Diagnóstico Micológico

Jorge FinquelievichDirector del Centro de Micología.

Depto de Microbiología. Fac. de Medicina. UBA

Características generales de los hongos

• Microorganismos eucariotas

• Nutrición lisotrófica

• Gran adaptabilidad a diversos hábitats.

• El talo vegetativo es la forma que expresan su • El talo vegetativo es la forma que expresan su parasitismo.

• Los esporos son la forma de dispersión y pueden actuar como elementos infectantes. La clasificación morfológica se basa micro y macromorfológicas.

Diagnóstico micológico

• Características clínicas de los pacientes. Permiten evaluar la toma de muestra y las mas útiles a tomar para

llegar al diagnóstico.

• Antecedentes epidemiológicos.Permiten dirigir los pedidos y evaluar la rentabilidad de las muestras.

Estudios de brotes.• Estudios de brotes.Permiten conocer la existencia y diseminación de hongos

productores de micosis en aéreas determinadas

• Pruebas de sensibilidad antifúngicaPermite conocer el comportamiento de las drogas

antimicóticas “in vitro”

Diagnóstico micológico

Directo: � Exámenes directos y cultivos

� Detección de componentes de la estructura celular. Moléculas estructurales o ácidos nucleicos.estructurales o ácidos nucleicos.

Indirectos� Dosaje de anticuerpos específicos.

Intradermareacciones de lectura tardía: detectan micosis infección.

Clasificación de las enfermedades

fúngicas (criterio topográfico)

• Micosis superficiales: comprometen la capa cornea de la piel y sus faneras. Se adquieren por contacto

• Micosis por inoculación traumática: pueden comprometer todas las capas de la piel y sus comprometer todas las capas de la piel y sus tejidos adyacentes, en general no se diseminan a distancia.

• Micosis profundas: pueden adquirirse por diversas vías. La inhalatoria, la mas común, es seguida por diseminación a partir del foco pulmonar a cualquier órgano de la economía.

Diagnóstico micológico

1. Toma de muestras

2. Transporte y conservación

3. Exámenes directos

4. Cultivos4. Cultivos

5. Búsqueda de antígenos fúngicos.

6. Detección de ácidos nucleídos

7. Búsqueda de anticuerpos

8. Interpretación de resultados

Toma de muestra

• Conocer las características clínicas y evolutivas de las lesiones.

• Suspender la medicación antifúngica local y sistémica.sistémica.

• Suspender el uso de cremas, talcos, etc.

• Evaluar el riesgo y la morbilidad asociada a la toma de muestras

Transporte y conservación

• Micosis superficiales• Escamas

• Material esteril

• A temperatura ambiente

• Procesar dentro de las 24 hs de obtenida las muestras

• Micosis subcutáneas y profundas:• Micosis subcutáneas y profundas:• En general se deben conservar a 8°C Heladera común.

• Procesar lo mas cercano al momento de la toma de muestras, siempre dentro de las 24hs de su obtención. Sobre todo cuando las mismas provienen de zonas habitadas con biota normal o ambiental.

• La sangre para hemocultivos debe ser sembrada dentro de los medios líquidos inmediatamente de obtenidos, al lado del paciente y se deben incubar a 35/37°C

• En caso de sospechar infección por hongos de micelio continuo , el procesamiento debe ser inmediato. Tienden a la autolisis

Examen directo I

• Al estado fresco:

• En los materiales fluidos poner una gota entre porta y cubreobjetos.

• Las escamas o cualquier material córneo requiera la • Las escamas o cualquier material córneo requiera la digestión para la ruptura de la estructura queratínicacon KOH.

• En caso de orientar la búsqueda a levaduras capsuladas utilizar contraste con el agregado de tinta china.

Examen directo II• A fin de poner de manifiesto características tintoriales

o conocer la posición en relación a las células se deben utilizar coloraciones.

• Giemsa: permite observar la morfología celular, tiñe la levaduras y las forma tróficas y quísticas de P jirovecii.

• Coloraciones argénticas tiñe los talos.• Hacer tinciones para Gram, ZN y Kinyoun permite • Hacer tinciones para Gram, ZN y Kinyoun permite

conocer la asociación con otros microorganismos.• Los colorantes fluorescentes (blanco de calcofluor)

aumentan la sensibilidad de los exámenes observadas con técnicas al estado fresco

• Histopatología

Examen directo III

• La morfología observada en las muestras nos permite llegar a un diagnóstico de sospecha.

En el término de horas permite elegir un • En el término de horas permite elegir un tratamiento antifúngico.

Exámenes directos

� Examen en fresco o con coloraciones

1. Permite reconocer la presencia de elementos fúngicos

2. Diferenciar las formas levaduriformes de las miceliales

3. Diferenciar los micelios hialinos de los pigmentados

4. Diferenciar micelios tabicados y continuos.4. Diferenciar micelios tabicados y continuos.

Baja sensibilidad

Buena especificidad dependiendo del conocimiento del origen de la muestra, y del estado y

antecedentes de los pacientes

�Permite conocer la invasión tisular .

�La observación de trombos fúngicos confirma el carácter micótico

�Las coloraciones de H&E permiten estudiar el tipo de reacción y distinguir los hongos hialinos de los pigmentados.

PAS y Grocott aumentan la sensibilidad por evidenciar la presencia

Estudios histopatológicos

�PAS y Grocott aumentan la sensibilidad por evidenciar la presencia de hongos

�El uso de métodos inmunohistoquímicos y moleculares aumentan la sensibilidad y permiten llegar en algunos casos

al diagnóstico de género y especie.

Estudios histopatológicos•La observación de hongos en tejidos con

coloraciones especiales, PAS y Grocott.

•Permiten ver la forma tisulares y estudiar el

tipo de reacción inflamatoria.

•Su tiempo de procesamiento puede variar de

24 a 72 horas.

•Está en desarrollo promisorio la tipificación •Está en desarrollo promisorio la tipificación

de género y/o especie por PCR y anticuerpos

específicos.

Cultivos I

• Permite el aislamiento del agente etiológico.

• Es una técnica que permite conocer tanto el talo vegetativo como el de fructificación, sirven para caracterizar los géneros y especies.

Se deben incubar a 1 o 2 temperaturas• Se deben incubar a 1 o 2 temperaturas

• Se deben sembrar entre 4 y 6 tubos por material.

• De acuerdo a sus características pueden desarrollar a partir de las 24 hs pero no se deben descartar los cultivos hasta los 30 días

Diagnóstico micológico Cultivos

• Son métodos de concentración

• Los medios cromogénicos permiten aislar e identificar algunas especies de levaduras

• Detectar infecciones mixtas• Detectar infecciones mixtas

• Permiten el aislamiento del agente causal

• Permiten la identificación de género y especie

Cultivos II

• Los hongos se pueden identificar por• La morfología

• Las pruebas bioquímicas

• La producción de exoantígenos.• La producción de exoantígenos.

• Caracterización de sus secuencias proteicas por espectrometría de masa.

• Estudio de sus ácidos nucleídos por PCR o secuenciación. Única manera de conocer los componentes de grupos de especies con morfología similar (concepto filogenético de especies) o las similares respuestas a las pruebas bioquímicas.

• La utilización de métodos automatizados y de lisis-centrifugación son los mas sensibles en los casos dehistoplasmosis diseminadas.

• El aislamiento de hongos levaduriformes tiene unalto valor predictivo positivo.

• La sensibilidad es variable.

Diagnóstico micológico Hemocultivos

• La sensibilidad es variable.

• Mas del 60% de los pacientes con fusariosispresentan hemocultivos positivos.

• El hallazgo de Aspergillus spp. y otros hongosambientales se deben interpretar en relación con laclínica y el aislamiento en otros materiales.

Cultivos III

• Aislamientos de los hongos. Aportan el diagnóstico de certeza por la caracterización del género y la especie del agente etiológico.

• Permiten conocer la susceptibilidad a los • Permiten conocer la susceptibilidad a los antifúngicos.

• Permiten conocer la epidemiologia de la enfermedad a partir de la fuente de contagio analizando el hábitat natural de los microorganismos

•El aislamiento primario lleva 24 a 48 hs.

•El uso de medios cromogénicos permite

conocer la especie en forma precoz y detectar

las infecciones mixtas.

•Su identificación requiere de pruebas

bioquímicas que tardan 24 a 72 hs. Son

Para hongos levaduriformes

bioquímicas que tardan 24 a 72 hs. Son

métodos comerciales

Equipos para identificación de microorganismos

• El aislamiento debe estar relacionada con la clínica.• El aislamiento de A. fumigatus y A. flavus de muestras

respiratorias tiene valor predictivo en pacientes neutropénicos.

Interpretación de resultados cuando solo hay cultivos

neutropénicos.• La agresividad de los mucorales justifica comunicar su

aislamiento.• El aislamiento de hongos del género Candida solo

tiene valor diagnóstico si fueron aislados de cavidades cerradas.

• Detección de biomarcadores

• Galactomananos de Aspergillus en suero y LCR

• Beta-Glucanos panfúngico

• Glucuroxilomananos (GXM) para Cryptococcus

• Resultados en el termino de horas.• Disponibilidad económica para equipamiento y equipo s

comerciales. • Sensibilidad y especificidad variable. En general a lto VPN.• Permiten adoptar conductas terapéuticas racionales

Detección de ácidos nucleicos

• Técnicas no estandarizadas

• PCR para la detección de hongos (panfúngico)

• Detección de ac. Nucleicos en diversos materiales para: MSE, Aspergillus, etcmateriales para: MSE, Aspergillus, etc

• PCR- real time para aspergilosis

Diagnóstico Indirecto

• Detección de anticuerpos

• Detección de IgG e IgM• Útiles en micosis sistémicas endémicas.

• Las técnicas de precipitación son cuali-cuantitativas. Baja sensibilidad alta especificidadsensibilidad alta especificidad

• Las de ELISA son de alta sensibilidad

• La especificidad depende de los antígenos que se utilizan.

• Detección de IgE especifica para Aspergillus por RIA o

ELISA

• Su presencia diagnostica la aspergilosis broncopulmonar alérgica. Su cuantificación es fundamental para el seguimiento de la misma.

Un diagnóstico micológico precoz posibilitará un uso racional de los

antifúngicos y limitará el desarrollo de antifúngicos y limitará el desarrollo de resistencia.

Conclusiones Finales

• El diagnóstico micológico clásico es aun hoy la forma mas segura de confirmar la enfermedad fúngica y caracterizar su agente etiológico.

• La recuperación por cultivo del hongo permite:

I. Elegir el tratamiento mas adecuado de acuerdo a su I. Elegir el tratamiento mas adecuado de acuerdo a su género y especie.

II. Estudiar la susceptibilidad a los antifúngicos.III. Caracterizar a través de estudios moleculares su

responsabilidad en la aparición de brotes de infecciones intrahospitalarias.

IV. Establecer medias de control

Conclusiones Finales

Detección de biomarcadoresI. La búsqueda de antígenos capsulares (GXM) de Cn en

cualquier hospedero presenta alto nivel de evidencia y es diagnóstica.

II. La cuantificación de galactomananos de Aspergillus en pacientes oncohematológicos son útiles para su categorización.

III. La detección de Beta glucanos es útil como prueba panfungica, aunque no permite conocer infecciones por

III. La detección de Beta glucanos es útil como prueba panfungica, aunque no permite conocer infecciones por hongos de micelios continuos y levaduras capsuladas

Búsqueda de anticuerposI. La detección de anticuerpos en pacientes

“inmunocompetentes” ha demostrado su utilidad en la toma de conductas terapéuticas.

Conclusiones Finales

Las técnicas moleculares son aun hoy promisorias:

I. No están estandarizadas.

II. Presenta utilidad con evidencia variable en II. Presenta utilidad con evidencia variable en la caracterización de los hospederos inmunocomprometidos.

III. Son útiles en la caracterización de brotes de infecciones intrahospitalarias.