DISEÑO DE OLIGOS

Aunque no existe una 'regla' general, se recomienda que:

1. Los primers no tengan ninguna discrepancia (mismatch), a exepción de los utilizados para mutagenesis.

2. No exista algún sitio alternativo en el templado donde el primer pueda hibridarse.

3. Los primers no formen estructura secundaria, especialmente en el extremo 3' o que sean parcialmente complementarios

4. La longitud del oligo sea de 20 a 24 bases para reducir al mínimo la posibilidad de hibridización en sitios secundarios en el vector o inserto.

5. La temperatura de fusión (Tm) sea de 55oC o más, de manera que este por arriba de la temperatura de "annealing".

6. El oligo no contenga "strings" de más de una base. Es de especial importancia evitar 3 o mas G's o C's consecutivas.

7. Los primers tengan un contenido de C/G entre 40 y 60%. Para primers con contenido menor al 50% de C/G, es necesario incrementar la secuencia de los mismos para levar la Tm sobre la temperatura de annealing.

8. El primer sea más afín en su extremo 3

Diseño de Oligonucleótidos para PCR

Uno de los parámetros más importantes para tener éxito en la amplificación por PCR es el diseño de los oligonucleótidos cebadores (oligos o primers). Si éstos no están bien diseñados la PCR puede no funcionar bien; el resultado es la nula amplificación del producto debido a amplificación no específica o a la formación de dímeros de oligonucleótidos que pueden competir con la amplificación del producto deseado.¿Qué debemos tener en cuenta a la hora de diseñar oligonucleótidos para PCR?

Las principales variables a tener en cuenta son:

1. Tamaño del oligonucleótido2. Temperatura de fusión (Tm)3. Especificidad4. Secuencias complementarias

5. Contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) or polipurinas (A, G)

6. Secuencia 3’ terminal.7. Secuencia 5’ terminal y regiones centrales

1. Tamaño del oligonucleótido

El tamaño del oligonucleótido influye en la especificidad, en la temperatura de fusión y en el tiempo necesario para la hibridación del oligonucleótido a su secuencia complementaria, por tanto es decisivo para que salga bien la PCR. Los oligonucleótidos de 18 a 24 bases son muy específicos de secuencia, siempre que la temperatura de hibridación sea óptima.

El tamaño del oligonucleótido es proporcional a la eficiencia de hibridación: en general, cuanto más largo sea el oligonucleótido más ineficiente será la hibridación. Si hay pocos moldes con su oligonucleótido hibridado (o anillado) en cada paso de la PCR el resultado va a ser muy poco producto amplificado.

Los oligos no deberían ser demasiado cortos a menos que se especifique lo contrario en el protocolo. La meta es diseñar un oligonucleótido con una temperatura de hibridación (la que programamos en el termociclador) de al menos 50ºC.

La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es muy importante en la PCR. Como regla general la temperatura de hibridación debe ser 5- 8°C más baja que la de fusión. Por tanto, si queremos un oligonucleótido con una temperatura de hibridación de al menos 50°C, correspondería a un oligonucleótido con una temperatura de fusión de (Tm ~ 55-58°C). A menudo, la temperatura de hibridación así determinada no es óptima y es necesario determinarla empíricamente. Se puede hacer fácilmente con un termociclador con gradiente (por ejemplo el Mastercycler® gradient de Eppendorf).

2. Temperatura de fusión (Tm)

Es importante tener en cuenta que en una reacción de PCR hay dos oligonucleótidos. Ambos oligonucleótidos deberían diseñarse de manera que tengan temperaturas de fusión similares. Si los oligonucleótidos no tienen Tm parecidas, la amplificación será menos eficiente o incluso puede no funcionar ya que el oligonucleótido con la Tm más alta hibridará mal o inespecíficamente a bajas temperaturas mientras que el oligonucleótido con la Tm más baja puede que no funcione a temperaturas más altas.

Las temperaturas de fusión de los oligos se calculan de una manera muy exacta con cálculos termodinámicos usando la siguiente fórmula:

Tmoligonucleótido = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] –273.15°C + 16.6 log 10 [K+]

donde H es la entalpía y S la entropía para la formación de la hélice, R es la constante molar y c es la concentración del oligonucleótido. Pero lo más sencillo es usar cualquiera de los paquetes de software para el diseño de oligonucleótidos del mercado. Por suerte, una buena aproximación (generalmente válida para oligos en el rango de 18–24 bases) a la Tm se puede calcular con la fórmula:

Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Fórmula de Wallace

En esta tabla hay valores de Tm de oligonucleótidos de varios tamaños usando la fórmula de Wallace asumiendo un contenido en G/C del 50%.

Tamañodel

Oligonucleótido

Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)

Tamaño del Oligonucleótido

Tm = 2 (A+T) + 4(G+C)

4 12°C 22 66°C6 18°C 24 72°C8 24°C 26 78°C

10 30°C 28 84°C12 36°C 30 90°C14 42°C 32 96°C16 48°C 34 102°C18 54°C 36 108°C20 60°C 38 114°C

Las temperaturas calculadas usando la ecuación de Wallace son inexactas en los valores extremos.

Además hay que tener cuidado de que la Tm del producto sea lo suficientemente baja para asegurar que esté totalmente desnaturalizada a 92º. Este parámetro ayudará a asegurar una PCR más eficiente, pero no siempre es necesario para amplificar por PCR. En general, productos entre 100–600 pares de bases se amplifican eficientemente en muchas reacciones de PCR. En caso de duda, la Tm del producto puede calcularse con la fórmula:

Tm = 81.5 + 16.6 log10[K+] + 0.41 (%G+C)–675/tamaño.

Bajo condiciones estándar de PCR de 50 mM KCL, se reduce a:

Tm = 59.9 + 0.41 (%G+C) – 675/tamaño

3. Especificidad

La especificidad del oligonucleótido depende parcialmente del tamaño del oligonucleótido. Es evidente que hay más combinaciones de oligos de 24 bases que de 15 bases. Con todo, debemos elegir oligonucleótidos que tengan una secuencia única en el molde de DNA que queremos amplificar. Por ejemplo: un oligonucleótido diseñado con una secuencia altamente repetitiva resultará en un “smear” cuando amplifiquemos DNA genómico; sin embargo, el mismo oligonucleótido puede dar una sola banda si amplificamos un clon de una genoteca de DNA.

Como la Taq Polimerasa es activa en un amplio rango de temperaturas, puede extender el oligonucleótido a temperaturas bajas de hibridación. Si la temperatura es demasiado baja, puede suceder una hibridación no específica que será extendida por la polimerasa con que haya una pequeña homología en el extemo 3’ del oligonucleótido. En general, una temperatura de fusión de 55°C –72°C es la más adecuada (Fíjate que corresponde a un tamaño de oligonucleótido de 18–24 bases según la regla de Wallace).

4. Complementariedad en la secuencia de los oligonucleótidos

Es muy importante que los oligonucleótidos no tengan homología intra-oligonucleótido en más de 3 pares de bases. Si un oligonucleótido tiene una región de auto-homología, se pueden formar estructuras parcialmente de doble cadena que interferirán con la hibridación al molde.

Otro peligro es la homología entre los dos oligonucleótidos. Homología parcial en las regiones medias de dos oligonucleótidos puede interferir con la hibridación. Si la homología ocurriese en el extremo 3' de cada oligonucleótido, se dará la formación de dímeros de oligonucleótido que impedirán la formación del producto por competición.

5. Contenido en G/C y extensiones de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G)

La composición de bases de los oligonucleótidos debería ser del 45% al 55% en GC. La secuencia del oligonucleótido debería elegirse de manera que no contenga zonas de poliG o poliC que puedan llevar a hibridación no específica. Hay que evitar también las zonas ricas en poli A y poli T ya que es por donde puede deshibridarse el complejo molde–oligonucleótido lo que llevaría a una menor eficiencia de amplificación. También hay que evitar secuencias ricas en polipirimidinas (T, C) y polipurinas (A, G). Idealmente el oligonucleótido deberá tener una mezcla casi a alzar de nucleótidos, un contenido en GC del 50% y ~ 20 bases (la Tm estaría en el rango de 56°C – 62°C).

6. Secuencia 3’-terminal

Se sabe que la posición 3' terminal de los oligonucleótidos de PCR es esencial para controlar el apareamiento incorrecto. Ya hemos visto el problema de la homología del oligonucleótido en esas regiones. Otra variable que hay que considerar es que haya algún residuo de G o C en el extremo 3' del oligonucleótido. Este “cepo de GC” (en inglés “CG Clamp”) ayuda a asegurar que el extremo 3’ hibride correctamente debido a los enlaces de hidrógeno que se dan entre los residuos de GC. También ayuda a mejorar la eficiencia de la reacción de PCR minimizando cualquier deshibridación que pudiese ocurrir. Los oligos con secuencias inestables en el extremo 3’ (G > -9 kCal/mol) a menudo son más específicos ya que el potencial de apareamiento en lugares incorrectos es menor. Por lo general, esta condición se puede cumplir incluyendo como mucho dos residuos G o C en la últimas cinco bases del extremo 3’ terminal.

7. Secuencia 5’-terminal y regiones centrales.

Es conveniente incluir en esas zonas “cepos GC” para dar mayor estabilidad a la hibridación del oligonucleótido con su secuencia diana.

Conclusión

Es esencial un buen diseño de oligonucleótidos para tener éxito en la PCR. Los parámetros más importantes y que es necesario optimizar son el tamaño del oligonucleótido, el contenido (%) en GC y la secuencia del extremo 3'. Alguno de estos parámetros pueden optimizarse fácilmente a mano pero otros es mejor hacerlo con herramientas informáticas.

EJERCICIO

Por favor contesta a las preguntas siguientes de este ejercicio previo al diseño de oligonucleótidos durante esta clase y entrégalo al terminar.

Empleando las herramientas que ya vimos en la anterior clase práctica del 10/3/2005:

1. Localiza al menos cuatro herramientas de software no comerciales para el diseño de primers que puedas usar vía WWW.

2. Haz una búsqueda con BLAST: primero consigue la secuencia problema (la secuencia la puedes encontrar en la carpeta clase 14 abril 2005 en http://campusvirtal.uma.es)

3. ¿Podrías decir de qué organismo se trata?4. Cuantos ORF hay en esa secuencia y para qué codifican?

Imaginaos que estáis realizando un estudio de variabilidad de la polimerasa de este organismo y queréis amplificar una región que comprende los aminoácidos 980 al 1422 del mRNA de dicha polimerasa.

5. ¿Podrías localizar la secuencia de aminoácidos de esta polimerasa? Di cómo lo has hecho y/o dónde lo has encontrado.6. ¿Y la de nucleótidos de su mRNA? Di cómo lo has hecho y/o dónde lo has encontrado.7. ¿Qué % en GC tiene dicho mRNA?

Para conseguir amplificar DNA por PCR (o RT-PCR si partimos de RNA, como es el caso) el paso más crucial es el de diseño de oligonucleótidos cebadores o primers. Vamos a diseñar unos primers aceptables para amplificar esa región. Primero propondremos unos oligos basándonos en los criterios de diseño que os resumo a continuación.

Los primers deben cumplir los siguientes criterios:

Criterios “positivos” para el diseño de primers

Temperatura de fusión (Tm)

TmForward = TmReverse

Tm = 55-62ºCT hibridación ~ 5-8ºC menos que la Tm

Tamaño del primer 12-30 b, óptimo 18 a 24 b

Distancia entre primers 10 b-10 kb

Contenido en G+C >= secuencia diana; ideal del 45% al 55%

“cepo GC” en 3’ termina en T; G o C en dos (máx) de cinco últimas bases

“cepo GC” en 5’ incluir varias G o C en las últimas bases

Lugares de anillamiento de primers

únicos

Criterios “negativos” para el diseño de primers

Evitar apareamientos incorrectos

Evitar interacción primer-primer (Tm)

Evitar estructuras en horquilla

1. Busca los nucleótidos correspondientes a los codones de los aminoácidos 980 y 1422 (el fragmento que queremos amplificar).¿Qué tamaño (en nt) tiene la secuencia que queremos amplificar?¿Qué porcentaje de GC tiene?

2. Diseña unos oligos externos a éstos teniendo en cuenta todos los criterios anteriores. El oligo se escribe empezando siempre por su extremo 5’ pon el nucleótido de comienzo y de fin del oligo con respecto a la secuencia del mRNA.Oligo Reverse (complementario a la secuencia que queremos amplificar):5’................................................................................................................................................Oligo Forward (idéntico a la secuencia que queremos amplificar)5’................................................................................................................................................

3. Calcula la Tm de los primers por la fórmula de Wallace.Oligo R: Oligo F:

5. Con las herramientas bioinformáticas que habéis buscado antes podemos comprobar nuestros primers.a) Por ejemplo la herramienta:http://micro.nwfsc.noaa.gov/protocols/oligoTMcalc.htmlnos permite calcular la Tm, contenido en GC, tamaño y peso molecular de los oligos. ¿ Coinciden los valores con los que habías calculado manualmente?b) Si queremos además comprobar que no forme estructuras secundarias como horquillas, hibridaciones ente los dos primers, repeticiones o palíndromos podemos ir a:http://207.32.43.70/biotools/oligocalc/oligocalc.asphttp://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.htmlEn este último caso esperad a que salga otra ventana y luego pinchad en el botón “Grant this session”. ¿Se forman horquillas o dímeros en tus primers?

c) Si vas a amplificar mRNA del virus por RT-PCR debes tener presente que la muestra de RNA total de células infectadas con virus (previamente purificado de los extractos celulares) es una mezcla de RNAs de origen viral y celular. Para comprobar la especificidad de vuestros primers, es decir, que los oligos no se unan inespecíficamente a otras zonas del genoma del virus o bien a otros RNAs virales o celulares, debes hacer una búsqueda en bases de datos introduciendo la secuencia de los primers que has diseñado.¿Qué herramienta has utilizado?¿Qué homología de secuencia has encontrado y con qué organismos?

6. Propón un programa de RT-PCR adecuado para amplificar este fragmento partiendo de RNA purificado (recuerda que la temperatura de hibridación de la PCR va en función de los primers que has diseñado).

7. Con la secuencia de aminoácidos de la zona amplificada busca en BLAST y en la herramienta de búsqueda de función de proteínas AnaGram (http://jaguar.genetica.uma.es/anagram.htm; recuerda que debes limitar esta búsqueda a 400 aminácidos).¿qué función asigna cada uno de estas herramientas a la proteína?

8. Por último, quieres clonar en pBR322 para poder expresar esa zona de la proteína, diseña (o modifica) unos primers que contengan secuencias diana de enzimas de restricción. (Indica todos los pasos intermedios que te han permitido llegar a ese diseño).

Oligo Reverse5’................................................................................................................................................Oligo Forward5’...............................................................................................................................................