Diagnóstico de laboratorio de infección por el VIH

Esther Cristina Barros LiñanGrupo de Virología

Subdirección Red Nacional de LaboratoriosInstituto Nacional de Salud

Infección por el Virus del VIH

• En Colombia la prevalencia estimada es de 0,67% (VI Estudio centinela 171.504

• El mayor riesgo para adquirir la infección continua siendo el contacto sexual sin protección.

UNAIDS.AIDS epidemic update 2007 www.nlm.nih.govPlan nacional de respuesta ante el VIH y el SIDA 2008-2011-MPS

Diagnóstico de infection por el VIH

El diagnostico se hace

generalmente por

pruebas serológicas

(detección de anticuerpos)

www.geocities.com

Clasificación de pruebas serológicas

• Tamizaje: proporcionan una identificación presuntiva.

• Confirmatorias: usadas para confirmar si las muestras con resultados reactivos en las pruebas de tamizaje tienen anticuerpos específicos al VIH.

bp.blogspot.com/.../antigeno-anticuerpo.g

Pruebas de tamizaje: Elisa.• 1ª. Generación: Primeros ensayos usaban lisados de VIH1 purificado, a menudo

les faltaba sensibilidad y especificidad.

• 2ª. Generación: Ensayos mejorados basados en proteínas recombinantes y/o los péptidos sintéticos, que permitieron la producción combinada de VIH 1 y 2.

• 3ª. Generación: Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2, ensayos tipo sándwich, usan un antígeno marcado como conjugado, muy sensibles.

• 4ª. Generación: Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y VIH-1 "O" y anticuerpos para detectar el antígeno p24, detectan tempranamente seroconversión reduciendo el período de ventana.

• Deben tener una sensibilidad de por lo menos el 99% y una especificidad de por lo menos el 98%.

WHO (2004): HIV Assays: Operational characteristics

Pruebas de tamizaje

• Colorimetría

• Fluorescencia Estrategia

• Quimioluminescencia

• Electroquimioluminiscencia

Pruebas rápidas

• Pruebas sencillas, no requieren instrumentos o equipos.

• Diferentes principios: aglutinación, inmunofiltración, inmunocromatografia.

• Presentación: en forma tiras, tarjetas o cassettes.

• Se realizan en máximo 20 minutos.

• Lectura visual

• Útiles en laboratorios que no tienen la complejidad para realizar rutinariamente pruebas de Elisa, Gestante en trabajo de parto sin tamizaje previo (Guia para el manejo de VIH/Sida Dec 3442/ 2006.)

• Deben tener una sensibilidad igual o superior al 99% y una especificidad cercana o superior al 98% (Guia para el manejo de VIH/Sida Dec 3442/ 2006.)

Presentaciones pruebas rápidas

www.medmira.com

HIV ASSAYS:OPERATIONAL CHARACTERISTICS.OMS

Pruebas confirmatorias

• Se realizan cuando existen dos pruebas de tamizaje previas con resultado reactivos.

• Confirma la presencia de anticuerpos específicos.

• Escasa probabilidad de resultados falsos positivos.

• Pruebas confirmatorias recomendadas en el país de acuerdo a la Guia de atención en VIH (decreto 3442/2006).: Western Blott.

• EN LA ESTRATEGIA: utiliza como prueba confirmatoria HIV blot 2.2, determina anticuerpos al VIH-1 y VIH-2.

Tipos de pruebas confirmatorias

• Western Blot: inmunoelectrotransferencia de lisado viral.

Tipos de pruebas confirmatorias

• LIA y RIBA: ensayos que utilizan antígenos recombinantes y/o péptidos sintéticos seleccionados.

Se deben tener en cuenta los criterios de interpretación establecidos por cada Casa comercial

Enferm Infecc microbiol clin 2007;25(10)632-8

Problemas en las pruebas de tamizaje y confirmación

• Falsos Negativos: Periodo de ventana inmunologica y estadios finales de la infeccion.

• Falsos positivos: autoanticuerpos, multitransfundidos, transplantados y enfermedades autoinmunes, técnica utilizada.

• Indeterminados.

Enferm Infecc microbiol clin 2007;25(10)632-8

Resultados indeterminados

Clin.Vaccine Immunol 2007, Vol 14 p. 649-659

Resultados indeterminados y embarazo

• El embarazo puede considerarse un factor de riesgo para resultados indetermininados.

• Las embarazadas pueden desarrollar autoanticuerpos a proteinas celulares que comigran con proteinas del VIH-1 en el WB.

BJID 2005; 9

Recomendaciones: Recolección, conservación y transporte de muestras para

pruebas Serológicas• Recolectar suero o plasma por venopuncion.

• Tubos de muestras debidamente rotulados.

• Mientras se procesa o envía la muestra debe estar refrigerada de 2-8 °C (max 5 días) o congelada a -20ºC si el tiempo de conservacion es mayor.

• Evitar ciclos repetidos de congelación –descongelación

• En lo posible no procesar muestras hemolizadas o hiperlipemicas.

• En caso de tener que transportar las muestras, este debe realizarse de acuerdo a los estándares internacionales de triple embalaje y a una temperatura estable.

CARGA VIRAL

• Medición de la cantidad de copias del genoma del virus de VIH que se encuentran circulando en sangre y en otros fluidos biológicos mediante la amplificación in vitro del material genético viral (ARN).

Carga viral

• Evaluación y seguimiento de pacientes infectados con el virus.

• Junto con el recuento de CD4 constituye un marcador pronóstico de la infección.

• Determinar inicio de la terapia antiretroviral.

• Evaluación de la eficacia de ARV.

• Toma de decisiones frente al tratamiento.

• Diagnostico inicial en recién nacidos.

Principios de los ensayos de carga viral disponibles

� Amplificación de ADN por RT-PCR: utiliza unaenzima para multiplicar al VIH de la muestra. Una reacción química marca al virus y son medidos para calcular cantidad virus.

� Amplificación de señales bDNA (branched ADN): Combina la muestra con un material que emite luz. Se mide la cantidad de luz y se calcula la cantidad virus. Mide el RNA directamente.

� Amplificación de secuencias de ARN: se fundamenta en la amplificación por la transcripción (viriones) y una detección basada en el método de electroquimioluminiscencia para producir un conteo.

Abbott Roche Roche Siemens Biomerieux

Tiempo Real Cobas TaqMan Cobas Amplicor Versant NucliSense

Tecnologia Tiempo Real

PCR

Tiempo Real

PCR

Punto final

PCRBranched DNA NASBA

Limite de cuantificion 40 copias 48 copias 50 copias /

400 copias 75 copias176 copias

40 copias

Region blanco pol/integrasa gag gag integrasa gag

Fuente: insertos de las tecnica, www.plosmedicine.org/2006

Tipo de prueba a usar da conteos

de carga viral DIFERENTES.

Las cifras no son estrictamente

Comparables.

Debería hacerse siempre el

mismo tipo de análisis para

monitorear la carga viral.

Carga Viral

• El resultado se expresan en forma logarítmica decimal y en números enteros (En numero de copias de ARN/ ml de muestra.

• Forma Logarítmica valora mejor efecto del tratamiento.

• El informe del numero de copias interpreta e informa teniendo en cuenta el limite de cuantificacion de la tecnica.

Copias/mlCopias/ml Logaritmo Logaritmo Base 10Base 10

1010 11

100100 22

10001000 33

1000010000 44

100000100000 55

10000001000000 66

Recolección de muestra para carga viral.

• Tubo tapa perla de plástico (plasma) por venopuncion

• Conserve la muestra refrigerada hasta 5 dias.

• Por tiempos de conservacion mayores a 5 dias congele de -20 a -70ºC.

• Evite muchos ciclos de congelación y descongelación.

• Si requiere transportar las muestras: Sistema de Triple embalaje

Recuento de Linfocitos

• Permite conocer el número absoluto de sub-poblaciones de linfocitos T por mL de sangre periférica :

• CD4 positivos• CD8 positivos • Numero total de linfocitos T(CD3 positivos)

• Se utiliza la técnica de citometria de flujo.

• Recolectar en tubo tapa lila con EDTA por venopuncion

• La muestra debe permanecer a tempuratura ambiente 18-25 ºC

• Se debe procesar entre las 24 y 48 (Maximo) una vez recolectada la muestra.

• Evitar los cambios bruscos de temperatura.

Recolección de muestra para recuento de linfocitos

(CDC Guidelines, 2003)

Aplicaciones Clínicas

• El recuento absoluto de linfocitos CD4 y CD8 es importante para el estudio del estado del sistema inmunológico de pacientes infectados con el virus del VIH.

• La reducción progresiva de Linfocitos T CD4+ está altamente asociada con la severidad del VIH y un pronóstico desfavorable.

Estrategías de diagnóstico de VIH

OMS – ONUSIDA

T11

T1+Considerar Positivo2

T1 –Reportar Negativo3

Estrategia 1

VigilanciaSeguridad transfusión/transplante

1 Test T1, T2, T3 representan 3 tests diferentes. 2 Como resultado no es adecuado para propósitos de diagnóstico; usar las estrategias 2 o 3. Cualquiera que sea el diagnóstico final, las donaciones que sean inicialmente reactivas no deben ser usadas para transfusiones o transplantes.

3 Reporte: el resultado puede reportarse.

Estrategías de diagnóstico de VIH, OMS – ONUSIDA

T11

T1+ T1 –Reportar Negativo3

T21

T1+ T2+Reportar Positivo4

T1+ T2–

Repertir T1 y T2

T1+ T2+ReportarPositivo4

T1+ T2–Considerar

Indeterminado5

T1– T2–ReportarNegativo3

Estrategia 2

VigilanciaDiagnóstico

1 Test T1, T2, T3 representan 3 tests diferentes. 3 Reporte: el resultado puede reportarse. 4 Para individuos con primer diagnóstico, un resultado positivo debe ser confirmado en una segunda muestra.

5 La prueba debe ser repetida en una segunda muestra tomada después de 14 días.

Estrategías de diagnóstico de VIH, OMS – ONUSIDA

T11

T1+ T1 –Reportar Negativo3

T21

T1+ T2+ T1+ T2–

Repetir T1 y T2

T1+ T2+ T1+ T2– T1– T2–ReportarNegativo3

Estrategia 3

Diagnóstico

1 Test T1, T2, T3 representan 3 tests diferentes. 3 Reporte: el resultado puede reportarse. 4 Para individuos ______, un resultado positivo debe ser confirmado en una segunda muestra.5 La prueba debe ser repetida en una segunda muestra tomada después de 14 días.6 El resultado es considerado negativo en la ausencia de cualquier riesgo de infección con VIH.

T31

T1+ T2+ T3+ T1+ T2+ T3–ó

T1+ T2– T3+

T1+ T2– T3–

Reportar Positivo4

ConsiderarIndeterminado5

Alto riesgo Bajo riesgo

ConsiderarIndeterminado5

Considerar Negativo6

Estrategías de diagnóstico de VIH, OMS – ONUSIDA

Flujograma para el diagnóstico de VIH

Decreto 3442 de 2006

Flujograma diagnostico Guía para el manejo de VIH/SIDA- 22/09/06

Algoritmo Diagnostico Gestantes

Algoritmo Diagnostico Gestantes

Emisión de resultados

• Al emitir un resultado este debe contar como minimo con datos como:

• Datos del paciente: Nombre ( la sugerencia es que se debe informa tal como aparece en el tubo con la muestra, Numero de Identificación de la muestra

• Código de la muestra.• Fecha resultado• Técnica utilizada• Lote del reactivo• Interpretación del resultado de acuerdo a la prueba realizada.• Responsable de la prueba.

Para recordar……

� Elisas: Informa puntos de corte y absorbancias de la muestra.

� Western Blot: informar la bandas presentes y la interpretación del resultado.

� Carga viral: informar en numero de copias de ARN/ml y el logaritmo correspondiente.

� Recuento de linfocitos: Informar el conteo total de CD3, CD4, CD8 y la relación CD4/CD8

Reportes…..

Reportes…..

Cuántos niños más deben nacer con SIDA ?

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