivamente a los cultivos de arroz,

seleccionando regiones con estructuras secundarias definidas, con características

hidrofílicas y ubicadas en la parte externa de la proteína, porque son más accesibles y poseen

alta probabilidad de generar una interacción anticuerpo-antipéptido.

8 Trabajo de investigación

Estas moléculas fueron sintetizadas por medio de la estrategia de Síntesis Química de

Péptidos con y sin restricción conformacional siguiendo el modelo de síntesis

macromolecular por el grupo de PROTEOMA UD (12).

1.1 Generalidades del Arroz

La semilla de arroz proviene de la planta Oryza sativa, considerado como el cereal de mayor

consumo en la población mundial, se cultivan alrededor de 150 millones de hectáreas

anualmente para una producción aproximada de 745 millones de toneladas (13), con un

incremento proyectado del 70% para el año 2025 (14). Los grandes productores de este

grano son: África occidental, Asia suroriental (China, Indonesia, Tailandia y Laos) y

América del sur (Brasil, Colombia, Argentina, Chile, Perú, Venezuela) (15), donde el

principal productor y consumidor es China, con una cifra estimada de 185 millones de

toneladas por año (31% de la producción mundial) (16).

En Suramérica se siembran cerca de 6,7 millones de hectáreas de arroz considerado uno de

los principales sectores en la economía. Colombia ocupa el puesto 24 en el mercado mundial

en producción arrocera, el cual alcanza una producción nacional de 1,5 millones de toneladas

anuales en un área aproximada de 320 mil hectáreas; las principales zonas productoras son

la región caribe, región andina y llanos orientales (17).

Este cereal aporta hasta un 40% del suministro de energía alimenticia según la Organización

de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, por sus sigla en inglés,

Food and Agriculture Organization) (18) a su vez es excelente fuente nutricional de

carbohidratos (76%), proteínas (6.5%), fibra (1.9%), agua (12%), minerales (zinc, magnesio

y fosforo) y vitaminas (2%) (tiamina y riboflavina) (19).

Es de crecimiento rápido y gran capacidad productiva, adaptable a diversas condiciones de

clima tropical y suelos; su temperatura óptima de germinación oscila entre 27 y 35 °C. Es

una planta monocotiledónea que proviene de la familia graminácea Oryza sativa, de raíces

fibrosas y delgadas, tallo erguido y cilíndrico, con una altura (30-150 cm) que depende de

las condiciones de cultivo (Ilustración 1) (4). Los tallos se componen de hojas alternas,

largas y planas, las cuales se ramifican en panículas de 20 a 30 cm, cada panícula consta de

entre 50 y 300 espiguillas o flores de las cuales se forma el fruto obtenido en una cariópside

(7).

El manejo de los arrozales es una actividad dinámica donde generalmente se emplean tres

métodos para el cultivo del arroz; trasplante, secano y riego, en los dos últimos la siembra

puede ser mecanizada o por voleo, donde el agricultor esparce manualmente las semillas

(20). El tipo de siembra aumenta o disminuye los niveles nutricionales del arroz, no obstante

el cultivo implementado depende de las facilidades económicas del productor, la variedad

agronómica del grano y el área a cultivar. La siembra por trasplante es un método indirecto

que traspasa la plántula del semillero en el cual germinó al campo definitivo donde se va a

desarrollar, la ventaja es el uso de poca semilla por área de siembra, sin embargo se necesita

de mucha mano de obra lo que influye en altos costos y poco empleo del método (21). El

9

cultivo secano es una técnica más implementada, en la cual se requiere de un suelo fértil,

con alto contenido en minerales, poco uso de productos agroquímicos (3) y empleo

exclusivo de aguas lluvias las cuales pueden ser canalizadas proporcionando un suelo

semihumedo; sin embargo es necesario esperar las lluvias o un riego previo para no afectar

el cultivo, lo que genera mayor inversión en el rubro de las labores.

Ilustración 1. Morfología de la planta de arroz. Tomado de: “El cultivo del Arroz (Oryza Sativa L.)” (15).

Por otro lado, el método de riego requiere una inundación continua lo que favorece el

contenido en minerales, alta presencia de aluminio y la siembra del grano en cualquier época

del año, el rendimiento en este de cultivo es mayor ya que las condiciones le permiten

minimizar la predisposición a enfermedades y no presentan ningún tipo de estrés hídrico lo

que facilita la asimilación de los productos (22). Sin embargo, el arroz como cualquier otra

planta está expuesto a una gran variedad de agentes patógenos que inciden durante todas las

etapas de desarrollo, la mayoría de estos problemas fitosanitarios en el arroz se presentan

en el cultivo secano, favorecido por el ambiente y el manejo del mismo dañando

drásticamente el proceso de labranza al ser el principal obstáculo en la producción arrocera

(21). En Colombia coexisten estos dos últimos sistemas de cultivo mecanizado, siendo el de

riego el más utilizado sin embargo, regiones como los llanos orientales implementan el

cultivo secano favoreciendo la presencia de estas enfermedades (20).

1.2 Enfermedades del Arroz

El arroz es atacado por diversas enfermedades desde el inicio de la siembra hasta poco

antes de la cosecha, las pérdidas que causan son severas, pueden reducir el rendimiento a

valores insignificantes o llevar a la pérdida casi total del cultivo (15). Las enfermedades


van cambiando de acuerdo a la etapa de cultivo, sistema de labranza, densidad de la

siembra, manejo de agua, nutrición, entre otras (23), como consecuencia se genera un

mayor consumo en insumos agroquímicos para su tratamiento, lo que implica un aumento

en los costos de producción que serán trasladados al consumidor final (24). Las

enfermedades de mayor impacto que afectan a nivel mundial el cultivo de arroz son, el

Añublo del Arroz (Pyricularia Oryzae), el Virus de la Hoja Blanca, y el Quemazón de la

Vaina, las cuales pueden ocasionar importantes reducciones en el rendimiento, muerte de

las plantas o influir en la perdida de la calidad del grano (22).

La Pyricularia Oryzae o Añublo del Arroz es de las enfermedades más importantes del

cultivo de arroz por su poder destructivo, esta es ocasionada por el hongo Pyricularia

Grisea u Oryzae (25) el cual produce una sustancia tóxica conocida como pericularina que

inhibe el crecimiento de los tejidos y los desorganiza causando el añublo o quemazón del

cereal (26) los síntomas se ven reflejados principalmente en hojas, tallo y panícula, aunque

puede afectar todas las partes aéreas de la planta visualizadas por medio de puntos color

café verdoso los cuales pueden ser de diferentes tamaños (1-1.5 cm diámetro) según las

condiciones ambientales de la planta, la consecuencia principal de la enfermedad es la

pérdida parcial o total de la panícula, cosechando granos vacíos o parcialmente formados

(27).

Ilustración 2. Ciclo de vida de la Pyricularia Oryzae en la planta de arroz (28)

La reproducción del hongo Pyricularia es asexual y se propaga por medio de esporas

(Ilustración 2), trasmitidas por aire y agua las cuales se posan en nuevas plantas iniciando el

proceso de infección, la espora germinada libera un tubo angosto el cual se adhiere a la

epidermis de la planta, en el extremo del tubo se forma un apresorio u órgano de fijación

cuya función principal es perforar la cutícula y liberar el patógeno (29). La espora se ubica

11

en los nodos de los tallos, hojas y panícula, siempre y cuando las condiciones del cultivo,

como alta humedad relativa (90-92%), temperatura (22-29 °C), concentración de nitrógeno

en agua, nubosidad, presencia de vientos e intensidad lumínica sean favorables (30). Cuando

la espora penetra el vegetal se producen filamentos que obstruyen el sistema vascular de la

planta interrumpiendo la circulación de la savia hacia el tallo y/o panícula, al cabo de 4 o 5

días termina secándose y tornando el color café característico, si la espora llega a afectar la

semilla puede generarse un nuevo foco de enfermedad (24), (31).

Por tanto, es de vital importancia para el agricultor contrarrestar este tipo de enfermedades

y emplear métodos adecuados e integrales que contribuyan al mejoramiento de las defensas

naturales de la planta de arroz, como implementar el riego a bajas temperaturas, disminuir

el contenido de nitrógeno en el abono, purgar el terreno de cosechas previamente infectadas,

y cortar de inmediato las malas hierbas presentes en el sembrado, de igual forma el empleo

de fungicidas también hace parte de la protección de la cosecha siempre y cuando sea

proporcional y adecuado a la especie sembrada, sin ocasionar daño al ambiente (24). Por

consiguiente, una de las prioridades en investigación agrícola es ofrecer a los productores

arroceros variedades resistentes a las enfermedades que se le presentan al momento de

cultivar, en este caso la quemazón de la panícula, lo cual puede representar un control

adecuado (26).

1.3 Genes de Resistencia: variedades resistentes

Las plantas generalmente se defienden de los patógenos de dos formas: 1) características

estructurales que actúan como barreras físicas e inhiben la entrada del patógeno y la

dispersión a través de la planta; 2) reacciones bioquímicas que tienen lugar en las células y

tejidos de la planta que producen sustancias que pueden ser tóxicas para el patógeno (32).

La combinación de estas dos formas de defensa son diferentes para cada sistema hospedero-

patógeno y varían dependiendo de la edad, clase de órgano de la planta, tejido atacado,

condición nutricional y climática (33), con este concepto se busca mejorar la calidad y

rendimiento del cultivo de arroz (34).

Un estudio realizado por el grupo de Takatsuji et al., muestra que los genes de resistencia

que se expresan en la planta de arroz al ser atacada por la Pyricularia son propensos a decaer

debido a la variabilidad patogénica del hongo (9). Sin embargo el gen Pb-1 (Panicle blast

1) derivado de la especie de arroz “indica cultivar-Modan” se caracteriza por la durabilidad

y resistencia ante el hongo (35), otros estudios muestran que la resistencia parcial de la planta

se asocia a la variedad poligénica, aun así el periodo de latencia no contrarresta lo suficiente

la estadía del patógeno, un conjunto de diversos factores ambientales como humedad,

temperatura, tipo de suelo, fertilización, entre otros, pueden influir en la expresión de la

resistencia parcial del gen, ahora bien, en un entorno propicio es posible aplicar una ayuda

a la resistencia de la planta hospedante ante el patógeno (36); Por esta razón, se seleccionó

una proteína de resistencia expresada por este gen, y de esta se seleccionaron fragmentos

peptídicos para ser evaluados y sintetizados en esta investigación.


1.4 Síntesis de péptidos en fase sólida

La síntesis química de péptidos nació en 1901 con la síntesis de dipéptidos desarrollados por

Emil Fischer, posteriormente los investigadores Max Bergmann y Leonidas Zervas en 1932

diseñaron los primeros grupos protectores de los grupos amino (carbobenzoxilo) y de las

cadenas laterales de los aminoácidos, en 1953 el científico Vincent Du Vigneaud sintetizó

por primera vez un péptido funcional, la oxitocina, motivo por el cual fue galardonado con

el premio nobel de química en 1956, un logro importante poco tiempo después fue el diseño

de la síntesis en fase sólida por Bruce Merrifield, por cuyo desarrollo e impacto también le

fue concedido el Premio Nobel de Química en 1984. (37) Esta metodología de síntesis

pronto adquirió gran relevancia y con los avances tecnológicos se empezaron a desarrollar

nuevos soportes sólidos, espaciadores, grupos protectores y estrategias de activación para la

formación del enlace peptídico (38).

La metodología de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, solid phase peptide synthesis),

consiste en la adición secuencial de alfa-aminoácidos, protegidos en la cadena lateral y su

alfa amino, a un soporte polimérico insoluble que es químicamente inerte y mecánicamente

estable a las condiciones de síntesis (39); esta estrategia sintética permite emplear excesos

del aminoácido y demás reactivos que se eliminan fácilmente por los procesos sencillos de

lavado y filtrado lo cual facilita el proceso de síntesis en comparación a la síntesis en fase

líquida (40) (Ilustración 3). Los grupos protectores acido-lábil t-Boc (tert-butiloxicarbonilo)

o básico-lábil Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) son los más empleados para la protección

alfa-amino y los grupos Benzil (Bzl) y tert-Butil (tBu) respectivamente para la protección

de las cadenas laterales de los aminoácidos que lo requieran (41). El crecimiento de la cadena

peptídica inicia por el extremo carboxílico del aminoácido protegido, el cual se ancla a la

matriz polimérica por medio de un brazo o espaciador funcionalizado que permite la unión,

una vez acoplado el aminoácido se remueve el grupo protector alfa-amino por medio de un

proceso de desprotección (42).

La desprotección del grupo t-Boc y Fmoc se realiza con ácido trifluoroacético (TFA)

(Ilustración 4) y piperidina o piperazina (Ilustración 5), respectivamente; de esta forma el

grupo alfa-amino se encuentra libre y permite la unión al siguiente aminoácido el cual es

previamente activado para formar el enlace peptídico. El proceso de acople (Formación del

enlace amida) requiere la activación del grupo carboxilo del aminoácido entrante usando un

agente de acople de modo que reaccione con el amino terminal del péptido en construcción

(Ilustración 6) (43).

El acople y la desprotección se repite tantas veces como sea necesario hasta completar la

secuencia deseada (38), finalizada la síntesis se remueven los grupos protectores de las

cadenas laterales de los aminoácidos y se desancla el péptido del soporte sólido teniendo en

cuenta la estrategia de síntesis implementada (41). En la estrategia t-Boc se emplea ácido

fuerte como el ácido fluorhídrico (HF) o ácido trifluorometanelsulfonico (TFMSA) y para

13

la estrategia Fmoc se utiliza TFA; en cada uno de estas estrategias químicas se emplea un

coctel de compuestos que dependen de la secuencia peptídica y son adicionados para evitar

o disminuir la formación de reacciones colaterales que son propias del proceso de desanclaje

del péptido (44), (45).

Espaciador

Espaciador

Espaciador

Espaciador

Espaciador

Espaciador

+.

O

NH.OH

R1

P1

T

.

O

NH.X

R1

T

P1

.

O

NH2

X

R1

P1

.

O

NHX

R1

.

O

NH.

R2

P1

.

O

NH.A

R2

T

P2

T

P2

.

O

NHX

R1

.

O

NH

R2

.

O

NH

Rn.

.

O

NH.

Rn+1

P1

P2

Pn

n

T

Pn+1

O

NHX

R1O

NH

R2O

NH

Rn.O

NH2

Rn+1

n

Acople del primer aminoácido a la resina

Remover el grupo protector del -amino

Acople del siguiente aminoácido activado

n ciclos de acople y desprotección

Remoción de todos los grupos protectores y desanclaje del péptido de la resina

Ciclos SPPS

P Grupo protector de la cadena lateral de los aminoácidos

T Grupo protector del -amino de los aminoacidos

Soporte sólido

A Grupo activante

X NH o O

Ilustración 3. Esquema general de la síntesis de péptidos en fase sólida.


Ilustración 4. Mecanismo de desprotección de t-Boc

Ilustración 5. Mecanismo de desprotección de Fmoc

Ilustración 6. Mecanismo de acople DCC/HOBt

15

1.4.1 Matrices Poliméricas.

La síntesis química de péptidos ha sido la base principal para la preparación de estas

moléculas por más de 50 años, el óptimo resultado de la síntesis depende de la adecuada

elección del soporte sólido, el brazo espaciador “linker”, grupos protectores de los

aminoácidos, metodología de acoplamiento y protocolo de desanclaje del péptido de la

resina. Las características de un buen soporte sólido deben ser; estabilidad física y química

a las condiciones de síntesis, una alta capacidad de hinchamiento en los diferentes solventes

empleados para permitir accesibilidad a los sitios de reacción de los diferentes reactivos,

tener un grado de entrecruzamiento adecuado y de funcionalización aceptable, ser

compatible con los reactivos, longitud y secuencia del péptido deseado. Para la síntesis de

péptidos es favorable el uso de resinas con bajo grado de entrecruzamiento y gran capacidad

de hinchamiento, puesto que la cinética de reacción controlada por la velocidad de difusión,

permite a una resina más hinchada tener tiempos de reacción más cortos y acomodar mejor

a la cadena peptídica en crecimiento (46).

Los soportes basados en poliestiréno, tienen el historial más largo de uso en síntesis de

péptidos en fase sólida, tienen una capacidad de carga significativamente alta y poseen entre

el 1% y 2% de divinilbenceno (DVB) como agente de reticulación; de igual forma otras

matrices con núcleos que incluyen poliacrilato, poliacrilamida y polietilenglicol con igual

rango de reticulación, han sido utilizadas para la síntesis de “péptidos difíciles” (propensos

a agregación), soportan elevadas temperaturas, son insolubles en solventes orgánicos y

solvatadas e hinchadas en solventes apróticos tales como tolueno, dimetil formamida,

diclorometano y 1-metil-2-pirrolidona, sin embargo la capacidad de hinchamiento varia con

respecto al solvente que se expone (45)

Los linkers o brazos funcionalizados, son moléculas que sirven para unir de forma reversible

la cadena peptídica en crecimiento a la resina, a la vez que determinan el grupo funcional y

sirven de grupo protector del C-terminal. La mayoría de los linkers son escindidos por

acidólisis en diferentes concentraciones dependiendo la estrategia química empleada (46)

Ilustración 7. Estructura de resinas utilizadas como soporte sólido.


1.4.2 Activadores

El acople del primer aminoácido a la resina o la formación de enlace amida entre el

aminoácido que ingresa y uno previamente acoplado, requiere la activación del aminoácido

entrante. Esta activación del ácido carboxílico es la base del enlace peptídico, cuya función

principal es formar el acople y mantener la integridad del péptido en crecimiento en especial

el centro estereogénico del carbono alfa del aminoácido. Para esta reacción es necesario

recurrir a agentes de acople, los cuales permiten aumentar la cinética de la reacción puesto

que proporcionan al carbono carbonilo un buen grupo saliente lo que favorece el acople, sin

embargo, también se ve favorecida la formación de oxazolonas y enoles, que son las dos

vias de racemización debidas al aumento de la acidez del protón del carbono alfa el cual es

fácilmente retirado (Ilustración 8) (41).

Ilustración 8. Racemización de del carbono terminal de un aminoácido durante el proceso de acople, a)

enolización y b) formación de oxazolonas.

Los reactivos de acople (activadores) más utilizados se pueden dividir en dos grandes

grupos, las carbodiimidas y triazoles; Las carbodiimidas son los reactivos de acoplamiento

más utilizados en fase sólida, la N´N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) fue primera en ser

empleada y hoy día sigue siendo la más popular, sin embargo, la formación del subproducto

diciclohexilurea interviene negativamente en el rendimiento final y a su vez es un potente

alérgeno (47).

Por tal motivo se ha estudiado nuevos reactivos que minimizan la formación de

subproductos no deseados a la vez que disminuyen los niveles de racemización. La mayoría

de estos compuestos son benzotriazoles de las cuales se derivan las sales de fosfonio y

uronio, que en presencia de una base pueden convertir el carboxilato del aminoácido entrante

en una especie activada. (48), Las más empleadas son el Hexafluorofosfato de benzotriazol-

1-il-N-oxi-tris (pirrolidin) fosfonio (PyBOB) derivadas del HOBt. Entre las sales de uronio

se encuentran el hexafluorofosfato de N-oxido de N-((1-H-benzotriazol-1-il)-dimetilamino-

metilen)-N-metilmetanaminio (HBTU), y el tetrafluoroborato de N-oxido de N-((1-H-

benzotriazol-1-il)-dimetilamino-metilen)-N-metilmetanaminio (TBTU) (48).

17

1.4.3 Dificultades Sintéticas

A pesar de los avances en la síntesis química de péptidos en fase sólida y la optimización

del proceso, existen secuencias peptídicas que presentan dificultades sintéticas,

denominados péptidos de secuencia difícil; estas dificultades sintéticas son más frecuentes

en algunos péptidos que otros y ha sido descrito como el problema potencial más serio en la

síntesis de péptidos (49). Estos inconvenientes se presentan en secuencias con alto contenido

de un solo aminoácido, aminoácidos estéricamente impedidos por causa de cadenas laterales

o grupos protectores voluminosos, problemas de hinchamiento de la resina, baja solvatación

del complejo resina-péptido y las interacciones entre aminoácidos que inducen al

plegamiento del péptido, provocando agregaciones inter e intramoleculares de la cadena

peptídica reflejado en la formación de estructuras tipo hojas-β (50), afectando de manera

parcial o total las reacciones de desprotección y acilación; en algunos casos extremos el

complejo péptido-resina se vuelve insoluble y no está disponible para reaccionar.

Las estrategias para aumentar la eficiencia sintética disminuyendo la formación de

agregados y estructuras secundarias se basa en la modificación del entorno químico y la

incorporación de grupos protectores reversibles en la estructura del péptido en construcción.

Todas estas aproximaciones buscan el mejoramiento de la solvatación del complejo resina-

péptido, y así minimizar las dificultades sintéticas. Dentro de estos desarrollos se encuentra

el uso de resinas de composición química especifica tipo polientilenglicol (PEG) o

polietilenglicolacrilamida (PEGA) las cuales permiten mejorar la eficiencia sintética debido

a su gran capacidad de hinchamiento, sumado a esto el uso de resinas de baja sustitución

que disminuye el impedimento estérico entre cadenas peptídicas adyacentes. El uso de

solventes y de activadores que aumentan la velocidad de reacción, sales y detergentes

caotrópicos también han mostrado una exitosa disminución de los fenómenos de agregación

durante el acople de los aminoácidos, detergentes no iónicos, sonicación, aumento de

temperatura (microondas) y procesos de neutralización In-Situ (51).

1.4.4 Péptidos estructurados

Debido a la relación entre secuencia primaria, conformación molecular y función biológica,

estudios como el de Anfinsen permitieron demostrar que la estructura tridimensional de una

proteína está directamente ligada a la secuencia de aminoácidos, puesto que el orden de

nucleótidos en el ADN especifica la secuencia primaria, es decir que un gen contiene toda

la información necesaria para determinar la estructura tridimensional de su producto

proteico (52).

La síntesis de fragmentos peptídicos ha permitido el estudio de moléculas que imiten las

estructuras nativas de las proteínas las cuales están dominadas por los ángulos de torsión

que permiten conformaciones especificas junto con factores externos como enlaces de


hidrógeno e interacciones hidrofóbicas; la estructura hélice alfa es una de ellas, tiene los

ángulos torsionales phi (φ) y psi (ψ) toman valores cercanos a -57° y -47°, respectivamente.

Estas hélices tienen 3,6 residuos por vuelta y por cada aminoácido se produce un incremento

de la hélice de 1,5 Å (traslación por residuo), se caracteriza por que adopta una forma

helicoidal gracias a los puentes de hidrógeno de la cadena principal, los aminoácidos tienen

la cadena lateral orientada hacia el exterior. Para formar esta estructura el grupo carboxilo

de cada aminoácido (n) se une mediante un puente de hidrógeno al grupo amino de otro

aminoácido (n+4), es una de las más estables por que da lugar a un gran número de

interacciones. Otra conformación es la hoja-beta, la cual se forma con enlaces de hidrógeno

entre dos cadenas peptídicas vecinas creando láminas en zig-zag, la disposición puede ser

paralela o antiparalela, puede darse entre dos regiones próximas o distantes del péptido , los

grupos radicales de cada aminoácido sobresalen de la lámina en ambos sentidos, de forma

alterna. También se encuentran en este grupo, los giros β, los cuales se forman por la unión

mediante un puente de hidrógeno del aminoácido n + n+3, también llamados “bucle” o

“loop” (53).

Ilustración 9. Estructuras peptídicas; primaria secundaria y terciaria.

En algunos caso es posible obtener en fragmentos peptídicos estructuras similares a las

encontradas en la proteínas nativas en otros no es posible debido a que la proteína ayuda a

19

estabilizar dichas estructuras, en otros casos es posible el empleo de restricciones

conformacionales que ayudan a estabilizarla (54)

La estructura secundaria de las proteínas se puede determinar por espectroscopía de DC en

la región espectral del “UV lejano” (190-250 nm). A estas longitudes de onda, el cromóforo

es el enlace peptídico, y la señal se origina cuando un haz de luz polarizado es absorbido por

la molécula que debe ser ópticamente activa (quiral). La energía más débil de transición en

el cromóforo del péptido es una transición n observada a 210-220 nm, que involucra

electrones no enlazantes de oxigeno del carbonilo. Sin embargo, la energía más fuerte es

una banda de absorción centrada a 190 nm debido a la transición que involucra los

electrones del carbonilo. Por lo tanto, la intensidad de las transiciones depende de los

ángulos de torsión de y ψ. Las α-hélice, las hojas β, y las estructuras helicoidales aleatorias

dan lugar a un espectro de DC de forma y magnitud característica, respectivamente.

Ilustración 10. La gráfica muestra espectros de dicroísmo circular en el UV lejano asociados con diversos

tipos de estructuras secundarias. Línea sólida: α-hélice, líneas punteadas hojas líneas discontinuas largas:

random coil.

1.4.5 Formas de Presentación Peptídica

La estrategia de síntesis de péptidos ha permitido el estudio de moléculas con alto peso

molecular caracterizadas por presentar multicopias de un antígeno consideradas centro de

interés en el desarrollo de estudios biológicos. Los tipos de presentaciones peptídicas con

dichas propiedades son los polimeros de cisteina, Péptidos Multi-Antigénicos (MAPs) y los

Constructos de Doble Dímero (DDCs). (55)


Los polímeros de cisteína son sintetizados a partir de unidades peptídicas que contienen una

cisteína en el C y N-terminal las cuales son oxidadas por medio del grupo tiol de cada

cisteína dando un enlace disulfuro, que puede unir varias unidades peptídicas, pero esta

primera aproximación es de difícil caracterización debido a las múltiples especies

poliméricas que se pueden formar por medio del grupo tiol y a la falta de direccionamiento

en la formación del enlace disulfuro (Figura 3);

n=1 n=2

Oxidación

C-terminalN-terminal

Ilustración 11. Representación de las diferentes especies formadas para la síntesis de un polímero peptídico de

cisteínas, cada flecha representa una unidad peptídica; donde n=1 es el monómero cíclico, n=2 son las especies

diméricas que presentan diferente direccionamiento. Se omite las moléculas cíclicas del dímero, y moléculas

de mayor número de unidades.

Los MAPs son estructuras que contienen una lisina la cual permite sintetizar los epítopes

por el grupo α y ε amino (Figura 4). Estas estructuras consisten en unidades ramificadas y

una superficie de grupos funcionales donde puede ser sintetizadas (síntesis divergente) o

ancladas unidades peptídicas previamente sintetizadas (síntesis convergente), obteniéndose

moléculas una sola especie; sin embargo, la principal desventaja son los pasos inherentes de

purificación y síntesis (56).

Péptido NH

LYSPéptido NH NH

LYSNHLYSPéptido NH

Péptido NH

Ilustración 12. Presentación de un MAP con cuatro unidades peptídicas incorporadas en los grupos

funcionales del amino de la lisina.

Los DDCs son moléculas con un core de glicina y cisteína, utilizando como punto de partida

para la síntesis de los péptidos los grupos amino α y ε del aminoácido lisina (55), Su

construcción presenta varias ventajas sobre la síntesis de MAPs como lo es una disminución

21

en el impedimento estérico al sintetizar sobre una sola lisina, lo que permite obtener mejores

rendimientos y perfiles cromatográficos, en la obtención de las moléculas sintetizadas.

Finalizada la síntesis se realiza la formación de un puente disulfuro entre dos moléculas

peptídicas por medio del grupo tiol de la cisteína, para producir una plataforma que contiene

cuatro copias del mismo antígeno (57) .

Debido a su tamaño y tipo de estructura esta macromolécula tiene como característica

principal, presentar un antígeno de interés en forma tetramérica en la misma molécula

(Figura9) (58).

Ilustración 13.Constructos de Doble Dímero (DDC) los cuales contienen cuatro copias de un mismo péptido.

Tomada de la referencia (57) (58)


2. Metodología

Este proyecto fue desarrollado con los objetivos propuestos de forma secuencial.

2.1 Búsqueda de la estructura secundaria y terciaria de una proteína expresada por el Gen

Pb-1 de Oryza sativa, involucrada en el mecanismo de defensa contra la Pyricularia.

Mediante el uso de software se buscó un modelo tridimensional de la proteína seleccionada,

el cual aportó datos sobre las estructuras secundarias que se encuentran en la proteína con

lo cual se eligieron los péptidos sintetizados

2.2 Selección de las estructuras de la proteína expresada por el Gen Pb-1 de Oryza sativa,

candidatas para estudio.

A partir de los resultados obtenidos se eligieron las estructuras en función a su estructura

secundaria, hidrofobicidad y ubicación en la proteína, y si la secuencia tenía probabilidad

de alfa hélice se analizaban sus propiedades con el programa Helical Wheel.

2.3 Diseño y síntesis de un péptido con y sin restricción conformacional que imite un


Una vez se seleccionó la secuencia se procedió a la síntesis del péptido de C a N terminal

mediante la metodología Fmoc, siguiendo el protocolo que se describe a continuación

0,040 g de resina Fmoc Rink Amida con sustitución 0,59 meq/g, fueron introducidos en una

bolsa de polipropileno con dimensiones de 15 x20 mm, se codificó numéricamente para

identificar la bolsa y así permitir realizar síntesis simultanea de péptidos. La bolsa fue

introducida en el recipiente de reacción, donde se hinchó la resina con 3 mL de

Diclorometano (DCM) (2 x5´), esta matriz polimérica posee un amino protegido con el

grupo Fmoc, el cual fue removido para poder realizar el acople del primer residuo de

aminoácido; (59).

Para esto se adicionó 2 mL de una solución de Piperidina al 20% en Dimetilformamida

(DMF) (2x10´), una vez terminado se lavó con DMF(3X1´), Isopropanol (IPA) (1X1´),

DMF (2X1´) y DCM (2X1´) para retirar remanentes del reactivo y dejar la resina en

condiciones para el acople si es requerido.

Se monitoreó la remoción del grupo protector Fmoc mediante dos reacciones colorimétricas

que determinan la presencia de grupos aminos libres. En el primer método se tomó una

pequeña porción de resina en un ependorf y se adiciono una solución de ninhidrina (3 gotas

de la solución A y 1 gota de la solución B, (ver anexo 2), se calentó por 5 min a 100°C; El

segundo ensayo consistió en adicionar a una porción de resina 5 gotas de la solución de azul

de bromofenol al 1% en DMF, se agito y se observó pasados 3 minutos de reacción; Si el

resultado en las dos pruebas muestran tanto la resina como la solución azul o verdosa indica

23

un ensayo positivo para aminas libres, y se puede proceder a realizar el acople, de lo

contrario (solución y resina incoloras) el ensayo es negativo y se repite el procedimiento de

desprotección.

Seguido a este paso se realizó el acople del primer aminoácido, asi;

5 equivalentes del aminoácido a acoplar (con respecto a la carga de la resina) , 5 equivalentes

del agente de acople (HBTU, TBTU, TCTU, OXIMA, HATU o DIC) y 10 equivalentes de

base N,N-di-isopropiletilenamina (DIPEA) fueron disueltos en 1ml de DMF y adicionados

a la resina, se dejó reaccionar por 1 hora en agitación constante a temperatura ambiente,

después se drenó la solución y se lavó la resina con DMF (3X1´) y DCM (2X1´). Para

verificar que la acilación haya sido efectiva se realizó un ensayo de ninhidrina, si el resultado

es negativo se procede a desproteger el grupo Fmoc del N-terminal como se describe

anteriormente, de lo contrario se repite este paso de reacción variando el agente de acople

hasta obtener la incorporación total del aminoácido. Sucesivamente se realizaron ciclos de

acople y desprotección de acuerdo al número de residuos en la secuencia.

Una vez sintetizada la secuencia se removió el último grupo Fmoc y se procedió a retirar los

grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos, en simultaneo con el

desanclaje del péptido de la matriz con una solución de TFA/TIS/H2O (ácido

trifluoroacético/ triisopropilsilano/ agua) en proporciones 95:2,5:2,5 respectivamente para

secuencias que no contienen, Metionina, Cisteina ni Triptofano, en caso contrario se empleó

una solución de TFA/TIS/DOTA/H2O (ácido trifluoroacético/ triisopropilsilanol/ 2,2′-

(etilendioxy)dietanetiol /agua) en proporciones 94:2:1:2 respectivamente, empleandose en

los dos casos un volumen de 2 ml de solución de clivaje por cada 50 mg de resina con un

tiempo de reacción de 3 horas, luego se adiciono éter etílico frio a la solución para obtener

un precipitado el cual fue disuelto, liofilizado y posteriormente analizado por cromatografía

líquida de alta eficiencia en fase reversa y Espectrometría de Masas y dicroísmo Circular.

2.4 Síntesis del péptido con Restricción Conformacional

Para la síntesis del péptido con restricción alfa-helical o “loop” se siguió el diseño propuesto

por el grupo de investigación Proteoma UD. (En proceso de Patente) (60)

El fragmento peptídico con tendencia α-hélice, se sintetizó primero la secuencia sobre la

resina (2.2) y al final se introdujo los ligandos J` y Z` como sitio de nucleación dejando entre

ellos un aminoácido X (X: cualquier aminoácido); si se estabiliza como bucle “loop” se

ubican los ligandos en los extremos de la secuencia; J` como ligando N-terminal y Z` como

ligando C-terminal. Por último se cicla la secuencia llevando a cabo la restricción

conformacional. (En proceso de Patente). (61).


Ilustración 14. Inserción de ligandos J` y Z` en una secuencia peptídica para dar alfa-hélice (a.) o “loop” (b.)

Proteoma UD.

2.5 Síntesis del péptido con presentación de Dendrímero de doble constructo (DCC):

Para la obtención del DDC (tetrámero), se sintetizó inicialmente un core de lisina KGC, y

se continuó con la construcción de las cadenas peptídicas en el α y ε amino de la Lisina,

siguiendo con la metodología presentada en el numeral 2.3 y 2.4. Una vez sintetizadas se

realizó un enlace disulfuro con las cisteínas del C-terminal entre las dos moléculas

diméricas. La reacción se llevó a cabo con una concentración de 10mg/ml en una solución

acuosa de dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%, a pH 7,5 (62).

2.6 Desalinización de los péptidos crudos por Sephadex ® G-10:

Los crudos obtenidos fueron desalinizados en una columna cromatográfica Sephadex G 10,

hidratada con agua ultra pura, esta permite la separación de sus moléculas en función a su

tamaño. 10mg de péptido se disolvieron en el menor volumen posible (<500 μl), se pasó a

través de la columna y se recogieron los primeros 4ml de elusión con agua, en donde debería

eluir por completo el péptido.

2.7 Caracterización de los compuestos sintetizados:

2.7.1 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia en Fase Reversa (RP-HPLC)

Las especies obtenidas fueron analizadas por RP-HPLC en una columna (C-18) Water

Corp.XBridgeTM BEH130 equilibrada con acetronitrilo/agua/ácido trifluoroacético. 1mg del

péptido fue disuelto en 1 ml de agua ultra pura (1mg/ml) de allí se tomó una alícuota de 5

uL y se llevó a un volumen de 100 uL (Cf 0.05mg/ml). Se analizó con un gradiente de 0-70

% (v/v) de acetonitrilo en agua con 0,05 % de ácido trifluoroacético, en 10 minutos de

elución a un flujo de 1 ml/mín y la absorbancia medida a 220 nm.

Resina J`XZ` SECUENCIA Resina J` SECUENCIA Z`

J`XZ` SECUENCIA J` SECUENCIA Z`

a. b.

Ciclación

25

2.7.2 Espectrometría de Masas

Para la determinación del peso molecular del péptido se utiliza un espectrómetro Microflex

MALDI-TOF (Bruker Daltonics Inc. MA-USA). Se mezclan 1 µL de una solución matriz

de ácido α-ciano-4-hidroxicinnámico ((HCCA) preparada con una concentración del

10mg/ml en acetonitrilo 50% v/v y ácido fórmico 0.1% v/v) y 1 µL de una solución del

péptido (1mg/mL); se siembra esta mezcla en una placa metálica micro scout, se seca y se

introduce en el espectrómetro para realizar el análisis.

2.7.3 Dicroísmo Circular

1mg del péptido fue disuelto en 1 ml de agua ultra pura (1mg/ml) de allí se tomó una alícuota

de 35 uL y se mezcló con 215 uL de 2,2,2 trifluoroetanol (TFE) al 30 % (v/v) para estabilizar

la estructura del péptido favoreciendo la formación de puentes de hidrógeno intramolecular

y evitando que el péptido reaccione con el agua alterando la estructura, para un volumen

final de 250 ul (Cf 0.14mg/ml).

El espectro CD se obtuvo a 20° C en una celda con un paso óptico de 0,1 cm en un espectro

entre 190 y 250 nm de longitud de onda utilizando un espectrómetro de dicroísmo circular

Jasco (J-815 Jasco Corporation, Japan) con una señal promedio sobre 2 segundos por cada

intervalo de 0,5 nm. Todos los datos de dicroísmo circular fueron expresados como valores

de elipticidad molar.


3. Resultados y Discusión

3.1 Búsqueda de la estructura secundaria y terciaria de una proteína expresada por el Gen Pb-

1 de Oryza sativa, involucrada en el mecanismo de defensa contra la Pyricularia.

Se realizó un estudio bioinformático de la proteína expresada por del gen de resistencia Pb-

1 con el fin de analizar las estructuras secundarias y terciarias de esta proteína, lo cual

permitió la selección de fragmentos de interés para la presente investigación.

Por medio de la base de datos del centro nacional para la información biotecnológica, NCBI

(National Center for Biotechnology Information) se identificó la secuencia completa de la

proteína de resistencia (Grupo Oryza Sativa Japónica), reportada en la literatura (9) y en

estudios previos hechos en la Universidad Distrital (11) luego se filtró información con el

programa de alineamientos de secuencias de tipo local BLAST (Basic Local Alignment

Search Tool) y se obtuvo los siguientes datos.

Es una proteína de resistencia que se compone de 1296 aminoácidos, proveniente del Gen

Pb-1 de la variedad de arroz Oryza sativa Japónica, y esta es la proteína secuenciada (Figura

1)

“1 mtelasgavs sllvvirnea allggvrddv qfikeemesm nsflahlaks apqggehneq 61 vrtwmnqvrl laqdcnncid lylysgnpei hrakgrlrrh lwwaywylrk miarhraavq

121 lcqlkdrard vgerrlrygv evpattkaaa pdaasgyaag ddedeedyeh qlavataghh

181 sarravydpp aledyvnekl lewaeeiptr aiqtlsiaiv apdtdnnevl alaheilvap

241 gyyyrrsimv nvpavhakfl plrpkevlyy ilrelehgeg agsqkqatdq gnpwqgyyni

301 yrdkkkvlrk ikrniekmni ykklekiesd ikheqqksdk qlllqlqkkg vdqvdlhvll

361 qllllqsqqd qvknkaadif klpewndnni mkiarklkkh metdeetkev qieveeettk

421 qgrrgkrged ekqkekgeer keverhkeke eetkeeeqqh kkqeekgeer ekverhekek

481 eeetkeehee kkeregreve deeekdnddn ndgeeeeeee eeddddedpi hlhedqyaqi

541 lqevfpkian sktqqqdkse akqvtktatt tldeerikqm ineakedvfr elrggkpdkn

601 qatcepdvpp dknqatgeha gvmdhngeay fteieqkide ikqefkkqlk ikgivdkikh

661 hlieykikhe lpdecpliil kfddmmdgsr weefrkalsl lecsadalif ttenteqakr

721 ysypprepid yslvglyhyt vleltskhkn edncspkifr dileeceghe fcmkifthal

781 yanpkrsnee lsklhstlqd sqksfdaiak kmfmysyndl pkeyksclly laifpkgqki

841 rrstligrwv aegltlkedw pssvrqanrc fdalirrylv cpvdiggtgk vkscavhdpv

901 hgfittiark qhivetrlsh hlarhfsifn dlrlrssdgi htffqslsrs srvsllkvld

961 legsqcfgvk nqrylkdics kmlllkylsl kkteitqlps einclrelev ldiretkvpa

1021 natvnvlllk lkrllaghid ssprnsgtsv qiphridkmv nievlsnvka qrrddledig

1081 klwqlrklgv vvddkrghlg nllkaisnlh ecirsltiti sttthkdtps npelpdhigs

1141 dlphpkkles lsisgarhlf plliksdnnk lakvtlsstp lnqddlevla klpklqcvrl

1201 qhiscivsel ifkeenfkcl kylliegfnl tnitfedgsa celekmvlss tsiesisgvd

1261 vlpkfkelel nnshvpnevk eavennkrii lkcnep”

Figura 1. Proteína secuenciada de N—C terminal con 1296 aa, con número de acceso BAJ25849. (9)

27

A partir de la secuencia seleccionada se buscó con el programa I-Tasser (Protein Structre

and Function Prediction) (63) la estructura secundaria y terciaria de la proteína de estudio,

el resultado se observa en la figura 2. La secuencia tiene alta presencia en estructuras tipo

hojas beta, sin embargo se encuentran en el interior de la proteína evitando la exposición al

medio, mientras que la proporción de alfa-hélices es menor, pero se ubican en su mayoría

en el exterior permitiendo la accesibilidad del solvente representado en la figura 3-d con el

color verde amarillo. a) b)

Figura 2. Proteína S210084, modelo 1 C-Score = -1.64 S210084_results.tar.bz2, Swiss-PdbViewer 4.1.0. a)

cadena principal de la proteína y la representación de estructura secundaria en cinta, lamina-β amarillo, α-

hélice rojo b) probabilidad de acceso de cada residuo al solvente, azul menos accesible hasta el rojo más

expuesto.

3.2 Selección de las estructuras de la proteína expresada por el Gen Pb-1 de Oryza sativa,

candidatas para estudio.

Con la información obtenida a partir del análisis bioinformático se seleccionaron fragmentos

de regiones anfipáticas y expuestas ya que permiten la accesibilidad e interacción con el

solvente. Sin embargo, para aumentar la posibilidad de generar respuesta antígeno-

anticuerpo, se debe no solo tener en cuenta la estructura primaria, sino en lo posible

fragmentos peptídicos con estructura conformacional definida (estructura secundaria),

puesto que son frecuentemente encontrados en interfaces de proteínas y desempeñan un

papel importante en la interacción receptor-ligando, por este motivo los fragmentos elegidos

presentan características alfa-helical. Estos fueron los péptidos seleccionados.

http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/output/S210084/S210084_results.tar.bz2


Tabla 1. Péptidos lineales y sus correspondientes péptidos restringidos sintetizados.

Formula estructural N. Secuencia P. M. Representación helicoidal

(Helical Wheel)1

Primera síntesis

3 LHEDQYAQILQE 1486.61

4 (JAZ- LHEDQYAQILQE)2-KGC 3778.2

5 DEEEKDNDDN 1222.1

6 (JAZ- DEEEKDNDDN)2-KGC 3249.18

Segunda síntesis

1 1Convenciones:

Circulo ---------hidrófilico---------rojo Diamante-------hidrofóbico-------verde al amarillo

Triangulo-------negativo----------azul

Pentágono------positivo-----------azul

29

7 EDQYAQILQEVF 1482.62

r-1 (JAZ- EDQYAQILQEVF)2-KGC 3770.22

10 VEDEEEKDND 1221.16

r-2 (JAZ- VEDEEEKDND)2-KGC 3247.3

3.3 Diseño y síntesis de un péptido con y sin restricción conformacional que imite un


Estos fueron los datos obtenidos de las secuencias anteriormente estudiadas, se sintetizaron

por medio de la estrategia química Fmoc de síntesis de péptidos en fase sólida, fueron

caracterizados por RP-HPLC y espectrometría de masas EM, y la conformación de dichos

péptidos fue determinada por medio de Dicroísmo Circular (DC). Todas las secuencias

sintetizadas se encuentran en una región externa de la proteína como se visualiza en la

gráfica de la formula estructural de la tabla uno.


PRIMERA SINTESIS

- (3) LHEDQYAQILQE

Figura 3. Péptido lineal (3) (LHEDQYAQILQE; PM: 1484.71 Da).

a) estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas ESI

En el cromatograma del péptido número tres (3) se observa la elución de un solo pico con

un tiempo de retención de 14.07 minutos presenta gran hidrofobicidad dependiente del

péptido por parte de los aminoácidos tirosina, Alanina, isoleucina y leucina. El análisis del

espectro de masas muestra los iones teóricos con respecto al m+1/1= 1485 m/z y m+2/2 =

744 m/z, de la molécula. De igual forma el porcentaje de rendimiento fue del 32%, con una

masa teórica de 35.08 mg y un crudo de 11.22 mg.

31

- (4) (JAZ- LHEDQYAQILQE)2-KGC

Figura 4. Péptido dendrimérico con restricción (4) (JAZ- LHEDQYAQILQE)2-KGC; PM: 3778.2 Da). a)

estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas MALDI-TOF

El péptido número cuatro (4) muestra en el cromatograma la elución de un solo pico con

mayor intensidad sin embargo, el tiempo de retención de 4.39 minutos es menor al lineal,

debido a que aumentan los aminoácidos hidrofílicos en la secuencia como el core de lisina,

aun así la pureza disminuye por la misma amplitud del pico y esto se corrobora con el

análisis del espectro de masas, que muestra la masa de péptido 3778.2 Da, más un aducto

(+23 m/z) que posiblemente es sodio (Na+). De igual forma el porcentaje de rendimiento

fue menor a lo que se esperaba, 6.2%, con una masa teórica de 89.16 mg y un crudo de 5.52

mg

109876543210

1.200

1.100

1.000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

0

-100

-200

1,2

25

4,3

92

RT [min]

2480 (154)-281015.DATAmV


Figura 5. Dicroísmo circular y deconvolución de: a) péptido lineal (3) b) péptido restringido (4) c) Grafica

superpuesta de cada dicroísmo.

a) La grafica de dicroísmo del péptido lineal (izquierda) muestra una fuerte tendencia a hoja-

β con un máximo en longitud de onda 190 nm que corresponde a 41723,6 elipticidad molar

y un mínimo marcado en 218 nm con –15562.3 de elipticidad molar por la presencia de

aminoácidos como tirosina e isoleucina los cuales estabilizan este tipo de estructura

secundaria, aunque se encuentren aminoácidos como leucina, glutamina y ácido glutámico

los cuales favorecen la estructura alfa-helical. b) En cuanto al péptido dimérico (derecha) se

observa un cambio en el espectro puesto que disminuye drásticamente la tendencia de hoja

beta conservando el máximo y mínimo característico y aparece un leve porcentaje de α-

hélice, confirmando posiblemente que el sitio de nucleación estabiliza fragmentos con

tendencia alfa-helical. c) En esta última grafica se observa la superposición del espectro

lineal con el dimérico, mostrando la diferencia representativa en estructura conformacional.

-20000

50000

0

20000

40000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]

33

- (5) DEEEKDNDDN

Figura 6. Péptido lineal (5) (DEEEKDNDDN; PM: 1222.1 Da), a) estructura de la secuencia. b)

cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas ESI

El péptido lineal número cinco (5) muestra la elución de un solo pico con un tiempo de

retención de 14.55 minutos, con gran hidrofobicidad, a pesar de tener aminoácidos con

carácter hidrofílico como ácido aspártico, ácido glutámico y asparagina. El análisis del

espectro de masas muestra los iones teóricos con respecto al m+1/1= 1221 Da y m+2/2 =

611 Da, de la molécula sintetizada. Así mismo el porcentaje de rendimiento fue del 37%,

con una masa teórica de 28.84 mg y un crudo de 10.84 mg.


- (6) (JAZ- DEEEKDNDDN)2-KGC

Figura 7. Péptido dendrimérico con restricción (6) (JAZ- DEEEKDNDDN)2-KGC; PM: 3249.18 Da), a)

estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas

El péptido dimérico número seis (6) muestra en el cromatograma un pico de elución con

intensidad notoria y un tiempo de retención de 13.74 minutos de igual forma menor al

péptido lineal, debido a que aumentan los aminoácidos hidrofílicos en la secuencia como el

core de lisina, el grado de pureza es mayor al 50% sin embargo hay presencia de algunos

subproductos que posiblemente son aductos que se pueden detectar en el espectro de masas,

aun así se confirma la presencia de la especie con la masa de los iones moleculares m+3/3=

1084.1 Da, m+4/4 = 651 Da m+6/6= 542 Da, de igual forma el porcentaje de rendimiento

4.8% con una masa teórica de 76.68 mg y un crudo de 3.68 mg, fue muy bajo con respecto

al esperado.

35

Figura 8. Dicroísmo circular y deconvolución de: a) péptido lineal y b) péptido restringido c) Grafica


La grafica de dicroísmo del péptido lineal (izquierda) muestra una tendencia random coil

con un mínimo en 199 nm y con -10427, 1 en elipticidad molar, aunque se esperaba con la

presencia de la secuencia de poliglutámicos una conformación más helical. En cuanto al

péptido dimérico (derecha) se observa un aumento pronunciado de una estructura

determinada, lo cual indica que el punto de nucleación ejerce un posible cambio en la

conformación nativa del fragmento, sin embargo la estructura formada es de tipo hoja-beta

indicados con un mínimo en 217 nm con -17410, 2 de elipticidad molar y un máximo en

190 nm con 21840, 2 elipticidad molar, aun así tiene un leve porcentaje del 16, 9% de alfa-

hélice ya que el máximo de la hoja beta esta en 196 nm y hay alta presencia de glutámicos

que favorecen la estructura alfa-helical sin embargo la conformación del péptido tiende a

estabilizarlo en hoja beta. c) En esta última grafica se observa la superposición del espectro

-20000

30000

-10000

0

10000

20000

190 250200 220 240

Mol. Ellip.

Wavelength [nm]


lineal con el dimérico, mostrando la diferencia representativa en elipticidad molar y

conformacional de cada muestra.

SEGUNDA SÍNTESIS

Al ver la dificultad sintética en la síntesis anterior, evaluada por el rendimiento obtenido en

los dímeros, se realizó un nuevo estudio de los péptidos, optando por modificarlos levemente

en su estructura primaria siguiendo la secuencia de la proteína. Al péptido lineal número tres

(3), se le restaron los dos primeros aminoácidos del N-terminal (LH) y se aumentaron dos

en el C-terminal (VF) ese es el nuevo péptido número siete (7) Y para el péptido lineal

número cinco (5), se modificó lo contrario, adicionando dos aminoácidos en el N-terminal

(VE) y retirando los dos primeros del C-terminal (DN), este es el nuevo péptido número diez

(10), y con cada una de estas secuencias se hizo el respectivo péptido estructurado con el

core y el punto de nucleación.

- (7) EDQYAQILQEVF

Figura 9. Péptido lineal (7) (EDQYAQILQEVF; PM: 1482.62 Da), a) estructura de la secuencia. b)


El péptido lineal número siete (7) muestra la elución de un solo pico con un tiempo de

retención de 12.671 minutos, con menor hidrofobicidad comparado con el péptido número

37

tres (3), a pesar de tener aminoácidos con carácter hidrofóbico como la tirosina, Alanina

isoleucina leucina, valina y fenilalanina. El análisis que muestra el espectro de masas indica

los iones teóricos con respecto al m+1/1= 1481,6 m/z, m+2/2 = 741.8 m/z y m+3/3 = 494.9

m/z, de la molécula sintetizada. Así mismo el porcentaje de rendimiento fue del 39%, con

una masa teórica de 34.98 mg y un crudo de 13,64 mg.

- (r-1) (JAZ- EDQYAQILQEVF)2-KGC

Figura 10. Péptido dendrimérico con restricción (r-1) (JAZ- EDQYAQILQEVF)2-KGC; PM: 3770.22 Da), a)

estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas MALDI-TOF

El péptido dimérico número (r-1) muestra en el cromatograma de la figura 10, un pico de

elución con baja intensidad, con un tiempo de retención de 6.56 minutos, de igual forma

menor al péptido lineal, sin embargo el grado de pureza es muy bajo y hay presencia de

algunos subproductos que posiblemente son aductos que detecta en el espectro de masas,

aun así se confirma la masa de la especie sintetizada 3770.22 m/z, el porcentaje de


rendimiento 9% es un poco mayor al péptido número cuatro, con una masa teórica de 76.68

mg y un crudo de 3.68 mg, fue muy bajo con respecto al esperado.



La grafica de dicroísmo del péptido lineal (izquierda) muestra una fuerte tendencia a hoja-

β con un máximo en 190 nm y un mínimo marcado en 218 nm por la presencia de

aminoácidos como Tirosina e Isoleucina y el aumento de la Valina y la Fenilalanina los

cuales estabilizan este tipo de estructura secundaria, aunque se encuentren aminoácidos

como leucina, glutamina y ácido glutámico los cuales favorecen la estructura alfa-helical. b)

En cuanto al péptido dimérico (derecha) se observa un cambio notorio en la conformación

39

de la estructura nativa estabilizando la tendencia alfa –helical, confirmando los datos en el

dicroísmo con un máximo de 192 nm y dos mínimos en 209 nm y 221 nm de longitud de

onda verificando una vez más que posiblemente el sitio de nucleación estabiliza e induce

fragmentos con tendencia alfa-helical. c) En esta última grafica se observa la superposición

del espectro lineal con el dimérico, mostrando la diferencia representativa en elipticidad

molar y conformacional de cada muestra.

- (10) VEDEEEKDND

Figura 12. Péptido lineal (10) (VEDEEEKDND; PM: 1221.16 Da), a) estructura de la secuencia. b)


El péptido lineal número diez (10) muestra la elución de un solo pico con un tiempo de

retención de 10.916 minutos el cual indica una pureza alta, con menor hidrofobicidad

comparado con el lineal número cinco (5), debido a los aminoácidos con carácter hidrofílico

como ácido aspártico, ácido glutámico y asparagina que la componen. El análisis que

muestra el espectro de masas indica los iones teóricos con respecto al m+1/1= 1220,5 m/z y

m+2/2 = 611.3 m/z, de la molécula sintetizada. Así mismo el porcentaje de rendimiento fue

mayor que el lineal número (5) del 41%, con una masa teórica de 28.81 mg y un crudo de

11,8 mg.


- (r-2) (JAZ- VEDEEEKDND)2-KGC

Figura 13. Péptido dendrimérico con restricción (r-2) (JAZ- VEDEEEKDND)2-KGC PM: 3247.3 Da), a)

estructura de la secuencia. b) cromatograma RP-HPLC c) espectro de masas MALDI TOF.

El péptido dimérico número (r-2) muestra en el cromatograma un pico de elución con menor

intensidad y tiempo de retención de 4.192 minutos, menor al péptido lineal debido a que

aumentan los aminoácidos hidrofílicos en la secuencia como el core de lisina, pero el nivel

de pureza sigue siendo bajo, evidenciado en la amplitud del tiempo de retención, esto es

respaldado con la presencia de algunos subproductos que posiblemente son aductos

detectados en el espectro de masas, se confirma la presencia de la especie con la masa

3247.38 m/z y una segunda señal que posiblemente es la masa del péptido más una especie

de (+71) que puede ser la adición de una Alanina, sin embargo el porcentaje de rendimiento

fue 8.9% un poco mayor con respecto al dímero número seis (6), la masa teórica es de 76.63

mg y el crudo de 6.82 mg.

41



La grafica de dicroísmo del péptido lineal (izquierda) muestra una curva pronunciada con

una leve tendencia alfa helical sin embargo el espectro muestra un mínimo en 216 nm con -

20118, 9 de elipticidad molar y un máximo en 191 nm de 11013, 1 de elipticidad molar que

indican presencia de hoja beta en un 16%, ya que el aminoácido valina, ácido aspártico y

asparagina tienen tendencia a esta conformación. En cuanto al péptido dimérico (derecha)

se observa un cambio pronunciado en la estructura nativa, lo cual indica que el punto de

nucleación ejerce un posible efecto en la conformación del fragmento lineal, mostrando en

el espectro una estructura secundaria alfa helical del 48%, con dos mínimos notables en 223

nm con -18090,9 de elipticidad molar y el otro en 214 nm con -21417,9 elipticidad molar, y


un máximo en 190 nm con 21129,6 de elipticidad molar. c) En esta última grafica se observa

la superposición del espectro lineal con el dimérico, mostrando la diferencia representativa

en elipticidad molar y conformacional de cada muestra, indicando la probable estabilidad

del péptido en esta conformación reiterándolo con el punto de nucleación

Tabla 2. Tendencia de loa aminoácidos a formar estructuras secundarias2

2 Tomado de http://www.uib.cat/facultat/ciencies/prof/josefa.donoso/campus/modulos/modulo3/modulo3_5_3_4.htm

5/01/16

http://www.uib.cat/facultat/ciencies/prof/josefa.donoso/campus/modulos/modulo3/modulo3_5_3_4.htm

43

4. Conclusiones y recomendaciones

4.1 Conclusiones

1. Todos los productos obtenidos fueron caracterizados por Cromatografía liquida de

alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC) y espectrometría de masas (MS), y la

tendencia conformacional por dicroísmo circular (CD).

2. Se pudo sintetizar el fragmento lineal correspondiente a la secuencia

LHEDQYAQILQE, el cual presentó una tendencia de hoja-β y al sintetizar la misma

secuencia con la restricción conformacional en DDC y el sitio de nucleación

disminuyo la tendencia inicial de su estructura nativa. En la segunda síntesis se pudo

observar que el movimiento de dos aminoácidos cambia notablemente la estructura

y la introducción del punto de nucleación a la secuencia en el constructo

dendrimérico acentúa la tendencia alfa-helical del péptido.

3. El fragmento peptídico con secuencia DEEEKDNDDN, al ser sintetizado mostró

una cierta tendencia de hoja-β y al introducir el punto de nucleación en la secuencia

en una plataforma peptídica, se estabiliza una estructura con cierta tendencia alfa-

helical. Sin embargo en la segunda síntesis del péptido el movimiento de dos

aminoácidos cambia notablemente la estructura y la introducción del punto de

nucleación a la secuencia en el constructo dendrimérico estabiliza notoriamente la

tendencia alfa-helical del péptido.

4. El sitio de nucleación “JAZ” (en proceso de patente) muestra que puede estabilizar

fragmentos con tendencia α-helical en macromoléculas peptídicas tipo DDC.

4.2 Recomendaciones

1. Se propone inocular los péptidos seleccionados en ratones y analizar los sueros

obtenidos en ratones contra los mismos péptidos para verificar su inmunogenicidad,

es decir, para que estas secuencias no solamente puedan reconocer sino producir

anticuerpos.

2. Llevar a cabo ensayos de Elisa con extractos de hoja de la planta de arroz, para

verificar si es posible la identificación de la proteína de estudio por este medio

inmunoenzimático.


A. Anexo 1. Tabla de los 20 aminoácidos naturales

Tomado de:

http://chemwiki.ucdavis.edu/Wikitexts/University_of_California_Davis/UCD_Chem_115_Lab_Manual/Lab_7%3A_Ele

ctrospray_Mass_Spectrometry

45

B. Anexo 2. Solución de Ninhidrina y Azul de

Bromofenol

MONITOREO DEL ACOPLAMIENTO Y DESPROTECCION

El objetivo es verificar mediante una reacción calorimétrica el porcentaje de acople de cada

aminoácido en la síntesis de péptidos en fase sólida.

TEST DE KAISER

1. Preparar las siguientes soluciones:

1.1 Solución 1: Disolver 40 g de fenol p.a. en 10 mL de etanol absoluto y guardar

en un frasco ámbar y en un ambiente fresco).

1.2 Stock de KCN: Disolver 65 mg de KCN en 100 mL de agua.

1.3 Solución 2: Luego tomar 1 mL de esta solución y completar hasta 50 mL con

piridina (recién destilada sobre ninhidrina).

1.4 Solución A: Mezclar las soluciones 1 y 2 en proporción de volúmenes de 1:10 y

agitar. Almacenar en la oscuridad.

1.3 Solución B: Disolver 1.25 g de ninhidrina en 25 mL de etanol absoluto.

2. Colocar una pequeña cantidad de la resina-péptido a ensayar en el respectivo tubo

de ensayo.

3. Adicionar 3 gotas de A y 1 gota de B y agite

4. Realizar un blanco de reactivos.

5. Calentar los tubos de ensayo en un bloque de calentamiento por 3 minutos a 100ºC.

6. Resultados:

a. Resina-péptido y solución azul a verdosa: ensayo positivo.

b. Resina-péptido incolora: ensayo negativo.


AZUL DE BROMOFENOL

1. Preparar la siguiente solución:

1.1 Disolver 0.25 g de azul de bromofenol en 25 mL de DMF.

2. Colocar una pequeña cantidad de resina-péptido en un tubo de microcentrífuga de 0.6 mL.

3. Adicionar 5 gotas de la solución del reactivo, agite y observe.

4. Resultados:

a. Resina-péptido y solución azul a verdosa: ensayo positivo.

b. Resina-péptido incolora: ensayo negativo.

47

C. Anexo 3. Grupos Protectores, Resinas y Brazos

Espaciadores


Bibliografía

1. FEDERACION NACIONAL DE ARROCEROS (FEDEARROZ) FNDA.

FEDEARROZ y Universidad Nacional construyen las bases de la investigación en lineas

transgénicas de arroz. ARROZ. Septiembre-Octubre 2010;58(488).

2. Cárdenas RM, Pérez N, Cristo E, González MC, Fabré L. Estudio sobre el

comportamiento de líneas y variedades de arroz (Oryza sativa Lin.) ante la infección por el

hongo Pyricularia grisea Sacc. Cultivos Tropicales. 2005;26(4):83-7.

3. Pantoja A FA, Correa F, Sanint L, Ramirez A. . MIP en Arroz: Manejo integrado de

plagas; Artrópodos, enfermedades y malezas. Cali Colombia & Caracas Venezuela.: CIAT,

FEDEARROZ & FLAR; 1997.

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