diagnÓstico de enfermedades por fitopatogenos

7/28/2019 DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES POR FITOPATOGENOS

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UNIVERSIDAD DE MATANZASCAMILO CIENFUEGOS

Ttulo: Tcnicas para el diagnstico y determinacinde variabilidad gentica de fitopatgenos.

Autores: Olga Lidia Macias Figueroa Yosmary Delgado Calvo Eliel Pea Marrero

Roberto Len BetancourtRoberto Elas Barreto

Email olga.macias @umcc.cu

[email protected]

Ao 2006


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I. Introduccin.

Las enfermedades de las plantas tienen una notable importancia en laagricultura moderna, no slo porque poseen el potencial de destruirenteramente las cosechas, sino porque an en los casos en que no causan

prdidas totales, por lo general reducen, en forma crnica, el rendimiento de lamayora de los cultivos y obligan a tomar medidas de lucha que aumentan loscostos de produccin; adems afectan la calidad y durabilidad de los productoscosechados.

Las enfermedades vegetales se conocen desde que el hombre empez acultivar la tierra, pero los conceptos sobre ellas han sufrido un largo procesoevolutivo de ms de veinte siglos. Ya filsofos griegos, como Teofrasto (370 286 a.n.e.), citan la aparicin de enfermedades en los cultivos y especulansobre sus posibles causas y tratamientos curativos. Durante la Edad Mediaencontramos que los sabios de aquella poca se asombraban ante la aparicin

de enfermedades vegetales, pues su confusin era total acerca de los factoresoriginarios de stas. La experimentacin cientfica no estaba al alcance detodos, y el perspicaz observador de la naturaleza vea limitada su capacidad deobservacin por la necesidad de tener que explicar los fenmenos naturalespor medio de un proceso de razonamiento deductivo. Interpretacionesincorrectas, basadas en un anlisis poco profundo de los hechos, influidas porla supersticin, y en algunos casos, por las creencias religiosas, fueronpasando de una a otra generacin, hasta llegar a ser aceptadas comoverdades inconmovibles (Patio, et al, 1981).

Incluso, a finales del siglo XVIII, los criterios actuales sobre el origen y lanaturaleza de las enfermedades vegetales, as como sobre la relacin delmedio ambiente con el desarrollo de stas, no haban sido adoptados an porlos investigadores en el estudio de las ciencias botnicas y agrcolas.

El desarrollo alcanzado por la Fitopatologa entre las ciencias agrcolas,adquiere en la actualidad relevante importancia en la agricultura moderna. Elestudio de los numerosos enemigos de las plantas constituye uno de los pilaresfundamentales para obtener cosechas ms productivas, necesidadimpostergable de la humanidad (De Faz, 1987).

Los microorganismos son los seres ms numerosos que existen en la tierra.Son organismos ancestrales que han colonizado exitosamente cada nichoecolgico posible. Se encuentran prcticamente en todas las regiones delplaneta, desde los polos, en ambientes bajo el punto de congelacin y muysecos hasta los trpicos con temperaturas altas y con elevada precipitacinpluvial. Su presencia y actividad es esencial para la salud y funcionamientoadecuado de todos los ecosistemas. Los microorganismos tambin pueden sercausantes de numerosas enfermedades a las plantas. Las condiciones para laproliferacin de los patgenos hasta alcanzar niveles epidmicos, sonespecialmente favorecidas por la difusin de cultivos gentica y culturalmentehomogneo (Zadoks y Schein, 1979).


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Los estudios microevolutivos y genticos en poblaciones naturales se basan enla evolucin de la diversidad y la comparacin entre poblaciones y gruposjerrquicos a lo largo del tiempo en diferentes ambientes.

La materia prima del mejoramiento es la variacin gentica disponible en el

material de partida, de ah, que evaluar y marcar la variacin gentica es degran importancia para la eficiencia de la seleccin.

El genoma de los organismos superiores contiene miles de loci estructurales yuna elevada proporcin del cido desoxirribonucleico con carcter repetitivo oredundante. Por lo tanto la estimacin de la cantidad exacta de variabilidadgentica es una poblacin imposible en la prctica. Los estimados devariabilidad constituyen una muestra de la variacin gentica total existente enla poblacin estudiada (Sigarroa, et al, 2001).

Los mismos autores agregan que la variacin gentica puede ser en diferentes

niveles, desde el estimado fenotipo hasta el material hereditario o ADN. Lamayor parte de estos estudios se han realizado a nivel allico (protenas,isoenzimas, fragmentos de ADN o al nivel nucleotidico (secuencia de base)).Como los estudios se iniciaron con protenas y enzimas, las estimaciones delos indicadores se desarrollaron por organismos diploides. Por lo que a travsde las tcnicas moleculares se ha hecho posible obtener datos de los genomasde organelos tales como las mitocondrias y los cloroplastos.

El objetivo del siguiente trabajo consiste en desarrollar algunos conceptosbsicos para el estudio de la Fitopatologa como ciencia al servicio de laagricultura y describir algunas de las tcnicas que se aplican en el diagnsticode patgenos y la determinacin de variabilidad gentica de los mismos ascomo las tcnicas para estudiar las variables climticas


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Desarrollo.

Generalidades sobre enfermedades, plantas y patgenos.

La Patologa Vegetal o Fitopatologa es la ciencia que se ocupa de las

enfermedades de las plantas.

La enfermedad es un fenmeno exclusivo y propio de los sistemas vivientes,que incumbe a todos los niveles de organizacin biolgica. La ciencia queestudia la enfermedad, o Patologa, es una disciplina general de la Biologa,del mismo nivel y con similar objeto (disfuncin y funcin) que la Fisiologa. Eneste contexto general el concepto de enfermedad ha evolucionadoconsiderablemente a lo largo de la historia y, sobre todo, durante los siglos XIXy XX (Llcer, et al, 1996).

Patio, et al, 1981), seala en su libro Sanidad Vegetal, que no hay una lnea

clara de demarcacin entre lo que se considera una planta sana o normal y unaplanta enferma, de ah que se hace difcil definir lo que es enfermedad. Existentantas definiciones como autores han abordado el tema. Sin embargo, sepuede consideran que: plantas enfermas son aquellas cuyo desarrollofisiolgico y morfolgico se ha alterado desfavorablemente y en formaprogresiva por un agente extrao, hasta tal punto que se producenmanifestaciones visibles de esa alteracin. Estas manifestaciones, que soncaractersticas de cada enfermedad, se llaman sntomas.

Llcer, et al (1996), plantean que una buena definicin de enfermedad esaceptada por el Comit de Terminologa de la American PhytopathologicalSociety: enfermedad es la disfuncin de un proceso, causada por una accincontinuada, con efectos deletreos para el sistema viviente, y resultante en lamanifestacin de sntomas. Los mismos autores agregan que esta definicin,puede aplicarse a todos los sistemas o niveles de organizacin vivientes, caberesaltar cuatro aspectos fundamentales:

1.La disfuncin se manifiesta por medio de sntomas, que no tienen por queser macroscpicos (Ej. Muchos estados patolgicos solo son reconocibles anivel molecular).2.Los efectos son negativos para el sistema viviente, por tanto muchas

situaciones consideradas como enfermedad desde el punto antropocntrico(Ej. Roturas de color de flores debidas a infecciones virales) no lo sonsegn este concepto.3.Se debe a una accin continuada, lo que la diferencia de daos oaccidentes (Ej. Si una mquina amputa una mano a un operario, ste sufreun dao y queda manco, pero no enfermo, y lo mismo con un pedrisco y uncerezo en flor).4.Es un proceso y como tal dinmico y, al menos hasta cierto punto,reversible (Ej. Una planta que pierde superficie foliar, debido a la actividadde fitfagos, no es una enfermedad).


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Importancia de las Enfermedades.

La enfermedad, como disfuncin, puede llevar a una disminucin de laproductividad y de la produccin biolgica de las plantas. La disminucin de laproduccin debida a enfermedades y/o el aumento de costos de produccinencaminados a prevenir y controlar las enfermedades, resultan en unadisminucin de la produccin econmica que llamamos prdida.

La importancia de las prdidas debidas a enfermedades es obvia cuandoresultan de grandes epidemias con efectos catastrficos sobre cultivos,regiones o sociedades enteras. Baste citar la epidemia en el cultivo de la papaen Irlanda, provocada por el hongo Phytophthorainfestans (Mont) (de Bary) enel ao 1845, que result en una hambruna cuya consecuencia fue la reduccin

de la poblacin de la isla, debida a la mortalidad y emigracin, a un 70 % de sunivel anterior a dicha epidemia. A otra escala, y cindonos a situacionesactuales en Espaa, podemos citar la epidemia de la tristeza de los ctricos,que desde 1957 ha infectado unos doce millones de rboles, causando lamuerte de ms de un milln, y obligando a un cambio importante en el cultivodel naranjo mediante el uso de portainjertos tolerantes, o las epidemias denecrosis de tomate debidas a los virus del mosaico del pepino (CMV) y delbronceado del tomate (TSWV) que desde los ltimos aos han llevado a unareduccin drstica de la superficie de dicho cultivo en buena parte de sus reastradicionales de la costa levantina.

Cramer, 1967, menciona que normalmente, sin embargo, las enfermedadespermanecen ms o menos endmicas en un rea geogrfica, y causanprdidas variables de un ao a otro segn sea su incidencia. Dentro de laslimitaciones propias de este tipo de estudios, las evaluaciones de prdidas anivel mundial sitan las debidas a enfermedades en un 12 % (diferencia entrela produccin econmica obtenida, o real, y la alcanzable si se optimizaran lossistemas de control disponibles). (Pimentel, 1981). La importancia de lasprdidas debidas a enfermedades frente a las debidas a otras causas comoplagas de artrpodos o malas hierbas, crece con a tecnificacin y con laintensificacin de la agricultura: as, es que el 13 % (sobre un total del 25 %

debido a enfermedades, plagas y malas hierbas) en Europa Occidental, y de un11 % (sobre un total del 43 %) en Asia. Sin duda esto refleja una menoreficacia del control de enfermedades respecto al de plagas o malas hierbas.Aunque los datos globales presentados son antiguos, los datos ms recientesde que se dispone para cultivos y reas concretos indican que siguen siendovlidos (Oerke et al, 1994).

Rabbinge, 1993, considera que las necesidades de alimento, fibra, madera, etc.de una poblacin mundial en continua expansin, y que la productividad de losprincipales cultivos herbceos (como cereales, leguminosas, papa oremolacha) parece estar cercana a un tope impuesto por las caractersticas del

propio sistema productivo, es decir, de la planta, la importancia de lasenfermedades de las plantas es evidente.


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Es posible disminuir las prdidas debidas a las enfermedades de las plantas?Es de esperar que s, y este es uno de los objetivos de la Patologa Vegetal.

Parece claro que las modificaciones del medio que comporta la actividad

agrcola y, en menor medida, forestal, favorecen la incidencia de lasenfermedades. Cabe destacar dos grupos principales de causas de laimportancia de las enfermedades en el agroecosistema:

Aquellas relacionadas con la homogeneidad de los cultivos: la mayor parte dela superficie cultivada lo est con muy pocas especies (Ej. El 90 % de losalimentos procede de solo 15 especies). Adems, dentro de una parcela enexplotacin o incluso regin, se tiende a la uniformidad gentica de estas pocasespecies. A estas mismas escalas el cultivo es uniforme, no slogenticamente sino por su distribucin espacial, de hecho lo normal es queindividuos de una sola variedad ocupen todo el espacio. Por ltimo, a esta

uniformidad gentica y espacial puede aadirse una uniformidad temporal, alcultivarse las mismas especies o variedades en el mismo espacio estacin trasestacin.

La uniformidad de los cultivos, agrcolas o forestales, resulta en unasoportunidades muy favorables para el incremento de las poblaciones de lospatgenos que tengan la virulencia necesaria, y por tanto para el incrementodel impacto negativo de las enfermedades.

Aqullas relacionadas con la propia actividad agrcola o forestal. Adems de lasalteraciones del agroecosistema debidas a multitud de prcticas ligadas a laintensificacin de los cultivos, cabe destacar:

Incrementos involuntarios de susceptibilidad a patgenos de variedadesmejoradas con otros fines.

El agroecosistema, a diferencia de los ecosistemas naturales, reponecontinuamente el husped, evitando su extincin y la del patgeno.

La introduccin de patgenos o huspedes en reas nuevas lleva a nuevascombinaciones que pueden ser especialmente importantes. Como ejemplos

se pueden citar la introduccin de Amrica a Europa de Plasmoparaviticola, ysu contacto con la vid europea, mucho ms susceptible que las especiesamericanas, o la introduccin del cacao de Amrica a frica Occidental, y sucontacto con el virus del brote hinchado del cacao (CCSV) que encuentra enl un husped ms favorable, y en el que causa una enfermedad ms grave,que en su husped natural (el baobab).

Dentro de las posibilidades ms o menos estrechas se puede tratar demodificar estas causas, de forma que el agroecosistema sea menos favorableal desarrollo de las enfermedades. Sin embargo, no hay que olvidar que lospatgenos, como las plagas y las malas hierbas, se han domesticado con las

plantas cultivadas y son componentes inherentes al agroecosistema con losque es obligado convivir (Zadoks, 1993).


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Burdon, (1987), plantea que los patgenos son tambin componentesesenciales de los ecosistemas naturales, donde no siempre conviven con sushuspedes en condiciones cercanas al equilibrio, como a menudo se da porsupuesto con cierta ingenuidad. El estudio del papel de los patgenos en las

poblaciones naturales de las plantas se ha iniciado en fecha relativamentereciente. Segn se progresa en este campo parece claro que los equilibriospoblacionales husped patgeno slo se manifiestan a nivel metapoblacional,con extinciones y recolonizadores de huspedes y patgenos en las distintassubpoblaciones, como demuestran, por ejemplo, los trabajos del grupo Burdonsobre poblaciones silvestres de Linux marginales y su patgeno Melampsoralini. En otras ocasiones los patgenos pueden causar epidemias devastadorasy eliminar a un husped casi por completo de amplias reas geogrficas(Brasier, 1990).

Gibas, 1980; aport que la infeccin por un patgeno puede suponer una

ventaja selectiva, como es el caso de la infeccin de la leguminosa silvestreKennedya rubicunda por el tymovirus del mosaico de la Kennedya (KMV),cuyos sntomas conllevan una no preferencia de las plantas infectadas porparte de los fitfagos. Evidentemente el estudio del papel de las enfermedadesen poblaciones naturales de plantas contribuir a desterrar ideas simplistas y auna mejor comprensin de las posibilidades de manejo de los patgenos en elagroecosistema.

Importancia Econmica de la Fitopatologa

Las enfermedades de las plantas no solamente hacen disminuir las cosechas ysu rendimiento, sino tambin reducen considerablemente el valor de las tierrasen que han aparecido y hecho sus estragos.

A veces, las epidemias vegetales han sido la causa de numerosas prdidas devidas humanas; por ejemplo, los daos que pueden causar las enfermedades,lo tenemos en la destruccin que han sufrido los cocales, producto de laenfermedad pudricin del cogollo, lo que ha mermado considerablemente laproduccin de este notable rengln exportable, en detrimento de nuestraeconoma.

Es bueno sealar que las enfermedades de las plantas causan daos en formadirecta, al originar una disminucin de la produccin en cantidad y calidad; eindirectamente, al dificultar el desarrollo del fruto, y por tanto, su valor.

Las plantas, actualmente estn expuestas a un mayor nmero deenfermedades que en el pasado; la explicacin es lgica, los cultivos hanaumentado en extensin y variedad, lo que ha facilitado la aparicin ypropagacin de numerosas enfermedades desconocidas anteriormente en elpas; de ah la importancia que desde el punto de vista econmico adquiere eldominio de esta ciencia para evitar as el desarrollo y extensin de lasenfermedades en nuestro pas.


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La Patologa Vegetal tiene como objeto, el conocimiento de las enfermedadesde las plantas en cualquiera de sus aspectos, y orientado hacia su prevencin ycontrol. Tiene, por consiguiente, una doble vertiente:

a) Un ncleo cientfico terico, cuyo objeto cuyo objeto es comprender la

naturaleza de las enfermedades de las plantas.

b) Una componente tcnica, mediante la cual la teora se hace til y seorienta al control de las enfermedades.

La Patologa Vegetal, es por tanto una ciencia biolgica y una Ciencia Agraria,y se participa y se interrelaciona con las otras ciencias de estos dos mbitos(Biologa Molecular, Fisiologa Vegetal, Gentica, Microbiologa, Ecologa,Fitotecnia, Entomologa Agrcola, Herbologa, etc.) y con aquellas cienciasmatemticas y fsicoqumicas que le sirven de apoyo.

La doble naturaleza de la Patologa Vegetal y su desarrollo, condicionado porsu importante vertiente econmica, a moldeado el papel de los fitopatlogosque, hasta fecha muy reciente, rara vez se han ocupado nicamente de losaspectos tericos de su ciencia, sino que se han ocupado adems, de susderivaciones tcnicas. Esta circunstancia ha sido ventajosa en ciertos aspectosdel desarrollo de esta ciencia, pero a menudo dificulta a quienes la ejercen altener una visin global de la Patologa Vegetal como tal disciplina cientfica,con un cuerpo unitario de doctrina. En efecto, la pluralidad de huspedes y depatgenos, puede llevar a una aparente atomizacin de los aspectos tcnicosde la disciplina, que impida percibir la comunidad de conceptos, hiptesis ymtodos que comparten.

El amplio campo cientfico de la Patologa Vegetal puede dividirse en al menoscuatro grandes reas:

Etiologa: Estudio de la naturaleza y causas de la enfermedad.

El anlisis etiolgico basado exclusivamente en la teora del germen, segn lasllamadas reglas de Koch, ha tenido los efectos colaterales negativos de relegara segundo plano el anlisis de las enfermedades de causa no biolgica o decausa compleja. A lo largo del siglo XX se ha hecho de nuevo hincapi en la

importancia etiolgica de factores asociados al husped y al medio. Esto hadado lugar a una etiologa basada en el ya clsico triangulo de la enfermedadque representa a esta como la interaccin de factores asociados al patgeno,husped y medio ambiente. La ms reciente pirmide de la enfermedadintroduce el tiempo como elemento modificador de estos tres conjuntos defactores en la actualidad se huye de tendencias reduccionistas y se subrayaesta naturaleza multicompuesta de la enfermedad, como punto de partidanecesario para su comprensin (Bateman, 1978).


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Patognesis:

La enfermedad como fenmeno que afecta a individuos.

El estudio de la patognesis debe explicar la especificidad de las interacciones

entre husped y patgeno, que desembocan en una relacin compatible (o desusceptibilidad) o incompatible (o de resistencia). El anlisis de losfenmenos relativos ala interaccin husped-patgeno comienza alreconocerse el patogenismo de los hongos. Inicialmente se aborda mediantemtodos histolgicos de los que se trata d obtener informacin sobre loscambios que tienen lugar en el husped. El empleo de los mtodos de laFisiologa Vegetal caracteriza una segunda etapa del estudio de lapatognesis. Mc New, (1960), comenta sobre los trabajos realizados durante laprimera mitad del siglo XX permiten descubrir patrones de disfuncin (o dedesarrollo de la enfermedad) comunes a distintas enfermedades,independientemente del tipo de agente que las induzca lo que lleva a agrupar

las enfermedades segn los procesos afectados (destruccin de reservas,interferencia con el transporte vascular, interferencia con la fotosntesis, entreotros.). El enfoque fisiolgico permite adems analizar con detalles los distintosmecanismos ofensivos en el patgeno y defensivos en el husped y su papelen el desarrollo de la enfermedad (Whitman, et al 1994).

Clarke, et al 1992, menciona que durante los ltimos veinticinco aos, lametodologa propia de la biologa molecular ha llevado a un desarrolloespectacular el anlisis de los aspectos primarios de la relacin husped patgeno, que ha culminado con la identificacin y caracterizacin de genes deavirulencia / virulencia en el patgeno y muy recientemente, de los primerosgenes de resistencia en plantas.

3- Epidemiologa

La enfermedad como fenmeno que afecta a poblaciones.

La epidemiologa, desde sus inicios a mediados del siglo XIX, pasa por unaprimera etapa descriptiva de las tres componentes de la enfermedad, patgeno(ciclos vitales, principalmente), husped (diferencias de resistencia /susceptibilidad) y medio ambiente (sobre en cuanto al afecto en los ciclos

vitales de los patgenos). Posteriormente la epidemiologa evoluciona a unaecologa, descriptiva y cualitativa de los patosistemas.

El reconocimiento de la importancia del factor tiempo, y el paso a una etapaterico cuantitativa, es sorprendentemente reciente. Los trabajos pioneros deVan Der Plank, (1963), aplican por primera vez la metodologa de lademografa y la ecologa al anlisis de la dinmica poblacional de laenfermedad. Campbell, et al, 1990, comentan que el anlisis de la variacinespacio temporal de las enfermedades, si bien no ha generado hiptesis nimetodologas de originalidad cientfica sino que ha adoptado los mtodos ymodelos desarrollados por eclogos, epidemilogos (mdicos o veterinarios) y

demgrafos, a supuesto un gran avance en el entendimiento de las epidemiasy en el desarrollo de simuladores y modelos predictivos. Por otro lado, la


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aplicacin de la gentica de poblaciones al estudio de la interaccin entre laspoblaciones de plantas y patgenos, ha contribuido notablemente a entenderlas causas de las epidemias (Thompson et al, 1992). Esto ha generado unacontribucin muy notable (y, sta s, original): una teora de control que permitedesarrollar estrategias eficaces basadas en el uso cientfico de las distintas

tcnicas (o mtodos) de control de que se dispone.

Control.

El control de las enfermedades es la razn ltima de la Patologa Vegetal y,por otro lado, constituye su vertiente aplicada y tcnica, como contrapuesta acientfica. De hecho, tradicionalmente y an en la actualidad, los programas decontrol de las diversas enfermedades en los distintos entornos agroecolgicos,se han desarrollado de forma fundamentalmente emprica. Esto ha conllevado,a menudo, ineficacia o efectos negativos, como problemas de contaminacinpor plaguicidas o de implantacin en las poblaciones de patgenos de

resistencias a aquellos, o de superacin rpida de la proteccin conferida porgenes de resistencia. El desarrollo cientfico de la Patologa Vegetal y cienciasafines, ha posibilitado, desde hace ms o menos tres dcadas, elplanteamiento de estrategias de control cientficamente correctas ytcnicamente eficaces. Esto se ha conseguido principalmente por la integracinde conocimientos sobre:

a)La epidemiologa de la enfermedad.b)La fisiologa de la produccin y el efecto de la enfermedad en ella.c)La economa del cultivo considerando los condicionantes necesarios

desde una perspectiva de agricultura sostenible.Los conceptos de umbral econmico de daos o de control integrado,desarrollados por otros profesionales de la proteccin de cultivos (Carlson,1971).

Algunos efectos significativos del cambio en la perspectiva desde la que seorienta el control.

a)La revalorizacin de prcticas de control con pequeo efecto inmediatosobre las poblaciones de patgenos, pero con efectos potencialmente

importantes y estables a largo plazo, si se integran en estrategias msamplias. As, los mtodos basados en la modificacin del medio a travs deprcticas culturales o en el control biolgico, cobran especial relevancia.

b)La reconsideracin del uso de la resistencia gentica, incluyendo laobtenida por mtodo de ingeniera gentica (resistencia por transgenes).Los progresos en el anlisis de la gentica de poblaciones de husped ypatgenos, principalmente en poblaciones naturales, permiten disearestrategias en la que la resistencia, procurando una proteccin eficaz, nosea rpidamente erosionada.

Dentro de las estrategias de manejo, el uso de variedades resistentes poseemxima prioridad a nivel mundial; sin embargo, no siempre es posible contar


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con variedades que posean dichas caractersticas por lo que se agrava debidoa la cantidad de especies y razas existentes.

Generalidades sobre diagnstico de enfermedades.

Un diagnstico oportuno detecta el agente causal de un evento patolgico y esfundamental para el manejo del problema. Genera medidas de controlefectivas, optimizacin de los recursos, reduccin de los efectos negativos enel medio ambiente y a la vez origina informacin respecto a la interaccinpatgeno hospedante (Barnes, 1994 citado por Flores-Olivas, 1997., Vzquez,2003).El diagnstico y manejo de enfermedades y otros desrdenes en las plantasdepende del conocimiento de todos los factores que afectan el crecimiento ydesarrollo de los mismos. Usualmente, hay factores ambientales que causandao y afectan el crecimiento de las mismas, causando que stas se observenpoco vigorosas. Esto promueve que organismos causantes de enfermedades y

otras plagas, como insectos y caros, afecten las plantas. Al realizar undiagnstico debe asegurarse de tener un cuadro amplio del caso particular queest analizando y considerar otros factores como, la historia del lugar y elpatrn de dao causado por la enfermedad o plaga.Segn Malagn y Pupiro, (2003), el diagnstico de las enfermedades de formarpida y precisa evita el uso desmedido o incorrecto de compuestos qumicoscomo plaguicidas.En aos pasados, bsicamente la deteccin de patgenos dependa demtodos que requieren de mucha experiencia, habilidad y conocimiento de lataxonoma de los microorganismos. Adems son tcnicas que consumenmucho tiempo. Sin embargo las tcnicas modernas han permitido unadeteccin ms eficiente de variedades patognicas con mayor rapidez yprecisin, ejemplo de ello tenemos el uso de tcnicas serolgicas (ELISA) ymoleculares (PCR) (Rosales, 2003 citado por Malagn y Pupiro, 2003).

El diagnstico por PCR resulta ms rpido que los mtodos tradicionales paraaislar el patgeno y por lo tanto se minimiza las prdidas de los cultivos por lasenfermedades y los costos para el tratamiento se reducen. (Shaad y Frederick,2002).

Procedimientos para realizar un diagnstico

El diagnstico incluye la identificacin del problema, el alcance del problema,importancia de la magnitud del problema, mtodo de control empleado,demanda de investigacin y costo-beneficio (Vzquez, 2003).

1.2 Diagnstico presuntivo

Para realizar un diagnstico presuntivo lo ms certero posible el fitosanitariodebe tener en cuenta los siguientes aspectos:Examinar el campo y los alrededores.Identificacin de la especie o variedad enferma.

Patrones de anormalidad, distribucin geogrfica de la enfermedad en elcampo y comparacin de plantas.


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Examinar plantas individuales, posicin de sntomas y signos.Prcticas agrcolas del cultivo: fertilizacin, riego y control qumico.Antes de enviar una muestra para diagnosticar enfermedades o dao porinsectos al laboratorio, examine la planta para otros problemas como dao poranimales, factores nutricionales o ambientales. Adems, asegrese de que

est enviando una muestra que tenga los sntomas ms distintivos delproblema que usted est observando.

1.3 Diagnstico de confirmacin

1.3.1 Diagnstico tradicional.

Se pueden considerar dos fases (Flores- Olivas, et al, 1997):

Diagnstico macroscpico el cual se basa en la observacin de sntomas. Esmuy importante la experiencia del fitopatlogo y su conocimiento de las

variables que inciden en la enfermedad, como el cultivo a investigar, el suelo,clima, patgeno.Diagnstico microscpico, que consiste en la observacin de la estructuras delmicroorganismo fitopatgeno. Esta observacin puede ser directamente almicroscopio de luz, para el caso de las bacterias, hongos, nemtodos o en eluso de microscopa electrnica para identificar a los virusPara el diagnstico de los hongos se necesita la formacin de estructurasreproductivas, como esporas o conidios y cuando se trata de las bacterias, elproceso de identificacin debe complementarse con pruebas bioqumicas(Flores- Olivas, et al, 1997).

Estos principios de Patologa Vegetal sobre los que se apoyan gran parte delas investigaciones no pueden ser cumplidos por cierto grupo de patgenoscomo los virus, ya que su reducido tamao y su condicin de parsitosendocelulares obligados (no pueden ser cultivados en medios de cultivoartificial). En este tipo de enfermedades, la observacin de sntomas en campoy el empleo de formas alternativas de inoculacin en huspedes diferenciales,permite una discriminacin clara de ciertos patgenos.

2. Tcnicas clsicas para el diagnstico

Un requisito previo para el control de cualquier enfermedad es la deteccin eidentificacin apropiada del organismo causal. La deteccin de patgenos enplantas con sntomas puede ser relativamente simple si se tiene extensaexperiencia con el diagnstico de la enfermedad y aislamiento del patgeno.Por otro lado la deteccin del patgeno en las semillas y materiales depropagacin asintomtica tales como: tubrculos de papa, pueden sersumamente difciles cuando la poblacin de los patgenos es muy baja en lospropgulos. Debido a esto se necesita tcnicas capaces de detectar un nmerobajo de patgenos en los propgulos. Antes del desarrollo de las tcnicasserolgicas el nico mtodo disponible y fiable para la identificacin de hongos

y bacterias fue el aislamiento en medio de cultivo y prueba de patogenicidad.Las pruebas serolgicas permiten el diagnstico presuntivo de enfermedades


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bacteriana. Sin embargo hasta que no se desarrollaron las tcnicas basadas enADN, no se pudo detectar los patgenos en plantas asintomticas (Shaad yFrederik, 1992).

2.1 Empleo de medios selectivos

Mediante el empleo de medios selectivos se puede realizar una determinacincuantitativa de poblacin. Algunos medios selectivos se basan en lasposibilidades de las bacterias de utilizar sustratos especficos. La presencia oausencia de crecimiento y el color de las colonias son importantes Ejemplo: Lasespecies del gnero Erwinia causantes de la pudricin blanda producenenzimas peptolticas que sirvieron de base para la confeccin de un medioselectivo que contiene polipectato sdico, las cavidades que se forman en lasuperficie del medio indican la presencia de microorganismos peptolticos.Estas enzimas degradan las pectinas de la lmina media, causando el colapsodel tejido, pudricin blanda y muerte de la clula

Otros medios se basan en la tolerancia del patgeno a cierto nmero deantibiticos, fungicidas, bactericidas que los microorganismos saprfitos notoleran o no soportan en determinadas concentraciones. Se emplean tambindiferentes colorantes que provocan un crecimiento caracterstico y desarrollode colonias cuyo aspecto permite distinguirlas fcilmente de otros que no secorresponde con el patgeno estudiado contaminante.

No resulta fcil crear un medio selectivo o semi-selectivo para un determinadopatgeno porque hay que tener en cuenta su sensibilidad o sea capacidad derecobrar la bacteria en concentraciones bajas y suprimir en forma eficiente laflora contaminante.

Tcnica de microscopa ptica y electrnica

El empleo de estas tcnicas se limitan solamente a la observacin directa delas estructuras del patgeno en cuestin (Pupiro y Malagn, 2003).

2.3 Tcnicas serolgicas.El uso de inmunoensayos en la deteccin de patgenos de plantas ha sidorutinario en los ltimos aos, especialmente en virus entre los ms usados

estn:Mtodo por aglutinacin: Consiste en hacer reaccionar cantidades equivalentesde los reactantes (Ag y Ac). La formacin de grnulos aglutinados o agregadosindican una reaccin positiva. Las reacciones de aglutinacin son menosespecficas pues tienen la desventaja de depender grandemente de losfactores fsicos qumicos, tales como, concentracin de electrolitos, pH,temperatura y tiempo.

Mtodo por precipitacin: Pueden ser en medios lquidos o en geles. Estosmtodos han demostrado tener una notable eficacia para individualizar ypurificar los antgenos dotados de diferencias particulares. La unin del Ag y Ac

se traduce por la formacin de un precipitado insoluble con la condicin que losreactivos se encuentren a concentracin equivalente.


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Mtodo del ltex: Est basado en la prueba de aglutinacin. Los Ac sonadheridos a partculas de ltex. Al enfrentarse el ltex sensibilizado con el Agespecfico se produce la agregacin entre estas esferas y los Ag. Esta pruebaha sido usada principalmente en Virologa, en Bacteriologa la tcnica ha sido

usada con xito para detectar Clavibacter michiganense subps sepedonicum yRalstonia solanacearum en papa y Xanthomonas albilineans en caa. Elmtodo es de 100 a 1000 veces ms sensible que una aglutinacin normal,la reaccin aparece ms rpida, generalmente no es necesario microscopiopara observar la reaccin, se necesita muy poco inmunosuero, no requiere laclarificacin de la savia.

Tcnica de Inmunofluorescencia: Esta tcnica se basa en la conjugacin deanticuerpos especficos con molculas teidas con productos, ejemplo, lafluorescena, que produce un color verde amarillento. Es muy sensible paraidentificar bacterias fitopatgenas y til para analizar un gran nmero de

muestras. La tcnica de inmunofluorescencia permite identificar un antgenocon la ayuda de un inmunosuero conocido, e investigar y titular un anticuerpocon la ayuda de un antgeno conocido.

Tcnica inmunoenzimtica ELISA: El ensayo se basa en la interaccinespecfica de un antgeno (patgeno) y un anticuerpo (protenasinmunoglobulinas producidas en un vertebrado superior, usualmente conejos).La reaccin se visualiza a travs de la accin de un conjugado enzima-anticuerpo sobre un sustrato. Es un mtodo rpido de gran sensibilidad,especificidad y bajo costo, que supera a muchas tcnicas de diagnsticoempleadas con anterioridad.

Existen diferentes variantes de la tcnica de ELISA, todas basadas en elmismo principio. El tipo de tcnica y anticuerpo a emplear depender delobjetivo de la aplicacin (campo, laboratorio), tipo de muestra (suelo, aguatejido) y nivel de sensibilidad y rapidez requerida. La tcnica ELISA consndwich de doble anticuerpo es una de las ms empleadas, es este caso elantgeno es ubicado entre dos anticuerpos especficos, el de captura y el demarcaje, este ltimo est conjugado a una enzima y puede cuantificarse en elespectrofotmetro. Esta tcnica es de gran utilidad en la deteccin depatgenos de mezclas complejas, tales como, suelo, extractos de plantas.

Las tcnicas de inmunodeteccin han sido usadas en la deteccin demicroorganismos fitopatgenos, principalmente virus y bacterias y en menorescala para hongos. Una aplicacin importante se ha encontrado en losestudios de taxonoma de microorganismos, la fisiologa de la enfermedad y laecologa de los patgenos. Con el empleo de estas tcnicas se puedenestablecer estrategias de manejo de patgenos, como la certificacin desemillas o fijacin de cuarentenas.

Las tcnicas serolgicas ELISA- Inmunofluorescencia adems de ser mtodosmuy confiables y sensibilidad moderada tiene la ventaja de poder asimilar gran

cantidad de muestras en algunas horas y los resultados positivos ysospechosos se confirman mediante la prueba de patogenicidad (Gonzlez, et


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al, 1999).

Tcnicas avanzadas para el diagnstico.

Dentro de estas se encuentran las relacionadas con la biologa molecular que

sern abordadas mas adelante con las tcnicas para medir variabilidadgentica.

Tcnicas para evaluar patogenicidad y etiologa.

Para determinar la patogenicidad y la etiologa de un patgeno comnmentees necesario aplicar los postulados de Koch, los cuales permiten identificar deforma rpida utilizando hospedantes sanos de la misma especie el agentecausal que esta causando afectaciones fisiolgicas a las plantas (Flores-Olivas, et al, 1997., Iaez, 1998) los cuales son enunciados a continuacin:

El organismo debe ser encontrado asociado con la enfermedad en todos loscasos observados.

El organismo patgeno debe ser aislado y cultivado in vitro en el laboratorio. El organismo patgeno debe ser inoculado a un hospedante sano de la

misma especie o variedad en la cual aparece la enfermedad. El organismo patgeno debe ser reaislado en cultivo puro y tener las mismas

caractersticas que el postulado 2.

Tcnicas para la produccin de inculo.

- Mtodo de Hussey y Barrer (1973).

Segn, Snchez, y Rodrguez, (2000), Se emplea una suspensin dehuevos y larvas de una poblacin pura de Meloidogyne incognita, raza 2,proveniente del cultivo del tabaco y multiplicada en tomate.

El mtodo comprende la desintegracin, en una licuadora, de las racesfuertemente agalladas por el nemtodo, con solucin de hipoclorito de sodio(NaOCl) al 0.5 %, esto se aplica para la una mejor recoleccin de loshuevos, adultos y juveniles de la plaga.

- Obtencin de inculo in vitro.

Martnez et al, (2002) utilizaron esta tcnica para inducir la esporulacin enel hongoAlternaria solaniagente causal del tizn temprano de la papa.

Tcnicas para conocer la variabilidad microbiana.

Existen varios gneros para describir las variaciones en la capacidadpatognica de una especie (Robinson, 1969), entre ellos, las formas especialesy razas fisiolgicas. La primera se refiere cuando el diapasn de hospedantes

lo constituyen especies, gneros, etc, pero nunca variedades o lneas. El otro


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concepto est relacionado cuando las diferencias en la patogenicidad radicanal nivel de variedades o lneas del hospedante.

Las especies de Alternaria que se caracterizan por ser parsitos lo son entejidos vivos y alternativamente pueden comportarse como saprofitos en

distintos sustratos. Las especies que conforman el gnero manifiestan gransimilitud en el comportamiento patognico en los distintos hospedantes, entreellos: Las enfermedades que provocan son ms severas en climas clidos yhmedos y los conidios son resistentes a las condiciones adversas (Rotem,1994). Otra de las caractersticas comunes a varias especies del gnero es laproduccin de toxinas para asistir al proceso patognico (Nishimura, 1983;Cotty y Misaghi, 1984; Ozcelik, 1996, citados por Prez, 2003).

Estudios genticos poblacionales en hongos fitopatgenos.

El manejo de las enfermedades es un desafo continuo de los productores. El

ambiente complejo en que los patgenos interactan con los hospedanteshacen difcil su control. Una de las causas del xito limitado en el manejo de lasenfermedades es el escaso conocimiento de la variabilidad y de la estructuragentica de las poblaciones de los patgenos (Martin y English, 1997).Obstculos conceptuales y biolgicos, adems de la falta de comunicacinimpiden una integracin efectiva entre genetistas y fitopatlogos (Milgroon yFry, 1997).

Los patlogos vegetales comenzaron los estudios en gentica cuando sedescubrieron las razas fisiolgicas en poblaciones de hongos. Las preguntasque surgen a partir de este descubrimiento son las mismas que se hacen en lagentica poblacional, por lo que pudiera decirse, que hubo una integracinnatural entre esta disciplina y la epifitiologa (McDonald, 1997).

Las bases para los estudios poblacionales y las variaciones, esta puede serintroducida dentro de una poblacin por mutaciones, recombinaciones y lamigracin. La variacin existente acta mediante los procesos de seleccin yderiva gentica (Leung et al, 1993).

Segn varios autores, el futuro de la fitopatologa, desde el punto de vista, de lagentica poblacional ser enfatizar en el papel que tienen las fuerzas evolutivas

mencionadas anteriormente en el cambio de las poblaciones de losfitopatgenos (Leung et al, 1993; Milgroon y Fry, 1997).

Marcadores Fenotpicos

En el estudio de los hongos fitopatgenos, el anlisis de la virulencia es elmtodo ms empleado para caracterizar las poblaciones de los patgenos(Leung et al, 1993). Consiste generalmente en determinar el espectro devirulencia en un grupo de variedades diferenciadoras. Esta medida de lavariacin gentica brinda informacin sobre la estructura patognica de lapoblacin y es por tanto es de mayor inters directo para productores,

mejoradores y patlogos.


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Existen, sin embargo, algunas limitaciones en el empleo de este anlisis parainferir la estructura poblacional y es que los genes involucrados en laespecificidad con el hospedante representa una pequea fraccin de los genesen el patgeno y pueden estar sometidas a una fuerte seleccin por elhospedante (Leung et al, 1993).

Biologa Molecular, es la ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensinde todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la informacingentica se transmita eficientemente de unos seres a otros y se exprese en losnuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturalesque existen entre las especies y colocar genes de un organismo a otrollamado hospedero, empleando tcnicas de ingeniera gentica. Gracias a esteavance, se pueden producir fragmentos de cidos nucleicos a gran escala,abriendo as las puertas a la secuenciacin de los cidos nucleicos y por endea nuevas disciplinas como el diagnstico molecular, la terapia gnica o laobtencin de organismos superiores recombinantes (Disponible en:

www.monografas.com).

Segn Salazar, citado por Pupiro y Malagn, 2003 el uso de marcadoresmoleculares es importante en la caracterizacin gentica de las plantas, dondeno solamente se identifican genotpicamente los materiales, sino que seestablecen relaciones citogenticas entre los mismos, permitiendo el diseo demejores estrategias de seleccin y mejoramiento gentico.

Hibridacin de cidos nucleicos: Se basa en el apareamiento de secuencias debases de nucletidos del ADN de tal forma, que marcando una de lassecuencias de nucletidos (marcadores no radioactivos) se genera una sealque nos permite observar la hibridacin. Existen variaciones de la tcnica dehibridacin, la ms usada y sencilla es la hibridacin tipo gota (dot blot) en laque una gota de la muestra a analizar simplemente se fija en la matriz denitrocelulosa. Cuando la hibridacin se realiza con sondas no radiactivas, estasse detectan por reacciones colorimtricas. Existe una serie de variantes dehibridacin que, aunada al empleo de marcadores moleculares, sonherramientas poderosas en el diagnstico de enfermedades vegetales y en ladeteccin de la variacin gentica dentro y entre las poblaciones, el anlisis ydeteccin de la expresin de genes, tanto del patgeno como de la planta y enestudios taxonmicos y epidemiolgicos (Flores- Oliva, et al, 1997).

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): Es uno de los mtodosmoleculares de mayor eficiencia en el diagnstico de enfermedades vegetales.Es utilizada en la deteccin de patgenos en semillas, el cultivo de tejidos,deteccin de toxinas y residuos de pesticidas (Flores-Olivas, et al ,1997). LaPCR es una tcnica que permite determinar relaciones filogenticos entreespecies y constituye una buena herramienta de anlisis de la biologa de laspoblaciones (Bar, 1998). Segn Shaad,et al, Mutasa ,et al, citados por Flores-Olivas, et al ,1997 entre las ventajas de la PCR est la deteccin de molculassimples en mezclas complejas sin usar sondas radioactivas y con altasensibilidad. Una de las ventajas sobre los mtodos tradicionales es que no se

necesita cultivar los organismos antes de la deteccin.


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La PCR fue ideada por el bioqumico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 yse generaliz a finales de la dcada de los 80. Es fcil de automatizar y puedecopiar una sola molcula de ADN varios millones de veces en unas pocashoras (Encarta, 2006).La reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo

formado por tres etapas:

1 Desnaturalizacin del ADN doble cadena.2 Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de lashebras.3 Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasaLas aplicaciones de la PCR son mltiples y parecen estar slo limitadas por laimaginacin de los cientficos. Entre ellas tenemos: la amplificacin defragmentos de genes como rpida alternativa de la clonacin, la modificacinde fragmentos de ADN, la deteccin sensible de microorganismos seguido de

una segura genotipificacin,

La eleccin del mtodo de anlisis depender del organismo estudiado y sobretodo de su variabilidad gentica, para delimitar especies o grupos dentro deespecies se han utilizado ampliamente marcadores de tipo protenas oisoenzimas. Las tcnicas basadas en el anlisis comparado del tamao de losfragmentos de ADN permiten distinguir aislamientos especficos Bar citado por(Prez, 2003).

Los estudios genticos de cualquier organismo requieren una forma fcil yprecisa de registrar los caracteres o marcadores, deben ser fciles deidentificar y seguir en la descendencia y ser polimrficos (informativos).

Los marcadores del polimorfismo del cidodesoxirribonucleico (ADN) o marcadores moleculares(MM) se emplea en el monitoreo de la diversidadgentica, tanto en estudios filogenticos como en elcontrol de la estabilidad o de la novedad gentica confines mejoradores (Ceballos, 2000).

La variabilidad gentica es un fenmeno comn en la

naturaleza y es necesaria para la evolucin de losorganismos, se puede observar a nivel de individuos, elcual presenta varios locicon diferentes alelos, o tambin a nivel de poblacin,en donde se encuentran la diferencia entre los grupos de individuos (McDonald,1997).

En los ltimos aos, el uso de los marcadores moleculares en la actividadconservacionistas de los recursos fitogenticos, ha ido en aumento y cabeesperar que contine esta tendencia en la medida que surjan nuevos productosbiotecnolgicos y se establezcan medidas para su proteccin legal, en Cuba setrabajo en base a esto.

Actualmente los marcadores se clasifican en morfolgicos y moleculares.


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Marcadores Morfolgicos

Los marcadores morfolgicos son caracteres fcilmente detectables en unorganismo, no destructivos y permiten analizar gran nmero de individuos. En

plantas puede ser: altura, dimetro, formas o color, etc. En cambio, en loshongos son raros, aunque se han utilizado en estudios importantes a nivel delaboratorio sobre la variacin y recombinacin gentica (Michelmore y Hulbert,1987). Son tiles en estudios de laboratorios, pero muy difciles de observar enpoblaciones naturales, tienen un limitado nmero de alelos y generalmente sonafectados por las condiciones ambientales, lo que los hace caracteres pocoestable, adems de poder presentar codominancia (no se puede inferir todoslos genotipos a partir del fenotipo) o epistasia (un gen puede enmascarar laaccin de otro gen) (Egger, 1992).

Marcadores Moleculares

Marcador molecular (MM): En la literatura se recogen diversas definiciones deltrmino marcador molecular:

Son segmentos de ADN que se consideran como marcas o puntos dereferencias para el anlisis del genoma. Estos segmentos, usualmente,representan variantes a sitios polimrficos que pueden ser identificadosempleando estrategias generales, tales como Hibridacin molecular oAmplificacin enzimtica del ADN (Caetano Anollis, 1993).

Es toda variabilidad de naturaleza bioqumica molecular susceptible de serde algn modo asociada con la variabilidad de algn parmetro morfolgicoagronmico, permitiendo la determinacin inequvoca de los progenitoresadems de transmitirse en forma estable a la progenie (Campos, 1995).

Cualquier fenotipo molecular originado de la expresin de un gen (Ejemplo:Isoenzima) o de un segmento especfico de ADN correspondiente a regionesdel genoma que se expresen o no (Ferreira y Grattapaglia, 1995).

Cuando se habla de un marcador molecular se define a su vez como unmarcador gentico, es necesario verificar su comportamiento de acuerdo con

las leyes bsicas de herencia mendeliana segregante (Len, 1998).

Los marcadores moleculares ofrecen soluciones exitosas en numerososcultivos y se consideran entre las 10 tecnologas de mayor impacto para el sigloXXI. Con el advenimiento de ellos, se revolucionaron los estudios genticosdebido a sus mltiples ventajas con respecto a los morfolgicos, los cualespermiten analizar directamente el genotipo sin la influencia de los factoresambientales. Dentro de sus ventajas se encuentran:

Permite mayor nivel de polimorfismo para cada locus estudiado y pueden serestudiados varios locus al mismo tiempo. Lo que facilita el mapeamiento

gentico.


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Los marcadores moleculares son generalmente neutros en relacin con losefectos fenotpicos, con influencia mnima de efectos epistticos opleiotrpicos.

En general son codominantes, conteniendo mayor cantidad de informacin

gentica por locus.Segn el nivel en el cual los genes son detectados, los marcadoresmoleculares se dividen en protenicos (isoenzimticos) y de ADN.

Isoenzimas

La mayora de los organismos contiene diferentes formas de muchas de susenzimas activas, estas formas (isoenzimas) comparten una misma actividadcataltica y son especficas del estado de desarrollo del individuo y de laespecie. Las isoenzimas pueden codificarse por diferentes alelos de un mismolocus (alozimas) o por locus genticos separados, frecuentemente poseen

diferente mivilidad electrofortica, debido a las diferencias en las secuenciasaminoacdicas, lo cual reflejan diferencias en la secuencia del ADN (Egger,1992).Esta tcnica se ha empleado mayormente en la dcada del 70 para el estudiode hongos fitopatgenos. La misma permite el procesamiento de un grannmero de muestras y es generalmente sensible para detectar variacionesdentro de la poblacin. Sin embargo, los marcadores isoenzimticos estninfluenciados por las condiciones de crecimiento, edad y tipo de estructura, selimita a las regiones codificadoras del ADN y generalmente no es losuficientemente variable para los anlisis de poblaciones (Egger, 1992).Muchos de los alelos detectados son monomrficos (loci con ninguna o pocavariacin entre los individuos). No obstante, las isoenzimas siguen siendo unpotente marcador gentico en hongos que poseen suficiente variacin(MCDonald, 1997).

Existen al menos tres reas fundamentales en las cuales se puede emplearanlisis isoenzimtico:

1. Esclarecimiento y delimitacin de tasas de hongos.2. Identificacin de cultivos de hongos a nivel de especie y subespecie.3. Estudios genticos incluyendo gentica poblacional.

Su utilidad como marcador molecular est bien documentada y las variantesgenticamente definidas de las isoenzimas han demostrado su importancia enla evolucin de la variabilidad de especies, en los cultivos del arroz, maz, frijol,ajo, trigo y soya (Len, 1998).

Marcadores genticos selectivamente neutrales

La variacin selectivamente neutral se refiere a la variacin que no afecta elfitness (o que asume que no lo afecta y que no est bajo seleccin). Estavariacin no se refleja en el fenotipo y puede llegar a ser, incluso, una

diferencia en un nucletido en un gen o en un fragmento de ADN repetitivo. Enla actualidad, entre los marcadores ms utilizados, estn los basados en el


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ADN (cido desoxirribonucleico). Los juegos de marcadores moleculares,repartidos por el genoma, y para los que se suele recurrir a la tcnica de lareaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se encuentran:

ADN Polimrfico Amplificado al Azar (RAPD) (Randow Amplified Polymorphic

DNA) Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restriccin (RFLP)

(Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos Amplificados (AFLP)

(Amplified Fragment Lenght Polymorphism).

Mc Donald, (1997), plantea que los mencionados marcadores detectan elsegundo tipo de variacin, por lo que son marcadores neutrales noinfluenciados por el ambiente, y por este motivo pueden ser determinados conmenor ambigedad que los marcadores tradicionales, los cuales abordaremosms adelante.

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es utilizada para el diagnsticode patgenos que afectan cultivos de importancia econmica (Ej. Geminivirus).La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y los marcadores de ADN quetiene por base esta tcnica, tiene sus mltiples aplicaciones en la identificacinde variedades y son especialmente tiles en la diferenciacin de materialesobtenidos por variacin somoclonal o mutaciones a travs de los marcadoresRAPD usando ocho cebadores, de firma comercial Operan Technologies, fueposible detectar diferencias entre los mutantes y su donante despus decalcular los coeficientes de similitud, la distancia y realizar anlisis de

componentes principales como el software. S PSS para Windows (SPSSWIN).El uso ms comn de las tcnicas de marcadores moleculares de ADN en lasinvestigaciones de mejoramiento gentico de vegetales es el estudio de ladiversidad de genes, sin embargo, existen otras alternativas diferentes, en lascuales la diferenciacin de cultivares, a travs de estos marcadores,especialmente los basados en la PCR pueden ser utilizados en los programasde mejoramiento.

Por diversas razones, que incluyen costos relativos, espacios, cantidades deADN, molde y tiempo, estos marcadores superan al resto de los marcadores

ms convencionales como el RFLP y la electroforesis de protenas. Laaplicacin de esta tcnica trae especiales beneficios en los casos deprogramas de investigacin para el mejoramiento de cultivos de ciclo mslargos.

ADN Polimrfico Amplificado al Azar (RAPD)

Los marcadores RAPD han sido ampliamente utilizados por sus ventajasprcticas que pueden resumirse en simplicidad y rapidez, desde su aparicin,esta tcnica se ha utilizado ampliamente en el estudio de la variabilidadgentica de los hongos. La deteccin del polimorfismo es rpida, sin necesidad

de hacer transferencia y tener conocimiento previo del ADN como sucede en el


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RFLP. Se requiere de poca cantidad de ADN, lo que lo hace adecuado parahongos bitrofos (McDonald, 1997).

Entre sus limitaciones se encuentra el hecho de ser menos informativo que elRFLP (marcador dominante) y tiene problemas de reproducibilidad. Entre los

factores que influye en la reproducibilidad de los resultados se encuentra elaparato termociclador y el origen de la enzima polimerasa.

Cuando se estudia una gran cantidad de aislamiento la tcnica RAPD es unade las ms recomendadas.

Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restriccin (RFLP)

Esta tcnica es fcil de interpretar, constituye un marcador codominante yofrece un potencial ilimitado de alelos por locus. Tiene ventajas para losestudios de gentica poblacional con respecto a RAPD, debido a la alta

especificidad cuando se utilizan sendas especficas, que el ensayo puedetolerar contaminaciones con ADN de otros orgenes y los experimentos sonreproducibles. Su desventaja fundamentalmente radica en que requiere mayorexperiencia e insumos que el RAPD, adems de que consume mayor cantidadde tiempo.

Boehm et al, (1993), plantean que la aplicacin de esta tcnica ha sido muyimportante en el estudio de hongos fitopatgenos. Se ha esclarecido laestructura gentica de la poblacin global del agente causal de la enfermedaddel Mal de Panam en el cultivo del pltano (Fusarium oxysporum fsp.cubense).

Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos Amplificados (AFLP)

Esta tcnica est basada en la amplificacin selectiva de fragmentos derestriccin genmicos empleando la reaccin en cadena de la polimerasa(PCR), Polimerase Chain Reaction. Es usada en ADN de cualquier origen ycomplejidad. Los cebadores para la reaccin en cadena de la polimerasa noestn dirigidos a una secuencia conocida del AND. La tcnica de AFLP detectapolimorfismo debido a cambios en y alrededor de los sitios de restriccin.Las ventajas de esta tcnica las describe Majer en (1996) y se pueden resumir

de la siguiente manera:1. Es un marcador neutral y detecta polimorfismo en todo el genoma.2. Es rpido y eficiente.3. Es real y reproducible porque la unin del cebador es muy especfica

tanto con la secuencia del adaptador como el sitio de restriccin de laenzima.

Las desventajas del AFLP respecto al RAPD es que se requiere msexperiencia (ligazn, digestiones con enzimas de restriccin y manipulacin degeles de poliacrilamidas) y sufren de los mismos problemas analticos delRAPD (McDonald, 1997).


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Esta tcnica se ha aplicado para determinar variabilidad intraespecfica endiferentes especies. En un estudio combinado de RAPD y AFLP mostr que elnmero total de bandas obtenidas con cuatro combinaciones de AFLP fuecuatro veces superior a la obtenida con 10 cebadores y el nmero de bandaspolimrficas es casi tres veces superior, en este caso se encontr la relacin

entre el origen de los aislamientos y no entre los patotipos (Gonzlez, 1998).

Marcadores genticos convencionales

Virulencia

Tradicionalmente los patlogos vegetales han usado marcadores genticos queson relevantes en la agricultura como es la virulencia de los patgenos, el cualse basa en determinar la virulencia de diferentes aislados segn la magnitud dela respuesta de determinados genotipos del hospedante con genes deresistencia diferente, o la resistencia a fungicidas especficos. Estos

marcadores brindan informacin til a los programas de mejoramiento gentico,a las compaas qumicas y al servicio de extensin agrcola.

No son marcadores neutrales ya que la distribucin de la variacin gentica deotro loci no seleccionado (todos los que no sean los de la virulencia o lasensibilidad) puede estar asociada con las variantes allicas de la virulencia yla sensibilidad a los fungicidas (desequilibrio gamtico en la poblacin).

Grupos de Compatibilidad Vegetativa (VCG).

Es un marcador empleado para clasificar y diferenciar cepas de hongos. Losgenes que determinar la incompatibilidad vegetativa proporcionan marcadoresnaturales para una gran variedad de hongos. Los grupos de compatibilidad sonmuy tiles para la identificacin de clones de hongos que se reproducenmayormente por va asexual, aunque se ha demostrado que hongos con elmismo VCG no siempre son miembros del mismo clon (McDonald, 1997).

La principal ventaja de los VCG es lo relativamente fcil y barato deimplementar. Una sus mayores desventajas es que es un marcador fenotipo ypor tanto no es adecuado para medir similitud y diferenciacin en la poblacin yadems, algunos aislamientos no forman mutantes (Kistler, 1997).

Tcnicas para evaluar el efecto de las variables climticas.

Los hongos, como patgenos de los cultivos agrcolas, son conocidos por lahumanidad desde el siglo IV antes de nuestra era. Teotraste (amigo y discpulode Aristteles) en sus trabajos mencionaba los championes, trufas,colmenillas y otros. En el siglo I de nuestra era, algunos fijaron su atencin enaquellos que descomponan las bases de los troncos de rboles (Gmez,1997).

Durante un largo perodo, los hongos impunemente causaron enormes daos a

la humanidad y esta buscaba distintos mtodos para eliminarlos, pero no tenanxito, porque no conocan su naturaleza.


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En 1578 apareci el primer libro del profesor holands Klausius y no fue hastamediados del siglo XIX que la micologa empez a desarrollarse, despus delos trabajos clsicos de una serie de miclogos entre los cuales se encuentra elfrancs Antn De Bary y la fitopatologa recibi entonces un fuerte empuje a

raz del descubrimiento del caldo bordels en 1881.

Por supuesto, era imposible en aquella poca hablar de pronstico ysealizacin y mucho menos como parte integrante de la fitopatologa, puesesta disciplina tiene sentido solamente cuando no slo se conocen las causasque provocan las enfermedades en las plantas, sino cuando adems, existenmedidas para su control. Es por eso que no es extrao que muchos sealenque los primeros grmenes del pronstico los encontremos en losseleccionadores. (Gmez, et al, 1993).

El hambre que en 1847 azot a Irlanda, como resultado de lo que hoy es

considerada la primera migracin de Phytophthora infestans en el mundo y quellev a la tumba a 1 milln de personas que se alimentaban casiexclusivamente de la papa e hizo emigrar a 2 millones de ellos al otro lado delocano. Esto provoc que comenzaran a realizar estudios acelerados endiferentes pases como Holanda, Inglaterra, Irlanda, Estados Unidos, Per,Bulgaria y la antigua URSS con vista a predecir las epidemias y sealizar lasfechas de control con medios qumicos de control. Los mtodos actuales quetienen como fundamento el que elaborara Van Everdingen en 1926 forma hoyparte del conjunto de medidas del manejo integrado de plagas en el cultivo dela papa con el objetivo de optimizar las aplicaciones de productos qumicos yno seguir aumentando la contaminacin en nuestro planeta, ms an, cuandonos encontramos hoy ante la segunda migracin de este patgenos en elmundo, cargado de una intensa dosis de agresividad y virulencia, producto delintercambio gentico y otros factores en los que el hombre juega un rol decisivocomo parte del complejo e interactuante mundo epidemiolgico.

Pronstico

No es ms que el conocimiento con antelacin de los intervalos, niveles deinfeccin y daos que pueden producir las plagas, con el fin de poder adoptarlas medidas necesarias para su control.

Guadalupe, (1997), plantea que no existe un mtodo estndar o nico, debidoa que el mismo depende de las particularidades biolgicas de las plagas encuestin, de las condiciones ambientales y del desarrollo cientfico tcnico delpas. Por lo que existen diferentes mtodos de pronstico para un mismoagente nocivo. Adems, para la elaboracin, adaptacin y su puesta enprctica, es necesario el desarrollo de una estructura de elevado nivel tcnicoorganizativo, que pueda estudiar el comportamiento de los agentes nocivos conlos factores biticos y abiticos desde el nivel territorial hasta el nivel de naciny que se puedan adoptar las medidas de proteccin en los plazos indicados.

Mucho se conoce hoy en da sobre como los factores meteorolgicos afectan eldesarrollo de las enfermedades. Los factores climticos que ms


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frecuentemente limitan las interacciones y los rendimientos potenciales de loscultivos son la temperatura y la humedad.

El clima como factor aislado es el nico ingrediente bsico utilizado paraelaborar advertencias para su uso tctico. Segn Bourque (1970), las

enfermedades de las plantas para las cuales el pronstico con la ayuda deinformacin meteorolgica puede ser de valor prctico al agricultor son los quetienen los cuatro siguientes requerimientos fundamentales.

1. Que la enfermedad cause daos econmicamente significante entrminos de cantidad o calidad en el rea que concierne.

2. Que la enfermedad sea variable en el tiempo (momento de aparecer,velocidad e desarrollo, mximo nivel de incidencia) y una parte apreciablede su variacin sea atribuida a factores ambientales que acten directa eindirectamente.

3. Que se disponga de medidas de control, ya sean preventivas o curativas y

que puedan ser operadas a un costo econmicamente aceptable.4. Que exista informacin de investigaciones de laboratorio y

epidemiolgicos sobre la dependencia e interrelaciones entre laenfermedad y los factores climticos.

Clasificacin de los parmetros.

De acuerdo al tiempo que media entre la emisin de la seal y al cumplimientodel pronstico, los mismos pueden clasificarse en:

- Pronstico a corto plazo.- Pronstico a mediano plazo.- Pronstico para muchos aos.

Sealizacin

Se apoya en la informacin que brindan las Empresas, Cooperativas,Agricultores y otras instituciones acerca de la aparicin de la plaga basada enel pronstico, con el objetivo de que se apliquen las medidas ms adecuadaspara la proteccin de las plantas.

Naumova Modificado.

Este mtodo, no es ms que una modificacin de un original ruso basado enlos conocidos das crticos del pionero holands sobre esta temtica VanEverdingen en 1926 y que ha servido de base para todas las metodologaselaboradas en mltiples pases, considera un perodo de alerta si durante 2das consecutivos la humedad relativa media es mayor o igual a 84 %, lahumedad relativa mnima es mayor o igual a 60 %, la temperatura mxima84%, la humedad relativa mnima es mayor o igual a 60 %, la temperaturamxima se encuentra entre 15 28 C y la temperatura mnima es superior alos 11C, bajo estas condiciones deben esperarse brotes ligeros de la

enfermedad en zonas bajas y partes inferiores de las plantas y se recomiendalocalizar los focos y tratar localmente en plantaciones con ms de 30 das.


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Un perodo crtico, es considerado si durante 2 das consecutivos, sepresentan esas mismas condiciones, pero la temperatura mxima es inferior a25 C, deben esperarse brotes fuertes de la enfermedad y si ocurren variosperodos crticos continuos, la epifitotia es eminente, sobre todo en presencia

de lluvias, fuerte nocividad en plantaciones con ms de 30 das.

Conclusiones

Las tcnicas de diagnstico de fitopatgenos constituyen unaherramienta indispensable para el trabajo de los fitopatlogos.

La biologa molecular constituye una tcnica de avanzada tanto en eldiagnstico de enfermedades como en la determinacin de variabilidadgentica de fitopatgenos.

La determinacin de las variables climticas y dentro de ella elpronstico y sealizacin constituyen una herramienta importante paraestablecer las medidas de control de los patgenos.


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