Detección e identificación de Phytophthora spp. como

herramienta de prevención

Paloma Abad CamposInstituto Agroforestal MediterráneoInstituto Agroforestal Mediterráneo

Universidad Politécnica de Valencia

pabadcam@eaf.upv.es

Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014

Síndromes observados:

� lento decaimiento progresivo

� rápido colapso mortal

Múltiples factores implicados

�¿están las raíces del árbol infectadas por el microorganismo patógeno Phytophthora cinnamomi?

�¿están las raíces infectadas por otras especies de Phytophthora

que también pueden ser patógenas?

Ciclo de infección

Reproducción asexual

1ddi

3ddi 4ddi

5ddi4ddi

6ddi 7ddi

micelio esporangios

clamidosporas

7ddi

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PHYTOPHTHORA SPP.

Detección molecular e Aislamiento de

Métodos modernosMétodos clásicos

Detección molecular e identificación de especies de Phytophthora mediante pirosecuenciación

Detección molecular de P. cinnamomi con sonda específica

Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014

Aislamiento de Phytophthora en medios de cultivo semiselectivos a partir de raíces

Detección de propágulos de Phytophthora en suelo mediante material vegetal trampa y su aislamiento en medios de cultivo

Toma de muestras en campoDehesa muestreada• 3 árboles sintomáticos en la parte aérea • 3 árboles asintomáticos en la parte aérea

Cada árbol muestreado• 4 submuestras raíces• 4 submuestras suelo

Árbol

1m2

1m21m2

1m2

Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014

Aislamiento de raíces Aislamiento a partir de lesiones desarrolladas en las trampas vegetales

Métodos clásicos: aislamiento

PARPBH

PDA

Phytophthora

Pythium

Métodos modernos: análisis del ADN

Extracción del ADN de cultivos puros (Phytophthora, Pythium)

Amplificación de la región ITS del ADN ribosomal

Secuenciación de los productos de la amplificación

Comparación con secuencias depositadas en la base de datos GenBank

1) Identificación molecular de los aislados

GenBank

2a) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en raíces de encina

Extracción del ADN genómico de raíces (50 mg)

2a) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en raíces de encina

No. Colour Name Genotype Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5

4

R22 78.8 87.8

6

R24 74.5 79.2 87.7 92.5

9

R27 75.8 85.5 91.2

10

R28 75.2 79.8 88.0 92.5

11

R29 80.0 87.8

12

R30 79.5 88.0

13

R31 78.5 87.5

15

R33 79.0 87.5 92.7

Las curvas melting relacionan la temperatura de desnaturalización del ADN con el tamaño del amplicon, e indican presencia de varias especies de Phytophthora en la mayoría de raíces

2b) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en suelo de dehesas con encinas

Extracción del ADN genómico de suelo (500 mg)

2b) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en suelos de dehesas con encinas

Las curvas melting indican presencia de varias especies de Phytophthora en las muestras de suelo de diversas dehesas

3) Pirosecuenciación de muestras de raíces y suelo para la detección de Phytophthora spp.

� Pirosecuenciación 454 (Roche): técnica de secuenciación masiva de DNA

basada en la detección de pirofosfatos liberados durante la síntesis del DNA

� Generación de librerías de amplicones

Primera PCR: 30 ciclos, calculados mediante qPCR

Segunda PCR: 25 ciclos

A ,B: adaptadores de pirosecuenciaciónA ,B: adaptadores de pirosecuenciación

Key (TCAG): se añade para la calibración de la señal

MID: se añade para la identificación de la muestra

� Cuantificación de las librerías

Fluorimetría: Quant-iT PicoGreen kit (Invitrogen Molecular Probes)

Cálculo del número de moléculas por cada amplicón y su longitud

3) Pirosecuenciación de muestras de raíces y suelo para la detección de Phytophthora spp.

� PCR en emulsión

Se suministró el mismo número de moléculas de cada librería

� Pirosecuenciación 454

Las librerías se secuencian en una placa de la plataforma Junior

Genome Sequencer (454 Life Sciences⁄Roche Applied Biosystems)

25,64

1,72

20,56

3,820,03 0,08

48,15

CLADO 2

CLADO 3

CLADO 4

CLADO 6

CLADO 7

CLADO 9

Pythium sp.

Encinas sintomáticas

Resultados de pirosecuenciación del ADN extraído de raíces

10,25

42,44

1,36

6,47 0,010,40

39,07

CLADO 2

CLADO 3

CLADO 4

CLADO 6

CLADO 7

CLADO 9

Pythium sp.

Encinas asintomáticasAdaptado de Cooke et al. 2000 por G. Abad

• GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN HONGOS FITOPATÓGENOS IAM-UPV

José García Jiménez, Mónica Berbegal, Maela León, Santiago Catalá, Beatriz Mora, Alexandra Puértolas, Rubén Moliner, Miguel Ángel Redondo

Agradecimientos

� Ministerio de Ciencia e Innovación Programa Nacional I+D+i AGL2011-30438-C02