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Diseño, síntesis y caracterización de complejos enjaulados

de ácido γ-amino butírico de baja toxicidad para aplicaciones en

electrofisiología.

TESIS DE LICENCIATURA

Autora: María Gabriela Noval

Director: Roberto Etchenique

Director Asistente: Luís Baraldo

Laboratorio de Dispositivos Moleculares

Instituto de Química-Física de Materiales, Medio Ambiente y Energía

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Universidad de Buenos Aires

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

Buenos Aires, Abril 2010

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1 RESUMEN

Los compuestos enjaulados, son entidades capaces de liberar moléculas al ser

irradiados con luz. Esta estrategia permite liberar un compuesto con precisión espacio

temporal. En particular, los complejos enjaulados de neurotransmisores son muy

utilizados en la elucidación de la dinámica de estructuras biológicas como circuitos

neuronales, estudios cinéticos rápidos en canales iónicos, mapeo de receptores, etc.

En nuestro laboratorio se desarrollan complejos enjaulados de base rutenio-

bipiridina que poseen moléculas bioactivas coordinadas, que son liberadas luego de ser

irradiadas con luz (un fotón de luz visible o dos fotones de infrarrojo). Principalmente

se enjaulan neurotransmisores como ácido γ-amino butírico (GABA), glutamato,

glicina, entre otros y moléculas con actividad modulatoria en el sistema nervioso como

nicotina. El GABA es el principal neurotransmisor inhibitorio del sistema nervioso

central en adultos. Tiene una gran importancia fisiológica, principalmente porque los

receptores GABAérgicos ionotrópicos son modulados por fármacos de uso clínico en

síndromes como epilepsia.

En este trabajo se realizó el diseño, síntesis y caracterización de compuestos

enjaulados de GABA basados en rutenio, de baja lipofilicidad. Se logró obtener una

familia de complejos de gran efectividad en la liberación del neurotransmisor en

preparados biológicos, con alta eficiencia cuántica y baja toxicidad. Se realizó un

ensayo funcional en un sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis;

expresando receptores de GABAc. Finalmente, se logró comprender alguno de los

mecanismos que regulan la toxicidad de los complejos.

Palabras clave: Complejos enjaulados de GABA-complejos de rutenio-receptores

GABAérgicos-sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis.

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2 INTRODUCCIÓN

En el constante desarrollo de herramientas para la realización de experimentos,

un criterio importante a tener en cuenta es, por ejemplo, qué precisión espacial puede

lograrse en la aplicación de un estímulo o tratamiento a una célula o a un organismo.

Para poder tener un control espacio-temporal y para aumentar la selectividad de ciertos

efectos que son causados por compuestos biológicamente activos (neurotransmisores,

hormonas, metabolitos, segundos mensajeros, etc) una estrategia posible es poner al

compuesto bajo el control de una señal, de manera de “activarlo” en el momento y

región del preparado que se desee.

A principios de los años 70 se comenzó a desarrollar una nueva familia de

compuestos orgánicos derivados de moléculas de interés biológico, que permiten la

liberación selectiva de la misma, cuando se las irradia con luz.

2.1 Compuestos enjaulados

En la figura 1.1 se observa un esquema de la primera molécula enjaulada

desarrollada en 1978 por Hoffman (Kaplan, 1978), un derivado del Adenosin trifosfato

(ATP).

.

Figura 1.1. Esquema de la reacción de fotólisis del primer compuesto enjaulado publicado en

literatura (Tomado de Kaplan, 1978).

Complejo enjaulado de ATP

Molécula con actividad biológica

(enjaulado)

Grupo protector

(jaula)

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El término “compuesto enjaulado” (caged compound) fue probablemente usado

por primera vez por J. F. Hoffman (Kaplan, 1978). Un compuesto enjaulado es una

molécula orgánica que está compuesta por dos partes, un grupo protector fotolábil

(jaula) y una molécula con actividad biológica (enjaulado). Cuando las dos partes se

encuentran unidas, la molécula biológica en cuestión no presenta actividad. Al irradiar

con luz, el grupo protector es removido irreversiblemente, con la concomitante

activación de la molécula con actividad biológica.

Idealmente, los compuestos enjaulados deben ser moléculas con alta solubilidad

en agua, resistentes a la hidrólisis y a cualquier proceso de ruptura no activado por luz.

Sus productos de fotólisis no deben ser tóxicos ni interactuar con el sistema biológico y

la fotólisis debe ocurrir con fotones de baja energía (preferentemente en el rango de luz

visible), de manera que la irradiación no sea nociva para la célula (Givens, 1998).

Este tipo de herramienta se utiliza en experimentos biológicos para generar

concentraciones efectivas de una sustancia en un punto determinado del espacio y en un

tiempo dado. Estos compuestos, hasta el momento, representan la mejor herramienta

para el estudio de cinéticas de receptores, el mapeo de receptores, el mapeo de circuitos

neuronales, entre otros (Corrie, 1992; Yoshimura, 2005; Rial Verde, 2008).

Los grupos protectores más utilizados para el diseño de compuestos enjaulados

son los basados en ésteres de nitrobencilo (ONB) (McCray, 1989) y en 4,5-dimetoxi-2-

nitrobencilo (DMNB) (Patchomik, 1970). Éstos son fáciles de sintetizar y son

compatibles con muchos grupos funcionales (carboxilatos, amidas, aminas, grupos

hidroxilo y fosfatos) permitiendo entonces enjaular una amplia variedad de moléculas.

En las últimas décadas, se ha logrado enjaular una gran variedad de

neurotransmisores, aminoácidos y segundos mensajeros, lo cual generó grandes avances

en el campo de la neurobiología (Kiskin, 2002).

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En la Tabla 1.1 se listan algunos de los compuestos obtenidos a partir de éstas

jaulas, su eficiencia cuántica (φ) y su absortividad molar (ε). La eficiencia cuántica se

puede definir como el número de enjaulado liberado por cada fotón de luz absorbido. Es

particularmente importante el producto de estas dos cantidades, εφ, que define la

sensibilidad efectiva del compuesto.

Tabla 1.1. Características fisicoquímicas de los compuestos enjaulados con jaulas orgánicas.

(Adaptada de Mamotake, 2006).

Es importante destacar que todos los compuestos sintetizados hasta el momento

necesitan absorber luz entre 300 y 350 nm para poder liberar el enjaulado (Momotake,

2006). A longitudes de onda mayores a 350 nm, estos compuestos, absorben débilmente

siendo necesario irradiar con luz UV para que ocurra la ruptura del enlace entre el

enjaulado y el grupo protector. En la figura 1 del ANEXO, se muestra el espectro de luz

UV y de luz visible con sus respectivas longitudes de onda.

El uso de la luz UV en experimentos biológicos presenta muchas desventajas,

entre ellas podemos destacar:

• Altamente mutagénica. La luz UV es un mutágeno físico muy potente,

porque las bases púricas o pirimidínicas del DNA absorben fuertemente

Grupo protector Enjaulado ε ε ε ε (absortividad molar) εφεφεφεφ

Nitrobencilo ATP 430 0,63

IP3 430 0,65

glutamato 500 0,14

Calcio (Ca2+) 970 0,20

DMNB ATP 5000 0,07

cAPM 5000 0,05

5500 0,012Calcio (Ca2+)

φ φ φ φ (eficiencia cuántica)

271

280

70

194

350

250

66

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luz del rango del UV (254-260 nm). Esta absorción produce dímeros de

pirimidinas lo cual puede generar mutaciones puntuales (Wees, 2007).

• Desencadena mecanismos de respuesta a estrés.

• La alta dispersión que presenta en los tejidos biológicos y, por lo

tanto, su baja penetrancia. Este tipo de luz es de baja penetrancia, por

lo que representa un problema cuando se quiere utilizar los complejos en

experimentos con tejidos u órganos enteros, como ganglios de

sanguijuela o sobre rodajas de cerebro.

• Costos de equipamiento. Los equipos son muchos más caros que los

utilizados para los experimentos con luz visible (Zayat, 2008).

Por otro lado, cuando estos compuestos son fotolizados generan como producto

de reacción un nitrosaldehido que es altamente tóxico para sistemas biológicos

(Pelliccioli, 2002; Corrie, 2003).

Para disminuir la energía necesaria para liberar el enjaulado, una opción es el

uso de compuestos de coordinación, donde la molécula con actividad biológica actúa

como ligando del complejo. Hoy en día se conocen numerosos complejos que pueden

sufrir rupturas heterolíticas cuando son irradiados con luz de baja energía, en el rango

de la luz visible (Balzani, 1970).

2.2 Complejos de rutenio como “jaulas”

Dentro de los complejos sintetizados a partir de metales de transición, los

complejos de rutenio, son los más estudiados desde el punto de vista fotoquímico en los

últimos tiempos. Estos complejos presentan elevada estabilidad química, una gran

reactividad en el estado excitado y absorben energía en el rango de la luz visible.

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Los compuestos de coordinación generalmente están constituidos por un átomo

metálico central alrededor del cual se disponen una serie de ligandos. El enlace entre el

centro metálico y los ligandos se da a través de uniones de coordinación, en las que el

ligando aporta la mayor parte de la densidad electrónica.

Se denomina ligando, a las moléculas que forman uniones de coordinación con

un metal. Estas deben poseer un par de electrones libres para formar dicha unión. Según

el número de átomos donores de electrones que posea la molécula puede clasificarse en

ligando monodentado o polidentado. Los ligandos monodentados poseen un único

átomo donor de electrones capaz de formar una unión con el metal, mientras que los

polidentados poseen más de un átomo donor. (Housecroft, 2005)

En estos compuestos, en particular en los complejos de polipiridinas de Ru (II),

el Ru (II) es el metal central y establece interacciones electrostáticas con ligandos que se

disponen a su alrededor. Como el número de coordinación más común para el Ru (II) es

seis, éste suele formar un complejo hexacoordinado octaédrico como se muestra en la

figura 1.2.

Figura 1.2. Estructura del [Ru(bpy)3]2+

. El átomo de metal central de Ru(II) se encuentra

hexacoordinado. Como ligandos contiene tres bipiridinas, adoptando una conformación

octaédrica.

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Las seis posiciones del Ru(II) pueden ser ocupadas tanto por ligandos

monodentados como por ligandos polidentados (Cotton, 1999). Como ejemplos de

estos, se pueden citar el cloruro, aminas y fosfinas (monodentados), la bipiridina

(bidentado), el tris(pirazolil)metano y la terpiridina (tridentado), etc. En la figura 1.3 se

puede observar la estructura química de algunos de ellos.

Figura 1.3. Ejemplos de ligandos monodentados, bidentados y tridentados coordinables a Ru

(II). En color se marca el átomo donor de electrones para cada ligando.

En la tabla 1.2 se muestra la eficiencia cuántica de fotoliberación para un

ligando monodentado piridina (py) y para un ligando bidentado bipiridina (bpy) en

complejos similares (Durham, 1982). Se puede observar que cuando el ligando es

bidentado, la eficiencia cuántica de fotoliberación en agua es cercana a cero, mientras

que para un ligando monodentado como la piridina es aproximadamente de 0,3, es decir,

30%. Esto indica, que los ligandos monodentados son liberados más fácilmente que los

ligandos polidentados.

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Tabla 1.2. Eficiencias cuánticas de fotoliberación de ligandos monodentados y ligandos

bidentados. En rojo se indican los valores correspondientes a las eficiencias cuánticas medidas

en agua a una longitud de onda de irradiación 436 nm. Ru(bpy)2(py)22+

libera piridina (py) y

Ru(bpy)32+

libera bipiridina (bpy).( Adaptado de Durham, 1982).

Como se mencionó previamente, una de las características principales de los

complejos de Ru-bipiridina es su capacidad de absorber energía en el rango de luz

visible. En la figura 1.4 se observa el espectro de barrido de absorción del complejo

[Ru(bpy)3]2+ en agua. La banda de absorción entre 400 y 500 nm corresponde a la banda

de transferencia de carga metal ligando (MLCT, por sus siglas en inglés).

Figura 1.4. Espectro de absorción del complejo [Ru(bpy)3]2+

en agua. En los ejes se representa

ε (absortividad molar) vs λ (longitud de onda).

Complejo medio φ φ φ φ (eficiencia cuántica)

Ru(bpy)2(py)22+ CHCl2 0,3

H2O 0,3

0,068

0,000021

CHCl2

H2O (0,1 M HCl)

Ru(bpy)32+

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En la figura 1.5 se muestra un diagrama de estados excitados para este tipo de

complejos. La banda MLCT representa la transferencia de un electrón en el estado

excitado desde el orbital πM (orbital pi del metal) al orbital π*L (orbital pi del ligando).

Desde éste estado, el electrón puede volver al estado basal de forma radiativa, no

radiativa o decaer a un estado de menor energía 3MLCT. Si la energía es suficiente,

desde el estado 3MLCT se puede poblar otro estado de mayor energía llamado d-d, en

donde la carga electrónica está centrada en el metal (MC), conduciéndose a la

disociación de los ligandos coordinados al mismo (Housecroft, 2nd Ed.). Esta

disociación se da principalmente porque esta transición implica la población de orbitales

no enlazantes.

A menor diferencia de energía (∆E) entre los estados 3MLCT y d-d mayor será

la probabilidad de que este último se pueble, y con ello mayor será la participación de

este en la relajación del estado excitado, produciendo la formación de fotoproductos

provenientes de la disociación del complejo. Las energías relativas de estos estados

dependen de la combinación de ligandos en la esfera de coordinación y de su capacidad

de modificar la densidad electrónica sobre el metal.

Figura 1.5. Diagrama de los estados excitados de baja energía de compuestos del tipo Ru-bipiridina. Las flechas verticales lisas y punteadas indican los decaimientos radiativos y no

ratiativos respectivamente de cada uno de los estados excitados.

∆EFOTOPRODUCTOS

Coordenada de reacción

Ene

rgía

1MLCT

3MLCT

d-d

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Los ligandos aceptores, reducen la densidad electrónica sobre el metal y

producen el corrimiento de la banda MLCT hacia longitudes de onda menores (mayor

energía), mientras que los ligandos donores corren la banda MLCT hacia longitudes de

onda mayores (menor energía). Un ejemplo de este comportamiento, se observa para la

familia de compuestos [Ru(bpy)2XY] donde Y=Cl- y X = trifenilfosfina o Cl-. La

trifenilfosfina (PPh3) es un ligando de características π-aceptor, el cual produce el

corrimiento de la banda hacia longitudes de onda menores comparado con el cloruro

que tiene características donoras, lo que provoca un corrimiento de la banda MLCT

hacia longitudes de onda mayores.

Finalmente la posición de la banda MLCT influye fuertemente en el potencial

redox de la cupla Ru3+/Ru2+ del complejo y en la eficiencia cuántica de fotoliberación

(Pinnik, 1984). Los ligandos más donores estabilizan el estado Ru3+ y por lo tanto bajan

el potencial de reducción de la cupla.

Debido a estas características que presentan los complejos de rutenio-bipiridina,

en donde según el tipo de ligando se puede modificar la posición de la banda MLCT y

su eficiencia cuántica, es que se los comenzó a utilizar como jaulas inorgánicas, para

permitir la liberación de un ligando con actividad biológica (Zayat, 2003; Zayat, 2006).

2.3 El neurotransmisor ácido γγγγ-amino butirico

El ácido γ-amino butírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio del

sistema nervioso central en vertebrados adultos (Zhang, 2001). Es un derivado del ácido

glutámico que se origina por la descarboxilación del mismo mediante una reacción

enzimática catalizada por la enzima L- ácido glutámico descarboxilasa (GAD, por sus

siglas en ingles; Hong Jin, 2003).

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En las neuronas del sistema nervioso existen dos familias de receptores para este

ligando:

• RECEPTORES IONOTRÓPICOS: Canales de cloruro (Cl-). (GABAA y

GABAC).

• RECEPTORES METABOTRÓPICOS: Receptores acoplados a proteína G.

(GABAB).

Los receptores ionotrópicos son proteínas pentaméricas que forman canales

iónicos. En condiciones fisiológicas, GABA actúa generando un aumento de la

conductancia a Cl-. Esta corriente entrante hiperpolariza a las neuronas; llevando a la

membrana de la célula a voltajes más negativos. (Nota: En los párrafos referidos a

canales, el término “ligando” se utiliza en su acepción bioquímica. No se debe

confundir con el término “ligando” utilizado anteriormente en referencia a los

complejos de coordinación, situación en que existe un enlace mucho más fuerte.)

En particular los receptores GABAC representan una subclase de la familia de

receptores ionotrópicos, insensible a moduladores alostéricos como benzodiazepinas y

barbitúricos. Su localización incluye muchas regiones del cerebro como por ejemplo el

colículo superior, cerebelo, hipocampo y principalmente en neuronas de la retina. Se

caracterizan principalmente, por su alta sensibilidad a GABA ya que presentan una

concentración efectiva 50 (EC50) del orden de 1 µM. Se han descrito tres subunidades

constituyentes de éstos receptores (ρ1-3) las que podrían formar homómeros o

heterómeros (Zhang, 2001).

Se eligió GABA como molécula con actividad biológica dada su importancia

fisiológica. Principalmente porque los receptores GABAérgicos ionotrópicos son

modulados por fármacos de uso clínico como benzodiazepinas y barbitúricos. Estas

drogas son utilizadas en la clínica en síndromes como epilepsia y desórdenes de

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ansiedad. Además, debido a las características del ligando, la presencia de un grupo

amino (NH2) en el carbono γ permite su coordinación a iones de metales de transición,

por lo que se lo puede incorporar en complejos de Ru-bipiridina.

2.4 Complejos enjaulados de GABA

Hasta el momento, los complejos enjaulados de GABA obtenidos a partir de

jaulas orgánicas, siguen presentando como desventaja la necesidad de ser irradiados con

luz UV para poder liberar el enjaulado (Cürten, 2005; Gee, 1994).

En el laboratorio, se ha desarrollado, un complejo de GABA de base inorgánica,

a partir de jaulas de rutenio-bipiridina Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006), llamado a partir

de ahora bisGABA. Éste complejo tiene su máximo de absorbancia en 480 nm, lo cual

representa una gran ventaja, frente a los complejos comerciales, ya que permite la

fotoliberación de GABA irradiando con luz visible. Sin embargo, este complejo posee

una baja eficiencia cuántica de fotoliberación (Tabla 1.3).

Tabla 1.3. Distintos compuestos enjaulados de GABA presentes en la literatura.

Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006); BC204 (Cürten, 2005) ; O-CNB-GABA (Gee, 1994).

En la tabla 1.3 se listan las longitudes de onda de absorción (λabs), de irradiación

(λirrad) y la eficiencia cuántica de fotoliberación (φ) de varios complejos de GABA de

base orgánica comparados con Ru(bpy)2(GABA)2. La obtención de un compuesto

Compuesto λλλλ abs (nm) λλλλ irrad (nm) φφφφ eficiencia cuántica

BC204 17 348 300-400 0,4

O-CNB-GABA18 262 308 0,16

Ru(bpy)2(GABA)214 488 450 0,04

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enjaulado que libere GABA cuando se irradia con luz de baja energía, es un buen

antecedente para el desarrollo de nuevos compuestos enjaulados de GABA con mayor

eficiencia cuántica, en base a complejos de rutenio-bipiridina.

2.5 Biocompatibilidad de los complejos

Un punto importante a tener en cuenta en el desarrollo de dispositivos para

aplicación en sistemas biológicos es su biocompatibilidad, esto significa que el

compuesto utilizado debe interactuar lo menos posible con el sistema a estudiar.

Para poder monitorear éste efecto, uno de los abordajes a seguir es el análisis de

la capacidad que posee un compuestos para particionar en una mezcla 1:1 octanol agua.

La partición octanol agua (KOW) o su logaritmo (LogP) es la propiedad fisicoquímica

más utilizada y aceptada para predecir la interacción compuesto-membrana. Este

coeficiente puede tomar valores entre 10-3 y 107 y se considera relativamente

hidrofílico, si su KOW < 10 (Ikonen, 2009).

Por otro lado, es necesario probar su biocompatibilidad. Para ello se deben

realizar estudios de citotoxicidad. Éstos permiten determinar el porcentaje de viabilidad

luego de tratar el cultivo con una determinada concentración del compuesto en cuestión.

Los ensayos de citotoxicidad más utilizados son: el método de exclusión de Tripan blue

y el ensayo de MTT.

El MTT (Bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5- difeniltetazolico) es un

compuesto de coloración amarilla. Las células pueden internalizarlo y reducirlo

mediante la enzima succinato deshidrogenasa mitocondrial. El producto obtenido,

llamado formazan es insoluble y de color azul. La capacidad de las células para reducir

MTT a formazan es una medida de la viabilidad celular y un indicador de la integridad

mitocondrial. Por lo tanto, si se realiza el ensayo después de incubar con un compuesto

X, se permite evaluar la toxicidad del mismo (Jimenéz, 2007).

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Finalmente, para estudiar los posibles efectos de un compuesto sobre un cultivo

celular, se puede evaluar las variaciones morfológicas y comportamentales producidas

sobre el cultivo durante el tratamiento. Para evaluar esto, se puede utilizar microscopía

time lapse. Ésta técnica consiste en el monitoreo de un cultivo, mediante la toma de

fotos consecutivas del mismo. Los tiempos entre fotos pueden variar entre 1 segundo

hasta el tiempo que se desee. Luego, a partir del set de fotos y utilizando un sofware

adecuado, es posible analizar en tiempo real la evolución del ensayo en cultivo. De esta

manera se puede evaluar el comportamiento de un cultivo y sus distintos parámetros,

como por ejemplo, migración celular, variaciones en la morfología, adherencia, ciclo

celular, etc.

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3 HIPOTESIS Y OBJETIVOS

Resultados recientes de nuestro laboratorio indican que es posible la obtención

de complejos enjaulados de base inorgánica del tipo rutenio-bipiridina con excelentes

propiedades fisicoquímicas y biocompatibilidad.

Los complejos de Ru(bpy)2GABA2 obtenidos hasta el momento presentan una

baja eficiencia cuántica. La hipótesis principal de este trabajo es que el agregado de un

ligando monodentado con características π aceptoras como son las fosfinas producirá un

aumento en la eficiencia cuántica de fotoliberación, por el corrimiento de la banda

MLCT hacia regiones de mayor energía en el espectro de absorbancia. Por otra parte,

esta hipótesis principal sugiere que el uso de fosfinas como ligandos permitirá no solo

mejorar la eficiencia cuántica sino también, variando los sustituyentes, modificar la

lipofilicidad de los complejos y por lo tanto mejorar su biocompatibilidad, ya que

suponemos que al disminuir la lipofilicidad del complejo, disminuiremos su afinidad

por las membranas celulares mejorando mucho su compatibilidad con distintos cultivos

celulares.

El objetivo principal de éste trabajo es sintetizar un complejo enjaulado de GABA,

a partir de complejos de rutenio-bipiridina, que liberen al neurotransmisor con luz visible y

con una elevada eficiencia cuántica. Asimismo, se busca que el complejo obtenido no

resulte tóxico permitiendo ampliar su utilización a organismos vivos.

Los objetivos particulares implican probar el complejo en sistemas biológicos para

evaluar su funcionalidad, como también evaluar su toxicidad.

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4 MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Síntesis

Todos los reactivos comerciales fueron usados sin purificaciones adicionales. El

complejo precursor Ru(bpy)2Cl2 fue sintetizado de acuerdo a la literatura (Sullivan,

1978). Las fosfinas comerciales utilizadas fueron compradas en Aldrich. El resto de

disolventes y reactivos son de las marcas comerciales: Cicarelli, Aldrich y Fluka.

Todas las síntesis de los complejos salvo que se indique lo contrario fueron

realizadas sin controlar la atmosfera y fueron seguidas por espectroscopía UV-Visible.

4.1.1 Sulfonación de la trifenilfosfina (PPh3)

Na(m-TPPMS)

Se disolvieron 1,6 g de PPh3 en 6 mL de H2SO4/SO3 fumante. La mezcla se

calentó a 70 °C durante dos horas. Se detuvo la reacción enfriando la mezcla con hielo.

El ácido se tituló con 22 mL de NH4OH hasta pH=7, en este paso precipita la

trifenilfosfina que no reaccionó. Se filtró y el filtrado se llevó a seco en rotavap. El

sólido del fondo del balón fue redisuelto en etanol absoluto. Luego, se le agrego a la

disolución anterior 2 mL de solución saturada de NaCl y se dejó precipitar toda la noche

a 4 °C. Al día siguiente, se filtró y se llevó a seco en desecador.

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4.1.2 Cloro complejos

[RuB2(m-TPPMS)Cl]PF6

Se disolvieron 500 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 30 mL de una mezcla 1:1 etanol agua

y se calentó en reflujo durante media hora hasta formar el [Ru(bpy)2(H2O)Cl]+. Luego,

se agregaron 400 mg de Na(m-TPPMS) sólido. Luego de 90 minutos, se agregó 1

equivalentes respecto al cloruro de AgNO3, se detuvo la reacción y el etanol de la

mezcla de reacción fue evaporado en rotavap. La solución acuosa obtenida se filtró para

remover cualquier sólido y el filtrado se precipitó por el agregado de exceso de KPF6 a

0°C en medio básico y en hielo.

[RuB2TPPTSCl]PF6


y se calentó en reflujo durante media hasta formar el [Ru(bpy)2(H2O)Cl]+. Luego, se

adicionaron 400 mg de sal de sodio de trifenilfosfina-3,3',3''-tris ácido sulfónico

(Aldrich, 63995-70-0) y 20 ml HCl. Luego de 90 minutos, se quitó del reflujo y se

llevó a seco en rotavap. El sólido se redisolvió en etanol absoluto. Se agregó exceso de

KPF6 y se dejo precipitar el complejo en frío durante toda la noche. Al día siguiente, la

solución fue filtrada y el sólido obtenido fue secado en desecador.

[RuB2PMe3Cl]PF6 (Salierno, 2009).

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Se disolvieron 520 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 20 mL de una mezcla 1:1 metanol

agua y se calentó en reflujo durante media hora bajo atmósfera de N2, el control de la

atmosfera de nitrógeno es muy importante debido a la fuerte tendencia que presenta esta

fosfina para oxidarse. Se agregaron 1.2 mL de solución 1M trimetilfosfina en THF.

Luego de 90 minutos se detuvo la reacción, el metanol y el exceso de fosfina fueron

removidos en rotavap. La solución acuosa obtenida se filtró para remover cualquier

sólido y el filtrado se precipitó por agregado de exceso de una solución acuosa 0,5M

KPF6 a 0 °C. El sólido obtenido se secó en un desecador. Rendimiento: 93%.

A continuación se indican los desplazamientos químicos de las señales

correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear. Entre paréntesis

aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento (J), JH-H

indica el acoplamiento protón-protón, JH-P indica acoplamiento protón-fósforo y el

número de protones para los que integra respectivamente.

1H-NMR (500 MHz, D2O): δ = 1.07 (d, , 9H, JH-P = 8.8Hz); 7.10 (t, 1H, JH-H = 8Hz);

7.27 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 7.51 (d, 1H, JH-H = 6Hz); 7.71 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 7.75-7.82

(m, 2H); 7.86 (d, 1H, JH-H = 5Hz); 7.94 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 8.12 (t, 1H, JH-H = 8Hz);

8.19 (t, 1H, JH-H = 8Hz); 8.29 (d, 1H, JH-H = 7.5Hz); 8.42-8.53 (m, 3H); 9.19 (d, 1H, JH-

H = 5Hz); 9.45 (d, 1H, JH-H = 5Hz) ppm.

[RuB2PPhMe2Cl]PF6


y se calentó en reflujo durante 30 minutos en atmosfera de N2. Luego se agregaron 1.3

equivalentes respecto al complejo de cloro de una solución de PPhMe2 en THF. La

mezcla se calentó en reflujo durante 120 minutos. Luego se detuvo la reacción quitando

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del reflujo y la fosfina remanente y los restos de etanol fueron evaporados en rotavap.

La solución acuosa obtenida se filtró para remover cualquier sólido que no haya

reaccionado y el filtrado se precipitó por exceso de una solución acuosa de KPF6 0,5 M.

El sólido obtenido se secó en desecador.


correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear. Entre paréntesis




δH (500 MHz; C3D6O) 1.63 (d, 6H, JH-P=8.69), 7.14 (m, 4H), 7.24 (m, 2H), 7.39 (t, 1H,

JH-H=6.53), 7.47 (d, 1H, JH-H=4.09), 7.57 (t, 1H, JH-H=6.99), 7.75 (t, 1H, JH-H=7.08),

7.92 (t, 1H, JH-H=7.62), 8.05 (t, 2H, JH-H=8.16), 8.13 (t, 1H, JH-H=7.55), 8.19 (t, 1H, JH-

H=7.08), 8.51 (d,1H, JH-H=8.03), 8.56 (d, 1H, JH-H=8.03), 8.63 (d, 1H, JH-H=8.03), 8.68

(d, 1H, JH-H=7.55), 9.38 (d, 1H, JH-H=5.75), 9.46 (d, 1H, JH-H=5.7).

[RuB2PPh2MeCl]PF6

Se disolvieron 1,5 g de Ru(bpy)2Cl2 en 20 ml de una mezcla 1:1 etanol agua.

Luego se calentó en reflujo durante 30 minutos con atmosfera de N2. A la mezcla, se

agregaron 1.3 equivalentes de una solucion de PPh2Me en THF. La reacción se mantuvo

durante 120 minutos en reflujo. Luego se detuvo la reacción quitando del reflujo y la

fosfina remanente y los restos de etanol fueron evaporados en rotavap. La solución

acuosa obtenida se filtró para remover cualquier sólido que no haya reaccionado y el

filtrado fue precipitado por agregado de exceso de una solución acuosa de KPF6 a 0 °C.

El sólido obtenido se secó en un desecador.

21


correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear, entre paréntesis




δH (500 MHz; C3D6O) 1.65 (d, 3H, JH-P=8.20), 7.26 (t, 2H, JH-H=7.5), 7.5 (m,

10H), 7.83 (t,1H, JH-H=6.79), 8.01 (d, 1H, JH-H=6.41), 8.08 (t, 2H, JH-H=8.12), 8.16 (t,

2H, JH-H=7.9), 8.24 (t, 1H, JH-H=7.69), 8.31 (d, 1H, JH-H=7.69), 8.49 (d,1H, JH-H=8.12),

8.67 (d, 1H, JH-H=8.0), 8.71 (d, 1H, JH-H=7.69), 8.85 (d, 1H, JH-H=7.69), 9.09 (d, 1H,

JH-H=5.13), 9.49 (d, 1H, JH-H=5.55).

[Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl

Se disolvieron 680 mg de Ru(bpy)2Cl2 en 45 mL de metanol. Se agregaron 410

mg de trifenilfosfina en agitación. Luego se adicionaron 20 mL de agua y la mezcla se

calentó a reflujo por 120 minutos. Una vez finalizada la reacción se quitó de reflujo y se

llevó a seco en rotavap. El sólido se disolvió en 50 mL de acetona. Este procedimento

provocó la disolución del producto [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. Luego se mantuvo over night en

la heladera donde se produce la precipitación de [Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl. El sólido

obtenido fue lavado con tres porciones de acetona y una de éter etílico y secado.



aparecen la multiplicidad de la señal y el número de protones para los que integra

respectivamente.

22

δH (500 MHz; D2O) 6.84 (t, 1H), 7.19 (m, 6H), 7.24 (t, 1H), 7.25 (d, 1H), 7.29 (d, 1H),

7.31 (m, 3H), 7.33 (t, 1H), 7.39 (m, 6H), 7.43 (t, 1H), 7.73 (t, 1H), 7.99 (t, 1H), 8.12

(t,1H), 8.35 (d, 1H), 8.45 (d, 1H), 8.56 (d, 1H), 8.62 (d, 1H), 9.22 (dd, 2H).

4.1.3 Complejos de GABA

[RuB2(TPPTS)GABA]PF6

Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2(TPPTS)Cl]Cl en 10 mL de agua. La

mezcla, se calentó a 80°C durante 30 minutos. Luego se agregaron 60 mg de GABA en

13 ml de NaOH 1M, de manera que el pH de la mezcla este entre 10,5 y 11. Se calentó a

80 °C durante 90 minutos. La reacción se detuvo en hielo. Para precipitar las impurezas

se agregan 2 ml de una solución de KPF6 0,5 M a 0 °C. Se filtró y se lavó con agua

helada varias veces. Luego para la precipitación del complejo se agregaron 10 ml de la

solución de KPF6 y se llevo a pH= 2 con HCl. El sólido se dejó precipitar en heladera

toda la noche. Luego el sólido envuelto en papel aluminio, para proteger de la luz, fue

llevado a seco en desecador. Para una mayor pureza y eliminar el GABA libre se

purifica por columna de intercambio aniónico DEAE-Sephadex A-25 cargada con Cl- a

pH 9.

[RuB2PMe3GABA]PF6

Este complejo fue sintetizado previamente en el laboratorio por el Dr. Roberto

Etchenique.

23

Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2PMe3Cl]PF6 en 10 mL de una mezcla

acetona agua para intercambiar el ión con resina DOWEX-Cl. Se dejó evaporar la

acetona mientra se cambia el ión. Luego de realizar el cambio del contraión a cloruro, se

filtró la resina obteniendo una solución acuosa. Se calentó a 80°C la disolución acuosa

de [Ru(bpy)2PMe3Cl]Cl durante 30 minutos hasta obtener [Ru(bpy)2PMe3H2O]2+.

Luego se agregaron 100 mg de GABA en 6 mL de disolución de NaOH 1M. La mezcla

fue calentada a 80 °C durante 90 minutos. Las impurezas fueron precipitadas con 0.8

mL de KPF6 1M a 0 °C. Se filtró para eliminar lo insoluble. A la solución remanente, se

le agregó HCl 1M gota a gota en frio, hasta que comenzó a precipitar un sólido naranja.

Luego se filtró y se llevó el sólido, envuelto en papel aluminio, a seco en desecador.

Para una mayor pureza se purifica por columna de intercambio anionico DEAE-

Sephadex A-25 cargada con cloruro a pH 9.






δH (500 MHz; D2O) 1.08 (d, 9H, JH-P=8.55), 1.54 (m, 2H), 1.67 (m, 1H), 1.93 (m, 1H),

2.03 (m, 2H),3.58 (t ,1H, JH-H=11.54), 3.89 (t, 1H, JH-H=11.54), 7.12 (t, 1H, JH-H=6),

7.28 (t, 1H, JH-H=6.41), 7.49 (d, 1H, JH-H=5.56), 7.55 (d, 1H, JH-H=5.56), 7.73 (t, 1H,

JH-H=6),7.79 (t,1H, JH-H=6), 7.81 (t, 1H, JH-H=7.69), 7.97 (t, 1H, JH-H=7.69), 8.17 (t,

1H, JH-H=7.69), 8.22 (t, 1H, JH-H=7.69), 8.28 (d, 1H, JH-H=7.69), 8.42 (d,1H, JH-

H=7.69), 8.48 (d, 1H, JH-H=8.12), 8.53 (d, 1H, JH-H=8.12), 8.91 (d, 1H, JH-H=5.56), 9.10

(d, 1H, JH-H=5.56).

24

[RuB2PPhMe2GABA]PF6

Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]PF6 en 10 ml una mezcla acetona

agua para intercambiar el ión con resina DOWEX-Cl. Se dejó evaporar la acetona

mientra se cambió el ión. Luego de realizar el cambio del contraión a cloruro, se filtró la

resina obteniendo una solución acuosa. Se calentó a 80 °C durante 30 minutos la

solución de [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]Cl hasta obtener [Ru(bpy)2PPhMe2H2O]2+. Luego se

agregaron 100 mg de GABA en 6 mL de solución de NaOH 1M, de manera que el pH

de la solución final oscile alrededor de 10,3 y 11. La mezcla se calentó durante 90

minutos a 80 °C. Una vez finalizada la reacción, se precipitaron las impurezas con 0.8

mL de KPF6 1M a 0 °C, se filtró y se eliminó la fracción insoluble. Luego se agregó a la

solución HCl 1M gota a gota en frio, hasta que comenzó a precipitar un sólido naranja.

Se filtró y se secó el sólido, envuelto en papel aluminio, para proteger de la luz. Para

una mayor pureza se purifica por columna de intercambio aniónico DEAE-Sephadex A-

25 cargada con cloruro a pH 9.






δH (500 MHz; C3D6O) 1.07 (d, 6H, JH-P=8.55), 1.58 (m, 2H), 1.60 (m, 1H), 1.98 (m,

1H), 2.04 (m, 2H), 3.59 (t ,1H, JH-H=11.54), 3.92 (t, 1H, JH-H=11.54), 6.68 (t, 2H, JH-

H=7.82), 6.99 (m, 3H), 7.14 (m, 2H), 7.29 (d, 1H, JH-H=5.87),7.35 (d,1H, JH-H=5.87),

7.53 (t, 1H, JH-H=7.34), 7.64 (t, 1H, JH-H=7.34), 7.7 (t, 1H, JH-H=6.36), 7.85 (t, 1H, JH-

25

H=7.82), 7.93 (t, 1H, JH-H=7.82), 8.02 (d,1H, JH-H=8.31), 8.07 (d, 1H, JH-H=7.82), 8.09

(d, 1H, JH-H=7.82), 8.30 (d, 1H, JH-H=8.31), 8.43 (d, 1H, JH-H=7.82), 8.69 (d, 1H, JH-

H=5.38), 9.11 (d, 1H, JH-H=5.38).

[RuB2PPh2MeGABA]PF6

Se disolvieron 100 mg de [Ru(bpy)2PPh2MeCl]PF6 en 10 mL de acetona para

intercambiar el ión con resina DOWEX-Cl. Se calentó durante 30 minutos a 80 °C la

solución acuosa de [Ru(bpy)2PPh2MeCl]Cl hasta obtener [Ru(bpy)2PPh2MeH2O]2+.

Luego se agregaron 100 mg de GABA en 6 mL de disolución de NaOH 1M, de manera

que el pH final de la mezcla oscile entre 10,3 y 11. Luego se calentó 90 minutos a 80

°C. Se precipitaron las impurezas con 0.8 mL de KPF6 1M a 0 °C, se filtró y se elimino

la fracción insoluble. Se agregó a la solución HCl 1M gota a gota en frio, hasta que

comenzó a precipitar un sólido naranja. Finalmente, se filtró y se llevó el sólido,

envuelto en papel aluminio, a seco. Para una mayor pureza se purifica por columna de

intercambio aniónico DEAE-Sephadex A-25 cargada con cloruro a pH 9

[RuB2PPh3GABA]PF6

Se disolvieron 110 mg de [Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl en 10 mL de agua. La mezcla se

calentó a 80°C durante 30 minutos hasta obtener [Ru(bpy)2PPh3H2O]2+. Luego se

agregaron 455 mg de GABA en 4.4 mL de solución de NaOH 1M, de manera que el pH

de la mezcla final oscile entre 10,3 y 11. Se calentó durante 90 minutos a 30 °C. El

complejo se precipitó con 0.8 mL de KPF6 1M a 0 °C, se filtró y se lavó con agua

helada varias veces. El sólido fue llevado, envuelto en papel aluminio para proteger de

26

la luz, a seco. Para una mayor pureza se purifica por columna de filtración cargada con

DEAE-Sephadex A-25 a pH 9. A continuación se indican los desplazamientos químicos

de las señales correspondientes al espectro de Resonancia Magnética Nuclear, entre

paréntesis aparecen la multiplicidad de la señal, el valor de la constante de acoplamiento

(J) y el número de protones para los que integra respectivamente.

δH (500 MHz; D2O)1.33 (m, 1H),1.43 (m, 1H), 1.49 (m, 1H), 1.78 (t, 2H), 1.82 (m, 1H),

3.16 (t, 1H), 3.55 (t, 1H), 7.15 (t,1H), 7.21 (m, 6H), 7.27 (t, 1H), 7.33 (m, 6J), 7.37 (t,

1H), 7.42 (d, 1H), 7.49 (m, 3H),7.6 (t, 1H), 7.85 (t, 1H), 7.9 (d, 1H), 8.01 (t, 1H), 8.02

(d, 1H), 8.13 (d, 1H), 8.22 (t,1H), 8.52 (d, 1H), 8.62 (d, 1H), 8.71 (d, 1H), 9.14 (d, 1H).

Las formaciones de los acuo-complejos como todas las síntesis aquí descriptas

fueron seguidas por espectroscopía UV-Vis.

4.2 Caracterización química: UV-visible (UV-Vis), fotólisis, Resonancia

Magnética Nuclear (RMN) , voltametría cíclica y partición octanol-agua.

Descripción de las técnicas utilizadas para la caracterizaciín química de los

complejos sintetizados.

4.2.1 UV-Vis y fotólisis

Los espectros de UV-Vis fueron obtenidos con un espectrofotómetro de arreglo

de diodos HP8453 (HewlettPackard).

27

Para determinar la eficiencia cuántica de fotodisociación, se midieron espectros

a diferentes tiempos de irradiación en solución acuosa, utilizando una cubeta de cuarzo.

Las irradiaciones fueron hechas con un LED LXHLLR3C a 455 nm (Luxeon Star

LEDs), tomadas cada 10 segundos de irradiación en agitación continua. La potencia de

la luz fue medida en una fotólisis patrón usando una solución de [Ru(bpy)2(py)2]2+

como referencia y considerando una eficiencia cuántica de fotosustitución de 0.26

(Pinnik, 1984). A partir de los espectros de absorción entre 300 y 700 nm, y conociendo

los espectros de las especies inicial y final, se obtuvo el grado de avance de la

fotorreacción para cada tiempo de irradiacion. Para los cálculos de la eficiencia cuántica

se utilizó una hoja de datos (ad-hoc).

4.2.2 Resonancia Magnética Nuclear

Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) se obtuvieron con

equipos Bruker Avance II 500. Para el análisis de los espectros se utilizó el software

MestreC 4.8.6.0.

4.2.3 Voltametría Cíclica

Los voltagramas se realizaron en acetonitrilo (CH3CN) agregando 0.1M de sal

de hexafluorofosfato de tetrabutilamonio (TBAPF6) como electrolito soporte. Se utilizó

un potenciostato de tres electrodos basado en un amplificador operacional TL071 en

configuración corriente-voltaje y un software teq3. Como electrodo de trabajo se utilizó

un electrodo de carbono vítreo. Como electrodo de referencia se utilizó un alambre de

28

Ag/AgCl y como contraelectrodo se utilizó un electrodo de platino. Los voltagramas

fueron todos referenciados al electrodo normal de hidrógeno (NHE).

4.2.1 Partición octanol-agua

Se prepararon disoluciones de los complejos entre 20 y 50 mM en PBS, de las

cuales se tomó 1 mL y se les agregó a 1 mL de n-octanol. Se mezclaron las fases por

agitación durante varios minutos y se dejó que la mezcla llegue al equilibrio. Luego de

60 minutos se centrifugó y se midió la absorbancia de cada una de las fases.

El coeficiente de partición (KOW) se obtuvo de dividir las absorbancias obtenidas

en la fase orgánica y la fase acuosa.

4.3 Set up Time-Lapse

Para los ensayos de seguimiento celular mediante microscopía Time-Lapse, se

utilizó un set up construido ad hoc en el laboratorio y se siguió el método descripto por

el Dr. Marcelo Salierno (Salierno, 2007; Salierno, 2009).

Se partió de células crecidas al 70 % de confluencia en cápsulas de pretri de 35

mm marca corning. Esta cápsula se colocó en el set up. Este set up consiste en un

sistema semi-abierto que mantiene constante la humedad, pH y osmolaridad, y por otro

lado permite, la entrada de una micropipeta para el agregado de una droga.

29

Figura 4.1. Corte transversal del sistema encapsulado, y la micropipeta por donde se

dosifican las drogas. La posición de la micropipeta es regulada por un micromanipulador.

(Tomado de Salierno, 2009).

Previo a los ensayos se procedió a realizar un seguimiento durante 60 minutos

como control, en donde solo fue dosificado medio de cultivo sin droga. Los distintos

experimentos fueron realizados luego de controlar el comportamiento normal del

cultivo.

4.4 Cultivos Celulares

Para los ensayos de citotoxicidad y los ensayos de viabilidad celular frente a la

incubación con los distintos complejos enjaulados, se utilizó la línea celular de hámster

Baby Hamster Kidney (BHK-21) provista por integrantes del grupo del Dr. Eduardo

Canepa.

4.4.1 Mantenimiento de la línea celular

Las células fueron crecidas en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

10% suero fetal bovino, 2 mM de glutamina y 1 mM de piruvato de sodio. Además se

les agregó al medio 100 µg/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y 250

30

ng/mL de anfotericina B. Estás células fueron mantenidas en estufas a 37 °C con

suministro de 5% de carbógeno.

4.5 Ensayo de toxicidad MTT

4.5.1 Preparación del material

Se plaquearon 4 placas de ELISA con 3.104 células BHK/pocillo con medio de

cultivo DMEM. Las placas se mantuvieron en estufa a 37 °C con suministro de

carbógeno durante 24 horas.

4.5.2 Desarrollo experimental

En el momento de realizar el experimento, se retiró el medio de cultivo de cada

pocillo y se agregó en su lugar 200 µl de las soluciones seriadas 1 mM, 500 µM, 100

µM y 10 µM de cada uno de los siguientes complejos: [RuB2PMe3Cl]PF6,

[RuB2PPhMe2Cl]PF6, [RuB2PPh2MeCl]PF6 y [RuB2PPh3Cl]PF6, diluidos a partir de

soluciones madre de 5 mM en DMEM. Las disoluciones madre fueron obtenidas a partir

de la disolución de los sólidos en PBS (Buffer fosfato de sodio). Los tiempos de

incubación fueron 30 o 90 minutos. Se realizaron 3 controles experimentales:

incubación con DMEM solo en presencia y ausencia de MTT, con PBS solo en

presencia de MTT. Cada uno de los tratamientos fue realizado por octuplicado.

4.5.3 Método de MTT

31

Se partió de una solución madre 5 mg/ml de MTT (Invitrogen) disuelta en H2O

destilada, la cual fue diluida al décimo con medio de cultivo. A partir de ésta solución

0.5 mg/ml se realizó el ensayo. Se procedió a sacar de cada posillo el medio de cultivo,

se lavó con PBS y se agregó 200 µl de la solución anterior. Se dejó incubar durante 2

horas. Se quitó el MTT, se lavó con PBS y finalmente se procedió a resuspender el

colorante con Etanol 96°. Se dejó en oscuridad durante 15 minutos y se leyó la

absorbancia de cada placa en un lector de ELISA Sensident Scan, Merck a 590 nm.

4.5.4 Análisis estadístico

A los resultados obtenidos se les realizó un ANOVA de un factor seguida de un

test de Tukey, utilizando el software GraphPad Prism.

4.6 Experimento con ovocitos de Xenopus laevis.

Es importante aclarar que la preparación de los ovocitos y el manejo del set up

de electrofisiología fue realizado por integrantes del grupo del Dr Daniel Calvo.

4.6.1 Preparación del material

Se expresaron heterólogamente receptores homoméricos GABAc ρ1 en ovocitos

de ranas de la especie Xenopus laevis. Los animales se anestesiaron utilizando MS-222

al 1%, los ovarios se aislaron quirúrgicamente y los ovocitos se separaron manualmente

con forceps. El ARNm codificante para las subunidades ρ1 del receptor de GABAC se

sintetizó in vitro utilizando un kit de transcripción (Ambion message-machine T7). El

ARNm se inyectó en los ovocitos con un microinyector manual (Drummond) montado

32

en un micromanipulador. A las 24hs se trataron las células con 0.5 mg/ml colagenasa

(en 96mM NaCl, 2mM KCl, 5mM HEPES,1.8mM MgCl2, pH 7.5). Después de tres

días de incubación a 17°C los ovocitos se colocaron en una cámara de superfusión

continua (10ml / min) en solución normal de Ringer para rana: 115mM NaCl, 2mM

KCl, 1.8mM CaCl2, 1,8mM MgCl2, 5mM HEPES, pH 7.0.

4.6.2 Electrofisiología

Los registros electrofisiológicos se llevaron a cabo utilizando la técnica de

fijación de voltaje con dos electrodos (amplificador Axoclamp 2B) y se adquirieron con

el programa pClamp (Axon Instruments). El potencial de membrana de los ovocitos se

fijó en -70mV.

El estudio de la respuesta al GABA se examinó mediante el agregado de una

solución de complejo enjaulado de GABA (disueltos en DMSO) de manera de obtener

una concentración final de 30 µM. La liberación del GABA enjaulado se hizo

irradiando con flashes de luz blanca directamente sobre el baño. Los datos fueron

almacenados en una computadora y analizados con el Origin Lab 8.0.

33

5 RESULTADOS

5.1 Síntesis, caracterización, estudio de toxicidad y estudiosfuncionales en ovocitos de Xenopus laevis del complejo[Ru(bpy)2PPh3GABA]+.

Para poder cumplir este objetivo, se eligió trabajar con complejos de rutenio-

bipiridina de la forma [Ru(bpy)2XY]n+ donde X representa a la trifenilfosfina (ligando

monodentado) e Y representa la posición ocupada por el GABA. Se eligió modificar el

complejo y trabajar con trifenilfosfina (PPh3) principalmente porque éste ligando

presenta un elevado carácter π-aceptor y por lo tanto por teoría se espera que el uso de

este tipo de ligando lleve a un aumento en la eficiencia cuántica de liberación de los

complejos, con respecto a lo observado en los complejos de bisGABA.

5.1.1 [Ru(bpy)2PPh3Cl]Cl (cloro-complejo a partir de trifenilfosfina)

Como primer paso, se sintetizó el complejo de rutenio-bipiridina

[Ru(bpy)2XY]n+, en donde X= PPh3 e Y=Cl. Como todos los ligandos aceptores, la

trifenilfosfina reduce la densidad electrónica sobre el metal provocando el corrimiento

de la banda MLCT hacia longitudes de onda de mayor energía..

La síntesis se realizó según lo indicado en materiales y métodos y la identidad

del complejo se verifico mediante 1H-RMN.

La tabla 5.1 lista los resultados obtenidos en la caracterización del complejo.

Tabla 5.1 Valores correspondientes a la caracterización química del complejo. Las medidas

fueron realizadas a 298 ºK.

17

Compuesto λλλλ abs (nm) E1/2 (Volts)

[Ru(bpy)2PPh3Cl]+ 456 1,24

ε ε ε ε (M-1 cm-1)

6200

KOW

34

En la tabla se observan los valores correspondientes al máximo de absorción del

complejo (máximo MLCT) y la absortividad molar, medidas en agua, el potencial redox

de la cupla Ru3+/Ru2+ medido en acetonitrilo y el coeficiente de partición octanol agua.

La partición de un compuesto entre dos fases puede verse afectada por distintos

factores como la concentración de sales en la fase acuosa, la temperatura, etc. Los

complejos enjualados se utilizan en medios biológicos como soluciones buffer con

elevada concentración de sales, por lo tanto, resulta necesario probar si hay efecto de la

fuerza iónica en la partición octanol agua. Para ello se analizó la partición octanol-PBS,

octanol-RINGER y octanol-agua destilada. Los resultados mostraron diferencias entre

los coeficientes obtenidos para agua destilada y los de soluciones salinas. Los

coeficientes obtenidos para soluciones salinas resultaron menores. Por lo tanto, debido a

esta observación y a las características de los medios biológicos todos los KOW

presentados en este trabajo fueron medidos en PBS.

5.1.2 [Ru(bpy)2PPh3GABA]+(complejo de GABA)

A partir del compuesto precursor [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, se prosiguió con la síntesis

del complejo de GABA. El compuesto obtenido fue analizado por 1H-RMN.

La figura 5.1 muestra el espectro de resonancia magnética nuclear obtenido para

el [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ en agua deuterada (D2O).

Se muestran dos secciones del espectro de 1H RMN, una correspondiente a la

región aromática (10-6 ppm) (figura 5.1 a) y otra correspondiente a la región alifática

(0- 6 ppm) (figura 5.1 b).

En la región aromática se observan las señales correspondientes a los protones

de las bipiridinas y a los de la trifenilfosfina. Se pueden ver 16 señales correspondientes

a los protones de las bipiridinas. Como en el complejo hay dos bipiridinas idénticas se

35

espera obtener 8 señales que integren para dos protones cada una. Esto no sucede

debido a que la trifenilfosfina como quinto ligando rompe la simetría del complejo y

permite la diferenciación de las bipiridinas.

La figura 5.1.b, muestra la región alifática del espectro, donde se observan las

señales de los protones correspondientes al GABA coordinado. Las señales A marcadas

en la figura son las producidas por los protones del grupo amino de la molécula y son

las que permiten identificar al GABA coordinado. Esto se debe a que cuando el GABA

no se halla coordinado, hay un continuo intercambio con el solvente deuterado y por lo

tanto, los protones del mismo no son detectados en el espectro.

36

Figura 5.1. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear de [Ru(bpy)2PPh3GABA]+

en D2O.

a .Región aromática del espectro (rosa). b. Región alifática del espectro (azul).

Para determinar la eficiencia cuántica en solución acuosa, se realizaron una serie

de registros, a distintos tiempos, de espectros de absorción luego de la irradiación con

un LED a 450 nm. En las figuras 5.2.a y b se observan los de espectros de absorción del

9,0 8,5 8,0 7,5 7,0

dd

d d

d

d t

t2t

d

d-t

3t

señales de la fosfina (integran para 15

protones)

señales de las bipiridinas(integran para 16 protones)

a

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0Desplazamiento quimico (ppm)

A A

C C´


D

B


A A

C C´


D

Bb

37

complejo obtenidos durante el proceso de fotólisis a dos valores de pH (pH=7 y

pH=12). En ambos casos se identificaron puntos isosbésticos, los cuales indican la

presencia de solo dos especies durante la fotolisis. La medición a pH=12 se realizó para

poder identificar de forma clara las dos especies que se forman, puesto que los

complejos de GABA y de acuo a pH fisiológico presentan espectros de absorción muy

similares.

Figura 5.2. Fotólisis del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ . En los detalles de las figuras se

muestra como disminuye la banda de absorción del complejo con GABA y aumenta la del acuo-

complejo. Las flechas negras indican la variación de los espectros a lo largo de la fotólisis.

300 400 500 600 700

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abso

rba

ncia

λ (nm)

a

b

300 400 500 600 700

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ab

sorb

an

cia

λ (nm)

b

aa

b

300 400 500 600 700

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ab

sorb

an

cia

λ (nm)

b

a

38

En la tabla 5.2 se detallan los valores correspondientes al máximo de

absorbancia (λmax), la absortividad molar (ε), la eficiencia cuántica (φ) medida a dos

valores de pH distintos y el coeficiente de partición octanol agua (KOW) del complejo de

GABA. Se observa que el máximo de absorción del complejo se halla en 424 nm,

correspondiendo a longitudes de onda dentro del rango de luz visible. El complejo

presentó una eficiencia cuántica de fotoliberación en agua, a pH fisiológico, del 48 %.

Por otra parte, el complejo de GABA presentó un coeficiente de partición

octanol agua un orden de magnitud menor que el obtenido para su complejo precursor

(el complejo [Ru(bpy)2PPh3Cl]+), indicando que este último sería la especie más

hidrofóbica.

Tabla 5.2 Caracterización química de [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. La fotoliberación se efectuó

irradiando con un Led de 450 nm. Todas las mediciones se realizaron a 298 K.

En este trabajo, además, se determinaron los potenciales redox de los complejos

empleando la voltametría cíclica. Esta técnica consiste en aplicar un barrido de

potencial directo e inverso a un electrodo de trabajo y analizar la variación de corriente.

En presencia de un proceso redox reversible (es decir si el proceso redox es rápido y no

hay reacciones químicas acopladas) se observan dos ondas, una para cada barrido cuyos

máximos distan 59 mV. Usualmente se informa el potencial medio (E1/2) que es el

promedio de los dos potenciales con corriente máxima denominados potencial de pico

(Ep). Este potencial es cercano al potencial estándar (E°) de la cupla redox. En cambio,

si el proceso es irreversible se observan dos picos separados o frecuentemente solo una

onda por lo que sólo se informa el Ep.

Compuesto λλλλ abs (nm) φφφφ (pH=7)

[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 424 0,48

ε ε ε ε (M-1 cm-1)

6400

KOW

0,26

φφφφ (pH=12)

0,42


[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 424 0,48

ε ε ε ε (M-1 cm-1)

6400

KOW

0,26

φφφφ (pH=12)

0,42

39

En la tabla 5.3 se listan los potenciales redox obtenidos para el complejo de

GABA. Se identificaron tres potenciales. El primer pico de oxidación corresponde a la

oxidación del rutenio coordinado al GABA, mientras que los otros dos picos se

atribuyen a compuestos que contienen los productos de la oxidación de la unión N-C en

el grupo amino.

El valor de estos potenciales es característico para cada complejo.

Tabla 5.3 Potenciales redox del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. Fueron realizados en

acetonitrilo y con TBAPF6 0,1 M como electrolito soporte. Medida realizada a 298 K y

referenciada a NHE. Los barridos de potencial fueron realizados desde 800 hasta 2200 mV.

E1/2 representa al potencial de media onda. Ep representa al potencial de pico.

Compuesto

[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 1,721,23

Ep(Volts) E1/2 (Volts) Ep (Volts)

1,87

40

5.1.3 Prueba de funcionalidad del complejo: Experimento en ovocitos de Xenopus

laevis.

Se realizaron los estudios de funcionalidad del complejo de GABA utilizando el

sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis; expresando receptores

de GABAc recombinantes de retina humana.

Estos estudios consistieron en mediciones de corrientes de Cl- utilizando la

técnica de Fijación de Voltaje con dos electrodos, luego de fotoliberar el complejo de

GABA. El potencial de membrana fue fijado en -70 mV. El set up de electrofisiología y

los ovocitos de Xenopus fueron provistos por el laboratorio de Daniel Calvo en el

INGEBI y el equipo fue operado por la Licenciada Cecilia Calero.

En la figura 5.3.a se muestra la respuesta control de receptores GABAc ρ1 en

presencia de GABA. La aplicación de concentraciones crecientes de GABA sobre estos

receptores evocó corrientes de cloruro entrantes. Dichas respuestas se incrementaron a

medida que se aumentó la concentración de GABA.

Es importante destacar, que debido a las concentraciones de cloro en el ovocito

el potencial de equilibrio para el mismo se halla cercano a 0 mV y por lo tanto cuando

se trata con GABA se observan corrientes entrantes.

La respuesta de los receptores GABAc ρ1 se caracteriza por poseer una cinética

lenta que no desensibiliza con la aplicación constante del agonista. Esta característica

permitió realizar curvas dosis-respuesta sin lavados intermedios. En la figura 5.3.a, se

pueden observar las respuestas escalonadas evocadas por concentraciones crecientes de

GABA.

41

Figura 5.3 Experimento de Fijación de Voltaje con dos electrodos en ovocitos de Xenopus

laevis que expresan receptores GABAc ρρρρ1. a. Curva dosis-respuesta control para GABA libre.

Se aplicaron concentraciones crecientes de neurotransmisor. b. Experimento con una solución

de 30 µM del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+

en Ringer irradiando con flashes.

Los trazos azules y rosas representan corrientes de Cl- mediadas por los receptores evocadas

por el GABA libre o el GABA liberado por luz.

50 mseg

flash

flashflash

flash

flashflash

flash

flash

lavado lavado lavadoflash

100 nA

50 mseg

flash

flashflash

flash

flashflash

flash

flash

lavado lavado lavadoflash

100 nA

50 mseg

100 nA

0,3 µM

1 µM

10 µM

30 µM

a

b

50 mseg

100 nA

50 mseg

100 nA

0,3 µM

1 µM

10 µM

30 µM

a

b

50 mseg

100 nA

Vm= - 70 mV

Vm= - 70 mV

42

Por otro lado, en la figura 5.3 b se muestran los resultados obtenidos luego de

agregar al medio 30µM de [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ y fotoliberar GABA en el medio.

Inicialmente, el complejo por si solo no evocó ningún tipo de respuesta. Esto podría

indicar que la solución del complejo no presenta GABA libre (es decir, que todo el

GABA de la muestra se encuentra coordinado al complejo) y que el complejo es

efectivo en el bloqueo de la actividad biológica del GABA cuando se encuentra

enjaulado. Cuando se irradió la muestra se obtuvieron registros escalonados similares al

control y con respuestas similares luego del lavado, pudiéndose repetir el experimento

varias veces sin que se modifique la respuesta.

Estos resultados muestran que el complejo obtenido posee la propiedad de

liberar GABA, sin presentar toxicidad aparente en el sistema utilizado, pudiendo

reproducir un comportamiento similar al de los receptores ante la presencia del

neurotransmisor libre.

Ensayos de citotoxicidad

Como se mencionó previamente, uno de los puntos más importantes en el diseño

de complejos enjualados es lograr que los productos secundarios de la fotoliberación de

la molécula con actividad biológica resulten inocuos para la célula. Para evaluar la

citotoxicidad de los complejos es necesario conocer cuáles son las especies que

intervienen durante la reacción, esto se muestra en el esquema de la figura 5.4.

43

Figura 5.4 Esquema de la fotólisis del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ en solución

fisiológica. En la imagen se muestran las especies que se forman durante el proceso.

Teniendo en cuenta la composición de los medios de cultivo y soluciones salinas

donde se realizan los experimentos electrofisiológicos, algunas de las especies

secundarias que pueden formarse son los acuo-complejos y los cloro-complejos. Si bien

estos últimos poseen una muy baja probabilidad de formarse, son más hidrofóbicos que

los acuo-complejos y por lo tanto son candidatos a poseer mayor toxicidad. Debido a

esto, y a la dificultad experimental que presenta poder obtener los acuo-complejos,

todos los ensayos de toxicidad presentados en este trabajo se realizaran a partir de los

cloro-complejos.

Esta elección, se basa en la hipótesis de que la toxicidad de estos compuestos

esta dada por su hidrofobicidad y por lo tanto con la probabilidad de interacción con las

44

membranas celulares. Entonces, partiendo de los cloro-complejos, se realizó un ensayo

de viabilidad por el método de MTT en células BHK-21. Se incubó a dos tiempos (30 y

90 minutos) y a distintas concentraciones. La selección de tiempos se realizó teniendo

en cuenta que la duración promedio de los registros electrofisiológicos es relativamente

corta, y rara vez se exceden los 60 minutos.

En la figura 5.5 a se muestran los resultados del ensayo de MTT luego de

incubar por 30 minutos con [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. A concentraciones de 1 mM, el

porcentaje de supervivencia es cero, esto indica que a esta concentración el complejo es

altamente tóxico al ser aplicado sobre un cultivo celular. En cambio, se puede ver que

concentraciones menores a 100 µM resultan inocuas, ya que no se detectan diferencias

significativas con respecto al control.

Por otro lado, la figura 5.5 b muestra resultados de los experimentos de 90

minutos de incubación. En esta figura, se observó que al igual que en el experimento de

30 minutos, a concentraciones de 1 mM de complejo se registran porcentajes de

supervivencia celular cercanos a cero. También, se vio que concentraciones menores a

100 µM resultan inocuas para los cultivos celulares, en los tiempos ensayados.

Además de las tres concentraciones medidas a los 30 minutos, en el experimento

de 90 minutos se midió toxicidad a una concentración de 500 µM. A esta concentración

el complejo presenta una elevada toxicidad, registrándose un 80% de mortalidad celular.

Este último resultado, mostró que para tiempos de incubación de 90 minutos, la

dosis letal de estos complejos se hallaría entre las concentraciones 500 y 100 µM.

45

Figura 5.5 Resultados del ensayo de citotoxicidad por el método de MTT. a. Experimento

incubando células con soluciones de 1mM, 100µM y 10 µM de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+

durante 30

minutos. b. Experimento incubando con soluciones de 1mM, 500µM, 100µM y 10 µM de

[Ru(bpy)2PPh3Cl] durante 90 minutos.***P<0.001 con respecto al grupo control.

También se monitoreó por microscopía time lapse las variaciones en el

comportamiento (migración, adherencia, división, etc.) de un cultivo de células BHK

antes y después de tratarlos con una solución tóxica del cloro-complejo (con una

concentración final de 500 µM). La dosificación fue realizada con pulsos de carbógeno

0

20

40

60

80

100

120

CONTRO

L

PPh3 1mM

PPh3 500uM

PPh3 100uM

PPh3 10uM

% d

e su

per

vive

nci

a

0

20

40

60

80

100

120

CONTROL

PPh3 1mM

PPh3 100uM

PPh3 10uM

% d

e su

per

vive

nci

a

******

a

b

***

46

a través de una micropipeta. En la figura 5.7 se muestran los resultados obtenidos en

este ensayo.

Figura 5.6 Estudio por microscopía time lapse del efecto de una concentración tóxica de

cloro complejo sobre el comportamiento del cultivo celular. Figuras a,b,c y d control con

medio dosificado con micropipeta .Figuras e, f, g y h agregado con micropipeta de 500µM de

cloro complejo.

50 µm

47

Los resultados obtenidos para el control y el tratamiento se muestran en los

siguientes videos:

CONTROL (http://www.youtube.com/watch?v=JWGU2AA8OjI)

TRATAMIENTO (http://www.youtube.com/watch?v=AF_yyxFb5Tc)

La figura 5.6 muestra una selección de imágenes a 0, 15, 30 y 60 minutos de

iniciado el experimento. La primera columna corresponde al control con medio y la

segunda al complejo de cloro.

Como la aplicación del complejo fue realizada puntualmente a través de una

micropipeta, solo las células dentro del campo de difusión de la misma se encuentran en

contacto con el complejo. Esto corresponde a un campo de un diámetro aproximado de

300 µm tomados desde la posición de la micropipeta.

De trabajos previos del laboratorio, se sabe que la pérdida de adherencia celular

luego de un tratamiento con un compuesto hidrofóbico, es un indicio de interacción con

la membrana celular (data not shown).

Se puede observar que a partir de 15 minutos de agregado de complejo las

células pierden adherencia solo en el campo de difusión de la micropipeta, comparado

con el control. Esta pérdida de adherencia se mantiene durante los 60 minutos del

experimento.

La elevada hidrofobicidad que le confieren los anillos aromáticos de las

bipiridinas y de la trifenilfosfina, pueden ser la causa de la toxicidad registrada de este

complejo, ya que podría interactuar con las membranas celulares.

Si bien los resultados obtenidos para los coeficientes de partición octanol:agua

sugieren cierta tendencia a particionar hacia la fase orgánica, no se puede afirmar que el

48

compuesto interactúe con las membranas a menos que se realice un ensayo directo

midiendo efecto del compuesto sobre la membrana.

El Doctor Leonardo Zayat estudió la interacción complejo-membrana en el

laboratorio de Rafael Yuste en la Universidad de Columbia, y demostró que al incubar

células piramidales de la capa 2/3 de corteza de cerebro de ratón con soluciones de 400

a 800 µM complejo de cloro hay una drástica reducción en la resistencia de la

membrana plasmática (ver figura 2 ANEXO) lo cual estaría confirmando la interacción

del complejo con las membranas celulares.

49

5.2 Diseño y síntesis de jaulas de rutenio a partir de fosfinassulfonadas.

Como hemos mencionado para el diseño de complejos enjaulados es sumamente

importante que ni el compuesto, ni ningún producto de la fotolisis interfieran con el

sistema de estudio. En particular los resultados de la sección 5.1 mostraron que el

complejo de trifenilfosfina, posiblemente por gran cantidad de añillos aromáticos,

interactuaba con las membranas celulares.

En la siguiente sección de la tesis, se modificaron las propiedades de los

complejos ([Ru(bpy)2XY]2+) sólo por la variación del ligando monodentado X. Para

ello, se exploró el campo de las fosfinas hidrofílicas. Para evitar los problemas

derivados de la lipofilicidad, se utilizaron trifenilfosfinas mono y tri sulfonadas. Estas

fosfinas poseen una estructura similar a la trifenilfosfina, planas y rígidas, por lo que se

espera que no modifiquen significativamente las propiedades fisicoquímicas del

complejo, principalmente la posición de la banda MLCT y por lo tanto su eficienciaa

cuántica.

5.2.1 Trifenilfosfina meta sulfonada (m-TPPMS): Derivatización de

trifenilfosfina, síntesis y ensayos de toxicidad.

Para hacer más hidrofílica la trifenilfosfina se decidió adicionar a los anillos

aromáticos sustituyentes sulfonilos (SO3-). Para ello, se realizó una reacción de

sulfonación sobre la trifenilfosfina con ácido sulfúrico fumante (H2SO4/SO3) en

condiciones controladas de tiempo y temperatura, de manera de obtener fosfinas

monosulfonadas.

La figura 5.7 muestra un esquema de la reacción de la sulfonación de la

trifenilfosfina. Se obtuvó trimetil fosfina monosulfonada en posición meta (m-TPPMS).

50

Figura 5.7 Esquema de reacción de sulfonación de la trifenilfosfina, empleado en este

trabajo para su derivatización.

Este ligando fue utilizado para sintetizar un complejo de cloro [Ru(bpy)2(m-

TPPMS)Cl]Cl. La tabla 5.4 muestra algunas de las características fisicoquímicas de

este complejo.

Tabla 5.4 Valores correspondientes a la caracterización química del complejo, medidas a

298 K. Se muestran el máximo de absorción del complejo (λλλλabs), el coeficiente de absortividad

molar (εεεε) y el potencial redox (E1/2).

Debido al efecto observado sobre la adherencia celular en la sección anterior,

producido por una concentración 500 µM de complejo de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. Se realizó

un estudio preliminar en cultivos celulares de BHK-21 por microscopía time lapse para

analizar el efecto del nuevo complejo sobre el comportamiento del cultivo.

El video del link http://www.youtube.com/watch?v=M3JCWSMUNZ4 muestra,

a diferencia de lo que se observó para el complejo [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, que el agregado

de [Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl]+ no produce pérdida adherencia del cultivo a

concentraciones nocivas (500 µM).

P P

SO3-

H2SO4 /SO32-


[Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl] 428 1,12

ε ε ε ε (M-1 cm-1)

4000

51

La figura 5.8 muestra una selección de fotos a 0, 15, 30 y 60 minutos de

dosificación de complejo. Se observa que no hay diferencias entre el cultivo tratado con

medio de cultivo (control) o el cultivo tratado con una solución de 500 µM de complejo

de [Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl]+, durante el tiempo que duro el experimento. Este resultado

muestra que la reducción de la hidrofobicidad del complejo, reduce la interferencia del

mismo en la pérdida de adherencia celular.

Finalmente, fue evaluada la funcionalidad del complejo, por el Dr Emiliano Rial

Verde en la Universidad de Columbia, en ensayos de corriente voltaje (I-V), sobre

células piramidales de rodajas de cerebro de ratón. El protocolo seguido para el

experimento I-V fue realizado según Thompson, 1989 (Figura 3 ANEXO). Los

resultados mostraron una reducción de la conductancia (g=6,68 nS) luego de tratar con

el cloro-complejo del compuesto monosulfonado y GABA, comparada con la obtenida

al tratar solo con GABA (g=18,67 nS). Estos resultados sugieren que el complejo se

comportaría como antagonista de los canales GABAA.

Frente a este resultado, resultó necesario seguir indagando sobre nuevos ligandos

para sintetizar los complejos.

52

Figura 5.8 Estudio por microscopía time lapse del efecto de una solución 500 µµµµM de cloro

complejo sobre el comportamiento del cultivo celular. Figuras a,b,c y d control con medio

dosificado con micropipeta . Figuras e, f, g y h agregado con micropipeta de 500µM de cloro

complejo.

53

5.2.2 Complejos a partir de trifenilfosfina trisulfonada (TPPTS).

Debido a los efectos antagonistas del complejo sintetizado en la sección anterior,

fue necesario probar con nuevas fosfinas. Se eligió una fosfina comercial (trifenilfosfina

trisulfonada) la cual está trisulfonada, es decir posee un grupo sulfonilo en cada fenilo.

En la figura 5.9 se muestra un esquema de éste ligando. Los tres sulfonilos elevan

significativamente la solubilidad de la fosfina en agua.

Figura 5.9 Esquema del ligando elegido para sintetizar el complejo.

Se siguieron los procedimientos de síntesis convencionales y se obtuvo tanto el

complejo de cloro como el complejo de GABA, ambos dos presentaron una elevada

solubilidad en H2O.

Sin embargo, debido a la baja basicidad de la fosfina el enlance Ru-P es débil

por lo que en el complejo de GABA [Ru(bpy)2TPPTSGABA]- la irradiación en 450 nm

resulta en la liberación de la fosfina en lugar del GABA. En la figura 5.9 se observan los

espectros de absorción, antes y después de irradiar con luz azul, del complejo

[Ru(bpy)2TPPTSGABA]-. La posición de la banda MLCT antes de irradiar corresponde

con el espectro UV característico del complejo de GABA, luego de irradiar se obtiene el

espectro característico del [Ru(bpy)2(H2O)GABA]+.

54

Este resultado indica que el ligando TPPTS no es adecuado para el diseño de

complejos que liberen GABA y la necesidad de seguir buscando nuevos ligandos.

Figura 5.9 Fotólisis del complejo [Ru(bpy)2TPPTSGABA]- con LED de 450 nm. La línea azul

representa el espectro del complejo antes de irradiar y la línea verde representa el espectro

luego de irradiar. La flecha indica el corrimiento del espectro luego de la fotólisis. Se muestra

un detalle de la reacción que ocurrió.

.

400 450 500 550 600 650 7000,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Ab

sorb

an

cia

λ (nm)

55

5.3 Complejos enjaulados de GABA sintetizados a partir demetilfosfinas comerciales.

De los resultados de la sección anterior, surge la necesidad de buscar nuevos

ligandos hidrofílicos, a partir de los cuales se pueda sintetizar complejos biocompatibles

con sistemas biológicos. Para esto, se decidió trabajar con una familia de fosfinas del

tipo metilfenilfosfinas comercializadas por Sigma Aldrich. Las fosfinas utilizadas

fueron dimetilfenilfosfina (PPhMe2) y difenilmetilfosfina (PPh2Me).

En esta sección se presentan los resultados de la caracterización química de cada

uno de los complejos sintetizados y los resultados de los ensayos de toxicidad. Además,

se presenta la caracterización química de los complejos de cloro y GABA ya

sintetizados en el laboratorio a partir de jaulas con trimetilfosfina como ligando

([Ru(bpy)2PMe3GABA]+).

5.3.1 Complejos de cloro

Se sintetizaron dos complejos de cloro: [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+ y

[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+, a partir de las fosfinas comerciales mencionadas previamente.

En la tabla 5.5 se listan los valores correspondientes al máximo de absorbancia

(λabs), absortividad molar (ε), potencial redox (E1/2) y constante de partición (KOW) de

los complejos obtenidos a partir de trimetilfosfina ([Ru(bpy)2PMe3Cl]+),

dimetilfenilfosfina ([Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+) y difenilmetilfosfina

([Ru(bpy)2PPh2MeCl]+).

56

Tabla 5.5 Valores correspondientes a la caracterización química del complejo, medidas a

298 °K.Se pueden observar tendencias en cuanto al número de fenilos de la fosfina y las

posiciones de la banda MLCT, potencial redox del metal y la partición octanol agua.

Las tendencias observadas para la posición de la banda MLCT y el potencial redox, se

deben a una disminución en la basicidad de la fosfina provocada por los fenilos. A

medida que aumentan los anillos aromáticos del ligando, disminuye su basicidad y esto

produce el corrimiento de la banda a longitudes de onda menores (de mayor energía),

registrando potenciales redox mayores.

En cuanto a la tendencia observada para el coeficiente de partición octanol agua,

se registró por cada fenilo del complejo un incremento en un orden de magnitud del

KOW, lo que indica un aumento en la hidrofobicidad de los complejos.

Los complejos obtenidos fueron analizados por 1H RMN, se detectó la presencia

de las señales características y sus correspondientes desplazamientos químicos. Estos

compuestos de cloro, debido al elevado número de anillos aromáticos que poseen en su

estructura, presentan la mayoría de sus señales desplazadas hacia la región aromática

del espectro (> 6 ppm), presentando en la región alifática únicamente las señales

correspondientes a los protones de los metilos.

Todos tienen en común las 16 señales correspondientes a las bipiridinas (8

dobletes y 8 tripletes), y las señales de los fenilos de las fosfinas, las cuales variarán

dependiendo del número de fenilos del complejo.


[Ru(bpy)2PMe3Cl]+ 456 1,12

ε ε ε ε (M-1 cm-1)

5200

KOW

0,03

[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+450 1,146600 0,22

[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+ 444 1,166800 1,1

57

5.3.2 Complejos de GABA

En la tabla 5.6 se observan las características principales de los tres complejos

de GABA obtenidos a partir de los cloro-complejos descriptos en la sección anterior.

Para la posición de la banda MLCT se observó la misma tendencia que para los cloro-

complejos.

Se midieron las eficiencias cuánticas a dos pH distintos, uno correspondiente al

pH fisiológico y otro a pH 12 (pH > pKb del GABA). Se pueden observar cierta

dependencia de la eficiencia cuántica con el pH.

Tabla 5.6 Valores correspondientes al la caracterización química de los complejos de GABA,

medidas a 298 K.

La tabla muestra también las KOW de los distintos complejos. Se puede ver que

por cada fenilo de la fosfina, hay un aumento en la hidrofobicidad.

Al igual que con los cloros complejos, los complejos de GABA fueron

analizados por RMN. La figura 5.12 muestra un espectro obtenido para el complejo

[Ru(bpy)2PMe3GABA]+, realizado en agua deuterada. En la figura, se observa la

asignación de las señales del complejo tanto de la región aromática como de la región

alifática del espectro.

En la región alifática se pueden ver las señales correspondientes a los protones

A, B, C y D del GABA coordinado. Las señales de los protones A, que son los protones

del grupo amino, son las que permiten identificar que el GABA se halla coordinado al


[Ru(bpy)2PMe3GABA]+ 446 0,10

ε ε ε ε (M-1 cm-1)

5300

KOW

<10-3

φφφφ (pH=12)

0,05

[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+444 0,176000 0,060,10

[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+431 0,305500 0,150,27

58

complejo, ya que en el caso del GABA libre estos protones tienen un gran intercambio

con los protones correspondientes al agua deuterada y por lo tanto no se observan.

Además, la posición de las señales del resto de protones de la cadena sufren

pequeños corrimientos, comparadas con las obtenidas para el GABA libre las cuáles se

pueden apreciar cuando se fotoliza la muestra.

59

Figura 5.12 Espectro de RMN de [Ru(bpy)2PMe3GABA]+ en agua deuterada. a Región

aromática del espectro con las señales características de las bipiridinas. b. Región alifática

donde se muestra el análisis de los protones del GABA.

9,2 8,8 8,4 8,0 7,6 7,2

señales de las bipiridinas(integran para 16 protones)

a

Ru

NMe

PMe

Me

NH

COO-

N

N


A A C C´

D D´

B

b

60

Además del análisis de las señales correspondientes a los protones de la

molécula, también se evaluó la liberación de GABA por irradiación. Para ello se realizó

RMN de los complejos de GABA en agua deuterada, y se irradiaron los tubos de RMN

para verificar la liberación del enjaulado. Se sometió la muestra a dos pasos de

irradiación-medición (50 y 200 pulsos de luz blanca) hasta lograr liberar todo el GABA

coordinado.

En la figura 5.13 se muestra el resultado obtenido luego de medir RMN antes de

irradiar y luego de la irradiación con 50 y 200 pulsos de luz blanca. Las señales

obtenidas en la región alifática del espectro luego de irradiar con 200 pulsos de luz se

corresponden con las señales de GABA libre, observando la desaparición de las señales

correspondientes a los protones coordinados. Las flechas rojas identifican las señales del

GABA coordinado y las flechas azules las del GABA libre.

61

Figura 5.13 Región alifática del espectro de 1H RMN del complejo [Ru(bpy)2PMe3GABA]

+

medido antes (a), y después de irradiar con 50 (b) y 200 (c) pulsos de luz.

Para la medición de las eficiencias cuánticas de fotoliberación en agua, que se

muestran en la tabla 5.6, se irradiaron a 450 nm soluciones acuosas de los distintos

complejos de GABA y se midió un espectro UV-vis inmediatamente después de cada

irradiación. Estas medidas fueron realizadas, como ya se mencionó, a dos pH distintos

(pH=7 fisiológico y pH= 12). La figura 5.14 muestra los resultados obtenidos para los

tres complejos analizados.

A la izquierda se pueden ver los resultados de las fotolísis realizadas a pH=7.

Para los tres compuestos se pueden ver puntos isosbésticos, los cuales determinan la

4 ,0 3 ,5 3 ,0 2 ,5 2 ,0 1 ,5D esp lazam ien to qu im ico (pp m )

4 ,0 3 ,5 3 ,0 2 ,5 2 ,0 1 ,5D esp lazam ien to qu im ico (pp m )

a

b

c

Señales delGABA libre

Señales delGABAcoordinado

62

existencia de solo dos especies en la reacción de fotoliberación (el complejo de GABA

y el acuo-complejo). A la derecha se muestran los resultados de las fotólisis a pH=12, se

observan grandes diferencia en los espectros de absorción de las dos especies

involucradas en la reacción. Esto se debe a que a pH básico el acuo-complejo pierde un

protón y se transforma en hidroxo-complejo, el cual absorbe a longitudes de onda

mayores.

En todos los casos las figuras muestran un recuadro insertado que muestra el

porcentaje de fotoconversión. Donde se representan los moles de GABA liberado por

moles de fotones absorbidos.

63

Figura 5.14. Fotólisis de los complejos (a) [Ru(bpy)2PMe3GABA]+, (b)

[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y (c) [Ru(bpy)2PPh2MeGABA]

+. A la izquierda fotolisis realizada a

pH=7, a la derecha fotólisis realizada a pH=12. Las flechas negras indican el aumento o la

disminución de las bandas durante la fotólisis.

350 400 450 500 550 600

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 1 2 3 4 5 6

50

100

150

200

250

300

350

GA

BA

lib

re(n

mol

)

Fotones absorbidos (µmol)

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% F

otoc

onve

rsió

n

Abs

orba

ncia

λ (nm)

350 400 450 500 550 600

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0,0 8,0x10-7

1,6x10-6

2,4x10-6

3,2x10-6

4,0x10-6

0,0

5,0x10-8

1,0x10-7

1,5x10-7

2,0x10-7

2,5x10-7

% d

e fo

toco

nver

sión

GA

BA

libr

e (m

oles

)

Fotones absorbidos (moles)

0

20

40

60

80

100

λ (nm)

Abs

orba

ncia

a

b

350 400 450 500 550 600

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

20

40

60

80

100

120

140

160

GA

BA

lib

re (

nmol

)


10

20

30

40

50

60

70

% f

otoc

onve

rsió

n

Abs

orba

ncia

λ (nm)

c

300 350 400 450 500 550 600 650 700

0,0

0,4

0,8

1,2

0,0 2,0x10-6

4,0x10-6

6,0x10-6

8,0x10-6

0,0

5,0x10-8

1,0x10-7

1,5x10-7

2,0x10-7

2,5x10-7

GA

BA

libr

e (m

oles

)

Fotones absorbidos (moles)

0

20

40

60

80

100

% d

e fo

toco

nver

sión

Abs

orba

ncia

λ (nm)

300 350 400 450 500 550 600 650 7000,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0,0 0,3 0,6 0,9 1,2

20

40

60

80

100

120

140

160

% f

otoc

onve

rsió

n

GA

BA

libr

e (n

mol

)


10

20

30

40

50

60

70

80

160160

Abs

orba

ncia

λ (nm)

300 350 400 450 500 550 600 650 700

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,50,0

0,4

0,8

1,2

1,6


% fo

toco

nver

sión

GA

BA

libr

e (n

mol

)

0

20

40

60

80

100

Abs

orba

ncia

λ (nm)

64

Por otro lado, se estudió mediante voltametría cíclica el comportamiento

electroquímico de los compuestos sintetizados. Para ello se realizó un barrido de

potencial desde 700 a 2200mV. Los resultados se muestran en la tabla 5.7 y los

voltagramas obtenidos se pueden ver en la figura 5.15.

Tabla 5.7 Potenciales redox los complejos de GABA medidos en acetonitrilo y con TBAPF6

0,1 M como electrolito soporte. Medida realizada a 298 °K y referenciada a NHE.

Estos complejos, al igual que el [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ presentan tres

picos característicos. El primer pico registrado corresponde a la oxidación del rutenio

coordinado al GABA, mientras que los otros dos picos se atribuyen a compuestos que

contienen los productos de la oxidación de la unión N-C en el grupo amino.

Se puede ver que en estos complejos el proceso redox de la cupla Ru(III/II)

resulta irreversible, comparado con los resultados obtenidos para los cloro-complejos

pudiendo registrar únicamente potenciales de pico. Se probó acotar el rango de

potencial a 800 hasta 1300 mV y el proceso siguió siendo irreversible. No tenemos una

explicación para este fenómeno.

Compuesto

[Ru(bpy)2PMe3GABA]+ 1,571,25

Ep(Volts) E1/2 (Volts) Ep (Volts)

1,72

1,711,18 1,84

1,661,19 1,82

[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+

[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+

65

Figura 5.15 Voltametrías cíclicas de los complejos (a) [Ru(bpy)2PMe3GABA]+, (b)

[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y (c) [Ru(bpy)2PPh2MeGABA]

+. A 100 mV/s en acetonitrilo.

0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2

E / V vs. NHE

20 µA

a

0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2

E / V vs. NHE

50 µA

E / V vs. NHE

b

0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2

E / V vs. NHE

20 µA

c

66

5.3.3 Ensayos de citotoxidad

Para evaluar la toxicidad de cada uno de los complejos sintetizados en esta

sección se realizó, un ensayo de citotoxicidad por el método de MTT sobre células

BHK-21. Se estudió la toxicidad de los cloro-complejos a tiempos de incubación de 30

minutos y 90 minutos.

Para el experimento de 30 minutos se utilizaron concentraciones de 10 µM, 100

µM y 1 mM para los complejos de trimetilfosfina y dimetilfosfina. Los resultados

obtenidos se muestran en la figura 5.16.

Figura 5.16 Resultados del ensayo de MTT en células BHK. Se incubaron células durante 30

minutos con concentraciones 1mM, 100µM y 10µM de los cloro complejos

[Ru(bpy)2PPh3Cl]+,[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]

+ y [Ru(bpy)2PMe3Cl]

+. El control fue incubado con

medio. *P<0.05 y ***P<0.001 con respecto al grupo control.

En la figura 5.16 se puede ver que a concentraciones menores a 100 µM,

ninguno de los dos complejos evaluados son citotóxicos, ya que no muestran diferencias

significativas con respecto al control.

***

****

0

20

40

60

80

100

120

CONTROL

PPhMe2 1m

M

PPhMe2 100uM

PPhMe2 10uM

PMe3 1m

M

PMe3 100uM

PMe3 10 uM

% d

e s

uperv

ivencia

****

67

El compuesto de trimetilfosfina es el que presenta menor toxicidad a

concentraciones de 1 mM con respecto a los tres complejos estudiados, ya que presenta

un porcentaje de supervivencia del 60%. Por otro lado, el complejo de dimetilfenil

cloro a concentraciones de 1 mM produce aproximadamente un 50% de mortalidad

celular comparado con el control. Este resultado indica que el compuesto presenta cierta

toxicidad a dicha concentración, pero que es muy inferior a la registrada para los

complejos de trifenilfosfina.

Asimismo, se estudió el efecto de los complejos realizando una incubación de 90

minutos. En la figura 5.17 se muestran los resultados obtenidos para los tres complejos

estudiados en esta sección. Se analizaron cuatro concentraciones 1 mM, 500 µM, 100

µM y 10 µM.

Figura 5.17 Resultados del ensayo de MTT en celulas BHK. Se incubaron células durante 90

minutos con concentraciones 1mM, 500µM, 100µM y 10µM de los cloro complejos

[Ru(bpy)2PPh3Cl]+, [Ru(bpy)2PPh2MeCl]

+, [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]

+ y [Ru(bpy)2PMe3Cl]

+.

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 con respecto al grupo control.

0

20

40

60

80

100

120

140

CONTROL

PPh2Me 1mM

PPh2Me 500uM

PPh2Me 100uM

PPhMe2 10uM

PPhMe2 1mM

PPhMe2 500uM

PPhMe2 100uM

PPhMe2 10uM

PMe3 1mM

PMe3 500uM

PMe3 100uM

PMe3 10uM

% d

e s

up

erv

iven

cia

*** ***

***

68

En la figura se puede ver que todos los complejos sintetizados a partir de

metilfosfinas presentan menor toxicidad que la registrada para los complejos de

trifenilfosfina previamente descriptos. Esta diferencia se puede apreciar a

concentraciones de 500 µM y 1 mM, no pudiéndose registrar diferencias significativas a

concentraciones menores o iguales a 100 µM entre los cuatro compuestos evaluados y

entre estos y el control. Estos resultados indican que los complejos de metilfosfinas

presentan una menor toxicidad que los de trifenilfosfina, lo cual correlaciona con lo

observado con los KOW.

69

5.4 Comparación global de los complejos enjaulados de GABA

En esta sección se describen y comparan algunas de las características más

importantes de los cuatro compuestos enjaulados de GABA sintetizados y/o

caracterizados en este trabajo.

5.4.1 Características fisicoquímicas

La figura 5.18 muestra la correlación entre la eficiencia cuántica medida a pH=7

y la posición de la banda MLCT para los complejos: [Ru(bpy)2PPh3GABA]+,

[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+, [Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y [Ru(bpy)2PMe3GABA]+.

También se muestran los coeficientes de partición octanol agua (KOW) de los cloro-

complejos obtenidos.

420 430 440 450 4600,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

KOW

=0,03

KOW

=0,22

KOW

=1,1

D

B

AA [Ru(bpy)2PPh3GABA]

+

B [Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+

C [Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+

D [Ru(bpy)2PMe3GABA]+

Efi

cien

cia

cuá

nti

ca

( φ)

λ(nm)

C

KOW

=17

Figura 5.18. Correlación entre la eficiencia cuántica y la posición de la banda MLCT. En

rosa, los complejos de GABA analizados en este trabajo: A=[Ru(bpy)2PPh3GABA]+,B=

[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+, C=[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]

+y D=[Ru(bpy)2PMe3GABA]

+. Además

se muestran los Kow del producto de fotólisis (cloro complejo). Las eficiencias cuánticas fueron

medidas en agua, a pH=7 y a 298 °K.

70

Se observó que a medida que se sustituye un fenilo por un metilo en el ligando,

hay una disminución en un orden de magnitud en el coeficiente de partición

octanol:agua, y un aumento en la eficiencia cuántica.

Existe correlación entre la energía de la banda MLCT (que es inversamente

proporcional a su λ) y las eficiencias cuánticas obtenidas para los distintos complejos

medidas en agua a pH fisiológico. Este comportamiento se vincula con la diferencia de

basicidad entre las distintas fosfinas usadas como ligandos.

Menos básico PPh3 <PPh2Me <PPhMe2 <PMe3 Más básico

A mayor basicidad de la fosfina, menor es la eficiencia cuántica de

fotoliberación obtenida y la posición de la banda MLCT se desplaza a mayores

longitudes de onda.

5.4.2 Citotoxicidad

En esta sección, se resumen y se comparan los resultados de los ensayos de

viabilidad celular realizados a dos tiempos (30 y 90 minutos), en cultivos celulares de

células BHK-21 para los complejos: [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+,

[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+ y [Ru(bpy)2PMe3Cl]+.

En la figura 5.19 se muestran comparados, todos los resultados obtenidos para el

tratamiento de 30 minutos. Los resultados de los tratamientos fueron sometidos a un

ANOVA de un factor, seguido de un test de Tukey.

Para concentraciones menores o iguales a 100 µM, de los complejos, no se

observó efectos sobre la viabilidad celular luego de incubaciones de 30 minutos.

En cambio, para concentraciones de 1 mM, se observó, para todos los

complejos, diferencias significativas respecto al control. Realizando comparaciones

entre los distintos tratamientos a los que fueron sometidos los cultivos, el complejo

71

[Ru(bpy)2PPh3Cl]+ resultó significativamente más tóxico que los otros dos complejos

sintetizados a partir de fosfinas de mayor hidrofilicidad (trimetilfosfina y

dimetilfenilfosfina).

Figura 5.19. Ensayo de citotoxicidad MTT para los complejos de cloro:[Ru(bpy)2PPh3Cl]+,

[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+y [Ru(bpy)2PMe3Cl]

+ a concentraciones (a) 1mM, (b) 100µM y (c) 10

µM, luego de 30 minutos de incubación. Estadística por test de Tukey, seguido de un ANOVA de

un factor***P<0.001 respecto al control. *** P<0.001 entre [Ru(bpy)2PPh3Cl]+

y los otros dos

complejos.

0

20

40

60

80

100

120

PPh3 1mM

PPhMe2 1mM

PMe3 1mM

CONTROL

% d

e su

per

vive

nci

a

****

***

***a

0

20

40

60

80

100

120

PPh3 100uM

PPhMe2 100uM

PMe3 100uM

CONTROL

% d

e su

per

vive

nci

a

b

020406080

100120

PPh3 10uM

PPhM e2 10uM

PMe3 10 uM

CONTROL

% d

e su

per

vive

nci

a

c

72

Por otro lado, en la figura 5.20 se muestran los resultados de los tratamientos de

90 minutos.

Figura 5.20. Ensayo de citotoxicidad MTT para los complejos de cloro:[Ru(bpy)2PPh3Cl]+,

[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+,[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]

+y [Ru(bpy)2PMe3Cl]

+ a concentraciones (a) 1mM,

(b) 500µM, (c) 100 µM y (c) 10 µM, luego de 90 minutos de incubación. ***P<0.001 respecto

al control, ** P< 0,01 y *** P<0.001 entre [Ru(bpy)2PPh3Cl]+ y los otros tres complejos.

Como ocurrió para los tratamientos a 30 minutos, a 90 minutos tampoco se

observaron efectos sobre la viabilidad celular luego de incubar los cultivos de células

BHK, con concentraciones menores o iguales a 100 µM de los complejos de cloro.

Para concentraciones de complejo de 1 mM, se observó que todos los complejos

presentan cierta toxicidad. Al igual que en el experimento de 30 minutos, el complejo de

trifenilfosfina ([Ru(bpy)2PPh3Cl]+) resultó el más tóxico, no pudiendo registrar

0

20

40

60

80

100

120

PPh3 1mM

PPh2Me 1mM

PPhMe2 1mM

PMe3 1mM

CONTROL

% d

e s

up

erv

iven

cia

0

20

40

60

80

100

120

PPh3 500uM

PPh2Me 500uM

PPhMe2 500uM

PMe3 500uM

CONTROL

% d

e su

perv

iven

cia

0

20

40

60

80

100

120

140

PPh3 100uM

PPh2Me 100uM

PPhMe2 100uM

PMe3 100uM

CONTROL

% d

e su

perv

iven

cia

0

20

40

60

80

100

120

140

PPh3 10uM

PPhMe2 10uM

PPhMe2 10uM

PMe3 10uM

CONTROL

% d

e s

up

erv

iven

cia

***

*** ******

***

****

a b

***

***

c d

73

supervivencia celular luego del tratamiento. En cambio, para los otros complejos

probados, si bien los tratamientos con éstos presentaron diferencias significativas

respecto al control resultaron significativamente menos tóxicos que el complejo de

trifenilfosfina.

Los experimentos de incubación con soluciones de 500 µM de complejo

mostraron que salvo el [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, el restos de los complejos de cloro

resultaron inocuos para los cultivos celulares. Esto indicaría que los complejos

sintetizados a partir de metilfosfinas son significativamente menos tóxicos que el

complejo sintetizado a partir de trifenilfosfina.

74

6 DISCUSIÓN

Para poder cumplir el objetivo de esta tesis de licenciatura, se trabajó con

complejos de rutenio-bipiridina de la forma [Ru(bpy)2XY]n+ donde X representa al

ligando no biológico e Y representa la posición ocupada por el GABA. La posibilidad

de cambiar el ligando no biológico proveyó una gran ventaja, ya que se pudieron

modificar las características fisicoquímicas del complejo como por ejemplo su

eficiencia cuántica, su solubilidad y su toxicidad. Se trabajó con fosfinas aromáticas y

metilfosfinas porque éstas poseen características muy interesantes, entre las cuales

podemos destacar:

• El carácter ππππ-aceptor de las fosfinas: Desplaza la energía de la banda MLCT

hacia menores longitudes de onda (mayor energía). Esto facilita que se pueble el

estado d-d y consecuentemente produce complejos con rendimientos cuánticos

de fotodisociación altos (ver introducción).

• La fortaleza del enlace Ru-P: Debido al basicidad de la fosfina y a su carácter

aceptor, evita que el ligando que se libere sea la fosfina, dando un grupo

protector robusto que libera exclusivamente la molécula bioactiva.

En esta tesina de licenciatura se logró sintetizar una familia de complejos

enjaulados de GABA de baja toxicidad y alta eficiencia cuántica, que liberan GABA al

ser irradiados con luz visible.

Los complejos sintetizados son de la característica [Ru(bpy)2XGABA]n+, donde

X= trifenilfosfina, dimetilfenilfosfina o difenilmetilfosfina.

75

6.1 [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. Primer complejo enjaulado de GABA de alta

eficiencia cuántica y utilizable en el rango de luz visible

El complejo de GABA ([Ru(bpy)2PPh3GABA]+) obtenido a partir del

[Ru(bpy)2PPh3Cl]+ presentó una eficiencia cuántica de fotoliberación en agua y a pH

fisiológico del 48 %. Está eficiencia cuántica resulto ser un orden de magnitud superior

a la registrada para el complejo Ru(bpy)2GABA2 (Zayat, 2006) y levemente superiores

a las registradas para los complejos de GABA de base orgánica publicados en literatura:

BC204 (Cürten, 2005), O-CNB-GABA (Gee, 1994).

La diferencia observada entre el [Ru(bpy)2PPh3GABA]+ y el Ru(bpy)2GABA2,

esta dada principalmente por la trifenilfosfina (PPh3). Como se mencionó a lo largo del

trabajo, las fosfinas poseen carácter π aceptor que desplaza la energía de la banda

MLCT hacia mayores energías (menores longitudes de onda). Esto se evidencia

comparando las posiciones de las bandas MLCT de los dos complejos, en donde el

[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ presenta su banda en λ=424 nm, mientras que el

Ru(bpy)2GABA2 la presenta en λ=488 nm. El corrimiento de 64 nm hacia longitudes de

onda menores es, por lo tanto, efecto de la trifenilfosfina. En consecuencia, el

corrimiento hacia mayores energías, disminuye la diferencia de energía (∆E) entre el

estado 3MLCT y el estado d-d, facilitando la población de este último. Con una mayor

participación del estado d-d en la relajación del los estados excitados, mayor será la

eficiencia cuántica.

Se realizaron los estudios de funcionalidad del complejo de GABA utilizando el

sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis; expresando receptores

de GABAC. Estos estudios consistieron en mediciones de corrientes de Cl- utilizando la

técnica de Fijación de Voltaje con dos electrodos, luego de fotoliberar el complejo de

GABA.

76

Los resultados mostraron que utilizando el complejo de GABA y fotoliberando

con pulsos de luz blanca se pueden obtener registros similares a los del registro control.

Además, se pudo demostrar que el complejo de GABA no posee actividad biológica en

oscuridad, demostrando que el GABA coordinado no puede ser reconocido por los

receptores a menos que éste sea liberado. Este resultado mostró que el complejo de

trifenilfosfina es una buena “jaula” para el neurotransmisor GABA, bloqueando la

actividad biológica del mismo cuando se halla unido al complejo y permitiendo su

liberación con una elevada eficiencia cuántica.

Este complejo de GABA es el primer compuesto enjaulado que libera GABA

con luz visible y con una buena eficiencia cuántica. Su síntesis, caracterización y

pruebas funcionales fueron publicadas en la revista ChemBioChem en el año 2007 (ver

figura 4 del ANEXO). Y desde el año 2009 es comercializado por TOCRIS (ver figura

5 del ANEXO).

A pesar de ser el primer compuesto de GABA del mercado que libera el

enjaulado con luz visible y elevada eficiencia cuántica, a concentraciones del orden del

milimolar presentó cierta toxicidad.

Para evaluar la toxicidad de los complejos sintetizados, se trabajó con la especie

más hidrofóbica que esta en contacto con el sistema biológico durante un experimento.

Esta elección, se basó en la hipótesis de que la toxicidad de estos compuestos esta dada

por su hidrofobicidad y por lo tanto con la probabilidad de interacción con las

membranas celulares.

Teniendo en cuenta la composición de los medios de cultivo y soluciones salinas

donde se realizan los experimentos electrofisiológicos, las especies secundarias que

tienen más probabilidad de formarse son los acuo-complejos y los cloro-complejos.

Estos últimos, son más hidrofóbicos (KOW= 17) y por lo tanto son candidatos a poseer

77

mayor toxicidad. De todas maneras, la probabilidad que se forme el cloro-complejo

frente al acuo-complejo es muy baja, debido principalmente a que la concentración de

cloruro de las soluciones fisiológicas o medios de cultivos es relativamente baja.

Se demostró, por un ensayo de citotoxicidad con MTT, que el complejo de cloro

es altamente tóxico, en cultivos celulares, a concentraciones iguales o superiores a 500

µM en exposiciones de 30 y 90 minutos. Además, se observó por microscopía time

lapse, que tratamientos con 500 µM de complejo de cloro produjo la pérdida de

adherencia en el campo de dosificación de la micropipeta. Esta pérdida de adherencia

resultó irreversible, por lo tanto podría asociarse a un efecto tóxico del complejo.

De todas maneras, si bien resultó necesario diseñar nuevos compuestos que

presenten una mejor biocompatibilidad, esté complejo de GABA es una buena

alternativa cuando se requiere realizar experimentos en donde se necesitan bajas

concentraciones de GABA en el medio. Como por ejemplo cuando se trabaja con

canales de GABAC cuyas concentraciones efectivas 50 (EC50) se encuentran en el orden

de 1 µM (Zhang, 2001).

6.2 Nuevos complejos a partir de fosfinas de menor lipofilicidad.

En el laboratorio se obtuvieron evidencias experimentales de que los complejos

de rutenio-bipiridina con fosfinas lipofílicas presentan una elevada probabilidad de

particionar hacia la fase orgánica durante un proceso de extracción. Este

comportamiento determina el carácter lipofílico de los complejos. En un experimento

con células, tejidos u órganos, el análogo a la fase orgánica de una extracción son las

membranas celulares y el análogo de la fase acuosa es el medio en el que se encuentran

78

las células (medios de cultivo, PBS, etc). Por lo tanto, existe la probabilidad que

complejos lipofílicos interactúen con las membranas celulares.

Inferimos que la toxicidad de los complejos radica principalmente en su

lipofilicidad. Para poder modificar éste efecto, se utilizaron fosfinas polares, de manera

de obtener jaulas más hidrofílicas y en consecuencia de menor toxicidad.

6.2.1 Complejos de rutenio-bipiridina sintetizados a partir de fosfinas

sulfonadas (m-TPPMS y TPPTS).

Las jaulas obtenidas a partir de las fosfinas sulfonadas, no resultaron útiles para

la obtención de complejos enjaulados de GABA.

En primer lugar, el cloro-complejo obtenido a partir de la trifenilfosfina

monosulfonada ([Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl]) resultó ser antagónico de los canales

GABAA. Esto se puede ver en las figura 2 del ANEXO, donde se muestra que el

agregado del complejo de cloro redujo la conductancia de los receptores GABAA entre

3 y 5 veces. Esto sugiere que alguno de los ligandos del complejo podrían estar

interactuando específica o inespecíficamente con el receptor.

De todas maneras, se obtuvieron resultados favorables en los ensayos

preliminares realizados por microscopía time lapse, donde se mostró que la incubación

con jaula no produjo pérdida de adherencia ni ningún otro tipo de efecto sobre la

morfología del cultivo celular. Por lo tanto, a pesar que el complejo [Ru(bpy)2(m-

TPPMS)Cl] no puede ser utilizado como jaula para el GABA, se demostró que el

cambio por un ligando menos lipofílico (trifenilfosfina por trifenilfosfina

monosulfonada) redujo la toxicidad del complejo.

79

Por otro lado, el complejo de GABA ([Ru(bpy)2TPPTSGABA]2-) sintetizado a

partir de la jaula con trifenifosfina trisulfonada (TPPTS) mostró que la reducida

basicidad del ligando TPPTS no lo hace apto para su uso en complejos enjaulados de

GABA. Esto se puede observar en la figura 5.9, donde se mostró que la fotolisis del

complejo [Ru(bpy)2TPPTSGABA]2- libera el ligando no biológico TPPTS en lugar del

GABA.

6.2.2 Complejos enjaulados de GABA a partir de metilfosfinas y

fenilfosfinas.

Se sintetizó una nueva familia de complejos enjaulados de GABA a partir de

jaulas de rutenio-bipiridina utilizando como ligando no biológico metilfosfinas

(dimetilfenilfosfina y difenilmetilfosfina). Además se realizó la caracterización química

y biológica de un compuesto ya sintetizado en el laboratorio llamado

[Ru(bpy)2PMe3GABA]+.

Se obtuvieron complejos de GABA con eficiencias cuánticas superiores a la del

complejo Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006) y de menor lipofilicidad que el complejo

[Ru(bpy)2PPh3GABA]+.

En la tabla 6.1 se listan algunas propiedades fisicoquímicas de los complejos de

GABA presentados en este trabajo y de los publicados hasta el momento en

bibliografía.

80

Tabla 6.1. Comparación de los compuestos enjaulados de GABA caracterizados en este trabajo

con los compuestos de GABA obtenidos en bibliografía. Ru(bpy)2(GABA)2 (Zayat, 2006);

BC204 (Cürten, 2005) ; O-CNB-GABA (Gee, 1994.)

Al igual que el complejo Ru(bpy)2(GABA)2 todos los complejos presentados en

este trabajo absorben en el rango de luz visible. Haber mantenido esta propiedad es

importante debido a los efectos nocivos que presenta la luz UV (Wees, 2007), además

de la alta dispersión que presenta en tejidos biológicos y los altos costos de

equipamiento que implica su uso (Zayat, 2008). Esto, representa un gran avance

comparado con los complejos de base orgánica que solo pueden liberar la biomolécula

irradiando con luz UV (Cürten, 2005).

Por otro lado, si bien las eficiencias cuánticas medidas a pH=7 para los

complejos de metilfosfinas ([Ru(bpy)2PMe3GABA]+, [Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ y

[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+) fueron superiores a la registrada para el Ru(bpy)2(GABA)2,

resultaron menores a la obtenida para el complejo de trifenilfosfina.

Esto se debe principalmente a la diferencia de basicidad que existe entre las

distintas fosfinas utilizadas. A continuación se muestra como es la tendencia de

basicidad de las distintas fosfinas.


[Ru(bpy)2PMe3GABA]+ 446 0,10

ε ε ε ε (M-1 cm-1)

5300

KOW

<10-3

φφφφ (pH=12)

0,05

[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+ 444 0,176000 0,060,10

[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+ 431 0,305500 0,150,27

[Ru(bpy)2PPh3GABA]+ 424 0,486400 0,260,42

BC204 300-400 0,4

O-CNB-GABA 262 308 0,16

Ru(bpy)2(GABA)2 488 450 0,04

λλλλ irrad (nm)

450

450

450

450

348 -------

-------

-------

-------

-------

-------

-------

-------

-------

81

Menor basicidad PPh3 > PPh2Me > PPhMe2 > PMe3 Mayor basicidad

Se puede ver que a medida que aumenta el número de fenilos de la fosfina,

disminuye su basicidad. Existe una tendencia entre la basicidad del ligando y la

posición de la banda MLCT. A mayor basicidad del ligando la banda MLCT se corre

hacia regiones de menor energía (mayor longitud de onda), mientras que a menor

basicidad del ligando, la banda se corre hacia regiones de mayor energía (menor

longitud de onda). Esto puede verse en la tabla 6.1 comparando las longitudes de onda

de máxima absorción de los primeros cuatro complejos. Además, como ya fue

explicado, a mayores energías de la transición, mayor es la probabilidad que decaiga

fotoliberando los ligandos monodentados, es decir, mayor será su eficiencia cuántica.

En cuanto a las particiones octanol agua, se pudo ver que los complejos de

GABA resultaron menos lipofílicos que sus cloro-complejos precursores. Esto indicaría

que éstos últimos presentan una mayor tendencia a interactuar con las membranas

celulares. En la tabla 6.2 se detallan los coeficientes de partición octanol agua

registrados para los complejos de GABA y los complejos de cloro.

Tabla 6.2. Comparación de los coeficientes de partición octanol agua obtenidos para todos los

complejos presentados en este trabajo. Los resultados se muestran de a pares (complejo de

cloro- complejo de GABA). La flecha roja indica lipofilicidad creciente.

17

Compuesto

[Ru(bpy)2PMe3Cl]+

KOW

0,03

[Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+ 0,22

[Ru(bpy)2PPh2MeCl]+ 1,1

[Ru(bpy)2PMe3GABA]+

[Ru(bpy)2PPhMe2GABA]+

[Ru(bpy)2PPh2MeGABA]+

[Ru(bpy)2PPh3Cl]+

[Ru(bpy)2PPh3GABA]+

<10-3

0,06

0,15

0,26

82

En la tabla se puede observar una tendencia entre el número de fenilos de la

fosfina utilizada como ligando y la lipofilicidad del complejo resultante. A medida que

se sustituyó un fenilo por un metilo en la fosfina, el complejo resultó cada vez más

hidrofílico, indicado por una disminución en un orden de magnitud en el coeficiente de

partición octanol agua. Esto demuestra que el uso de fosfinas polares provoca un efecto

apreciable en la lipofilicidad del compuesto.

Este abordaje experimental permitiría, a partir de este trabajo, generar nuevas

líneas de investigación basadas en la reducción de la toxicidad de esta clase de

complejos utilizando otro tipo de fosfinas polares (hidroxiladas, carboxiladas, etc) y de

esta forma ampliar el espectro de compuestos disponibles para utilizar como

dispositivos moleculares en experimentos biológicos. A su vez, se podría analizar la

posibilidad de incluir modificaciones en las bipiridinas de la molécula, de manera de

aumentar la versatilidad de las características de los complejos.

Biocompatibilidad de los complejos

Cuando se pone una solución de complejo de GABA en contacto con material

biológico durante un experimento y se realiza fotólisis para la liberación del enjaulado,

la muestra está en contacto con tres especies químicas: el complejo de GABA que no se

fotolizó, y los productos de cloro y acuo. Estos productos se forman cuando el GABA

es liberado y su posición en el complejo es ocupada por un cloruro o una molécula de

agua. La proporción que se forme de cada uno va a depender en parte de las

características del medio donde se realiza la fotolisis. El complejo de cloro es la especie

más hidrofóbica (ver Kow) y por lo tanto es la candidata a ser la especie que más

interactúe con la membrana plasmática y por consiguiente resulte la más tóxica.

83

Los complejos sintetizados a partir de trimetilfosfina, dimetilfenilfosfina y

difenilmetilfosfina: [Ru(bpy)2PMe3Cl]+, [Ru(bpy)2PPhMe2Cl]+, [Ru(bpy)2PPh2MeCl]+

presentaron menor toxicidad que el complejo de trifenilfosfina ([Ru(bpy)2PPh3Cl]+).

Los resultados de los experimentos de citotoxicidad realizados por el método

de MTT, mostraron que los cuatro complejos resultaron inocuos a concentraciones

menores o iguales a 100 µM para los dos tiempos de incubación estudiados.

Por otro lado, para los tratamientos de 90 minutos con soluciones de 500 µM de

los distintos complejos, se observó que salvo para la solución de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+, el

restos de los tratamientos con los otros complejos de cloro no presentaron diferencias

significativas con respecto al control. Esto sugiere que a concentraciones del orden de

500 µM los complejos sintetizados a partir de metilfosfinas resultan inocuos para

cultivos celulares.

El hecho que tratamientos con estas concentraciones de complejo no hayan

producido muerte celular, no implica que los complejos no estén interactuando con las

membranas celulares. Es importante aclarar que las pruebas de viabilidad celular, son

solo ensayos que permiten detectar toxicidad por muerte celular, pero no dan

información en cuanto a la interacción del complejo con las membranas plasmáticas.

Para poder evaluar este fenómeno, hubiese sido necesario estudiar la interacción

complejo membrana de manera directa. Para ello se podría haber medido la variación de

la resistencia de la membrana celular antes y después de tratarlas con distintas

concentraciones de los complejos.

Sin embargo, integrando los resultados obtenidos para las pruebas de toxicidad

con los resultados de los coeficientes de partición octanol agua, se pudo observar una

correlación directa entre estos resultados, lo cual sugiere que la causa directa de la

84

toxicidad es la interacción con la membrana plasmática. De todas formas, más ensayos

son necesarios para determinar el mecanismo implicado en la toxicidad.

Todos los complejos presentados en este trabajo resultaron tóxicos cuando

fueron utilizados en concentraciones de 1 mM. El complejo de trifenilfosfina

([Ru(bpy)2PPh3Cl]+) resultó el más tóxico, no pudiendo registrar supervivencia celular

luego del tratamiento. En cambio, para los complejos de metilfosfinas, si bien los

tratamientos con éstos presentaron diferencias significativas respecto al control

resultaron significativamente menos tóxicos que el complejo de trifenilfosfina.

Por otra parte, si bien en este trabajo no se presentan pruebas de funcionalidad

para los complejos de metilfosfinas, el Dr. Darcy Peterka de la Universidad de

Columbia, confirmó que estos complejos no presentan actividad biológica en oscuridad.

Todos estos resultados indican que el uso de fosfinas polares para el diseño de

complejos enjaulados de GABA de baja toxicidad, resultó una buena estrategia para

reducir la toxicidad del complejo sin variar en gran medida su eficiencia cuántica.

Concluyendo, se ha logrado sintetizar una familia de complejos enjaulados de

GABA de alta eficiencia cuántica, que liberan las moléculas con actividad biológica

luego de irradiar con luz visible. Los complejos obtenidos a partir de metilfosfinas

presentan una menor toxicidad que el complejo obtenido a partir de trifenilfosfina. Estos

nuevos complejos representan una plataforma conveniente para el desarrollo de nuevos

complejos enjaulados de baja toxicidad para otras moléculas con actividad biológica. La

obtención compuestos de menor toxicidad permitirán ampliar su rango de uso para

experimentos in vivo.

85

7 ANEXO

Figura 2 Resistencia de entrada de neuronas piramidales en presencia (trazo rojo) o

ausencia (trazo azul) de [Ru(bpy)2PPh3Cl]+

Figura 1 Esquema del espectro UV-Visible. Se puede ver que de 400 a 750 nm el espectro

corresponde al rango de luz visible, para longitudes de ondas menores a 400 nm

corresponde con el espectro ultravioleta y longitudes de onda mayores a 750 nm

corresponden con el espectro Infra Rojo. Además, se muestra marcada dentro del espectro

de luz visible, la longitud de onda del LED utilizado en este trabajo para fotoliberar los

complejos.

LED de450 nm

86

Figura 2 Resistencia de membrana de neuronas piramidales de la capa 2/3 de rodajas

coronales de corteza visual de ratón en presencia (trazo rojo) o ausencia (trazo azul) de

una solución 400 µµµµM del complejo [Ru(bpy)2PPh3Cl]+. Se puede observar que en presencia

de cloro complejo hay una marcada reducción en la resistencia de la membrana,

indicando que la presencia del compuesto produce un aumento en la corriente de fuga.

Esto indicaría que el complejo interactúa con las membranas celulares (Zayat, 2008).

87

Figura 3 Curva corriente voltaje. El estudio fue realizado sobre neuronas piramidales de

rodajas de cerebro de ratón. En los ejes se grafica corriente (pA) en función del potencial

de membrana (mV). Se muestran los valores obtenidos para las conductancias antes y

después de tratar con una solución 1mM de [Ru(bpy)2(m-TPPMS)Cl].

a

b

c

88

Figura 4 Síntesis, caracterización y ensayo funcional del [Ru(bpy)2PPh3GABA]+

publicado en la revista ChemBioChem.

89

Figura 5 Catalogo de TOCRIS para el complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+.

90

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93

INDICE

1 RESUMEN ........................................................................................ 2

2 INTRODUCCIÓN............................................................................. 32.1 Compuestos enjaulados ................................................................................... 32.2 Complejos de rutenio como “jaulas” .............................................................. 62.3 El neurotransmisor ácido �-amino butirico ................................................ 112.4 Complejos enjaulados de GABA................................................................... 132.5 Biocompatibilidad de los complejos.............................................................. 14

3 HIPOTESIS Y OBJETIVOS .......................................................... 16

4 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................... 174.1 Síntesis ........................................................................................................... 174.2 Caracterización química: UV-visible (UV-Vis), fotólisis, ResonanciaMagnética Nuclear (RMN) , voltametría cíclica y partición octanol-agua. ........ 264.3 Set up Time-Lapse......................................................................................... 284.4 Cultivos Celulares.......................................................................................... 294.5 Ensayo de toxicidad MTT ............................................................................. 304.6 Experimento con ovocitos de Xenopus laevis. ............................................... 31

5 RESULTADOS................................................................................ 335.1 Síntesis, caracterización, estudio de toxicidad y estudios funcionales enovocitos de Xenopus laevis del complejo [Ru(bpy)2PPh3GABA]+. ...................... 335.2 Diseño y síntesis de jaulas de rutenio a partir de fosfinas sulfonadas. ........ 495.3 Complejos enjaulados de GABA sintetizados a partir de metilfosfinascomerciales. ........................................................................................................... 555.4 Comparación global de los complejos enjaulados de GABA ....................... 69

6 DISCUSIÓN .................................................................................... 74

7 ANEXO............................................................................................ 85

8 BIBLIOGRAFÍA............................................................................. 90

diseño, síntesis y caracterización de complejos …ejemplos de ligandos monodentados, bidentados...

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