determinacion del perfil de acidos grasos cromatografia de
TRANSCRIPT
OS
t
PLY, UNIVERSIDAD NACIONAL auronowa /
DE MEXICO
CAMPUS IZTACALA
DETERMINACION DEL PERFIL DE ACIDOS GRASOS
DE CUATRO ESPECIES DE Shigella spp. MEDIANTE
CROMATOGRAFIA DE GASES.
T E S I § QUE PARA OBTENER EL TITULO DE;
LICENCIADO EN BIOLOGIA
P R — Ss E N T A
HURTADO BOCANEGRA MARIA DOLORES DIRECTORA DE TESIS: Q.F.B. ESPERANZA ROBLES VALDERRAMA.
ENERO DE 1998
TESIS CON FALLA DE CRI
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso
DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor.
DEDICATORIA
@ Primeramente gracias a Dios, por darme la vida y permitirme alcanzar este suefo.
@ Ami padre y mis tias , por su apoyo y carifio durante la formacién de este suefio.
¢ A mis hermanos, esposas, sobrinos y Lourdes, por ser la familia que son.
@ A mis compaiieros y amigos que durante mi formacién profesional, me dieron su
apoyo y alegria para continuar.
¢ A mis maestros por los conocimientos que pacientemente me brindaron durante
mi formacién.
AGRADECIMIENTOS
A la Q.F.B. Esperanza Robles Valderrama per la direccién de} presente trabajo, por su apoyo ¥
confianza.
AEM. en C. Pedro Ramirez Garcia por su apoyo, sugerencias y tiempo.
A! M. en C. Ignacio Pefialosa Castro por sus observaciones y aportaciones al trabajo.
AlMenC. Guillermo Avila Acevedo por su valiosa colaboractén.
AIM. en C. Cesar Flores Ortiz por sus comentarios que enriquecieron en gran medida este trabajo.
AIM. en C. Angel Duran Diaz por su apoyo y sugerencias a la parte estadistica y aspectos generales.
A los Biol. Blanca Martinez, Guadalupe Sainz, Maria Elena Martinez, Rocio Ibarra,Patricia
Sanchez, Adriana Romero, Gabriela Quiroz,Valentin Moreno,Daniel Garcia, Nicolas, Gama,
Bianca, por su valiosa amistad y compafierisme.
A todos aquellos que de alguna manera contribuyeron a la realizacién de este trabajo.
INDICE
1 Introduccién
2 Justificacién 3 Objetivos 4 Antecedentes
5 Marco teérico 5.1 Caracteristicas e importancia sanitaria del género Shigella
5.2 Clasificacién §.2.1 Shigella dysenteriae §.2.2 Shigella dysenteriae tipo |
§.2.3 Shigella dysenteriae tipo 2
§.2.4 Shigella flexneri
5.2.5 Shigella sonnei
5.3 Cromatografia
5.4 Acidos grasos
6 Metodologia 6.10btencién y conservacién de cepas
6.2 Obtencién de la biomasa 6.3 Extraccién de los acidos grasos
6.4 Analisis cromatografico
6.5 Analisis estadistico
7 Resultados y Analisis
7.1 Identificacién de los acidos grasos
7.2 Normalizacién de los datos
7.3 Perfil cromatografico de las cepas tipificadas
7.3.1 Shigella dysenteriae
7.3.2 Shigella boydii
7.3.3 Shigella flexneri
7.3.4 Shigella sonnei
7.4 Perfil cromatografico de cepas ambientales
7.4.1 Shigella $
7.4.2 Shigella 6
7.4.3 Shigella 7
7.4.4 Shigella 8 :
7.5 Perfil cromatografico del género Shigella spp.
7.6 Comparacién del contenido de acidos grasos
eo
we
entre las cepas tipificadas de Shigella
7.7 Comparaci6n del contenido de acidos grasos entre las cepas ambientales de Shigella
7.8 Diferenciacion entre cepas tipificadas y cepas ambientales
8 Conclusiones
9 Recomendaciones
10 Bibliografia 11Glosario
43
45
46
$1
1. INTRODUCCION
Probablemente quien primero vio las bacterias fue Antoni van
Leewenhoek, cuando examino casi todo lo que tenia a la mano, agua de mar,
agua estancada, vinagre, heces, saliva, semen y muchas cosas mas.
EI describia los objetos que veia y se los comunicaba a la Real
Sociedad Cientifica de Londres. En una comunicacion remitida en 1683,
describe lo que sin lugar a dudas eran bacterias, apoyando esta opinién en el
tamano, la forma y movimientos caracteristicos (Brock 1976).
Desde tiempos remotos existia ya el interés en los microorganismos y su
efecto en la salud publica. En el area biolégica, los microorganismos han
jugado un papel importante en ef desarrollo de la investigacidén, 1a docencia, y
la tecnologia.
Las mejoras realizadas al microscopio éptico y el desarrollo de las
técnicas de tincidn, hicieron posible observar con mayor precisién la forma de
las células, pero es hasta 1963 cuando surge al analisis bioquimico de los
microorganismos, para ser usado en su clasificacion. El andlisis bioquimico se
basa principalmente en la determinacion de la presencia o ausencia de
diferentes enzimas codificadas por el material genético del cromosoma
bacteriano, estas enzimas guian el metabolismo de las bacterias a lo largo de
las diversas vias, que pueden detectarse a través de medios especificos, estos
medios sirven como sustrato sobre los cuales las enzimas pueden actuar ya sea
incorporandose al medio de cultivo junto con un sistema indicador que puede
detectar la declinacién del sustrato o la presencia de productos metabdlicos
especificos. Por otra parte en los cincuenta surge también la posibitidad de
clasificar ec identificar a los microorganismos mediante sus componentes
celulares entre los que se encuentran: el ADN, la composicién quimica de las
membranas, lipopolisacaridos, carbohidratos, proteinas y acidos grasos.
Subsecuentemente James y Martin en 1952 proponen el analisis de la
composicién de los acidas grasos bacterianos, a través de la técnica de
cromatografia de gases, como una prueba complementaria en la
identificacion y clasificacién de estos microorganismos. La cromatografia
puede ser una gran herramienta sobre todo en la identificacién de las
bacterias consideradas patégenas como las Enterobacterias que han sido de
gran importancia para el sector salud; algunos de los mas destacados géneros
son: Salmonella, Escherichia, Vibrio y Shigella cuya prevalencia ha sido
mayor en paises subdesarrollados 0 en zonas en condiciones precarias, como
es el caso en algunos lugares de nuestro pais, como por ejemplo en algunos
\—
estados que presentan numerosos casos de shigellosis. F1 estado de Guerrero
con 3853 casos hasta la semana 46 del afio en curso, seguida del estado de
México con 3351 casos y Chiapas con 2733 casos, haciendo un total de 28343
casos en todo el pais (boletin epidemiolégico, SSa), por esto es importante
continuar la biisqueda de técnicas de identificacion de microorganismos
patégenos que sean mas rapidas y precisas.
¢
2 JUSTIFICACION
Actualmente la cromatografia de gases es una técnica que se utiliza, para el
andlisis de compuestos en los diferentes campos de la investigacién. Dentro del
analisis cromatografico, la determinacién de los acidos grasos bacterianos
permite identificar de manera rapida y exacta a el microorganismo en estudio
y esto nos proporciona una herramienta alternativa y/o complementaria en la
identificacién de microorganismos. La técnica de analisis cromatografico de
los Acidos grasos reduce considerablemente el tiempo que se requiere para la
obtencién de resultados, hasta 48 h mientras que las pruebas bioquimicas de
rutina requieren de un minimo de 5 dias a 1 semana, para llegar a una
determinacién, que en muchas ocasiones no es precisa y requiere
complementarse con otras pruebas , Por la rapidez de la técnica
cromatografica, esta puede ser de gran utilidad en diferentes campos como
son: el area de la salud, permitiendo la deteccién rapida de patégenos
causantes de enfermedades riesgosas para el hombre, en el area industrial
puede utilizarse como una herramienta en control de calidad, en el area
ambiental para la deteccién de bacterias patogenas etc. Sin embargo el empleo
de esta técnica requiere, bancos de datos en donde se cuente con los perfiles
del contenido de los acidos grasos de las bacterias de interés. A partir de 1990
en el proyecto de Conservacién y Mejoramiento del Ambiente (CyMA), se
implementé ja técnica de cromatografia de gases para la identificacién de
bacterias en muestras de agua mas especificamente de Enterobacterias;
debido a su importancia como grupo microbiano, y que son tiles tanto para
conocer el grado de contaminacién de cuerpos de agua como para detectar la
presencia de algunos organismos patégenos. Actualmente se cuenta con un
banco de datos conformado por 13 especies de Enterobacterias y es necesario
seguir alimentandolo, por ello el presente trabajo es una aportacion a dicho
banco y a su vez la obtencién de estos perfiles permitira su uso inmediato
como una técnica complementaria en el andlisis rutinario de estas especies y
en un futuro mediato como una técnica alternativa de identificacién.
3 OBJETIVOS
Objetivo general
Aplicar en forma rutinaria, la cromatografia de gases para la identificacion
de Shigella dysenteriae, S. Boydii, S. flexneri. y S. sonnei como una técnica
complementaria a tas pruebas tradicionales.
Objetivos particulares:
1.- Jdentificar ei contenido de acidos grasos de Shigella boydii, S. dysenteriae,
S. flexneri, S. sonnei en cepas de referencia y cepas ambientales mediante su
comparacién con una mezcla estandar.
2.-Obtencion de! perfil erematografico de las 4 especies de referencia del
género Shigella y de cepas ambientales.
3.- Comparar los perfiles de los acidos grasos de las cuatro especies de
Shigella de las cepas de referencia e identificar cuales son los acidos grasos
que mas diferencian entre las especies.
4.- Comparar los perfiles de acidos grasos obtenidos de las cepas de referencia
con respecto a las ambientales, y determinar si presentan diferencias
significativas entre ellas.
4. ANTECEDENTES
Tras el descubrimiento por Antoni van Leewenhoek del invisible mundo
microbiano, la comunidad cientifica se interesé por el origen de esos pequefios
seres vivos. El conjunto de trabajos desarrollados en la edad de oro de fa
microbiologia fue la base de los diversos y monumentales logros alcanzados en
el siglo XX, desarrollandose nuevas ramas de la microbiologia como fa
inmunologia, ta virologia, la bacteriologia, micologia etc. (Pelezar 1981).
Mas recientemente el desarrollo de un conjunto de técnicas nuevas
dieron la posibilidad de facilitar la clasificaci6n e identificacién de tos
microorganismos, a través de estudios de sus componentes celulares entre los
que se encuentran el ADN, la composicién quimica de las membranas
celulares, lipopolisacaridos, carbohidratos, proteinas y acidos grasos (Jawetz
1992).
Las investigaciones sobre los constituyentes de tas células bacterianas
especificamente el contenido de acidos grasos, a través de la cromatografia
gas liquido tiene sus inicios en 1952 cuando James y Martin obtuvieron por
primera vez la separacién de algunos Acidos grasos volatiles. Otro de los
primeros trabajos con aplicaci6n microbiologica en los que se utiliz6
cromatografia de gases es el reportado por James y Martin en 1956, quienes
trabajaron en la separacién y la identificacién de los ésteres metilicos de
Acidos grasos saturados e insaturados por cromatografia de gases. En 1962
Kaneda realizé el aislamiento e identificacién de los acidos grasos celulares de
Bacillus subtillis.
En 1963 Abel y sus colaboradores propusieron la clasificacién de once
grupos de la familia Enterobacteriaceae por medio del analisis cromatografico
de lipidos. En este mismo aiio (1963), Davinoff y Korn realizaron una
investigacién acerca de 1a biosintesis de los acidos grasos celulares de
Dyctiotelium discoideum apoyandose en la cromatografia de gases. En 1968
Buford y Gardner compararon varias cepas de Vibrio de acuerdo con sus
antigenos de superficie y se identificaron los ésteres metilicos de acidos grasos
a través de cromatografia de gases y observaron que la distribucién de
fosfolipidos, acidos grasos y grasas neutras era muy similar entre las cepas,
sin embargo, se encontraron pequefias diferencias en sus porcentajes.
Afios mas tarde en 1973 Amstein y Hartman fograron la diferenciacién
de algunas cepas de Enterocecos utilizando la técnica de cromatografia de
gases. De los resultados obtenidos se encontraron grandes semejanzas entre
los perfiles de las diferentes cepas y algunas diferencias significativas sobre
todo entre las cepas de Streptoccocus faecium y Streptoccocus spp en el carbon
w
19:0, (nonadecanoato) estas diferencias fueron suficientes para considerarse
como un criterio taxondmico.
En 1974 Jantzen y sus colaboradores reportan un procedimiento para el
fraccionamiento y la identificacién de los acidos grasos y monosacaridos
celulares, es en este mismo ajio y el mismo grupo de investigadores (Jantzen E.
y col.) que reportan un trabajo acerca de la composicién de Acidos grasos de
Neisseriae sp y Moraxellae sp aisladas de casos clinicos encontrando grandes
diferencias entre ellas.
En 1980 Bze y Gjerde realizaron una investigacién sobre algunas cepas
de la familia Enterobaciaceac por cromatografia de gases, en este mismo afio
Moss y colaboradores realizaron un estudio comparativo de la eficiencia de
dos diferentes columnas cromatograficas, de dos especies bacterianas,
analizando los ésteres metilicos de sus acidos grasos, observaron que una
columna capilar de vidrio tiene como una caracteristica significativa la
resolucion de isémeros de los acidos de cadena carbonada larga, mientras que
la columna de silica flexible tiene como ventaja su operacion ademas de que su
eficiencia es muy parecida a la de vi
En agosto de 1981 Mayberry reporté un trabajo acerca de los acidos
grasos monohidroxilicos y dihidroxiticos en cepas de Legionella newmophila
utilizando técnicas de cromatografia en papel, cromatografia de gases,
espectrofotometria de masas, y espectrofotometria de infrarojo. En 1982 Erik
Jantzen y sus colaboradores analizaron la composicién de acidos grasos de 13
cepas de Bordetella sp y algunas de Brucella sp encontrandose acidos grasos
de cadena lineal saturada y algunos monoinsaturados en este documento se
menciona a la cromatografia de gases como una herramienta poderosa y util
para el diagnéstico bacteriolégico y adn mas en el estudio de interrelaciones
bacterianas.
En diciembre de 1983 Lambert y Moss realizaron una comparacién de
los efectos de la hidrélisis acida y basica en los hidroxiacidos grasos y el
ciclopropano en bacterias.
En este mismo aio (1983), Bousfield y sus colaboradores efectuaron un
analisis numérico del total de acidos grasos en los perfiles de Coryneformes y
Nocardioformes y algunas otras bacterias .
En 1983 Bergan y colaboradores analizaron los acidos grasos de Serratia
sp por cromatografia de gases logrando diferenciar muy bien entre especies y
biotipos, se encontraron diferencias significativas en el acido graso C14:0,
entre S. rubidea y S. marcences biotipo A 4a, las proporciones del C14:1 se
encontraron solo en cepas de S. rubidea mientras que en las otras no se
encontro.
Por otra parte Christer Alvin y sus colaboradores en 1983 también se
interesaron en conocer el contenido de acidos grasos y carbohidratos de cepas
de micobacterias, ademas trataron de optimizar las condiciones
cromatograficas con la finalidad de detectar de manera simultanea
carbohidratos y Acides grasos analizados como derivados metilglucésidos y
como metilésteres respectivamente, este trabajo recomendo la utilizacién de la
cromatografia en investigaciones taxondmicas.
También en 1983 Lambert y su grupo de colaboradores, presentaron
una investigacién acerca de la diferenciacion de especies de Vibrionaceae, con
base en su composicién de acidos grasos proponicndo este tipo de analisis
como una ayuda en la identificacién y clasificacién de mumerosas
Vibrionaceas.
Tiempo después en 1986 Coloe y Slattery reportaron el analisis de ta
composicién de los acidos grasos de especies de Campylobacter spp aisladas de
casos de enteritis en hombres y animales. Ellos encontraron que Jos acidos
grasos C14:0 30H, C14:0, C16:1, C16:0 y C18:1 son comunes entre las
especies de Campylobacter . En el aiio de 1988 Eerola y Pekka realizaron un
trabajo acerca de un procedimiento 6ptimo para el procesamiento de datos de
una identificacién automatica de bacterias por cromatografia de gases de los
Acidos grasos celulares. Otro trabajo de este aiio (1988), fue el realizado por
Monteoliva y sus colaboradores acerca de la composicién de los acidos grasos
Deleya halofila con diferentes concentraciones de sal en el cultivo y
variaciones de !a temperatura de crecimiento
También en 1988 Canonica y colaboradores llevaron acabo una
investigacion acerca del analisis de los Acidos grasos de Aeromonas hydrophila,
Aeromonas sobria y Aeromonas caviae de origen clinico encontrandose
diferencias basicas entre ellas, ademas de que recomiendan no establecer
comparaciones entre estudios en diferentes condiciones técnicas, pues se corre
riesgo de variabilidad.
Por otra parte en 1988 Lynn y sus colaboradores reportan la
composicién de acidos grasos celujares de Kingella, Cardiobacterium hominis y
Eikenella corrodens encontrandose diferencias basicas que complementandose
con otras pruebas bioquimicas ayudaron a una diferenciacién mas precisa.
En julio de 1989 Moss y lambert-Fair realizaron un estudio con la
finalidad de detectar Jas posiciones de las dobles ligaduras en la cadena
carbonada a través de la combinacién de Cromatografia de gases con
Espectrometria de masas para detectar derivados de dimetildisulfitos
(DMDS), se analizaron primero los ésteres metilicos de acidos grasos y
después se procedio a la obtencién de DMDS. Esto se realizé en cepas de
Campylobacter cryaerophila sp., también en julio de 1989 Veys y sus
colaboradores realizaron un trabajo donde identificaron bacterias gram
negativas no fermentativas a través de su composicién de acidos grasos,
encontrando 35 especies representativas; estas bacterias se dividieron en 19
grupos cromatograficos, algunos de los mas notables fueron Pseudomonas
spp., Achromobacter xylosoxidans ete. Ellos concluyeron que la cromatografia
de gas- liquido es un método poderoso, rapido y preciso para utilizarse en
identificaciones de rutina de bacterias no fermentativas. Otro trabajo en 1989
fue el de Luquin y colaboradores donde reportan el analisis CGL para
conocer el contenido de acidos grasos celulares de Micobacterium xenopi
confirmado con Espectometria de masas (EM), analizando el Acido micélico,
encontrandose una gran abundancia del Acido graso C16:0, y el Acido
tubercoloestedrico. También en este mismo aio (1989), Stewart y
colaboradores analizaron !a composicién de acidos grasos de Campylobacter
pylori de primates y urones comparandolas con otras Campylobacter,
estableciéndose 7 grupos cromatograficos, concluyendo que la presencia de
Acidos grasos inusuales es de gran ayuda para la diferenciacién de estas
especies.
En octubre de 1989 Barry Cookson y sus colaboradores trabajaron
sobre el andlisis de los acidos grasos de Streptococcus milleri, ellos proponen a
la cromatografia de gases como un método rapido para ser utilizado en
taxonomia y sistematica bacteriana. Se procesaron 21 cepas de aislamientos
orales y vaginales, encontrando 11 acidos grasos caracteristicos, con cadenas
entre 11 y 18 carbonos. Los Acidos grasos C11:0 y C17:0 contribuyeron a la
separacion de los grupos. Otro trabajo en 1989 fue el reportado por Lenart y
sus colaboradores, los cuales trataron de desarrollar un método mediante el
cual se analizaron dos constituyentes lipidicos, el Acido tuberculoestearico y el
2-eicosanol, usando cromatografia de gases con un detector de captura de
electrones controlado por un microprocesador.
Hacia 1990 Hidetoshi Okuyama y sus colaboradores realizaron un
trabajo donde detectaron los acidos grasos transinsaturados en Psychrophilic
bacterium y Vibrio sp. por cromatografia de gases y espectrofotometria de
absorcién atémica, ademas se probaron diferentes grados de temperatura
para conocer de que manera se modifica el contenido de los acidos grasos y la
configuracién de fos mismos.
En 1990 iniciaron los primeros trabajos relacionados con la obtencién
de los acidos grasos de diferentes especies de la familia Enterobaciaceae en la
Unidad de Investigacion del campus Iztacala de la UNAM , bajo la asesoria
del Doctor Jiri Hausler del Instituto de Investigaciones del Agua de la
Republica Checa, en los laboratorios de Bacteriologia y Cromatografia del
Proyecto CyMA. Esta investigacion se inicio con la implementacién de una
técnica por cromatografia de gases para el analisis de los Acidos grasos de
bacterias con la finalidad de establecer sus perfiles cromatograficos,
posteriormente se trabajo con la obtencién de los perfiles de algunas cepas de
enterobacterias, analizando los resultados se precisé de manera categérica
que cada microorganismo posee su propia huella quimica que lo hace
diferente a fos demas microorganismos. Actualmente se cuenta ya con 12
perfiles de las siguientes enterobacterias: E. coli, E. agglomerans, E. cloacac,
E. aerogenes, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella oxytoca, Enterobacter
aerogenes, Enterobacter aglomerans, Klebsiella ozaenue Citrobacter freundii y
Citrobacter amalonaticus.
En 1991 Lesley y Stephen estudiaron la composicién de lipidos polares y
acidos grasos de Pseudomonas gladioli y P. caryophilli con el fin de poder
lograr una diferenciacién entre ellas. Guckert y su grupo de colaboradores
realizaron un estudio acerca de los acidos grasos como marcadores fenotipicos
en la identificacién taxonémica de proteobacterias.
En 1992 Shantha y Napolitano realizaron una revisién acerca del
analisis cromatografico de los 4cidos grasos, mencionando diversos métodos
de trabajo sus ventajas y desventajas, asi como la aplicacién de gran utilidad
de este analisis en la industria alimentaria, en microbiologia, produccién de
aceites vegetales etc.
En 1993, Guy G. Orgambide y sus colaboradores investigaron acerca de
los acidos grasos en especies de Rhizobium .
En 1994, Srinivas Alugupalli y sus colaboradores realizaron un estudio
sistematico sobre los acidos grasos 3 hidroxi en Micobacterias, siendo
utilizados para la diferenciacién entre especies, por cromatografia de gases y
espectrometro de masas.
Otro trabajo reportado por Philipp en 1994, acerca de que el andlisis de
Acidos grasos puede ser utilizado para diferenciar numerosas comunidades
microbianas, la especificidad de los acidos grasos permite utilizarlos como
biomarcadores.
En 1995, en una publicacién realizada por Murray y colaboradores se
afirma que el analisis cromatografico de diversos componentes microbianos,
incluyendo los acidos grasos ofrece una alternativa a la identificacién por
meétodos convencionales.
Finalmente en 1996 Chou y sus colaboradores realizan la identificacion
directa de especies de Mycobacterium, a través del analisis de los acidos
grasos, alcoholes secundarios y acidos micdélicos, como productos clave para la
identificacién de estos microorganismos. Bottger también en 1996 publicé un
trabajo acerca de tas técnicas de identificacion de microorganismos a través
del andlisis de acidos grasos por CGL y la secuencia de acidos nucleicos
realizandu un analisis comparativo, encontrando que ambos son una gran
herramienta en la caracterizacién taxonémica.
10,
5. Marco teérico
5.1 Caracteristicas ¢ importancia sanitaria de género Shigella
Los agentes infecciosos de este género, poseen forma bacilar, son no
esporulados, inméviles y gram negativos, son patégenos principalmente del
hombre. Los microorganismos de! género Shigella son aerobios y anaerobios
facultativos, su temperatura ideal de crecimiento es de 37°C y viven en un pH
de 7.6 a 7.8, son destruidos por exposicién, al ealor a 55°C durante una hora y
con fenol al 1% durante 30 minutos (Divo 1990).
Los requerimientos de Shigella no son complejos ya que crece en medios
ordinarios; que contengan peptonas y extractos de carne, fermentan la
glucosa sin formacién de gas, dando lugar a los mismos productos que el resto
de las formas entéricas: acido lactico, junto con cantidades menores de acido
férmico, acido acético y alcohol etilico, Las Shigellas al igual que otros bacilos
gram negativos son relativamente mas resistentes a la accién de los colorantes,
y estas sustancias pueden incorporarse a medios diferenciales para su
aislamiento (Freedman 1989).
Para el aislamiento de Shigellas han sido utilizados maltiples medios de
cultivo para siembra en placa cada uno de los cuales tiene sus ventajas y
limitaciones, los medios normalmente utilizados son Agar Citrato
Desoxicolato, Agar Entérico Hektoen, S.S., el XLD, el Sulfito Bismute,
Tergitol 7 y MacConkey como medios selectivos, caldos como el Selenito, y
Tetrationato de Sodio como medios de enriquecimiento (Depto. de higiene,
1990). De sus caracteristicas en el cultivo se puede decir que crecen formando
colonias redondas de 2 a 3 mm de didmetro, grisaceas brillantes y opacas de
borde continuo segin el medio utilizado crecen como colonias color rosa
palido de diferentes tonalidades, frecuentemente en subcultivos tas colonias
aparecen con bordes irregulares que son considerados como variantes
rugosas(Divo 1990).
En cuanto a su actividad bioquimica son de comportamiento variable
sobre los azucares, con produccién de Acido pero no de gas, por etlo se dividen
en cuatro grupos: manitol, arabinosa, rabnosa y dulcitol, no producen sulfuro
de hidrégeno (HS), ni desdobtan la urea, reducen los nitratos a nitritos, son
citrato negativos pero con respecto al indol son variables (Divo, 1990).
La shigellosis o disenteria bacilar es una reaccién inflamatoria aguda
del tracto digestivo causada por bacterias del género Shigella, es distinta de la
disenteria amebiana y virica, la disenteria es una condicién clinica con
1d.
inflamacion intestinal y heces acuiferas con sangre, mucus y pus. El periodo
de incubacién de la enfermedad oscila entre 1 y 7 dias. Los sintomas iniciales
son fiebre y dolor abdominal intenso, con calambres, la diarrea generalmente
se presenta a las 48 h. y dos dias mas tarde la disenteria total, la gran pérdida
de fluidos y de electrolitos, puede ser muy significativa en pacientes muy
jovenes o muy viejos. El bacilo disentérico se encuentra, a veces, en cantidades
enormes en las heces, puede observarse en las autopsias en las glandulas
mesentéricas, pero por lo general no aparece en otros érganos internos ni suele encontrarse en la sangre o en la orina. El microorganismo tiene la
propiedad de ubicarse en las células epiteliales del intestino y multiplicarse en
ellas ocasionando su posterior destruccion.
Las infecciones disentéricas parecen ser mds comunes en los paises tropicales
y en los de clima templado durante los meses de verano, aunque puede brotar
en cualquier estacién del afio, la propagacién de la enfermedad se debe a la transferencia mas o menos directa del bacilo especifico desde productos
intestinales procedentes del individuo infectado al tracto digestivo de un
individuo susceptible, lo que se conoce como ruta fecal-oral. La forma de
transferencia varia con la_ situacién geografica y las condiciones socioeconémicas de la poblacién (Freedman, 1989; Divo, 1990; Depto higiene,
1990;Burrows, 1974).
5.2 Clasificacion
Seguin la clasificacién actual (Krieg, Manual Bergey, 1984); se reconocen
cuatro especies del género Shigella separadas principalmente por multiples
reacciones bioquimicas y seroldgicas.
5.2.1. Shigella dysenteriae
Los bacilos disentéricos que integran este grupo, se clasifican aparte por
su capacidad de fermentar el manitol. Shigella dysenteriae es
inmunolégicamente heterogénea, constituida por 10 serotipos bien separados
y designados arbitrariamente mediante numeros.
5.2.2 Shigella dysenteriae tipo 1
Este fue el primer bacilo disentérico que se descubrid. y el bacteridlogo
japonés Shiga descubrié que ese era el agente epidemioldgico causante de
disenteria bacilar, que se propagd en Japén en 1898, suele denominarse
también bacilo de Shiga.
Igual que otras bacterias entéricas, ef bacilo de Shiga produce un
lipopolisacarido endotéxico, que es también responsable de su antigenicidad
de tipo O; las diferencias quimicas y serolégicas de los antigenos O
determinan los serotipos de S. dysenteriae . Sin embargo el bacilo de Shiga
puede considerarse excepcional, porque también origina una o varias
exotoxinas; se sabe desde hace ya varias décadas que produce una exotoxina
neurotéxica, que afecta el sistema nervioso central de los animales
provocando paralisis y posteriormente la muerte, esta toxina se produce en
cantidades muy pequefias pero es muy activa y se parece a la toxina de la
diftéria en diversos aspectos. Recientemente se ha comprobado que por lo
menos una cepa de bacilo shiga produce una enterotoxina muy parecida a las
enterotoxinas del célera. En general se piensa que esta caracteristica explica la
forma mas severa de disenteria causada por este serotipo, ademas esta toxina
tiene efectos citotéxicos. Las infecciones por el bacilo de shiga se han
observado sobre todo en lugares como la India, Japon, China y algunas
regiones de Asia y ya se han presentado brotes epidémicos en América Centra!
y México (William, 1974).
5.2.3 Shigella dysenteriae tipo 2
Este serotipo fue descrito en 1917 por Schmitz, como la causa de disenteria
entre los pioneros de la guerra en Rumania. No fermentan el manitol pero se
distinguen por producir indoi, y fermentar el sorbitol y la ramnosa. El
serotipo es serolégicamente homogéneo y esta relacionado con Escherichia coli
0112 y los tipos 1 y 15 de boydii, el tipo 2 de Shigella dysenteriae se ha
observado particularmente en Europa, la India y Sudan, no es frecuente coma
otros microorganismos del género, pero se encuentra ocasionalmente en
brotes de disenteria nosocomial (Freedman, 1989).
5.2.4 Shigella flexner;
Poco después del descubrimiento dei bacilo de Shiga, Flexner descubrié en
Filipinas bacilos disentéricos que diferian de S. dysenteriae, tanto en sus
propiedades seroldgicas como en la fermentacién del manitol estos fueron
designados como S. flexneri. Esta ampliamente distribuido y ha sido el bacilo
disentérico mas cominmente observado, constituyendo mas de la mitad de los
aislados. En las ultimas dos décadas Shigella sonnei ha tendido a remplazarlo
en los EE UU, al igual que en la mayoria de las enterobacterias, la substancia
celular de S. flexneri es téxica, debiéndose su actividad endotdxica a los
lipopolisacaridos, que constituyen los antigenos somaticos (Pelezar, 1981)
5.2.5 Shigella sonnei
En contraposicién al resto de los microorganismos del género Shigella,
fermentadores del manitol los de Shigella sonnei se clasifican aparte por su
capacidad de fermentar Ja lactosa, esta es lenta y puede retrasarse hasta 10
dias; las cepas de este tipo fueron confundidas con los bacilos de Flexner por
los antiguos investigadores. Shigella sonnei se ha convertido en la especie
responsabie de shigellosis mas importante en los EE UU (Freedman, 1989)
5.2.6 Shigella boydii
Son otros bacilos de la disenteria que fermentan manitol y se parecen mucho a
Shigella flexneri en sus caracteristicas bioquimicas, pero no estan
relacionados con el grupo Flexner. Shigella boydii contiene 15 serotipos cada
uno corresponde a un distinto antigeno. Su poder patégeno parece muy
similar al de Shigella flexneri y su distribucién parece ser ubicua.(Joktik,
1987).
5.3 Cromatografia
Existen diversos métodos cromatograficos los cuales se pueden dividir
en dos grandes grupos, la cromatografia de liquide y la cromatografia de
gases, ésta ultima a su vez se puede subdividir en dos grandes grupos: la
cromatografia gas-sélido (CGS), aquella en la que la fase estacionaria es un
s6lido y la mévil un gas, mientras que en la cromatografia gas-liquide (CGL),
la fase estacionaria es una delgada pelicula que recubre a un lecho s6lido y la
movil un gas al que se le denomina gas acarreador y cuya funcién es la de
transportar la muestra a través de la columna.
La cromatografia de gas es un método fisico de separacion basado en la
distribucién de la muestra entre dos fases: una es un lecho estacionario de
extensa superficie, empacado dentro de una columna que puede ser sélido o
una delgada pelicula liquida que recubre al sélido, la otra fase consiste de un gas 0 liquido que se filtra a través de la fase estacionaria, al rededor de ella y
que se conoce como fase movil (Harol, 1981).
Una separacién cromatografica se leva acabo cuando una muestra que
contiene solutos se inyecta en un bloque de calentamiento, donde se vaporiza
instantaneamente y se arrastra en forma de vapor por medio de un gas
portador hacia la entrada de ta columna aqui los solutos son absorbidos en !a
fase estacionaria y después son desorbidos al hacer pasar gas portador puro.
Este proceso de particién se va eva a cabo varias veces y a medida que la
muestra se desplaza hacia la salida. Cada soluto se movera a su propia
velocidad a través de la columna y por consiguiente se formara una banda por
cada soluto (Hobart, Willard 1974).
Los solutos eluyen sucesivamente en orden creciente de sus
proporciones de particion y entran a un detector conectado a la salida de la
columna, este se utiliza para analizar Sos componentes ya separados. La
deteccién se realiza mediante la emision de una sefial eléctrica que se
transmite a un circuito adecuado conectado a un colector y un amplificador de
sefial para que pase a un graficador donde se registra finalmente como wm
cromatograma (Stroch, 1975).
Un cromatograma esta formado por diversos picos o bandas que
representan a cada uno de los componentes eluidos, ademas aporta
parametros de informacion como son el tiempo de retencion (TR) y el area (A)
de los picos, esta ultima permite mediante técnicas especificas determinar !a
concentracion de cada componente separado en la columna; por otro lado el
tiempo de retencién, es el tiempo transcurrido desde la inyeccién de la
muestra hasta que se obtiene el maximo del pico, el TR debe entenderse como
el tiempo que el componente permanece en la fase estacionaria, los tiempos de
retencién pueden utilizarse para identificar picos ya que en condiciones
controladas son reproducibles (Harold, 1981).
Por otra parte debe considerarse la eficiencia de la columna cromatografica,
esta se basa en su capacidad para separar los componentes de una mezcla, la
unidad utilizada para expresar la eficiencia de una columna es el plato tedrico
(Robinson,_1984). La columna es una de las partes de mayor importancia
cromatografica por ello existen en el mercado muy diversos tipos de columnas,
las cuales pueden ser de diferentes diametros y materiales, contar con una fase
liquida o no. y pueden ser capilares 0 empacadas. Sin embargo lo importante
de todo esto es conocer, las caracteristicas de una columna que sean
adecuadas para el estudio que se desee realizar (Dabrio, 1971).
Uno de los parametros de mayor importancia en el analisis
cromatografico es la temperatura a la que se trabaja; por ello un
cromatégrafo consta de la columna que ya se ha mencionado, esta se
acompajia de un termostato para que la separacién pueda efectuarse a una
temperatura reproducible, ademas es necesario para mantener la columna
15.
dentro de determinados intervalos de temperatura. Dentro de algunas
condiciones que se conocen respecto a la temperatura estan: la temperatura isotérmica, la cual se refiere al analisis cromatografico a una sola temperatura
de la columna, mientras que la temperatura programada significa el aumento
lineal de la temperatura en la columna, utilizando una temperatura inicial
baja que va aumentando en pegueiios intervalos de tiempo, la temperatura
programada es muy util para muestras de mezclas con diferentes puntos de
ebullicién. Otro de los elementos de gran importancia es el detector, la funcién de
éste es el de indicar el momento de emersi6n de los componentes. La accién del
detector se traduce en una sefiat de tipo eléctrico que posteriormente se
amplificara e interpretara mediante un registrador grafico o integrador
(Strorch, 1975).
Existen diversos tipos de detectores, como el detector de argén, de
seccién transversal, de conductividad térmica, de captura de electrones y de
ionizacion de flama, que es el tipo de detector que se utilizé en este trabajo por
ello nos ocuparemos brevemente de él. En el detector de ionizacién de flama el
efluente de la columna cromatografica se recoge en una flama oxihidrica y en
el cual se localizan dos electrodos filiformes entre los que se establece una
diferencia de potencial, cuando en la llama entra sélo el gas portador o
acarreador, la corriente entre los electrodos es constante, pero cuando lo hace
un compuesto organico se escinde en fragmentos que son altamente
conductores y facilmente detectables por el cambio de flujo de corriente entre
los electrodos, por este medio se detectan cantidades del orden de 10°? g de
sustancias organicas, este detector generalmente utiliza helio o nitrégeno
como gas acarreador (Robinson, 1970).
Electrodo ) | colector
Llama ( )
Electrodo polarizante
—— _]| ___s Oxigeno
Hidrogena__. Muestra
Esquema de un detector de ionizacién de tama
5.4 Acidos grasos
Los lipidos son componentes esenciales de los seres vivos, dentro de estos los
acidos grasos juegan un papel esencial constituyendo parte fundamental de las
membranas celulares, los lipidos en los animales forman la principal fuente de
reserva energética, acttan en algunas actividades fisiolégicas relacionandose
con las hormonas, vitaminas y acidos biliares (Blanco, 1988).
Los lipidos son los compuestos organicos que pueden extraerse de las
células y de los tejidos de los organismos mediante solventes de baja polaridad
tales como el cloroformo, éter o benzeno. Las estructuras de los compuestos
clasificados como lipidos son muy diferentes pero todos tienen en comun su
estructura principal que es de naturaleza hidrocarbonada, lo que les da su
propiedad de solubilidad (Schmid, 1986).
Los lipidos se distinguen de acuerdo con la complejidad de su molécula,
en dos categorias de sustancias, los lipidos simples y los complejos. Ademas
existe un grupo de sustancias que comparte las propiedades de la solubilidad
de los lipidos y que generalmente estan asociadas a ellos en la naturaleza.
Entre los lipidos simples se encuentran los acilgliceroles y las ceras. Los
lipidos complejos comprenden los fosfolipidos, los glucolipidos, y as
lipoproteinas. las sustancias asociadas a los lipidos son compuestos diversos
tales como esteroles, terpenos y vitaminas liposolubles.
Casi todos los lipidos extraidos de material biolégico se encuentran
formando parte de la molécula, acidos orgdnicos monocarboxilicos a los
cuales se denomina genéricamente acidos grasos. La importancia de estos
compuestos en !a constitucién de los lipidos y en la determinacién de sus
propiedades, aconsejan su estudio en primer término(Blanco, 1993).
La mayoria de moléculas lipidicas tienen como unidades basicas a los acidos grasos estos pueden existir en la naturaleza de manera libre en
pequefias cantidades por ejemplo los de baja magnitud molecular como el
acido acético, el Acido butirico y el acido capriénico. Se han aislado unas 100
clases diferentes de acidos grasos procedentes de lipidos de animales, vegetales
y microorganismos. (Chapman, 1973).
Los acidos grasos son acidos carboxilicos cuyo grupo funcional esta
unido a una larga cadena hidrocarbonada no ramificada, los acidos grasos se diferencian entre si por la longitud de la cadena carbonada y el numero y
posicién de los dobles enlaces existentes; los que no poseen dobles enlaces se
denominan acidos grasos saturados, y los que poseen dobles enlaces se
denominan acidos grasos insaturados, si tienen sélo una doble ligadura se
17,
denominan monoinsaturados, mientras que los que tienen mas de una se denominan poliinsaturados (Schimd, 1986).
Algunas propiedades fisicas y quimicas de los acidos grasos son que su punto de fusi6n depende de ta longitud de la cadena y del grado de insaturacion, mientras mas larga es 1a cadena mayor sera el punto de fusién, pero si ésta cadena posee insaturaciones el punto de fusién sera menor; los acidos grasos forman sales con iones metalicos a causa de la presencia de un grupo carboxilico terminal, los acidos grasos reaccionan con alcoholes formando asi ésteres (Mazur y Harrow, 1973). Se encuentran en muy poca cantidad como acidos grasos libres no esterificados, la mayoria forman parte de otros lipidos. No obstante en ocasiones es importante medir e identificar los acidos grasos libres presentes y para ello deben primero extraerse con un solvente organico y usualmente convertirlos en sus ésteres metilicos.
Existen diversos métodos de esterificacién de acidos grasos, sin embargo puede considerarse que la reaccién de esterificacién ocurre, segin la siguiente secuencia de reacciones reversibles:
1.- Protonacién del oxigeno del grupo carbonilo del Acido organico 2.- Ataque nucleofilico por parte del alcohol sobre el Acido protonado 3.- Pérdida de un protén
4.- Protonacién del intermediario
5.-Pérdida de una molécula de agua
6.- Pérdida de un protén para dar el éster y regenerar el catalizador.
Da - Pp RC + HOR’ © RC + HOH
™ ™
OH OR'
La serie de reacciones que acontinuacién se muestran son las que se llevan
acabo durante la esterificacién de los acidos grasos del presente trabajo.
ee fe R-C-OH + CH;QNa—-+ R-C-OH——~> R-C-OH CH; 0 Na
H* ty”
ee i Reon R-C-O-CH; + NaQH——*_ R-C-OCH;
CH;0
Es de interés recordar que las membranas celulares vegetales y animales son
muy ricas en acidos grasos poliinsaturados mientras que las bacterias no
contienen estos acidos grasos. De manera generalizada puede decirse que las
células bacterianas tienen mas del 95 % de su complemento lipidico total!
asociado a la membrana celular, el restante 5% se distribuye entre el
citoplasma y la pared celular (Erik y Stumpf 1976).
19.
6 METODOLOGIA
6.1 Obtencién y Conservacion de las cepas
Se obtuvieron las cepas de Shigella dysenteriae (B2188), Shigella boydii (ATCC
8700), Shigella flexneri (B2194), Shigella sonnei (B2199) a través del INDRE y
det ATCC, mientras que la obtencién de las cepas ambientales fue a través de
donaciones realizadas por el laboratorio de Microbiologia de Escuela
Nacional de Ciencias Biolégicas de IPN y del cepario de la facultad de
Quimica de la UNAM.
Se procedi6 a la conservacién de las cepas por el método de
transferencia periddica, en tubos inclinados de agar nutritivo, posteriormente
se Ilevé acabo una serie de pruebas bioquimicas tradicionales para estas cepas
con el fin de verificar su calidad y pureza, las pruebas realizadas
periddicamente (antes de cada corrimiento cromatografico), fueron: Urea,
Citrato de Simons, MIO, TSI, aziicares (dextrosa, sacarosa y manitol ) (Mac
Faddin 1990 ), ademas se les aplicé la prueba de API 20E. Una vez verificados
se procedié a la obtencién del perfil de los acidos grasos de S. dysenteriae, S.
boydii, S. flexneri y 8. sonnei y de las cepas ambientales a través de la técnica
de cromatografia de gases propuesta por Hiusler (1985).
6.2 Obtencién de la biomasa
Para la obtencién de la biomasa bacteriana se utilizaron, dos placas de agar
nutritivo (Difco) por muestra y en las cuales se sembraron por estria cerrada
las cepas de referencia y las cepas ambientales. Se incubaron durante 24 horas
a 37°C verificando frecuentemente la temperatura, puesto que variaciones en
la misma pueden afectar la produccion de acidos grasos celulares,
posteriormente se coseché dicha biomasa de cada placa con 5 ml de solucién
de formaldehido al 0.5% con la finalidad de fijar a los microorganismos. Se
centrifugé con refrigeracién a 4 °C durante 10 minutos a 20 000 G, en una
centrifuga refrigerada Sorvall RC-5B. Se repitié la centrifugacién dos veces
mas utilizando 5 ml de solucién fisiolégica 0.85% (NaCl) para lavar el paquete
celular. Posteriormente se transfeririéd a frascos viales para su liofilizacién
durante 3h aproximadamente a -50°C. La liofilizadora utilizada fue una Lyph.
Lock 4.5 modelo E2MS5.
a
6.3 Extraccion de los acidos grasos
De ia muestra liofilizada se pesaron 20 mg de biomasa liofilizada, cantidad suficiente para obtener cantidades adecuadas de acidos grasos para el analisis. Posteriormente se procedio a la esterificacién de los acidos grasos con objeto de transformar estos a su forma volatil “éster” y su posterior anilisis por cromatografia de gases, La esterificacién se realizé adicionando 1 mi de una
solucién de metéxido de sodio y se agité durante 5 min. con el propésito de
realizar la hidrdlisis de los acidos grasos; posteriormente se le adicioné 0.7 ml de una solucién de metanol saturado con cloro gaseoso, agitando durante 30
min., esta solucién se utiliza con la finalidad de crear un medio acido que
favorece las reacciones de esterificacion (Stuart 1981).
Posteriormente se agregaron 2 ml de solucién fisiolégica al 0.85 %
(NaC), agitando durante 7 min, transcurrido este tiempo se procedié a la
extraccidn de los ésteres metilicos de Acidos grasos con hexano, utilizando 2 ml
en cada extracci6n, Ilevando acabo tres extracciones por muestra, las cuales
fueron transferidas a tubos de ensayo que contenian sulfato de sodio anhidro,
con el objeto de absorber los pequefios volimenes de agua que pudiera tener
la muestra ya que debe tenerse en cuenta que para un buen analisis
cromatografico se requiere de muestras libres de agua debido a que pequeiias
cantidades de ésta pueden afectar la eficiencia de la columna.
6.4 Analisis cromatografico
El volumen obtenido de las extracciones se transfirié a viales cénicos, donde
fueron evaporados con nitrégeno gaseoso hasta un volumen aproximado de 10
HI de los cuales se tomo 1 ul y se inyecté en el cromatégrafo de gas
previamente acondicionado. Se utilizo un cromatégrafo Hewlett packard
modelo Hp 5890 A, con detector de ionizacién de flama, utilizando
temperatura programada de 120°C a 270°C con range de 4°C/min, el uso de la
temperatura programada aumenta la eficiencia y resolucién del
cromatograma ademas de que se acorta el tiempo de analisis.
Para el analisis cromatografico se utilizé una columna de heliflex RSL
150 (metilsilicon), con longitud de 30 m., didmetro interno de 0.25 cm con un
espesor de pelicula de 0.25 mm, no polar y se utilizé nitrégeno como gas
acarreador con un flujo de 30 + 2 ml/min.
6.5 Analisis estadistico
Una vez obtenidos los cromatogramas se procedié a comparartos contra un estandar de referencia (Bacterial acid methyl éster mix Supelco cp N° cat. 1114), para la identificacién de tos acidos grasos presentes en la muestra. Una vez identificados los picos de cada cromatograma contra el estandar, se procedié a la normalizacién de tos tiempos de retencién y las dreas de los picos. Para lo cual se seleccioné el pico con mayor area de los ésteres de acidos grasos y se le asigné el 100% comparando los demas contra éste. Del analisis estadistico se obtuvieron las siguientes medidas descriptivas: media y desviacién estandar para las areas normalizadas (AN) y tiempos de retencién normalizados (TRN) y con ello se elaboraron los perfiles de cada especie de Shigella. Ademas para determinar si existian diferencias entre tas cepas del estudio se realizé un analisis multivariado discriminante. Et cual nos permite comparar diferentes poblaciones, en este caso las diferentes especies de Shigella contra diversas variables (los diferentes Acidos grasos encontrados), para establecer si existen diferencias significativas, y cuales variables nos permiten la diferenciacién mas claramente.
ty
ra
7. RESULTADOS Y ANALISIS
En este estudio se procesaron un total de 200 muestras tipificadas de la ATCC
e INDRE y 28 ambientales de la Facultad de Quimica, UNAM y de la ENCB-
IPN, de las cuales una vez obtenidos los cromatogramas de las diferentes
especies se procedié al andlisis de los mismos, mediante su comparacion
contra un estandar de ésteres de Acidos grasos, con el fin de identificarlos y
obteniendo los siguientes resultados:
7.1 identificacién de tos acidos grasos
En primer término se debe destacar que tanto las cepas tipificadas como fas
ambientales presentaron 12 Acidos grasos cuyos ésteres en orden de elucion
fueron: C12:0 metil-dodecanoato (pico 3), C14:0 metil-tetradecanoato (pico
7), C15:0 metil-pentadecanoato (pico 10), 30H C14:0 3hidroxi-metil
tetradecanoato (pico 12), C16: 1° metil cis? hexadecanoato (pico 14), C16:0
metilhexadecanoato (pico 15), C17:0 cis-9, 10-metil- hexadecanoato (pico 17),
C17:0 metil heptadecanoato (pico 18), C18: 1° metil cis-9-octadecanoato
(pico21), C18:1°" metil trans-9-octadecanoato y metil cis 11 octadecanoato
(pico 22), C18:0 metil- octadecanoato (pico 23) y C19:0A cis 9-10 metilen-
octadecanoato (pico 24) (tabla 1). De estos datos se puede observar que tanto
las cepas de Shigella tipificadas como las ambientales presentaron a los acidos
grasos caracteristicos de la familia Enterobacteriaceae que son el C 16:1° metil
cis 9-hexadecanoato (pico 14), C 16:0 metil-hexadecanoato (picol 5) siendo éste
el mas abundante igual que en los otros miembros de la familia, y el C 17:0A
cis-9-10 meti!-heptadecanoate. (B.BG@E et al 1980)
Tabla 1 Acidos grasos presentes tanto en las cepas tipificadas como en cepas ambientales
de Shigella spp Numero de pico Numero de carbonos Nombre IUPAC del ester Nombre coman del Acido
3 12:0 metil dodecanoato laurico
7 14:0 metil tetradecanoato miristico
10 15:0 metilpentadecanoato
12 3 OH 14:0 metil3hidroxi tetradecanoato
4 16:0? metit cis 9hexadecanoate | palmitoleico
15 16:0 metithexadecanvato palmitico
V7 17:04 metilcis9,t@metilen hexadecanoato
18 17:0 metil heptadecanoato estearico
21 18:1° metil cis 9 octadecanoato 22 18:1° metil trans 9 octadecanoato
18st! metil cis 1f octadecanoato
3 18:0 metil octadecancato ~| FY 19:04 metilcis9, 1Ometilen ~
actadecangato
23.
7.2 Normalizaci6n de los datos
Una vez identificados los acidos grasos obtenidos, se seleccioné el pico del Acido graso que presenté el valor de area bajo la curva mas alto, y se le asigné
el 100%, éste fue el pico 15 en los 228 casos. Comparando contra este los
demas picos se obtuvieron sus porcentajes respectivos tanto para las areas
como para los tiempos de retencion, quedando asi los datos normalizados.
7.3 Perfil cromatografico de las cepas tipificadas
Con los datos obtenidos se calculé la media y Jas desviaciones estandar tanto para las areas como para los tiempos de retencién por pico y se hicieron las
graficas correspondientes para cada especie tipificada
7.3.1 Shigella dysenteriae
Para esta especie se realizaron 43 corrimientos cromatograficos de la cepa
tipificada, (INDRE, B2188), obteniéndose los 12 dcidos grasos ya mencionados
en los 43 cromatogramas, el Acido graso mas abundante fue el del pico 15
siguiéndole et pico 22, con una media de area normalizada de 66.04%, el pico
14, con 57.45%, el pico 17 con 26.89%, el Pico 7 con 17.89%, el pico 12 con
11.72%, el pico 3 con 11.04%, el pico 10 con 4.46%, el Pico 24 con 3.35%, et
Pico 23 con 2.23%, ef pico 18 con 1.77% y el pico 21 con 0.99%. Con los
valores de las medias de los tiempos de retencién y las dreas normalizadas de
cada pico, se procedié a la elaboracién de una grafica la cual representa el
perfil de acidos grasos obtenido para Shigella dysenteriae (figura | tabla 2).
Figura 1. Perfil cromatografico de los
a&cidos grasos de Shigella dysenteriae.
120--- - ee en ee
100 -
80-
22
60°
40-
Ww
7 20- 3 2
| [ 10 18 28 23 24 ° —4toid dt d P t
44 70 85 90 96 100 12 114 123 128 128.39 140
TRN (%}
24,
7.3.2 Shigella boydii
Para esta especie se realizaron 42 corrimientos cromatograficos (S. boydii
ATCC 8700), al igual que la anterior el pico con valores mas altos fue el pico
15, le siguié el 22 con una media de area 61.60%, el 14 con 51.71%, el 17 con
33.48% e1 7 con 14.12%, el 10 con 13.36%, el 18 con 9.76%, el 12 con 7.10%,
el 3 con 6.70%, el 24 con 4.07% el 23 con 2.92%, y el 21 con 1.25%. La grafica
de las medias de areas y tiempos de retencién de cada pico representa, el perfil
de 4cidos grasos obtenidos de la especie Shigella boydii (figura 2, tabla 2).
AN (%)
120 —_
100
80
60
40,
20- ;
wil 45 $71
Figura 2. Perfi! cromatografico de los
Acidos grasos de Shigella boygil.
18
vy
w
10 | 12 18
—t bb bbe 86 90 96 100 12 4 121 123
23 a
aL. 1.
128 140
TAN (%)
7.3.3 Shigella flexneri
Se realizaron 45 corrimientos cromatograficos de Shigella Flexneri (INDRE
B2194), encontrandose presentes también los 12 acidos grasos mencionados,
nuevamente el pico 15 fue el mas alto, siguiéndole el 17 con una media de area
de 63.51%, el 22 con 26.64%, el 7 con 22.72%, el 14 con 21.54%, el 24 con
13.71%, el 10 con 10.65%, el 3 con 3.57%, el 12 con 3.49%, el 18 con 3.01%, el 23 con 1.82%, y el 21 con 0.86%, el perfil de los acidos grasos de Shigella
flexeri se obtuvo graficando las medias de las dreas contra los tiempos de
retenci6n para cada pico (figura 3, tabla 2).
Figura 3, Perfil cromatografico de loa AN fe) &cides grasoe de Shigella flexneri.
120-8 em
100-
80
60
40 - 22
t 4
20-
12 8 21 as _ - abo bee dL ee
10
3
o—i—- 44 70 85 80 96 100 112 16 124 125 120
24
144
7.3.4 Shigella sonnei
Se realizaron 45 corrimientos cromatograficos en los cuales se encontraron los
12 acidos grasos mencionados el valor de 100% se le asigné al pico 15,
siguiéndole el 14, con una media de area normalizada de 70.63%, el 22 con
48.55% , el 17, 32.31 %, el 7 con 20.62 %, el 12, con 16.78 %, el 10 con 7.0 %,
el 3 con 6.51 %, el 24 con 5.71%, el 18 con 2.55%, el 23 con 1.37%, el 21 con
0.66%. El perfil de acidos grasos se obtuvo graficando, los valores de areas
contra tiempos (figura 4, tabla 2).
Figura 4. Perfil cromatografico de los
AN (%) acidos grasos de Shigella songei.
120- -—
100 -
80-
60- 22
40-
20-
ob sd tbe b ml 4. 44 70 86 90 96 100 112 116 124 125 129 141
TAN (%)
27.
Tabla 2 Valores de las medias de tiempos de retencién y areas de la
tipificadas de Shigella
s 4 especies
Shigella boydii Shigella flexneri Shi ella Shigella sonnei
TR Area TR Area TR Area TR Area
pico 3 [44.7144 6.70632 43.8121 | 3.5708 | 44.5461 11,04964 |43.6774 6.5144
pico 7 |70,5661 14,1284 70.2023 | 22.7298 | 70.5676 17.8978 |70.1498 20.6200 |
pico 10/85.0079 13.3623 84.7567 | 10.6558 [84.9942 4.46414 | 84,7975 7.00361
pico 12|90.4780 7.10666 90.4554 [3.49996 | 90.4791 11.72417 |90.3728 16.7839
pico 14 |96.0921 51.7157 95.9092 | 21.5479 | 96.0968 57.45 96.0929 26.8982
pico 15| 100 100 100 100 400 100 100 100 |
pico 17|111.614 33.4886 112.008 | 21.5479 | 111.601 26.8982 [111.851 32.3120 |
pico 18 114.130 9.7609 114.527 |3.01894| 114.110 4.77718 [114.865 2.55303 |
[pico 211120.991 1.25510 124.295 |0.86305 | 122.984 0.998034 (124.324 0.6691 9 |
pico 22 |122.644 61.6033 125.455 | 26.6436 | 128.073 66.04748 | 125.007 48.5534 | | pico 23 | 128.338 2.92389 129.030 | 1.82844 | 128.326 2.239638 | 129.068 4.37974 | pico 24 |139.726 4.07591 140.744 | 13.7195 |139.774 3.35922 | 140.984 5.71674
Tabla 3 Valores de las desviaciones estandar de las Areas y TR de fas 4
especies tipificadas de Shigella T
Shigella boydii Shigella boydii Shigella Shigella sonnei
SArea| OTR | dArea| STR | d5Area| STR 3Area_| STR |
pico 3 | 6.4220 | 0.2091 | 5.2203 0.6551 |15.6297| 0.7759 9.4550 _| 1.3464 |
pico 7 | 5.4895 | 0.2029 13.3025| 0.5831 [11.8721| 0.2148 | 18.1264 | 0.2313 |
pico 10| 4.0459 | 0.1954 4.0749 | 0.9510 | 5.9627 | 0.2209 7.6710 |0.1729
pico 12| 5.6300 | 0.2203 6.1434 | 0.5158 |17.5374| 0.2662 | 26.2953 0.1758
pico 14|14.6140| 0.0811 49.7474] 0.8979 |15.7458| 0.1168 | 18.8173 | 0.1307)
pico 15 0 0 0 0 0 0 0 0
pico 17 | 15.8373| 0.1684 23.1558| 0.6596 |11.7021| 0.2305 | 10.3251 | 0.4433
pico 18| 3.0910 | 0.2564 0.9424 | 0.1444 | 1.8030 | 0.3338 3.2112 | 1.1530
pico 21| 1.2455 | 0.2932 0.7914 | 0.1252 | 0.9329 | 0.2716 0.6352 _| 0.2623 |
pico 22/24.1423] 0.1280 8.7773 | 0.1062 [29.4149] 0.1280 | 27.4426 0.1939
pico 23| 2.8269 | 0.3173 4.8447 | 18.0651) 1.7989 | 0.3479 1.1324 | 0.4373
pico 24] 3.7217 | 0.3545 42.2865 0.1561 | 3.1380 | 0.5200 9.2026 [1.1124
7.4 Muestras ambientales
Se obtuvierun 4 cepas de Shigella aisladas del ambiente: Shigella 5.6.7.8. Con
los datos de jos acidos grasos identificados se calculd la media de las areas y
tiempos de retencion normalizado y se graficaron con la finalidad de obtener
su perfil.
7.41 Shigella 5
Se realizaron 8 corrimientos cromatograficos, en los cuales se presentaron los
12 dcidos grasos reportados para las Shigellas tipificadas. el pico 15 también
fue el que obtuvo el valor mas alto de area y se le asigné el valor de 100%,
siguiéndole el, 22 con 68.82%, el 14 con 55.63%, el 7 con 16.04%, el 17 con
12.83%, el 12 con 9.51%, el 3 con 9.08%, el 10 con 8.14%, el 18 con 4.58%, el
23 con 4.20 %, el 21 con 2.11% y el 24 con 2.28%. En fa grafica 5, se muestra
el perfil cromatografico para la muestra 5 de las cepas ambientales y en Ja
tabla 4 se pueden observar los valores de las medias de las dreas y tiempos de
retencién de cada pico.
figura 5. Pertil cromatcgrafico de log
acidos grasoa de ja muestra ambiertal &
5 100
30
60 "
40
20 , .
| ep 23024
- L re t 1
45 71 83 91 96 100 1z 114 124 127 128 140
TRN (4
7.4.1 Shigella 6
Se realizaron 8 corrimientos cromatograficos en los cuales se presentaron los
12 acidos grasos caracteristicos, el C 16:0 pico 15 obtuvo el valor mas alto
siguiéndole e! 14 con 83.41%, el 22 con 60.87%, el 12 con 18.85%, el 17 con
16.19%, el 7 con 14.22%, ei 3 con 11.84%, el 10 con 8.39%, el 18 con 6.96%, el
24 con 3.59%, el 23 con 3.04% y el 21 con 0.78%. Los valores de las medias de
las areas y tiempos de retenci6n normalizados se presentan en la tabla 4 y el
perfil cromatografico para esta muestra ambiental qued6 representado en la
figura 6.
Figure 6. Perfil cromatografico de los
&cidos grasos de la muestra ambiental 6
AN [%}
120--— — — -
100 -
80-
22
60-
40-
20- 7 12 7
bil. fps bao 3
44 70 86 90 96 100 112 114 124 125 128 140
TRN (%}
30.
7.4.3 Shigella 7
Se realizaron 8 corrimientos cromatograficos presentandose los 12 acidos
grasos encontrados en las cepas tipificadas, siendo el mas abundante el pico
15, siguiéndote el 14 con 95.28%, el 22 con 58.92%, el 10 con 41.42%, el 12 con
18.89%, el 17 con 16.95%, el J con 14.18 %, el 18 con 10.72%, et 3 con 7.62%,
el 23 con 2.42%, el 24 con 2.39% y el 21 con 1.0%. Los valores de las medias
de las areas y tiempos de retencién de los picos se presentan en la tabla 4. El
perfil cromatografico de la muestra ambiental 7 se presenta en la figura 7.
Figura 7. Pertil cromatogratico de ios
AN (el acidos grasos de la muestra ambiental 7
120 — —
100
80-
60 22
10 40
20- ? 12 ”
3 18
o—-t— 1. -- — = a pd
46 70 8 90 96 100 11 16 424 127.7 128 140
TRN (%)}
31.
7.4.4 Shigella 8
Se realizaron 8 corrimientos cromatograficos, presentandose los 12 acidos
grasos ya reportados para las cepas tipificadas y nuevamente el pico 15
obtuvo el valor maximo de area, siguiéndole el 14 con 74.76%, el 22 con
60.13%, el 10 con 32.60%, el 17 con 31.79%, el 7 con 17.80%, el 12 con
12.08%, el 24 con 11.14%, el 18 con 10.44%, el 3 con 6.23%, el con 1.88% y el
21 con 0.63%. Los valores de las medias de las areas y tiempos de retencién de
los picos se presentan en fa tabla 4. El perfil cromatografico de la muestra
ambiental 8 se presenta en Ia figura 8.
AN (%)
120-
100 -
80-
60-
40°
20-
10
t
3 2 18
: LL 2 pitt Lit a
44
Figura 8. Perfil cromatografico de los
Acidos grasos de la muestra ambiental 8
22
24
od 70, 86 90 96 100 96 114 124 128 129 141
TRN (%)
Tabla 4 medias de areas y tiempos de retencion de los acides grasos celulares
de las cepas ambientales de Shigella
Shigella 5 Shigella 6 Shigella 7 Shigella 8
| {TR Area TR Area TR Area TR Area
[pico 3 44.6587| _9.084[44.4995 | 11.8471 44.5525 | 7.62038 | 43.9245 | 6.23923
pico7 |70.5460 16.0414 [70.4944 | 14,2234 170.4541 14.1804 | 70.0837 | 17.8021
pico 10 | 84.9713 8.14303 [84.8513 |8.39378/85.0247 41.4296 [84.7869 [32.6089
pico 12 [90.5045 9.51364/90.4971| 18.853|90.4647 18.8951 |90.2640 | 12.0884
pico 14 |96.0949 55.6311 (96.1706 | 83.4184 | 96.2506 105.283 [96.0670 | 74.7628
ico 15 100 100 100 100 100 100 100 100
pico 17 |111.596 42.8373| 111.521 | 16.1992) 111.455 16.9542) 1114.78/31.7967
pico 18 [114.197 4.58056 | 114.131 |6.96045| 114.575 | 10.7265 414.384 |10.4475
pico 21 [124.089 2.11245 | 124.050 [0.78553 | 123.968 4.00847 | 124.476 |0.63411
|pico 22 426.786 | 68.8264 | 125,086 |60.8799 427.719 | 58.9242 | 128.113]|60.1360
[pico 23 128.438 | 4.20518 | 128.376 |3.04791 128.351 | 2.42217 | 128.916 | 1.88103
pico 24 |139.951 2.28082|139.836| 3.5938) 139.769 2.39634[140.538| 11.14
Tabla 5 Valores de las desviaciones estandar de area y TR de las cepas
ambientales de Shigella
[__ Shigella 5 Shigella 6 Shigella 7 Shigella 8
\8Area_ [STR 6 Area j|6TR éArea [6 TR 6 Area _[6TR
| 1.7238 | 0.8772 | 6.1692 | 0.1518 4.8464 |0.06129| 0.6136 | 0.6196
3.0500 | 0.6347 | 4.3985 | 0.1552 1.6306 | 0.0655 | 1.2851 | 0.0905
4.5357 |0.09404| 2.4851 | 0.2415 43.3754| 0.0474 | 1.0984 | 0.0660
2.2589 |0.09554| 5.9597 | 0.1749 2.1122 | 0.0610 | 2.7288 | 0.9845
5.0081 | 0.3736 |22.8718| 0.2056 11.3603 | 0.0420 | 1.7930 | 0.9917
0 9 0 0 Q 0 0 0
8.9694 | 0.1105 | 5.6503 | 0.2257 8.1963 | 0.1027 | 1.3541 | 0.3899
0.4803 | 0.1255 | 3.1370 | 0.2624 0.8495 | 0.4294 | 0.2892 | 0.1313
0.5604 |0.12738| 0.4506 | 0.2728 0.1703 | 0.1418 | 0.2029 | 0.1327
6.8900 | 0.4253 | 9.1954 | 0.0777 3.5685 | 0.0619 | 3.7041 | 0.3804
0.7885 | 0.1393 | 1.3609 | 0.3007 | 0.2750 | 0.1436 | 0.1056 | 0.3998
ico 24 | 2.3338 | 0.1247 | 2.2034 0.3370 | 1.4698 | 0.1627 | 0.7070 0.4439
33,
7.5 Perfil cromatografico del género Shigella spp.
Una vez obtenidos los perfiles cromatograficos de las cepas tipificadas y de
las cepas ambientales, se procedié a establecer del perfil general de acidos
grasos celulares del género Shigella spp., para lo cual se obtuvieron las medias
de las dreas y tiempos de retencién de los 12 acidos grasos obtenidos para
cada especie, y con estos valores se procedié a graficar para la obtencién del
perfil que se muestra en la figura 9.
Figura 9. Perfil cromatogratico de los
AN (%) acidos grasos de Shigel: <cc
120-—
100 - "
80-
60 - 22
40-
Ww o- ? 10
Wz 3 18
pteltotoi ded da Tt 44 70 85 90 86 100 112 114 124 126 129 140
TRN (%)
2
34.
7.6 Comparacién del contenido de acidos grasos entre las cuatro especies de
Shigella tipificadas
Con los perfiles de los acidos grasos obtenidos para cada especie se procedié a
hacer su comparacién, graficando las areas y los tiempos de retencién de cada
pico por especie (figura 9). Analizando la comparacién de los acidos grasos
entre las 4 especies estudiadas se puede observar que la especie que
corresponde a Shigella boydii, presenté el mayor numero de valores altos en
los picos 10 (13.3623), 18 (9.7609), 21(1.25510) y 23 (2.92389), le siguié la cepa
Shigella flexneri que presenté valores de Area altos especificamente en los
picos 7 (22.7298), 17 (21.5479), 24 (13.7195), mientras que la cepa de Shigella
dysenteriae presenté solo dos valores altos en los picos 3 (11.0496), y 22
(2.23963) y Shigella sonnei también presento 2 valores altos en los picos 14
(26.8982) y 12 (16.7839).
tigura 9 Gomparacion de los perfiles de acidos grasos de S. dysenteriae,
AN (%) S. boydi, S. flexneri y S. sonnei.
120
100
80
| AY NY
60 N N Ny N N Nis NYE?
49 N NE N
20 ih N Al” N N N N NE i
0 * eS 7 ~
3 7 10 12 14 15 7 18 21 22 23 24
NUM, DE PICO
WM soysentariae QW sveysi 3S. texreri Ex S. sonne
35.
7.7 Comparacién del contenido de acidos grasos entre las 4 cepas de Shigella ambientales
En la figura 10 se presenta una comparaci6n entre las medias de las areas
normalizadas de los acidos grasos, de las cepas ambientales. Analizando esta
figura se puede observar que la cepa de Shigella 7 fue la que presenté mayor
numero de valores altos de areas en los acidos grasos: pico 10 (41.4296), pico
12(18.8951), pico 14(105.283), pico 18(10.7265). Le siguid la Shigella 8 con 3
valores altos en los acidos grasos, pico 7(17.8021), pico 17(31.7967), pico
24(11.1400), siguiéndole la cepa Shigella 5 en los acidos grasos
correspondientes a los pico 22(68.8264) y pico 23(4.2051) y solamente con un
valor alto la cepa de Shigella 6 en el pico 3 (11.847).
Figura 19 Comparacion de los pertiles de acidos grasos de fos afslamientos
AN (%) ambientales.
120
100.
80
60
40
20
RESTON TE
one
4 15 7 18 21 22 23 24 RUM. DE PICO
7 Gad S. boydii &
36.
7.8 Diferenciacidn entre las cepas tipificadas y las cepas ambientales
Para determinar si existian diferencias significativas, entre las 8 especies
estudiadas (4 cepas tipificadas y 4 cepas ambientales), con respecto a las areas
de los Acidos grasos, se procedié a aplicar un anialisis multivariado
discriminante, obteniéndose los siguientes resultados:
Funcion x’ P %
t 1648.93 0.0 56.471
2 eee 2, BOTS.A2 _ 0.0 80.05 __
Ambas funciones resultaron estadisticamente significativas (p < 0.05), la
primera funcién explicd el 56.47% de la variacion total de los datos y la
segunda el 23.58% ( 80.05 % - 56.47%), la primera funcién qued6 integrada
por el pico 12 y 22, la segunda quedé integrada por el pico 18 y 23, esto quiere
decir que estos picos fueron los que mas discriminaron a las especies.(ver
figuras 13-16).
Los resultados de la comparacién entre las 8 especies, utilizando las
distancias de Mahalanobis, mostraron que existen diferencias significativas
(p< 0.05), entre todas las especies (ver tabla 5, de distancias).
En la figura 12 se aprecia el diagrama de dispersién de las especies de
Shigella, en el cual se diferencian 4 grupos fundamentales, los cuales
corresponden a las 4 cepas tipificadas de Shigella mismas que conforman el
género Shigella, el grupo 1 pertenece a Shigella boydii(ATCC 8700), el grupo 2
a Shigella flexneri (B2194), el grupo 3 a Shigella dysenteriae (B2188), y el
grupo 4a shigella sonnei (B2199), de estos grupos es importante sefialar que el
grupo 1 (S. boydii), se diferencia mas de los otros grupos y de acuerdo con las
distancias de Mahalanobis se observa que el grupo I con respecto al 2 tiene
una distancia entre ellos de 75.38, el grupo 1 con respecto al 3 tiene una
distancia mayor con un valor de 81.16, y aun mas se aleja el grupo 1 del 4 con
un valor de 82.55, estas diferencias en las distancias se pueden justificar si se
toma en cuenta que estas cepas pertenecen a diferentes especies dentro del
género.
De los 3 grupos restantes, el grupo 3 y 4se encuentran a una distancia
entre ellos de 17.17, mientras que entre el grupo 2 y 3 existe una distancia de
49.43, y el grupo 2 del 4 se encuentra a una distancia de 28.14. Con esto es
claro que existen diferencias significativas que permiten el establecimiento de
los grupos fundamentales del género Shigella .
37,
Por otra parte los grupos del 5 al 8 que se aprecian en el diagrama de
dispersion, que corresponden a los aislamientos de Shigellas ambientales, de
acuerdo con las distancias de Mahalanobis y el diagrama de dispersién de las
especies de Shigella, se puede observar que el grupo 5 (Shigella 5), se acerca de
una manera mas marcada al grupo 3 con una distancia de 29.15 por lo que se
puede deducir que corresponde al grupo S. dysenteriae, esto se apoya en los
resultados obtenidos de las pruebas bioquimicas tradicionales, confirmando
que el grupo 5 corresponde a Shigella dysenteriae. En cuanto al grupo 6, se
encontré mas cercano al grupo 1 con un valor de 35.34 indicando con ello que
corresponde a Shigella boydii, lo cual también fue corroborando con las
pruebas bioquimicas. Con respecto a los grupos 7 y 8 se observa en el
diagrama de dispersién que ellos se localizan como un grupo un tanto apartado
de los 4 grupos basicos que representan a las cepas tipificadas, sin embargo al
grupo que mas se acercan es al | (S. boydii), con una distancia de 96.08 para el
grupo 7 y 61.63 respectivamente. Entre ellos la distancia fue pequefia de un
valor de 28.05. Tomando en cuenta estos valores ambos grupos se localizarian
dentro del grupo Shigella boydii para verificar esto se corrieron las pruebas
tradicionales que confirmaron que pertenecian a S. boydii, la distancias
existentes con respecto a S. boydii se pueden explicar si se considera que S.
boydii cuenta con 15 serotipos y estos 2 aislamientos pueden pertenecer a
cualquiera de ellos.
Tabla de Distancias de Mahalanobis de las 8 cepas de Shigella estudiadas
Especies grape 1 grupo2 grupo3 grupo4 grupo5 grupo6 grupo7 grupo8
grupo | 75.38 81.16 82.55 53.48 35.34 96.08 61.63
grupo 2 75.38 0 49.43 28.14 75.31 78.42 178.62 127.74
grupo3 81.16 49.43 0 ATA7 29.15 38.38 «226.17 177.29
grupo4d 82.55 28.14 17.17 0 45.65 38.26 192.98 149.74
grupoS 53.48 75.31 29.15 45.65 0 28.23. 174.7 131.27
grupo6 35.34 78.42 38.38 38.26 28.23 0 132.27 99.43
grupo7 96.08 178.62 226.17 19298 174.71 132.27 0 28.05
grupo8 61.63 127.74 177.29 149.74 131.23 99.43 _ 28.05 o-
Con los picos (12,18,22 y 23), que representan a los acidos grasos que
permitieron la diferenciacién entre las 4 especies tipificadas del género Shigella
se procedié a graficar cada uno de ellos. En la figura 13 se muestra la
comparacién del pico 12, (3 OH tetradecanoato), mostrando diferencias entre
las 4 cepas tipificadas siendo la de mayor valor S. sonnei y en cuanto a las
cepas ambientales, cabe destacar el comportamiento de las cepas 6 y 7 que
presentaron los valores mas altos incluso mas que las cepas tipificadas y ambas
38.
tiene valores muy cercanos (18.85,18.89), esto se puede explicar si se considera
que ambas pertenecen a la especie de S. boydii, mientras que los valores altos
pueden fundamentarse si se toma encuentra que segun Colin Ratledge (1996),
los 3 hidroxiacidos, tales como el 3 OH C14:0, forman parte de la estructura
del lipido A en algunas enterobacterias. Por otra parte el lipido A tiene
relacion con la toxigenicidad bacteriana y considerando que éstas cepas son
aisladas del ambiente pueden estar sintetizando un poco mas del hidroxiacido
con Ja finalidad de protegerse del medio.
Por otra parte en la figura 13, det pico 22 (C 18:1° metil trans octadecanoato),
(fig. 14), sus valores en cada cepa tanto tipificada como ambiental se
encuentran préximos, con excepcion de S. flexneri y S. sonnei en la cual el
valor es mas bajo en las cepas tipificadas, sin embargo a pesar de la
proximidad de sus valores, se encontraron diferencias significativas entre las
cepas tipificadas y ambientales. Las diferencias encontradas para los picos 12 y
22 permitieron la conformacién de la primera funcion diferencial.
La segunda funcion diferencial qued6 integrada por los picos 18 y 23. En el
pico 18 (C17:0 metil hepta decanoato, fig. 15), se aprecia que existen
diferencias claras.
De Jas 8 cepas estudiadas (tipificadas y ambientales), los valores mas
elevados los presenté S. beydii y en las cepas ambientales los valores mas bajos
los presenté las cepas 6 y 7.
En cuanto al pico 23 (C18:0 metil octadecanoato fig. 16), se observan las
diferencias claras entre todas las cepas destacandose con los valores mas altos
la cepa ambiental 5 y con los mas bajos S. sonnei y S. flexneri de las cepas
tipificadas
39.
Te g-G =sajequaiquie saioadsa ‘p-} =sepeoyidy saisedsea ,
} ugiouny
8 v 0 a
~ — oT ~ 7 g-
| | |
i
9-
, i |
I |
1 °o | \
: Lj - i v
oo : | |
oLt : I &
-
5 Bit | z
i ou 2 8)
: _o ° B 5 °
0
| \ ° rob LoD BIG
: Lk Lo c
| SE DL o i bg
1 rt 9 i - a
| 9 v i It
' |
——, a. ao
5 9
‘eyaBbius ap saisedsa g se] op uoisuedsip ap eweibeig GL einbig
Z ug}ouny
40.
Figura 13. Comparacién del pico 12 entre
cepas de referencia y ambientales.
% AN 20- =- MAG, + MAT
Ss
15-
Sd. maa”
10~ '
MAS
Sb .
sr s. j Sb- Shigetia boydil
: : Ste Shigetia tlexneri
' v Sd- Shigeiia dysenteriae
| st Ss- Shigelis sonnei
i MA- Muesira ambiental
o- ae a _ —_ - - __
Figura 14. Comparacién del pico 22 entre
cepas de referencia y ambientales.
% AN Bo- . -
MAS
70~ sa +
Sb , MAG MA? MAB
60° f . ” cee Tt é ~ é
§0- f “
i / Se
1 40: : ‘
sof é 8b- Shigella baydii :
st Ste Shigeila Hexnerit
20- Sd- Shigella dysenteriae
: Sa- Shigella aonne:
10- MA Muestra ambiental
oO: -— ~ - _- -
41.
Figura 16. Comparacién del pico 18 entre
cepas de referencia y ambientales.
% AN
12- ~ see - - nee
MAT MAB
Sb many
10;
MA6,
6-
i MAB,
4- - “ Sb- Shigella boydit
1 st Sa St- Shigetia flexneri
™ ee Sd- Shigeita dysentoriae
ar eo 8a S8- Shigelia sonnei
MA- Muestra ambentat
Figura 16, Comparacién del pico 23 entre
cepas de referencia y ambientales.
% AN 6- - io - - -
MAS
i 4°
.
MAG sb ! .
3 f .
: =. MAT
| Sd ; 7~
_
ae a . i Pe /
MAS
i és
1 ; Sb Shigelia boyai $s+ Shigella sonnet
: St- Shigella flexneri MaA- Muestra ambiental '
| Sd Shigeita dysenteriae ono Be we eee ee
42.
8 CONCLUSIONES
Del presente trabajo se puede concluir lo siguiente:
Se identificaron los 4 acidos grasos caracteristicos de la familia
Enterobacteriaceae, a !a cual pertenece el género Shigella, los ésteres de estos
acidos grasos son: C16:1° cis-hexadecanoato, C17:0A 9-10 heptadecanoato y el
C16:0 hexadecanoato confirmando con esto lo reportado en la literatura. Al
igual que en los otros miembros de la familia Enterobacteriaceaceae el C 16:0
de las cepas tipificadas siempre fue el mas abundante.
Se identificé el contenido de acidos grasos celulares de Shigella boydii,
Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei y de las 4 cepas aisladas
del ambiente, encontrandose 12 acidos grasos cuyos ésteres fueron, ef C12:0
metil dodecanoato, C14:0 metil tetradecanoato, C15:0 metil pentadecanoato, 3
OH C14:0 metil 3 hidroxi tetradecanoato, C16:1° metil cis 9 hexadecanoato,
C16:0 metil hexadecanoato, C17:0A metil cis 9-10 metilen hexadecanoato,
C17:0 metil heptadecanoato, C18:1° metil cis 9 octadecanoato, C18:1° metil
trans 9 octadecanoato, C18:0 metil octadecanoato, C19:0A metit cis 9-10
metilen octadecanoato Con el contenido de acidos grasos de cada especie tanto tipificadas como
ambientales se elaboro su perfil de acidos grasos . En la comparacién de los perfiles de los acidos grasos de las 4 especies
tipificadas se obtuvieron 4 acidos grasos que permitieron la diferenciacién
entre fas especies del género Shigella los ésteres de estos acidos fueron: 3-
hydroxitetradecanoato (pico 12, fig 13), trans 9-octadecanoato (pico22, fig.14),
heptadecanoato (pico18, fig. 15) y octadecanoato (pico23, fig. 16), mismos que
también establecieron diferencias entre las cepas ambientales de Shigella .
De la comparacién de Jos perfiles de Jas cepas de referencia contra las cepas ambientales se puede concluir que se encontraron diferencias
significativas entre ellas sin embargo la cepa del grupo 5 es la que presenté las
caracteristicas mas cercanas a S. disenteryaeae, concluyendo que pertenece a
esta especie apoyandonos en las pruebas bioquimicas tradicionales, Con
respecto a las restantes 3 cepas ambientales, 6, 7 y 8, estas coincidieron con
Shigella boydii \as cuales también se corroboraron por bioquimicas
tradicionales.
Con los perfiles individuales tanto de cepas de referencia como de cepas
ambientales se obtuvo el perfil definitive para el género Shigella spp (fig.9).
43,
También se incrementé el banco de datos ya existente en el laboratorio de
Bacteriologia y Cromatografia del proyecto de Conservacion y Mejoramiento
del Ambiente, incorporando los perfiles del género Shigella spp, y de las 4
especies, S. boydii, S. flexneri, S. sonnei y S. dysenteriae.
Por ultimo, como resultado de este estudio se pudo apreciar la
importancia que tiene la técnica de cromatografia de gases, para su uso como
una técnica rutinaria en la identificacién de bacterias mediante el contenido
de sus acidos grasos, la cual aunque de momento no pueda utilizarse como una
técnica alternativa a las tradicionales, es una técnica alternativa y/o
complementaria excelente, pues ademas de su precision es una técnica mas
rapida, ya que una vez obtenidos los perfiles bastara solo con 48 horas para la
identificacion de un microorganismo hasta especie, lo que con pruebas
bioquimicas puede requerir de 7 a 10 dias.
44.
9 RECOMENDACIONES
Para posteriores estudios se propone:
1) Realizar los perfiles de cepas ambientales, que pertenezcan a las especies de
Shigella sonnei y Shigella flexneri, con el fin de establecer el perfil definitivo
para cada especie.
2) Trabajar con muestras ambientales directas para aplicar la técnica como
alternativa y no como complementaria.
3) Elaborar una clave de identificacién con los perfiles estudiados que ya
existen en el banco de datos.
45.
10 BIBLIOGRAFIA
Abel K.D., Schmertzing H.S., Peterson J.I, 1963 “Clasification of
microorganisms by analysis or chemical composition Eeasibily of
utilizing gas chromatography”, J. Bacteriol. Vol.85: 1039-1044
Albert Veys, Walter Callewaert, Etienne Waelkens y Karel Van Den Abbeele,
(1989) “ Aplicatién of gas liquid chromatography to the rutine
identification of nonfermenting gram negative bacteria in clinical
specimens” J. Clin. Microbiol., Vol. 27 N°7, p. 1538-1542
Amstein C.F., and Hartman P.A., 1973, “Diferentiation of some Enterocci by
gas chromatography”, J. Bacteriol., Vol.133: 38-41
B. B@ E. and J. Gjerde, 1980,"Fatty acids patterns in the clasification of some
representatives of the families Enterobacteriaceaceae and
Vibrionaceae”, J. Gen. Microbiol., Vol.116: 41-49
Barry Cookson Himat Talsania, Susan Chinn, Jan Philips, 1989, “ A
qualitative and quantitative study of the streptococcus milleri. with
capillary gas chromatography”, J. Gen. Microbiol., Vol.135:831-838
Bergan Tom Patrick, A. D. Grimont, and Francine Grimont, 1983, “Fatty
acids of Serratia determined by gas chromatography”, C. Microbiol.
Vol. 8 7-11
Blanco Antonio, 1993”Quimica biologica”,4a edicién, Ed. Ateneo, Buenos
Aires Argentina, p 677
Brock D. Thomas, 1976, “Biologia de los microorganismos”, Ed Omega,
Barcelona Espaiia, p. 619
Béttger C. Erik, 1996, “Approaches for identification of microorganims”,
ASM News, Vol. 62 N° 5 p 247-250
Bousfield LJ., G.L. Smith, T.R. Dando, and G. Hobbs, 1983, “Numerical
analysis of total fatty acids profiles in the identification of coryneform,
Nocardioform and some ather bacteria”, J. Gen. Microbiol., Vol.129:
375-394
Buford L. Brian and Ear W. Gardner 1968, “Fatty acids from Vibrio cholerae
lipids”, J. infectus diasease, Vol. 118 p. 47-53
Burrows William, 1974,”Tratado de Microbiologia”, 20a, Ed. Interamericana,
Méx. D.F., p 901.
Chapman D., 1983, “Introduccién a los Lipidos”, ed. Alhambra,Madrid
Espaiia p 162.
Chou 8., P. Chedore, A. Haddad, N. R. Paul and Kasatiya, 1996, “Direc
identification of Mycobacterium species in Bactec 7H12B medium by
gas liquid chromatography”, J. Clin. Microbiol. Vol 34.N°5 : 1317-1320
46,
Christer Alvin, Lennart Larsson, Moges Magnusson, per Anders Mardh,
Géran Odham and Gunilla Westerdahl, 1983, “Determination of fatty
acids and carbohydrate monomers in micro-organims by means of glass
capillary gas chromatography analisis of Mycobacterium gordonae and
Mycobacterium scrofulaceum “, J. Gen. Microbiol., Vol.129: 401-405
Great Britain
Coloe P.J., Slattery J.F.,1986, “The cellular fatty acid composition of
Campilobacter species isolated from case of enteritis in man and
animals”, J. Vol.96:225-229
Conn E. Erik., P. K. Stumpf, 1976,”Bioquimica analitica”, 3a, Ed. Limusa,
Mex. D.F., p 357.
Canonica P. Francis, and Michael A. Pisano, 1988, “Gas liquid
chromatography analysis of fatty acid methylesters of Aeromonas
hydrophyla, Aeromonas sobria, and Aeromonas caviae”, J. clin.
Microbiol, Vol. 26 N° 4 p 681-685
Davinoff Frak, and Edward D. Korn, 1963, “The biosintesis of fatty acids in
de cellular slime mold, Dictyostelum discoideum”, J. biol. chem. vol. 238
N° 10 3210-3215
Dabrio M. V., 1973, “Cromatografia de gases”, Vol ly 2 ,Ed. Alhambra,
Espaiia, p 223
Divo Alejandro, 1990,”Microbiologia Médica”, 4a .Ed. Interamericana, Méx.
D.F., p 466
Departamento de Higiene e Inspeccién Microbiologica de los Alimentos,
Facultad Veterinaria de Leon Espajia, 1990,”Microbiologia de tos
alimentos”, Vol. 1, parte I, De. Acribia, Zaragosa Espaiia, p427
Eerola Erkki and Ollin Pekka Lehtonen, 1988,”Optimal data processing
procedure for automatic bacterial identification by gas chromatography
of celular fatty acids”, J. clin. Microbiol., Vol. 26 N° 9 p. 1745-1753
Freemand A. Bob, P. H. D., 1985, “Microbiologia de Burrows”22a edicién, De.
Interamericana, p 1180.
Guckert James B:, David B. Ringlelberg, David C. White, Richard S. Hanson
and Bonnie J. Bratina, 1991, “Membrane fatty acid as phenotypic
markers in the polyphasic taxonomy of methylotrophs within the
proteobacteria”, J. Gen. Microbiol. Vol, 137 2631-2641
Guy G. Orgambide, Rosetta N. Reusch, and Frank B. Dazzo, 1993
“Methoxilate fatty acids reported in Rhizobium isolates arise from
chemical alterations upon acid catalyzed transesterification
procedures”, J. bacteriol. Vol. 175 N° 15 p 4922-4926
Harold M. MeNair, 1981,°Cromatografia de gases”, Ed. Alhambra,
Washington D.C., p 90
Hidetoshi Okuyama,Shoji Sasaki, Shoichi Higasashi and Norio Murata,
1990,” A trans-unsaturated fatty acid in psichrophilic bacterium, Vibrio
sp. strin ABE-1”,J. bacteriol. Vol. 172 N° 6 3515-3518
Hobart H. Willard, Lynne L. Merritt, Jhon A. Dean, 1975, “Meétodes
intrumentales de analisis”, Ed. Compaiiia editorial continental, Méx. p
964
Hiusler j., Ricchter V., 1985, “A proceess of identification of micreorganisms
using chomatyrography”, US patent Application GB 2121434",
James A. T., A. J. P. Martin, 1952, “Gas liquid partition chromatography: the
separation and microestimation of volatile fatty acids from formic to
dodecanoic acid”, J. biochem_Vol.50 : 679-690
James A. T., Martin P.J., 1956, “Gas liquid chromatography: the separation
and identification of methyl esters of saturated and unsaturated acids
from formic acid to n-octadecanoico acid”, J. biochem Vol.63: 144-152
Jantzen Erik, Egil Knudsen and Randi Winsnes, 1982, “Fatty acids analysis
for diferentiation of Bordetella and Brucella especies”, Acta path.
Microbiol. inmunol. scand. sectB_Vol.90: 353-359
Jantzen Erik, Klaus Bryn and Kjell B@vre, 1974,"Gas chromatography of
bacterial whole cell methanolysates”, Acta path. Microbiol. Scand. sectb
Vol.82: 753-766
Jawetz Ernest M. D., 1989,”Microbiologia médica”, 13a, Ed. Manual
Moderno S.A. de C.V., p 618, Méx D.F.
Krieg R. Noel, John G. Holt 1984, “Bergeys Manual of Systematic
Bacteriology”, Vol. 1, Ed. Williams , Wilkins, Honng Kong, p 964.
Kaneda T., 1962, “Biosynthesis of branched chain fatty acids from Bacillus
subtillis ATCC 7059”, J. Biochem. Vol. 238 : 1222-1228
Lambert A. Mary, F. W. Hickman-Brenner, J. J. Farmer I}, and C. Wayne
Moss, 1983, “Diferentiation of Vibrionaceae species by their cellular
fatty acid composition”, J. systematic bacteriology Vol. 33 N° 4777-792
Lambert,M.A. and Moss,C.W. 1983. Composition of the effects of acid and
base hydrolyses on hydroxy and cyclopropane fatty acids in bacteria. J
Clin Microbiol Vol.18:1370-1377.
Lennart Larsson, Julio Jimenez, Anders Sonnenson, and Francois Portaels,
1989, “Two dimensional gas chromatography with electron capture
detection for the sensitive determination of specific Mycobacterial lipid
constituents”, J. Clin. Microbiol. Vol. 27 N° 10 p 2230-2233
Lesley Galbrairth, and Stephen G. Wilkinson, 1991, “Polar lipids and fatty
acids of Pseudomonas pickettii”, J. gen. Microbiol.Vol. 137 : 197-202
48.
Luquin M., F. Lopez, and V. Ausina, 1989 “Capillary gas chromatographic
analysis of mycolic acid and alcohols of Mycobacterium xenopi”, J. Clin.
Microbiol. Vol. 27 N° 6 1403-1406
Lynn P. Wallace, Dannie G. Hollins, Robert E. Weaver and C. Wayne Moss
1988, “Cellular fatty acid composition of Kingella species,
Cardiobacterium hominis, and Eikinella corrodens”, J. Clin. Microbiol.
Vol. 26 N° 8 p 1592-1594
Macfaddin Jean F., 1993, “Pruebas bioquimicas de importacia clinica”, 2a,
Ed. Interamericana, Méx. D.F., p 301
Mayberry, W. R., 1981. Dihydroxy and Monohydroxy Fatty Acids in
Legionella pneumoniae. J. Bacteriol, Vol. 147 N°. 2 : 373-381.
Mazur Abraham, Benjamin Harrow, 1973; “Bioquimica basica”, 10a, Ed.
Interamericana ,Méx. D.F.
Monteoliva Mercedes Sanchez, M. Rita Ferrer, Alberto Ramos Cormenzana,
Emilia Quezada y Miguel Monteoliva, 1988, “Celullar Fatty acid
composition of Deleya halophila: efect of growth temperature and salt
concentration” J. gen. Microbiology, Vol. 134 199-203
Moss C. Wayne, S. B. Dees, and G. O. Guerrant, 1980, “Gas liquid
chomatography of bacterial fatty acids with a fused silica capillary
colum” J. Clin Microbiol. Vol. 15 p 308-311
Moss W. C., and Lambert-Fair M. A., “Location of double bonds in
monounsatured fatty acids of Campylobacter eryaerophila with
Dimethyl Disulfide Derivatives and combined gas chromatography-mass
spectrometry”, J. Clin. Microbiol. Vol. 27 N° 7, 1467-1470
Murray R. Patric, Ellen Jo. Baron, Michael A. Pfaller, Fred C. Tenover,
Robert H. Yolken, 1995, “Manual of clinical Microbiology”, 6a ed., Ed.
ASM Press, Washinton D.C., p 1452
Pelczar Michael J., 1981, “Elementos de microbiologia”, De. McGraw-
Hill,Méx. D.F., p 741
Philipp Gerhard, 1994, “Methods for general and Molecular bacteriology”,
Ed. American Society for Microbiology, p 1358
Robinson W. James, 1974, “Principios de analisis instrumental”, Ed. Acribia,
Zaragoza Espaiia, p 364
Schmid H. George, 1987, “Quimica biologica”, Ed. Interamericana
McGrawhill, Méx. D.F., p 800
Secretaria de Salud, 1997, “Vigilancia epidemiolégica”, Boletin semana! de
Epidemioldgia, Vol. 14 N° 46 Sem. 46.
Shantha N.C., Guillermo E. Napolitano, 1992, “Review gas chromatography
of fatty acids”, J. of Chromatography, Vol.624 : 37-51
ESTA TESIS NO 9 “ SAUR fo of ud
Srinivas Alugupalli, Francoise portaels,and Lennart Larsson, 1994,
“Sistematic study of the 3hidroxy fatty acids composition of
Mycobacteria”, J. bacteriol., Vol 176, N° 10 p 2962-2969
Stewart Goodwin C., William McConnell, Ross K. McCulloch, Chery
MacCullougn, Richard Hill, Metinda A. Bronsdon y Gerhard Kasper,
1989,”Cellular fatty acid composition of Campylobacter pylori from
primates and ferrets compared with those of other Campylobacter”, J.
Clin. Microbiol. Vol. 27 N° 5 p 938-943
Storch de Gracia y Asencio J. M., 1975,”Fundamentos de cromatografia”, Ed.
Alhambra, p 204.
Stuart J. Baum, 1981, “Introduccién a la quimica organica y biologica”, Ed.
Continental Méx. D.F., p 385
Veys,A., Clallenaert,W., Waelkens,E. and Abbeele,K.V. 1989. Application of
gas-liquid chromatography to the routine identification of nonfermenting
Gram-negative bacteria in clinical specimens J Clin Microbiol
Vol.7:1538-1542.
50.
11 GLOSARIO
ATCC American Type Colection Culture, es un jugar de cultivos
microbianos de referencia en los Estados Unidos de Norte America.
API 20 grupo de 20 pruebas bioquimicas basicas, para la identificacién de
Enterobacterias
Citrato de Simons prueba bioquimica, donde se observa Ia utilizacion del
citrato como fuente de carbono, para el crecimiento bacteriano.
CGL Cromatografia gas liquido
CGS Cromatografia gas sélido
Dextrosa caldo de cultivo de identificacion bioquimica, donde se observa la
fermentacién con produccién de gas de los microorganismos en estudio.
EM Espectrometria de masas
INDRE. Instituto Nacional de Diagnostico y Referencia Epidemioldgica,
lugar donde se pueden conseguir cepas de referencia cultivadas e
identificadas perfectamente por expertos.
Manitol caldo de cultivo de identificacion bioquimica, donde se observa la
fermentacién con produccién de gas, del azicar por los
microorganismos
Mac Conkey medio de cultivo, para el aislamiento de Enterobacterias.
MIO medio de cultivo de identificacién microbiana que nos permite detectar,
movilidad, produccién de indol y ornitina.
Sacarosa caldo de cultivo de identificacion microbiana, donde se observa la
fermentacion de este azucar con produccién de gas.
S. S. agar para aislamiento de Salmonella y Shigella
Selenito caldo de enriquecimiento, para el crecimiento de Salmonella y
Shigella
Tetrationato caldo para el enriquecimiento de Shigellas.
Tergitol 7 agar para el aislamiento de Shigellas.
Urea caldo de cultivo para identificacién microbiana.
XLD agar para aislamiento de Shigellas compuesto por Xilosa Lisina y
Desoxicolato.
Sl.
ya deg ueseard
“ON 'VASULVA
sir ese 1 areowedenr sou
Dok Daper
s.ecua sapere: 41512 g ajenuaaoper20- 5 -suen
s1equaIapCige 6-59 awouarpe3apen20 2 4'6-519 ajeouesaperaysxorPAn:-Z
Byeaue wpeIday areoueoaper ayaurpAuiaUs-Ot 6-52
BIEOLEDOPEKaLIAUIAW GL aigouesaperay
aleovanaprxay: 6° S12 ayeoursapeadiAuiew-# L meouesapenardxospay-E aleoLe sapesiarAxoupay-z
areourzapeiuad areouerapenanayiew- <1 aipoverapenayaurear ft
dleoues3pen7" ayeauesapoparaupay-E ayequea2popAroipAy-Z
ayeoue29pul ayeoue2apop
ayeouerapAxouDAy-Z aleoue2apun
AW
ow aw ow OW
103
cay oie ees ras
aoz 92 yegue a ay ta
Det Se cu ep sorte mdurg Ss OL ER HS Ts "O D0RL Heed WA De post tak
see gop ae 3aO6E BH YaUL T.OGL HE ww 7 ROL Wn WEG L eB is SH AES PD
Oat ee >» ont 3 Aurea 2240's Pas >. BSS
cand AST. SHPAIUL MIY OHMEHGL OD
wen eee mom oF BD
we a
ut
0 bL HO: OpLHo-z
ome
Ot ose ogi Ort
OZLHO'S iy
0 ZL HO-Z og oz
O01 HO-Z Git
101 05 12) Wor Aven ACU Sas Mead BANciay AIUO UONFIYNUaP! aAMeTKERD 103
ayeosdea jAyjaus Ui S195Sa |AYTO Ws U4, Bwo | 40 e107 @ SUIE]UOS Bin x1 suk
pibb ON Eoreted
XI ..dd $10383 [AWA ploy 121393988
Janporg FA InOgY UONEwioju) TELIadUN, SUrEIVOD H
LLEBHS VLVO SIHL AVS.