diagnóstico y corrección de anomalías hplc /uplc · diagnóstico y corrección de anomalías...

Diagnóstico y corrección Diagnóstico y corrección

de anomalías de anomalías

HPLC /UPLCHPLC /UPLC

©2007 Waters Corporation

HPLC /UPLCHPLC /UPLC

CerdanyolaCerdanyola, , EneroEnero 20142014

Course contentCourse content

� Section 1— Potential sources of chromatographic problems

— Performance monitoring

— Band spreading

� Section 2 — Peak shape problems

Section 3

©2007 Waters Corporation 2

� Section 3—Retention time problems

� Section 4—Miscellaneous problems

� Section 5—Column protection & baseline troubleshooting

Problem!

Troubleshooting StrategyTroubleshooting Strategy

Try to simplify:

Inspect the chromatography

Try to categorize

Troubleshoot the easiest to fix items first


CHEMISTRY

� COLUMN

� GUARD COLUMN� SOLVENTS� ADDITIVES� SAMPLE & VIALS

� PUMP� INJECTOR� DETECTOR� DATA COLLECTION� CONNECTIONS� TUBING�VIALS

MECHANICAL

•Retention time•Area

•Linearity

•Resolution

Troubleshooting overviewTroubleshooting overview


•Solvent- Pump Autoinjector Colum Detector•reservoir

•Tailing •Plate count•Noise/drift

� QCRM’s (suitability standards) are a tool for customers to benchmark their

column and system performance. This provides:

1. Confidence before running any critical assay.

� Preparative chromatography standard- used to show system is suitable for use before extracting valuable samples.

PerfomancePerfomance monitoringmonitoringQCRM’s(Suitability Standards)QCRM’s(Suitability Standards)What are they?What are they?


suitable for use before extracting valuable samples. � Neutrals standard used at the end of each assay to test column

efficiency (plate count).

2. A powerful trouble shooting tool that helps customers quickly eliminate and identify causes of failure.

� Eliminate own samples and mobile phase as the cause of error.� Identify column or system issues based on neutrals standard

performance and system information (ACQUITY console)

•

� Nuevo estándar de referencia para sistemas LCMS o MS – Referencia 186006968

� Mezcla de 9 componentes que permiten verificar de forma exhaustiva sistemas LCMS o MS en un amplio rango de métodos y condiciones.

� Mezcla desarrollada por Waters en el centro de I&D y producción de Manchester, y utilizada para la verificación de la instrumentación del Laboratorio de demo.

� El estándar de referencia QCRM para LCMS se suministra en un vial sellado para inyección directa. Contiene 500ul de mezcla 1:10 ACN:Agua calidad LC/MS.

QCRM QCRM –– Quality Control Reference MaterialsQuality Control Reference Materials


Contiene 500ul de mezcla 1:10 ACN:Agua calidad LC/MS.

1) Los compuestos da una respuesta variada en ESi (+-) y APCi+2) Cubre un amplio rango de m/z 3) Concentración optimizada para obtener una respuesta adecuada en modo ESI+4) Permite obtener una separación cromatográfica en el rango de condiciones habitualmente utilizadas para verificar la instrumentación.

� Establecer condiciones de referencia:

� Evaluar indicadores clave sobre el estado del sistema mediante comparación con los valores generados cuando el sistema está en óptimas condiciones.

� El resultado obtenido con los materiales de referencia QCRM son específicos del sistema QCRM en el que se ha ejecutado el test. Todas las medidas tienen algún nivel de variabilidad. La observación de tendencias en los resultados son útiles para definir la variabilidad en un sistema, o entre sistemas en uno o varios laboratorios. El test QCRM es una valiosa herramienta para diagnosticar anomalías.

�

QCRM QCRM –– Quality Control Reference MaterialsQuality Control Reference Materials


� Los criterios y especificaciones establecidos permiten determinar si el resultado del test QCRM indica un correcto funcionamiento del sistema.

� Criterios típicos del QCRM para sistemas MS son: 1)Exactitud de masa 2)Sensibilidad 3)Respuesta 4)Rango del tiempo de retención oreproducibilidad5)Area de los picos6)Resolución de los picos

Componentes en el QCRM para LCMSComponentes en el QCRM para LCMS


� Benchmarking Principle:

� Evaluate or check key performance criteria by comparison with data generated on a new column when the system is known to be in good working order. Sufficient data trending is required to gain an adequate benchmark initial point.

�

System Benchmarking QCRM’sSystem Benchmarking QCRM’s


� Criteria and specifications should allow customers to determine if the QCRM results indicate that their system and column is functioning as expected.

� Typical criteria might include:

oRetention time range or reproducibilityo Peak area range or reproducibility o Peak tailing range o Peak resolution o Plate Counto Sensitivity o Response

AU

0.010

0.020

0.030

Experiment procedure and sample Experiment procedure and sample chromatogramchromatogram

•Acetone

•Naphthalene

Acenaphthene


0.000

Minutes

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

•Acenaphthene

•Sample set run three times a day.

psi

6000.00

6500.00

7000.00

psi

6000.00

6500.00

7000.00

psi

6500.00

7000.00

Problem Bad Check Valve: Problem Bad Check Valve: Chromatogram and DataChromatogram and Data

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

AU

0.000

0.010

0.020

AU

0.02

0.04

0.06

•Good Check Valve

•Good Check Valve

•Bad Check Valve

•~6600 psi

•~6600 psi

•~6800 psi


6000.00

Minutes

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

0.00

Minutes0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

Acetone Retention Area TailingPlate

Count

Average 0.323 52245 1.18 3144

%RSD 0.69

Naphthalene Retention Area TailingPlate

Count

Average 1.633 155515 1.13 11009

%RSD 0.44

Acenaphthene Retention Area TailingPlate

Count

Average 2.893 101332 1.08 10436

%RSD 0.44


Count

Average 0.323 50804 1.18 3152

%RSD 0.68


Count

Average 1.631 153239 1.12 10753

%RSD 0.47


Count

Average 2.893 99538 1.08 10220

%RSD 0.44

•System Benchmarking data• N=45

•Benchmarking data + 9 injections• (after fix)N=54

•~6600 psi

AU

0.000

0.005

0.010

AU

0.000

0.010

AU

0.000

0.005

0.010

Problem Gap in Column Outlet Problem Gap in Column Outlet Fitting: Chromatogram and DataFitting: Chromatogram and Data

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

AU

0.00

0.02

0.04

AU

0.00

0.02

0.04

0.06

•Gap present

•No Gap

•No Gap•USP Tailing: 1.12

•USP Tailing: 1.12

•USP Tailing: 1.20


Minutes

0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.000.00

Minutes0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00


Count

Average 0.323 52245 1.18 3144

%RSD 0.69


Count

Average 1.633 155515 1.13 11009

%RSD 0.44


Count

Average 2.893 101332 1.08 10436

%RSD 0.44


Count

Average 0.323 50599 1.18 3159

%RSD 0.67


Count

Average 1.631 154565 1.12 10751

%RSD 0.45


Count

Average 2.893 100707 1.08 10247

%RSD 0.44

•System Benchmarking data• N=45

•Benchmarking data + 9 injections• (after fix)N=54

Product Type Mode

(UV, MS)

Part Number

Neutrals Suitability Standard Neutral compounds for most analytical

HPLC/UPLC assays

UV 186006360

Reversed-Phase Suitability

Standard

Neutral, Acid, Base for most

analytical HPLC/UPLC assays

UV 186006363

Preparative Chromatography

Mix

Neutral, Acid, Base for most

purification HPLC assays

UV and MS 186006703

AutoPurification Dye Mix Visible markers for fraction collection

verification

UV and MS 716000765

MassPREP OST Standard Oligo Standard for Oligo applications UV and MS 186004135

System Suitability Part NumbersSystem Suitability Part Numbers


MassPREP OST Standard Oligo Standard for Oligo applications UV and MS 186004135

MassPREP Protein Standard Mix Protein Standard for Protein applications UV and MS 186004900

Glycan Performance Test

Standard

Glycan Standard for Glycan applications UV and MS 186006349

BEH200 SEC Protein Standard

Mix

Protein Standard for Size Exclusion UV and MS 186006518

BEH125 SEC Protein Standard

Mix

Protein Standard for Size Exclusion UV and MS 186006519

Cytochrome C Digestion

Standard

Cytochrome C Digestion Standard for

peptide applications

UV and MS 186006371

MassPREPEnolase Standard EnolaseDigestion Standard for peptide

applications

UV and MS 186002325

MassPREP Peptide Mix

Standard

Four Protein Digestion Standard for

peptide applications

UV and MS 186002337

Detector Cell

� How do you get sharp peaks

with excellent resolution?—Well Shaped Bands -- Well Separated

— (Good Mechanical And Chemical Performance)

Isocratic

Band spreadingBand spreading


Detector Cell

Waters c 1998

ELUTING FROM THE COLUMNYellowYellow analyte: narrowest band width – sharpest peak

Red analyte: moderate band width – moderate peak width

Blue analyte: Slowest – BROADEST/MOST DILUTED BAND --Broadest Peak (longer on the column – takes more mobile phase to sweep it out of the column -- broader the peak)

Isocratic

Where Band Spreading OccursWhere Band Spreading OccursSimple Isocratic HPLC SystemSimple Isocratic HPLC System

HPLC Column(Stationary Phase)

Data

Mobile Phase


Pump

Waste

Data

Detector

InjectorAutoSampler

Sample

Where Band spreading occurs{Flow path of sample from injector to the detector}

Where Band Spreading OccursWhere Band Spreading Occursin gradient systemsin gradient systems

HPLC Column(Stationary Phase)

Data

Mobile Phase B

Pump B


Pump AWaste

Detector

InjectorAutoSampler

Sample

Where Band spreading occurs{Flow path of sample from injector to the detector}

•Mixer

Pump B

Mobile Phase A

Instrument Band SpreadInstrument Band SpreadMeasure the “Peak” WidthMeasure the “Peak” Width(No Column In System)(No Column In System)

Note: As the peak width gets wider, indicates band spreading is greater, plate count and resolution goes down Since there is no

column, V is close to 0

“Peak” comes out instantaneously


4.4%

close to 0

Measure Width (W) and Convert to Volume in µl

Auto Zero Problem

Base line off-set

Performance of Different Column Diameters Performance of Different Column Diameters with Normal Instrument Band Spreading (80µL)with Normal Instrument Band Spreading (80µL)

6000

7000

8000

9000

10000

Plate Count

4.62.0 mm ID

3.9mm ID

4.6mm ID

Peak Width due toInstrument Band Spreading exceeding Column Band Spreading

3.0mm ID


0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Retention Factor

(k)

Plate Count

(N)

4.6

3.9

3.0

2.0

1.01.0 mm ID

2.0 mm ID

Note: You will not get optimum plate count performance on standard instruments as you reduce the column ID, especially below 2.0mm ID

All Columns “would” provide 10,000 plates --Impact greatest for early eluters

System OptimizationSystem Optimization

� Optimize for Narrow Bore:

Instrument Band Spread Reduced from 80µL to <

25µL

—Detector flow cell design/reduced volume


—Reduce injector sample loop volume

—Use 0.005” ID tubing/short lengths

—Perfect (pre-cut) connections (with variable depth inlet)

—Time Constants <0.2

—Reduce the number of tubing connections to a minimum

Most common causes of Most common causes of extra band spreadingextra band spreading

� Incorrect tubings

—Diameters

— Lenghts

� Incorrect fittings


Effect of Connecting TubingEffect of Connecting Tubingon System Bandspreadingon System Bandspreading

0.009" I.D.

W = 68 µµµµl


0

0

0

64X

0.020" I.D.

W = 127 µµµµl

32X

0040" I.D.

W = 400 µµµµl

1 minute

16X

Effect of Wrong Detector cell on Effect of Wrong Detector cell on System BandspreadingSystem Bandspreading

Bad RI Cell

W = 236 µµµµl

Prep Cell


Good RI Cell

W = 87 µµµµl

Analytical Cell

Effect of Peak Band Spreading on ResolutionEffect of Peak Band Spreading on Resolution

2 x Gain in SensitivityMetabolite in tail of


• Customer’s plumbing• Lack of sensitivity

• Improved plumbing• Replaced 10 connections between the injector, switching valve and MS• Removed 4 feet of extra 0.005 inch id tubing

Metabolite in tail of peak now resolved

7.00 7.50 8.00 7.00 7.50 8.00



— Overall troubleshooting strategy



Section 3


� Section 3—Retention time problems



ContentContent� Causes of peak shape problems

—Contaminated in-line filter/guard column *

— Column destroyed

— Secondary interactions

— Incorrect sample solvent

— Temperature

— Column overload


—Column overload

o Mass overload

o Volume overload

— Other extra-column effects

o Sampling rate*

o Detector time constant/filter value*

Peak Shape ProblemsPeak Shape Problems

� Mechanical problem

— Tubing & fittings

— Column voided

� Chemical problem

— Silanol activity

— Column overload

All peaks affected?

Yes No


—Column voided

— Contaminated in-line

filter

— Injector problem

� Chemical problem

— Sample solvent problem

— Column overload

— Co-elution

— Elution from previous

injection


•

All Peaks Affected

fronting peaksdouble peaks


� All Peaks Affected

—COLUMN Voided

— COLUMN DESTROYED

o (pH <2 washes off functional group)

o pH >8 dissolves silica base

Normal columnNormal column

Packing Material Flush


“Well packed column”

Good ResultsGood Results


“Well packed column”

Column collapseColumn collapse

Packing Material Settled


“Voided column”

Column Collapse (Voiding)Column Collapse (Voiding)(shock/high pH/‘old’ (used) packing)(shock/high pH/‘old’ (used) packing)

All Peaks Distorted


Voids - high back pressure, distorted and/or double peaks

pH Limitations of Silica Based pH Limitations of Silica Based Packing Materials Packing Materials

Hydrolysis of Bonded Ligand

1

Dissolution of Silica particle


0 2 4 6 8 10 12 14pH

Hybrid / Polymeric -- Wider pH Range

Peak Shape ProblemsPeak Shape Problems� Contaminated in-line filter/guard column

� Column destroyed

� Secondary interactions

� Incorrect sample solvent

� Temperature

� Column overload


� Column overload

—Mass overload

— Volume overload

� Other extra-column effects

— Sampling rate

— Detector time constant/filter value

Poor Peak Shape for Basic Compounds due to Poor Peak Shape for Basic Compounds due to Secondary InteractionsSecondary Interactions

� Integration errors� Reduced resolution � Reduced sensitivity

Acids and Neutrals have Good peak shape --Basic Analytes “Tail”


Minutes

0 5 10 15 20 25

Tailing of Bases Tailing of Bases ---- Chemical Problem Chemical Problem

(Column Brand/pH(Column Brand/pH))

Conventional C18

Neutral

Different Silanol Activities forDifferent Column Brands


Time (min)50

Conventional C18

Current Generation C18

Neutral

Base

Base

0

Hydrophobic Interaction with Bonded Phase

Ion exchange Interaction with Charged Sites

O-Si

O-SiO-

O-SiO-SiO-

O-Si

O-Si

O-Si

OH

O-Si

O-Si

OH

O-Si(CH

3)2HN+(CH

3)2

HN+

Mobile Phase pH < 3

MixedMixed--mode retentionmode retention


O-Si

O-O-Si

O-Si

O-SiO-O--Si

O-Si

O-SiOH

O-Si

O-Si

O-Si

OH

O-Si

O-Si

3 22Phase pH < 3

Si - OH

-Mobile Phase pH > 3

Si – O

BaseBase

Column comparisonColumn comparison

Amitriptyline

Acenaphthene

Propranol Waters µBondapak™ C18 1973, USP TF = 10


Minutes0 15 30 45 60 75 90

Minutes5 10 150

Waters Xbridge RP18 2008, USP TF = 1.1


� Contaminated in-line filter/guard column




� Temperature

� Column overload


� Column overload

—Mass overload

— Volume overload


— Sampling rate


Effect of sample solventEffect of sample solvent

Sample in methanol

Minocycline

Tetracycline Demeclocycline


Sample in mobile phase(0.1% TFA, 4% ACN, 5% MeOH)Minocycline

Tetracycline Demeclocycline

Minutes

Minutes10

10

20

20

30

30






� Temperature

� Column overload


� Column overload

—Mass overload

— Volume overload


— Sampling rate


Column temperature equilibrationColumn temperature equilibration

70°C

70°C

70°C


22°C

70°C

70°C45°C 65°C 70°C

Peak Shape ProblemsPeak Shape Problems� Contaminated in-line filter/guard column




� Temperature

� Column overload


� Column overload

—Mass overload

— Volume overload


— Sampling rate


500 µL

300 µL100 µL

10 µL

Column/Volume OverloadColumn/Volume Overload


Effect of injection volume on peak

distortion

Volume OverloadVolume Overload


Note : Peak starts at same time

Wider peaks first

Column/Volume OverloadColumn/Volume Overload

6.25 µg injected in 5 µL

% of column volume: 0.625

Absorbance

Column Volume: 0.8 mL (800 µL)(4.6 X 50mm ODS)


Wider peaks first observed at low

retention( )

Peak position shifts to higher retention in proportion to the injection volume( )

2 4Minutes 6

6.25 µg injected in 500 µL

% of column volume: 62.5

2 4Minutes 6

Absorbance

Concentration/Mass OverloadConcentration/Mass Overload

6.25 µg injected

Absorbance

Analytical load of ~6 µgyields efficient peak

shape

Encountered when mass injected onto column exceeds a certain limit– Note earlier lift-off point for preparative load


2Minutes

25 mg injected

Absorbance

Preparative load of 25 mg generates mass overload

peak shape

Note that the back of the peaks of the analytical and prep loads are at the same retention (-------)

4 6

2 4Minutes

6






� Temperature

� Column overload


� Column overload

—Mass overload

— Volume overload


— Sampling rate


SummarySummary

� Peak shape problems

— All peaks affected

o Mechanical problem

o Exception : Incorrect sample solvent

— Only one or two peaks affected


—Only one or two peaks affected

o Chemical problem

Minutes0 5 10 15 20 25



— Overall troubleshooting strategy



Section 3


� Section 3— Retention time problems



Content Content

� Retention Time problems

—Reproducibility versus drifting or incorrect retention times

o Temperature

o Organic %

o Chemistry problem


o Chemistry problem

o pH

o Ion-pairing

o De-wetting (Hydrophobic Collapse)

Retention Time ProblemsRetention Time Problems

Reproducibility, incorrect &

- Solvent Composition

- Temperature

- pH Control

Drifting Retention

- Equilibration

- Stationary Phase Stability


- pH Control

- Ion Pairing- Column Contamination

- De-wetting/Hydrophobic Collapse (Low % Organic)

•More or Less Retention Time•(All Peaks Affected)

Retention time drift/Retention time drift/incorrect retention timesincorrect retention times

� Pump Flow Rate Problem —Correct flow rate ?— Air in pump— Check valve not working correctly


—Check valve not working correctly

� Wrong Column Type: —C8 – less retention — C18 – more retention

� Temperature Problem —warmer – less retention, — colder – more retention

� % Organic In Mobile Phase —more – less retention, — less – more retention)

Content Content



o Temperature

o Organic %

o pH


o pH

o Ion-pairing


Effect of TemperatureEffect of TemperatureReversed phase chromatographyReversed phase chromatography

� Reduction of Retention with Increasing Temperature

� 1% to 2% Change per 1° Celsius

� Shifts in Selectivity Usually Small


� Shifts in Selectivity Usually Small

•600 C

Effect of Temperature (Isocratic Effect of Temperature (Isocratic Separations)Separations)

•1160 psi•N=2250

•Higher Temperature:

•Efficiency •Back-Pressure


•300

C

•500 C

•Minutes•1.00•2.00•3.00•4.00•5.00•6.00•7.00•8.00•9.00•10.00

•400 C

•1920 psi•N= 1680

•Higher Temperature:

•Shorter Run Time

•Sharper Peaks

•Better Sensitivity

•Lower Back Pressure

Effect of Temperature Effect of Temperature

(Isocratic Separations(Isocratic Separations))

23.5°C

•Higher

Temperature:


26.5°C•Note selectivity change

Temperature:

•Shorter Run Time

•Sharper Peaks

•Better Sensitivity

•Lower Back Pressure

•Minutes•5 •10 •15 •20 •25 •30

•Minutes•5 •10 •15 •20 •25 •30

Temperature & SelectivityTemperature & Selectivity

•AU

•0.00

•0.05

•0.10

•0.15

•0.15

•1

•2

•3

•4•5

•1

•2

•3

•30°C

• 1 Triamterene

•Small, but significant selectivity changes may be obtained from temperature changes.


•AU

•0.00

•0.05

•0.10

•AU

•0.00

•0.05

•0.10

•0.15

•Minutes

•0.00 •1.00 •2.00 •3.00 •4.00 •5.00 •6.00 •7.00 •8.00 •9.00 •10.00•11.00•12.00

•2•1

•1

•3

•4

•5

•2•3

•4

•5•40°C

•50°C

• 2 Althiazide

• 3 Bumetanide

• 4 Benzthiazide

• 5 Ethacrynic Acid

•Column: XTerra® MS C18•3.5 µm, 4.6 mm x 50 mm •Mobile phase:•25% MeOH, 65% Water, •10% Ammonium •bicarbonate buffer, pH 9

Content Content



o Temperature

o Organic %

o pH


o pH

o Ion-pairing


Effect of solvent compositionEffect of solvent composition(% organic) RP chromatography(% organic) RP chromatography

� Exponential Relationship between k and Volume % Organic

� Retention Time Change of 5% to 15% per 1%

Retention Times vs. % Methanol

30.00

35.00


of 5% to 15% per 1% Change in Solvent Composition

� Bonded Phase Collapse in High Water Content (discussed later)

0.00

5.00

10.00

15.00

20.00

25.00

30.00

35 45 55 65

% MethanolRT (min.)

Change in Solvent CompositionChange in Solvent Compositionreversed phase chromatographyreversed phase chromatography

•More organic•shorter retention

•Can be caused by organic component evaporating from reservoir


•Less organic•Longer retention

•1 •2 •3 •4•Minutes

•1 •2 •3 •4

•Minutes

Questions????Questions????

•How difficult is it to make up a liter of•60/40 MeOH/Water •Mobile Phase????

•Mobile • Phase • Preparation


•How would You prepare this •mobile phase????

•Would we all get the same result????

•60/40 (MeOH/Water)

••400 mL400 mL••xyz grxyz gr

••600 mL600 mL••abc grabc gr

•Options A and A’ •Options B/C

•A) 600 mL•A’) 6?? mL

•??? mL•400 mL

Mobile Phase Composition Mobile Phase Composition is Critical for Reproducibilityis Critical for Reproducibility


•Options A and A’: Adding organic/aqueous directly to measuring vessel (not recommended)• Need to specify which solvent is added first: e.g. H2O to MeOH or MeOH to H2O

•

••Standardize pH Adjustment – ie; BEFORE organic is added

•• <1000 mL<1000 mL

••abc grabc gr

••1000 mL1000 mL

•Difference due to•partial volumes*

•Note: Partial Volumes on mixing may give • more or less than initial volumes•*

•*

•* 960mL

•Mobile Phase Composition •is Critical for Reproducibility




•Options A and A’ •Options B

•600 mL•640 mL

•440 mL•400 mL


•Options A and A’: Adding organic/aqueous directly to measuring vessel (not recommended)• Need to specify which solvent is added first: e.g. MeOH to H2O or H2O to MeOH

•Options B: Separate volumetric measurement •

•

•• <1000 mL<1000 mL•• (960mL)(960mL)

••abc grabc gr

••1000 mL1000 mL


•Note: Partial Volumes on mixing may give • more or less than initial volumes

•* 960mL

Mobile Phase

Composition•is Critical for Reproducibility





•600 mL•6?? mL

•4?? mL•400 mL



•Options B/C: Separate volumetric measurement or weighing is most accurate•

•

•• <1000 mL<1000 mL

••xyz grxyz gr••abc grabc gr

••1000 mL1000 mL



•Standardize pH Adjustment – ie; BEFORE organic is added

•(960 mL)

•Mobile Phase Composition is Critical for Reproducibility

•Clearly specify in your method HOW the Mobile Phase is to be prepared





•600 mL•6?? mL

•4?? mL•400 mL



•Options B/C: Separate volumetric measurement or weighing is most accurate•

•

•• <1000 mL<1000 mL

••xyz grxyz gr••abc grabc gr

••1000 mL1000 mL



•Standardize pH Adjustment – ie; BEFORE or AFTER organic is added

•*•* 960 mL

Content Content



o Temperature

o Organic %

o pH


o pH

o Ion-pairing


Retention Time ReproducibilityRetention Time Reproducibility-- pHpH

pH

� Neutrals: No Influence� Acids: Reduced Retention with Increasing pH


� Acids: Reduced Retention with Increasing pH� Bases: Increased Retention with Increasing pH� Up to 10% Change in Retention per 0.1 pH Unit

(Largest shift within +/- 1 pH unit of pKa)

20

25

30

35

ReversedReversed--Phase Retention Phase Retention BehaviourBehaviour of of Basic Basic CompoundsCompounds Relative to Changes in pHRelative to Changes in pH

Capacity Factor

•Non-ionized Base

•> ± 2 pH units provides stable retention (better reproducibility at flat portions of curve)

•Range where •pH control•is critical


0

5

10

15

20

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

•pH

•Capacity Factor

(k)

•Ionized Base

•pKa

•±2

•Base 1+2

•1

•10

•100

•log (k) •Acid

•(Un-ionized)•Neutral

•Base 1

•Acid(Ionized)

•Base 2•Un-ionized

Impact On Mobile Phase pH on Impact On Mobile Phase pH on Retention Factor (k) ReproducibilityRetention Factor (k) Reproducibility


1+2

•(Ionized)

•pH: Powerful tool in methods development for Selectivity –Range where pH control will be critical

•pH•0.1•0 •2 •4 •6 •8 •10 •12 •14

(Ionized)

•N

•A, B1•B2

•B1 •N

•A

•B2 •pH 5.5

•pH6.0

pH pH –– ControlControlTest for Robustness (+/Test for Robustness (+/-- 0.2 pH Units)0.2 pH Units)

•AZT Robustness testing•Imp1

•Imp1

•Imp2•Imp3

•Imp3

•Imp4

•pH 2.3


•Imp1

•Imp2

•Imp2 •Imp3

•Imp3

•Imp4

•Imp4

•pH 2.5

•pH 2.7

Content Content



o Temperature

o Organic %

o pH


o pH

o Ion-pairing


Retention Time Reproducibility

Ion Pairing Reagents(E.g. alkyl sulphonates / tetra alkyl ammonium salts)

� Retention– Increases Proportional to the Concentration of the Pairing Agent at Low Concentration


Pairing Agent at Low Concentration– Nearly Independent of the Concentration of the Pairing Agent at High (~10mM/L) Concentration

� Long Equilibration Times– Due to Adsorption of the Reagent on the Stationary Phase (can be up to 500 Column Volumes)

Content Content



o Temperature

o Organic %

o Chemistry problem


o Chemistry problem

o pH

o Ion-pairing


•Mobile phase must

Proper Wetting of Bonded Chromatographic Proper Wetting of Bonded Chromatographic Surface is Required for RetentionSurface is Required for Retention

•The particles are very porous, like the pores of a sponge –99% of chromatographic surface is inside the pores

• Mobile • Phase


•Mobile phase mustbe allowed into the pore

•in order for chromatographic •retention of the analyte

•to take place.

What influence does this have on chromatography?

•If the pores are dry, the analyte cannot get into the pores and it will not be retained by the chromatographic surface.

•Analyte

High High LigandLigand Density CDensity C88 Column: Column: “Hydrophobic Collapse“Hydrophobic Collapse

•Initial Column pre-wetted

•Mobile phase: Aqueous 0.1% Acetic Acid

•Amoxicillin


•Minutes•0 •2 •4 •6 •8 •10

Column pre-wetted with organic

•After Flow Stoppage(Pore de-wetting 100%)

•Vo: No retentivity for analyte

•1500 psi

•1500 psi

What is DeWhat is De--wetting or “Hydrophobic wetting or “Hydrophobic Collapse?”Collapse?”

•Low % organic or pure aqueous mobile

phase


•De-wetted Pore•Wetted Pore

•C18 Silica-Gel Particle Pores

How does flow stoppage cause this problem How does flow stoppage cause this problem with an HPLC column?with an HPLC column?

•Analytes•Analytes


•At flow with pressure on the mobile phase.

•Stopped flow with no pressure on the mobile phase, pores de-wet. Restart flow, pores remain de-wetted with analytes never entering pores (low surface area).

DeDe--WettingWetting

“Hydrophobic Collapse”“Hydrophobic Collapse”

•“Hydrophobic Collapse” is a term that has commonly been used to describe the loss of retention in RP Chromatography. It refers to the long C18 Chains folding or collapsing back


It refers to the long C18 Chains folding or collapsing back down to the particle surface, thereby not being fully extended to interact, or retain the analyte.

•In reality, it is the de-wetting of the pores which causes the loss of retentivity.

ReRe--wetting a Stationary Phase wetting a Stationary Phase Once DeOnce De--wetted:wetted:

�Use a mobile phase containing > 40 % methanol or other polar organic solvent

�Difficult to use pressure to force aqueous mobile


�Difficult to use pressure to force aqueous mobile phase back into poresTypically not practical because column outlet is at atmospheric pressure

•1 atm (14.7 psi)

•2200 psi

•Inlet •Outlet

•P

•Length

ReversedReversed--Phase Column Selection Phase Column Selection Considerations Relating to the Risk of DeConsiderations Relating to the Risk of De--Wetting/Hydrophobic Collapse Wetting/Hydrophobic Collapse

� Pore Size


� Ligand Density

� Ligand Type

Chapter 4Chapter 4Miscellaneous problemsMiscellaneous problems

� Methods Development Suggestions

� Extraneous Peaks

� Mobile phase degassing

� Gradients

� Samples and Vials



•Common Complaints:

• “My column is not reproducible” • – “a new column gives different results”

Changes in Retention/ResolutionChanges in Retention/Resolution


• “My chromatography changes”

• “Quality Control Laboratory can’t reproduce• my results”

• WHY?

•Changes in Retention/Resolution Method Development

•Please remember:

•HPLC Columns contain packing materials which can be chemically altered depending


which can be chemically altered depending on how they are used and treated

(mobile phase, pH, ion-pairing reagents, surfactants, age).

•“Column History”


•Once the column is altered in your laboratory, if you use this “modified particle surface” to create a separation, you may not be able to reproduce that separation on a new column –


reproduce that separation on a new column –because the new column was not chemically

altered in the same way.

•“Regeneration” may not always bring you back to the original chromatographic surface, especially, if ligand hydrolysis (loss of ligand) or

surface modification by ion-pairing reagents has occurred

•Methods Development Risk – starting with a “used column”•(in a drawer, on the instrument, donated by a colleague)


•Two Potential Causes

•Column Product is •Column Product is OK but


•How do you determine, and control the method development outcome?

•A suggested approach which controls the results, without confounding the reasons.

•Column Product is not manufactured reproducibly

•Column Product is OK but •use/conditions are changing

•the performance


• How Columns are Manufactured

1) A “BATCH” of Packing Material (particle) is prepared• First Silica then Bonding LOT # (Ligand/Endcapping)

(Determines retention/selectivity/resolution)

• 2) Approve “Chromatography”


• 2) Approve “Chromatography”

• 3) Pack Columns, LOT # / Test for efficiency/back pressure• Note: A BATCH* may be used to make many different

LOT #’s, and many thousands of columns

• 4) Approve and Ship

•*Note: Some column manufacturers buy packings and only pack columns•They may have little if any control over chromatographic performance.

•Suggested Methods Development Approach for Robustness*

1)

2) Obtain 3 - 4 NEW columns2 from the SAME BATCH (Columns A & B)

• 1 or 2 from ALTERNATIVE BATCH(ES) (C & D)


3) Select column A of the “2 from the SAME BATCH” of new columns and develop method conditions

•*Especially important for validated methods which• will be used for many years or in different locations

•Suggested Methods Development Approach for Robustness

• 4) Once conditions are set, run column B, (other NEW column from the SAME BATCH)

• 5) If results are the same – GREAT (no differences)


• 5) If results are the same – GREAT (no differences) then move to step 6

If results are NOT THE SAME – then you “modified” column A while you were developing the method. This necessitates starting again. Even a new column from the same batch will not duplicate your chromatography.

• Move back to step 2

••Suggested Methods Development Approach for Suggested Methods Development Approach for RobustnessRobustness

• 6) Try column C from an ALTERNATIVE BATCH (and column D from a third different batch if available)

• 7) If the results are the same – GREAT.


• 7) If the results are the same – GREAT. Manufacturer has adequate batch to batch reproducibility – Continue validation procedure.

•If the results are DIFFERENT – the manufacturer does NOT have adequate batch to batch reproducibility. You will need to work with that column vendor to get more reproducible columns or choose a new column vendor/manufacturer.

•Suggested Methods Development Approach for Robustness

••This approach provides you with an

early assessment of method robustness during the initial stages of separation


during the initial stages of separation development whilst allowing you to

identify reproducibility problems that may be occurring.

Tips from Case StudiesTips from Case Studies

� When replacing a column that has been used for

many injections you should expect that the surface

has been modified to some degree

� The new column will/may give different results initially (especially if the ligand was hydrolyzed off the old column)


•During Methods Development, running a “used” column

•can sometimes show degree of robustness

old column)

� The new column will have more ligand, and therefore changed retention characteristics.

•Tips from Case Studies

* Always use “New Columns” for initial method development work


method development work

•Avoid having to redo the development work all over again

Tips from Case StudiesTips from Case Studies

� Mobile Phase Preparation can be highly critical to ultimate method performance.

� Write your method procedures clearly so that no mistakes or misinterpretation can occur.

� Sequence of mixing, and method of measurement (volume,


� Sequence of mixing, and method of measurement (volume, weight) of components can dramatically change the chromatography. (pH control and % organic are especially important for some methods)

� Differences will often be observed for a mobile phase prepared in a single reservoir vs. “same” mobile phase made by blending lines using a proportioning/mixing valve

ContentContent



� Mobile phase degassing

� Gradients




Extraneous PeaksExtraneous Peaks

Isocratic LC - Extra Peak –

Sharp - Contaminant


•Contaminant(s) from; sample, vial, septum, injector etc… •Isocratic Method: extra peak with the same peak shape and width ,

•the contaminant came from this injection

Extraneous PeaksExtraneous Peaks

Isocratic LC - Broad -Peak from

Previous Injection


Preventing contaminationPreventing contamination

� Use clean, particle-free solvents

— Filter through 0.2µm filter

� Use ultrapure water

— Particle-free, chemically clean, 18-megaohm

� Prevent microbial growth

— Prepare, filter, and degas aqueous mobile phase daily

� Minimize the use of additives


� Minimize the use of additives

� Store solvents in clean glass reservoirs with covers

— Prevent airborne contaminants from entering the solvent

� Clean laboratory glassware properly

— First, rinse it with organic solvent and then water.

— Next, rinse it with the solvent that will be put into it.

— DO NOT WASH GLASS BOTTLES IN DETERGENT

Preventing contaminationPreventing contamination

� Prepare and Handle Samples Correctly

— Use clean vials, caps, and plates

� Use Clean Fittings and Tubing

— Connections that come into contact with solvents or sample include

stoppers, O-rings, check valves, and solvent inlet filters (sinkers).

— Be aware that tubing made of polymers (such as polyvinylchloride,


— Be aware that tubing made of polymers (such as polyvinylchloride,

or PVC) may contain plasticizers or other contaminants.

� Wear particulate-free, powder-free, non-latex gloves

� Use clean columns

Contaminated mobile phaseContaminated mobile phase

•4 different buffer as A solvent

•(b)


•HPLC grade water as A solvent

•Blank gradients 5-80% ACN after 10min (a) and 30min (b) equilibration w. A eluent =10mM phosphate buffer pH 7.0

•(a)

•Blank gradients 5-80% ACN after 30min (a) and 30min (b) equilibration w. A eluent =4 different 10mM phosphate buffers pH 7.0

Contamination sourcesContamination sources


ContentContent



� Gradients



Gradient TransferGradient Transfer

� Common Problem—Gradient method works excellently on the R&D HPLC

System

However!

— The results cannot be duplicated in the Production Quality Control Laboratories


Control Laboratories

(resolution, retention times)

� Is the Column at fault?

Effect of Gradient VolumeEffect of Gradient Volume

INJECT

D

E

H

V K

SCM

CAT Q

RG

Y

A WFL

NL

NS

•PTH Amino Acid Standards717 Autosampler


INJECT

INJECT

SCM

CA

NS

T R

Q

G

A

Y M

P

WF L NL

I

D

E

H

V

K

•2 mL Sample Loop

•200 µL Sample Loop

Problems with Gradient TransferProblems with Gradient Transfer

� Question: Are the instruments the same?—Brand—Model

� Question: If Model and Brand are different, how is the gradient mobile phase being created?


created?—High pressure or low pressure mixing/blending

� Even if the model and brand are the same, the EXACT SAME PLUMBING CONFIGURATION must be used for both

� The problems commonly arise from DIFFERENCES IN SYSTEM DELAY/DWELL VOLUMES

Gradient Transfer Gradient Transfer

� Check Gradient Delay/Dwell Volume of the

different instruments/systems

� Must specify the plumbing - even ID and

length of connecting tubing - should delay


length of connecting tubing - should delay

volumes be different, retention times etc. will

also be different

Example of Transfer of a Example of Transfer of a Gradient MethodGradient Method

large delay volume

small delay volume

•0.60

•0.80

•1.00 •1 mL/min


�Change in retention time�Change in resolution

Minutes

•0.00

•0.20

•0.40

•0.60

•2 •4 •6 •8 •10 •12 •14 •16 •18 •20

•AU

•Vo

ContentContent



� Gradients



Troubleshooting StrategyTroubleshooting Strategy

Problem!•Try to simplify:

•Inspect the chromatography

•Try to categorize

•Troubleshoot the easiest to fix items first


CHEMISTRY MECHANICAL

� SAMPLES & VIALS� Contamination� Sample Stability

� VIALS� Dimensional Problems�Jams, Pick-up� Needle Damage� Poor Injection Reproducibility� Septum Dislodging� Sample Evaporation� LVI Assembly

Troubleshooting Concerns Troubleshooting Concerns Regarding VialsRegarding Vials

� Vials Can Present both Chemical and Mechanical Problems

� Most important: What HPLC system is using the vial. Sometimes the autosampler appears to be at fault, but in reality it’s the vial.

— Differences in the designs of HPLC systems determine the demands placed on the vial


demands placed on the vial

o Needle draw port design

o Needle draw depth design

o Needle venting design

o Vial handling design (Fixed Tray, Robotic Handling)

� Vials are the least expensive component of an HPLC

system, but can be the biggest contributor to problems

that you encounter, such as:

•Sample Vials


� Evaporative loss

� Spurious peaks/extractables

� Sample/analyte degradation

� Sample draw volume reproducibility

� Septum dislodging/Coring

� Injector damage/Robotics malfunction

� Excessive residual sample volumes

•Chemical Mechanical

Choosing the CorrectChoosing the CorrectVIALVIAL

� Colourless/Clear glass— Type 1, Class A Borosilicate •Note:

•IMPORTANT:•Test the sample analytes for compatibility/usability with a vial.

•Some compounds may degrade, or become bound to certain surfaces.


— Type 1, Class A Borosilicateo Most chemically inert glass available

— Type 1, Class B Borosilicateo More alkaline than Class A

� Amber/Clear glass— All amber glassware is “Type 1, Class B”— Used for light labile samples

� Polypropylene— A non-ionic, non-reactive plastic. Used where

glass is inappropriate. Max. temperature : 135°C

•Note:•Decativated/Silanized glass surface is also available

Problem Problem -- Septa DislodgingSepta Dislodging

•Common problem with “non-bonded”

septa. •Can jam the


•Can jam the autosampler

� Don’t immediately blame the needle or needle alignment

� Switch to pre-slit septum

- Less force required to pierce

� Choose bonded septum (LectraBond™)

- Septum is bonded to the cap. Eliminates dislodging

- Electro welded: No chemicals or adhesives

Choosing the Correct SEPTAChoosing the Correct SEPTA

� Wrong choice of Septum may result in :

—Evaporative loss of sample

—Lack of reproducibility for repetitive injections


injections

—Septum coring

—Needle damage

—Septum dislodging

—Contaminationo Di-octylphthalate (silicone)

o Siloxane (silicone)

Problem Problem –– Sample Draw Volume Sample Draw Volume Reproducibility Reproducibility -- VentingVenting

� Symptom: Peak area increases after first injection from the same vial (first injection –

low, latter injections OK)

— Possible cause: Inadequate venting upon needle piercing the septum/cap for the

FIRST Time. “Vacuum formation” caused by the septum/cap sealing around the

injection needle.

— Vacuum draws some sample back out of the needleo Situation can be aggravated by over filling the vial


o Situation can be aggravated by over filling the vial

(Never fill the vial all the way to the top)

— Test: Remove cap and septum* from the vial.Perform multiple injections. Measure peak area to determine if the septum/cap is the cause.

•*Some auto samplers may have to have the vial sensor disabled

•Vial A•Inj. 1•Area = 200,000

•Vial A•Inj.2•Area = 250,000

Problem Problem –– Sample Draw Volume Sample Draw Volume Reproducibility Reproducibility -- Coring of SeptumCoring of Septum

� Symptom: Peak area varies (increases /decreases) from injection to injection from the same vial

— Possible cause:Coring of Septum by Needle. If using a bottom draw port needle, the draw port could be plugged with septum material

o Check needle draw port for septum material, remove / replace.


— Solution: Should self sealing PTFE/silicone septum be used:

o Switch to pre-slit PTFE/silicone septum

o Pre-slit septum will eliminate coring and deliver good resealing capability

“Alternatively”

o Switch to PTFE septum

o PTFE will eliminate coring. However, it will not reseal•Silicone Septum•Material Lodges in Bottom Draw

Needle

Problem Problem ---- Spurious PeaksSpurious Peaks

� Contaminants can come from three sources and can be either sample dependent or detection-method dependent

—Vial

—Cap

—Septum


—Septumo Most common contributor

• Chemical compatibility

• Absorbs contaminants from atmosphere (silicone)

• Observance of problem can be detection-method dependent

•Packaging and storage can be very important

Problem Problem -- Spurious PeaksSpurious Peaks

� Simple & Quick Testo Remove cap and septum from vial and run sample to see if spurious peaks still appear.*

• If peaks don’t appear, the problem could be coming form the septum

→Switch to a PTFE septum (most chemically inert material)

� Should peaks still appear, troubleshoot the vial


� Should peaks still appear, troubleshoot the vialo Vials are manufactured from different grades of glass. Choose a vial manufactured from a different grade / class of glass

o Packaging used for shipping the vials can also contribute to this problem.

* Some autosamplers may require you to disable the optical vial cap sensor

Included in every package Included in every package -- COACOA


Chapter 5Chapter 5Column protection, baseline Column protection, baseline troubleshootingtroubleshooting


Chapter 5Chapter 5Column protection, baseline Column protection, baseline troubleshootingtroubleshooting

� Column use, storage & maintenance

� Column protection & regeneration


� Column protection & regeneration

� Baseline troubleshooting

Column EquilibrationColumn Equilibration

� Initially purge column with 10-20 column

volumes (Vc) mobile phase to be used in

analysis

Vc= 0.5 x D2 x L

(4.6x150mm : Vc= 1.6ml, Equil. = 16-32ml)


� Caution : If our are using a buffer make sure it does not

precipitate in the column when initially flushing the column

w. mobile phase

— Most RP column comes in 100% organic usually acetonitrile

— Initially flush with water/organic and the switch to the mobile

phase

Column EquilibrationColumn Equilibration

� Reversed-Phase (C18, C8 etc.) columns

equilibrate faster than Normal Phase columns

— (order of magnitude = 10)

� Normal phase columns (silica or alumina) may


� Normal phase columns (silica or alumina) may

take several hours at flow rates of 1.0 ml/min

—Use dried solvents, or water saturated solvents or solvent

with traces of propanol

Column StorageColumn Storage

� Store in Shipping Solvent for Longer Periods of Time— Flush with water/organic and then 100% organic

� Column should be stored in solvent which manufacturer recommends

� For bonded phases, use organic solvent


� For bonded phases, use organic solvent (eg. MeOH or ACN) Using non-aqueous solvents minimizes hydrolysis.

� Some bonded phases (CN) become unstable in polar organic mobile phases. Storage in water or buffer is then ok.— Worst mobile phase for CN column is CH3CN


� Columns which may be stored in water or buffered

solvents:

—CN columns

— Ion exchangers

— Aqueous SEC packings

— However:


—However:

o Prevent microbial growth by using 0.05% sodium azide

in mobile phase

OR

o Small quantity of organic solvent (acetonitrile 5% or

methanol 10%)


� Columns which should be stored in Mobile Phase:

—Normal Phase

— Organic SEC (GPC)


Techniques to Protect the Techniques to Protect the ColumnColumn

� In-line Filter between the Injector and Column

— Protects against particles

� Guard Column Between Injector and Column

— Protects against particles as well as chemical contamination

� Filtering of the Sample


— Protects against particles

� Filtering of the mobile phase (0,2µm filter)

— Protect against particles and microbial growth

� Sample Cleanup through Solid Phase Extraction (SPE)

— Protects against chemical interferences

� Limit High Back Pressures/Pulses (solvent viscosity)

Column RegenerationColumn Regeneration

� Always follow column vendor’s guideline for

regeneration

� Regeneration can bring back a column’s performance

if problem relates to compounds, which are retained

under method conditions, causing changes in


under method conditions, causing changes in

chromatography. Washing them off with more

aggressive solvents can return performance

� If surface has been chemically altered, ie hydrolysis of

ligands, then performance may not be restored

Column Regeneration/CleaningColumn Regeneration/Cleaning

Reversed phase

columns:

� Methanol*

Normal phase columns:

� 50/50

Methanol/chloroform

Flush with 20 column volumes. Run columns in reverse flow direction, disconnected from detector. Cleaning efficiency is increased at 35-45ºC


� THF

� Hexane

� THF

� Methanol

� Mobile phase*

� Ethyl acetate

� Mobile phase

•

•

••* Make sure mobile phase is miscible w. methanol and no salt precipitation occurs

Column LifetimeColumn Lifetime

� HPLC columns have a finite lifetime.

� Most common cause of column failure is due to high pressure, typically caused by particulates.

� Sources of particulate contamination

— Debris from instrument seals

— Particles in the sample

— Particles in the mobile phase


� Chemical Degradation

— Contamination from adsorbed materials

o Strongly retained/irreversible bound

— Microbial growth

— Hydrolysis (cleavage) of bonded ligand (ODS,etc.)

— Dissolution of stationary support (silica, etc.)

Column Regeneration/CleaningColumn Regeneration/Cleaning

� Inject 100 µl DMSO while flushing the column with

100% acetonitrile

� Run a 10-100% B gradient where

A= 0.1% TFA in water

•If you suspect contamination with proteins :


A= 0.1% TFA in water

B= 0.1% TFA in acetonitrile

� Flush with 7M guanidine HCl or 7M urea

ContentContent


Línea de base

DerivaFalta de equilibrado

Fluctuaciones temperatura ambiente

Mirar condiciones de la aplicación para determinar el equilibrado.Si es gradiente, observar el tiempo de equilibrado entre iny e iny.1. Para calcular vol de equilibrado: ColumnEquilibration Time =((SystemVolume x 3) + (ColumnVolume x 5) / Flow rate) –Injection Cycle Time.

Columna a 5 grados por encima de la ambienteObservar ubicación de equipos respectos unidades de calor o frio.


Fase móvil

Celda que pierde

Columna contaminada

Lámpara

Equipo contaminado

Descartar contaminación de fase móvil, preparar fase frescaCambiar la botella y cambiar frits.Comprobar que los componentes no tienen lectura en la longitud de onda de trabajo.Solventes y aditivos equilibrados en los gradientesSuficiente lavado para obligar a componentes tardíos a eluir de la columna.

Mirar conexiones y apretar, en caso oportuno. Si fuga la celda por dentro sustituirla

Reemplazar por unión de vol muerto, pinchar f.m, si la línea es estable, se necesita columna nueva

Mirar la energía de la lámpara, si es muy baja, se debe reemplazar.Si la lámpara lleva más de 2500 horas, reemplazarSi vemos curvaturas de la línea de base, posiblemente la celda esté sucia. Limpiar la celda

Si quitando la columna y con nuevas fases móviles, solo bombeando fase móvil sigue habiendo deriva limpieza del equipo (ver protocolo Mantenimiento y Limpieza celdas de detectores Acquity)

Linea de BaseLinea de Base

� Ruido cíclico de línea de base

� spikes

Ruido de línea de base ciclico

Fluctuaciones de temperatura

Mezcla de solventes insuficiente

Columna a 5 grados por encima de la ambienteObservar ubicación de equipos respectos unidades de calor o frio.

Si haciendo la mezcla en una sola botella el problema desaparece es un problema del mezclador-ver vía A y B si funcionan correctamente por separado. Si es asi cambiar mezclador-para molec grandes a flujos bajos, utilizar mixer de mayor volumenPuede ser debido a fases móviles con diferentes Abs a la longitud de onda de trabajo


� Ruido errático

� Línea plana, no picos

Pulsaciones en la bomba

Filtros de botellas sucios

Inexistencia de restrictor de presión a la salida del último detector

Purgar las bombas con fase móvil. Si no se soluciona purgar con metanol o isopropanol. Sonicar las ckeck valves o sustituirlas por unas nuevas si es necesario.

Provocan burbujas en los tubos de solventes de la botella. Quitar los filtros de la botella y cambiar por unos nuevos

Colocar restrictor de presión a la salida del detector (tubo azul). Si detras hay un detector de masas no es necesario

Linea de baseLinea de base

Spikes Burbujas

Falta de restrictor de presión

Ruido eléctrico

Purgar la bomba con metanol y despues pasar 100% de metanol por todo el sistema incluido el detector para eliminar posibles burbujas

Instalar restrictor de presión a la salida del detector (tubo azul). Genera 250 psi. Si detrás hay un detector de masas no es necesario

Adquirir un cromatograma sin pasar fase móvil por el detector. Si el ruido es exactamente igual puede ser ruido eléctrico.


Saturación del detector

exactamente igual puede ser ruido eléctrico. Vigilar conexiones a circuitos eléctricos próximos.

Comprobar si diluyendo la muestra sucede lo mismo. Comprobar los parámetros de detector programados en el método

Linea de BaseLinea de Base

Línea de Base Plana Comprobar si fluyen los solventes

La lámpara no se enciende

Celda sucia

Longitud de onda incorrecta

Suficiente volumen en botella, caudal correcto

Cambiarla por una nueva o contactar con Waters

Mirar la energia del detector. Si es muy baja puede que la celda esté sucia. Limpiar la celda. (Protocolo de limpieza de celdas)

Comprobar que la longitud de onda


Longitud de onda incorrecta

Fugas en el equipo

Fase móvil tiene más lectura que analito

No se ha inyectado

Comprobar que la longitud de onda seleccionada es correcta

Chequear que no hay fugas. Comprobar si el flujo a la salida de celda es correcto. Si no lo es debe de haber una fuga

Cambiar las composiciones de fase móvil

Revisar suficiente volumen de muestra en vial, vial en correcta posición, test de pesada.Hacer prime de sample syringe y realizar el “sample srynge leak test”

ACQUITY UPLC™ TroubleshootingACQUITY UPLC™ TroubleshootingTiempos de retenciónTiempos de retención


Tiempos de retenciónTiempos de retención

Tiempos de retención erráticosTiempos erráticos Equilibrado de sistema y fase móvil

Pulsaciones de bomba, presión inestable

Fugas en algun punto del equipo

Volumen de inyección o concentración de

Mirar condiciones de la aplicación para determinar el equilibrado.Si es gradiente, observar el tiempo de equilibrado entre iny e iny. Si se usa par iónico, asegurarse que en el primer uso de la columna, está perfectamente equilibrada.

Purgar bombas con metanol. Sonicar check valves.

Chequear si hay fugas. Medir el flujo a la salida de detector. Si es menor del marcado puede que haya fugas

Reducir el vol de inyección o bien diluirlo con f.m. Si se utiliza un


Volumen de inyección o concentración de muestra demasiado alta, disrupción del equilibrio

Fluctuaciones temperatura

Mezcla inadecuada de los solventes

Contaminación de columna

Reducir el vol de inyección o bien diluirlo con f.m. Si se utiliza un solvente más débil que la f.m, se puede inyectar un 10% del volumen de la columna, pero si este solvente es más fuerte, tan sólo un 1%.

Columna a 5 grados por encima de la temperatura ambienteObservar ubicación de equipos respecto a unidades de calor o frio.Confirmar que el estabilizador se usa.

Para confirmar un problema de mezcla:-hacer la premezcla, filtrar, desgasificar-usar vías diferentes-equilibrar la columna-inyectar un std un mínimo de 3 veces y comparar los tr.Si los tr son reproducibles con la mezcla prehecha, indica un problema de mezcla:-verificar miscibilidad-verificar bomba y mixer-ver “ruido de base cíclico”

-Pasar orgánico a la columna (tener en cuenta posibles precipitaciones!!)-limpiar o reemplazar columna-volver a inyectar-si el tr es errático: mirar solventes, contaminación de f.m o de precolumna o filtro inline


Tiempos de retención Incremento progresivo en el tr Equilibrado de sistema

Chequear columna, fase y composición correctas

F.M no desgasificada correctamente



Cebar todas las líneas


F.M no desgasificada correctamente

F.m. contaminada


Degradación de la columna

Fugas

Filtro de solventes o inlets de las diferentes líneas bloqueados

Cebar todas las líneasCambiar solventes de líneaDesgasificar offline y volver a equilibrar

Ver f.m en el apartado de deriva

-Limpiar columna según su documento de “care and use”.-en caso necesario reemplazar

Realizar test de columna o pinchar un system suitability.Cambiar por nueva en caso necesario

Inspeccionar las conexiones Realizar el “static leak test”

Chequear la presión que se genera en cada una de las líneas y cambiar tubos si es necesarioLimpiar o cambiar los filtros de botella y el filtro inline del equipo.


Tiempos de retención Decremento progresivo en el tr Equilibrado de sistema

Chequear columna, fase y composición correctas


Cambiar la fase móvil por una nueva. Cambiar columna si es necesario


Diluyente de muestra es más fuerte que f.m


Degradación parcial de la columna, pérdida de funcionalización


-Limpiar columna según su documento de “care and use”.-en caso necesario reemplazar

Realizar test de columna o pinchar un system suitability.Cambiar por nueva en caso necesario


Tiempos de retención Cambio del tr a un nuevo valor fijo

Fase móvil o columna incorrecta

Temperatura programada en el column heater incorrecta

Comprobar posible malfunción de la bomba

Verificar si la columa es la adecuada. Cambiar por una fase movil nueva.

Comprobar si la temperatura programada es correcta y si no lo es cambiarla

Verificar el caudal midiendolo con probeta a la salida del detector

Vigilar aditivos y usar algún conservante.


Fase móvil contiene estabilizador

“Volumen de retraso del gradiente” incorrecto. Cambio de tubos por otros de diferente volumen (diámetro interno o longitud)

Partial loop con presión asistida con el weak solvent diferente de fase móvil

Vigilar aditivos y usar algún conservante.

Determinar si ha habido algún cambio a nivel de fluídica y en todo caso reajustar el retraso de gradiente correspondiente

Chequear o cambiar weak wash por una adecuada y caracterizarlo

Resultados cualitativos incorrectosResultados cualitativos incorrectos



Más picos de los esperados

Fase móvil contaminada

Muestra degradada o impurezas que vienen del proceso de preparación del equipo

Equipo contaminado

Ver punto de f.m en derivaVigilar la calidad de los solventes usados, filtrarlos

Inyectar std y comprobar que todo está correcto. Inyectar blanco y comprobar que no salen picos extras. Si así es, cambiar columna por una nueva.Vigilar temperatura del compartimento de muestras

Chequear el equipo para diagnosticar contaminación (ver documento de contaminación)


Carryover: compuestos que se arrastran de una inyección anterior. Puede deberse a:

- Inyector no se limpia suficente en cada inyección

- Columna no se limpia bien en cada inyección

- Lavado de aguja no funciona

- Problema en inyector

Pico ancho en medio de cromatograma

Picos desdoblados o con hombros-colas

Weak wash contaminado

Cambiar strong solvent por uno mas adecuado o aumentar el volumen de lavado.

Incrementar fase de limpieza en gradiente o tiempo entre inyección e inyección

Válvula defectuosa, bomba defectuosa, siphoning solvent. Cambiar pieza defectuosa

Reemplazar la pieza defectuosa

Puede venir de f,m que se acumula en columna y eventualmente se eluye, o bien de muestra previa. Modificar el gradiente con una etapa de lavado agresiva antes de volver a condiciones iniciales.

Ver sección de forma de pico

Hacer una inyección a full loop, si la cromatografia es ok, el weak wash está contaminado.


Menos picos de los esperados

Muestra degradada o impurezas que vienen del proceso de preparación del equipo

Pérdida de resolución

Pérdida de sensibilidad. Dejamos de ver los picos

Inyectar std y comprobar que todo está correcto. Si hay menos picos, utilizar fase nueva y columna nueva.

Según el detector chequear sensibilidad


Pérdida de sensibilidad. Dejamos de ver los picos más pequeños. El resto se ven más bajos

Aumento del ruido y algunos picos quedan absorbidos por el ruido

Muestra ha precipitado, también observaremos un incremento de presión

No se realiza bien el gradiente. La bomba con fase orgánica da menos caudal. Los último picos no tienen tiempo de salir.

Según el detector chequear sensibilidad (énergia en un detector UV, perdida de sensibilidad en MS)

Determinar segun el detector si el nivel de ruido es aceptable y similar al habitual.

Preparar muestras nuevas. Preparar estandar y chequear si salen todos los picos

Medir el caudal de cada una de las bombas por separado. Si no escorrecto proceder a su revisión.

Forma de pico y consecuenciasForma de pico y consecuencias

Falta de resolución

Picos Anchos Detectores UV: - Sampling rate muy baja.

- Filtro del detector demasiado alto

Detectores MS: - Velocidad de adquisición.

- Demasiado smoothing

Adquirir a una sampling rate suficiente para obtener 15/20 puntos por pico.

Disminuir el filtro con cuidado de no aumentar mucho el ruido de linea de base.

Fijar scan time o dwell time de modo que se adquieran 15/20 puntos por pico.

Reducir smoothing para evitar la distorsión de


- Demasiado smoothing

Tubos de entrada y salida de columna inadecuados (diametro interno superior al habitual).

Férrulas de loop o tubos colocadas incorrectamente. Tubos mal cortados

No está instalado el estabilizador de temperatura

Vol de inyección o concentración de muestra demasiado elevada

Diluyente de muestra demasiado orgánico respecto a la fase móvil

Needle wash solvent con demasiada proporción de orgánico

Una parte del método o todo él es isocrático

Reducir smoothing para evitar la distorsión de pico

Chequear los tubos instalados y sustituirlos si es necesario. Para acquity deben ser de 0.005” o menor de diámetro interno.

Chequear y cambiar si es necesario las conexiones. No es necesario cortar los tubos. Se suministran cortados

Instalar el estabilizador

Reducir a la mitad el vol de inyeción para chequear si es el problema, diluir la muestra hasta 10 veces

Chequear y sustituir si es necesario

Needle wash solvent debe tener composición similar a la de la fase móvil inicial

Probar a utilizar un métdo de gradiente



Picos con colas Tubos de entrada y salida de columna inadecuados (diametro interno superior al habitual).


Vol de inyección o concentración demasiado elevada

Chequear los tubos instalados y sustituirlos si es necesario. Para acquity deben ser de 0.005” o menor de diámetro interno.


Debemos escalar la capacidad en masa y volumen a la columna utilizada. Reducir volumen de inyección


Columna degradada que forma volumen muerto

Precolumna degradada

Analito muy hidrofóbico

Caudal demasiado bajo para el tipo de columna

Modo de inyección inadecuado

Weak wash es incompatible con la cromatografía y con el diluyente de muestra

volumen de inyección

Chequear la columna

Sacar la precolumna y si la cromatografia se recupera, reemplazarla

Incrementar la pendiente de gradiente o la proporción de orgánico

Cambiar el flujo por uno mas adecuado a la columna

Probar con otro modo de inyección. Por ej con Full loop puede que inyectemos demasiada cantidad de muestra en la columna

Needle wash solvent debe tener composición similar a la de la fase móvil inicial y ser compatible con diluyente de muestra.



Picos con hombros o frontingVolumen de inyección demasiado grande o sample overload, demasiada concentración

Diluyente de muestra demasiado orgánico

Composición de weak wash demasiado orgánico

Columna o precolumna contaminada o

Diluir la muestra o reducir volumen de inyección.

Reducir volumen de inyección ó disminuir porcentaje de orgánico del diluyente

Needle wash solvent debe tener composición similar a la de la fase móvil inicial

Sacar la precolumna y si la cromatografia se


Columna o precolumna contaminada o degradada o formando un volumen muerto


No está instalado el estabilizador de temperatura

Dos compuestos o isomeros que coeluyen

Sacar la precolumna y si la cromatografia se recupera, reemplazarla. Limpiar o reemplazar la columna si es necesario


Instalar el estabilizador

Modificación del método



Picos inacabadosParámetros del detector incorrectos

Volumen inyectado o concentración de muestra demasiado elevada

La fase móvil tiene demasiada absorbancia a la longitud de onda elegida reduciendo el rango de trabajo del TUV o PDA

Chequear el método de instrumento

Diluir la muestra o reducir volumen de inyección

Escoger una fase móvil más transparente o cambiar la longitud de onda de trabajo


Picos negativosLa fase móvil absorbe más que el analito a la longitud de onda elegida

Problemas de frente de solvente

Escoger una fase móvil más transparente o cambiar la longitud de onda de trabajo

Hacer más compatible el solvente de inyección y la fase móvil

SensibilidadSensibilidad

Pérdidas de sensibilidadVolumen de inyección

Columna

Volumen de inyección incorrectamente programado

Inyector mal configurado

Fuga en el inyector

Columna degradada, contaminada o con volúmenes muertos

Chequear el volumen de inyección

Chequear volumen de loop y aguja. Caracteizar de nuevo volumen de loop y aguja

Chequear for fugas en las conexiones del inyector


Conexiones

Muestra

Fase Móvil

Temperatura de columna programada es demasiado baja, el tr se alarga y el pico se ensancha

Deben estar correctamente, volúmenes muertos darán como resultado formas de pico no deseadas. Férrulas de loop o tubos colocadas incorrectamente.

Concentración insuficiente

No está completamente disuelta o precipita a lo largo del tiempo.

Se evapora o degrada

Fase móvil errónea (pH incorrecto, contaminada..)

Chequear temperatura de columna en el método

Chequear y cambiar si es necesario las conexiones.Chequear si hay fugas en alguna conexión del sistema

Aumentar concentración o volumen de inyección

Chequar su solubilidad y si hace falta elevar la temperatura del compartimento de muestras (a temperaturas bajas puede ser insoluble)

Disminuir la temperatura del compartimento de muestras

Preparar fase móvil nueva


Pérdidas de sensibilidadAguja

Weak wash solvent incorrecto

Aguja calibrada demasiado alta. Needle draw depth programado erróneamente en el método.

Aguja de peek, los compuestos hidrofóbicos se enganchan a ella

Demasiado orgánico, resulta en mala forma de pico, especialmente para los compuestos más hidrofílicos

Realizar de nuevo calibración Z de la aguja.Comprobar needle draw depth

Probar con otro tipo de aguja

Cambiar la composición del weak wash solvent


Loop offline

Jeringa de muestra

Platos

Temperatura

El loop se aisla demasiado rápido del paso del caudal y parte de la muestra no llega a ser inyectada en la columna

No se han cebado o hay burbujas.

Fugas en la jeringa

Velocidad de aspiración de la jeringa demasiado alta. Puede coger burbujas

Configuración de platos errónea

Temperatura de columna demasiado baja o estabilizador omitido

Evitar usar el loop offline aunque el flujo sea muy bajo y el loop muy grandeSi se usa pasar caudal por el loop más tiempo (3 veces el volumen total del loop) antes de aislarlo

Purgar el inyector

Chequear si fuga. Realizar test de jeringa

Cambiar la velocidad de aspiración en el método

Comprobar configuración de los platos

Modificar la temperatura. Instalar estabilizador


Pérdidas de sensibilidadData rate

Filter time constant

Energia de detector

Longitud de onda

Números de puntos por pico insuficientes. Mínimo se necesitan 15 o 20.

Si el filtro es demasiado alto, se reduce el ruido de fondo pero los picos serán más bajos y con colas.

Energia de detector baja debido a celda sucia o lámpara con muchas horas

Longitud de onda programada incorrectamente

Adquirir a una sampling rate suficiente para obtener 15/20 puntos por pico.

Disminuir el filtro con cuidado de no aumentar mucho el ruido de linea de base.

Comprobar energia de la celda. Limpiarla si es necesario. Cambio de lámpara si es necesario

Comprobar la longitud de onda del método


Material de vidrio

Vial

Vigilar los detergentes, algunos de ellos pueden causar ruido de fondo en el detector o supresión iónica en el masas

Usar vidrio borosilicatado

Comprobar que el compuesto no se adhiere al vidrio

Burbuja de aire en el fondo del vial, habitual en los insertos

Vigilar volúmenes residuales de cada tipo de vial

Usar preslit, el no usarlo puede provocar vacío al inyectar

Usar vidrio desactivado

Poner volumen de muestra superior al volumen residual

SobrepresiónSobrepresión

Puntos a chequear por este orden

Desconectar entrada a celda del detector Si presión baja el problema está en la celda, seguir los protocolos de lavado de la celdaSi presión no baja, está antes de celda


Desconectar tubo salida de columna Si la presión baja, está en el tubo de conexión de salida de columna a detector, comprobar también tornillos. Cambiar tubo.Si no baja el problema está antes

Desconectar conector entrada de columna Si presión baja, el problema está en columna, lavarla, cambiar frits, o renovar columnaSi no baja, es anterior

Desconectar del prefiltro online o precolumna Si presión baja, sustituir prefiltro o precolumna por una nueva

SobrepresiónSobrepresión

Puntos a chequear por este orden

Desconectar salida de inyector Si presión baja el problema está en el tubo de conexión de inyector a columna o en válvulas del column manager. Limpiar o cambiar tuboSi no baja es anterior


Antes de loop de inyección Si baja está precipitado en el loop, o válvula de inyección. Realizar lavados o cambiar loop por uno nuevoSi no baja es anterior al loop

Desconectar filtro on line Si baja, el problema está en el filtro. Limpiar o poner uno nuevo

Column manager Para saber si está en alguno de los tubos del column manager, probar con diferentes posiciones de columna

� Precauciones básicas con la celda del detector:

— Limpiar con agua después de haber trabajado con tampones

— No dejar nunca la celda en agua durante mucho tiempo para evitar

crecimiento de microorganismos

— Nunca dejar la celda seca. El paso de luz por una celda seca puede

estropearla irreversiblemente

— Pasar fase móvil por la celda antes de encender el detector cuando éste

Limpieza de la celdaLimpieza de la celda


— Pasar fase móvil por la celda antes de encender el detector cuando éste

lleve un tiempo apagado.

� Si ya tengo la celda sucia u obturada como la puedo limpiar

— Pasando agua si la suciedad se ha originado trabajando con tampones

— Limpiar con soluciones ácidas. Existe un protocolo de limpieza disponible.

Esta limpieza se ha de realizar sin columna.

Limpieza de columnaLimpieza de columna

� Lavado Básico para columna C18, C8, Phenyl

100% agua, 20 volúmenes de columna

100% metanol, 20 volúmenes de columna

100% acetonitrilo, 20 volúmenes de columna

� Para columnas tipo amida, sb o hilic, seguir protocolos indicados en su

“care and use”


“care and use”

� Siempre leer los documentos “care and use” de las columnas, localizados

en los documentos insertados en el ecord.

� Para fases móviles con pH muy básicos, contactar con el departamento de

columnas, para elaborar protocolos de lavado individualizados

� Para largos períodos inactivos: guardar en 20% agua, 80% orgánico y bien

tapada. Nunca colgada del equipo.

ACQUITY UPLC™ACQUITY UPLC™

� Prevención de problemas de presión

— Filtrar todos los solventes con filtros de 0.2 µm y prepararlos

diariamente, incluidos weak y strong solvent

— Usar sales de alta calidad para preparar los tampones

— Usar solventes orgánicos de grado HPLC gradiente o superior




— No dejar nunca el equipo con agua durante mucho tiempo para evitar

crecimiento de microorganismos

o Usar 10-20% fase orgánica en agua cuando se deje el equipo parado, MeOH

o IPA son correctos

— Asegurarse de utilizar material limpio (botellas, equipos de filtración,

viales)

— Filtrar las muestras con filtros de 0.2 µm

Compatibilidad de solventesCompatibilidad de solventes

� ACQUITY UPLC™ System recommended Solvents� Methanol Methanol/water mixtures � Water Acetonitrile/water mixtures � Acetonitrile (ACN) Isopropanol (IPA)

� Sample diluents (in addition to the solvents listed above)� Dimethyl sulfoxide (DMSO) Dimethylformamide (DMF)

� Additives / Modifiers� 0.2% formic acid 0.1% trifluoracetic acid (TFA) � 0.1% triethyl amine (TEA) 0.1% hexafluorobuteric acid


� 0.1% triethyl amine (TEA) 0.1% hexafluorobuteric acid � 10mM phosphate buffer 10mM ammonium bicarbonate � 50mM ammonium hydroxide 50mM ammonium acetate � 0.1% Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)

� Cleaners� Phosphoric acid (=30%) Sodium hydroxide (=1M)

� ACQUITY UPLC™ System non-recommended Solvents� Methylene-Chloride Chloroform � Ethyl Acetate Toluene � Chlorinated solvents: (Trichlorobenzene) Strong acids >5%

diagnóstico y corrección de anomalías hplc /uplc · diagnóstico y corrección de anomalías...

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