Centro de Investigación y Desarrollo de Tecnología de Alimentos

Estandarización de un Método para Determinar Benzoato de Sodio y Sorbato de Potasio en Jugos de Frutas por HPLC

Juana Betty MENACHO Universidad Autónoma “Gabriel René Moreno”. Centro de Investigación y Desarrollo de Tecnología de Alimentos (CIDTA). Km 71/2 Carretera al Norte. Santa Cruz-Bolivia, 2006.

La determinación de Benzoato de Sodio y Sorbato de potasio ha sido realizada en Cromatógrafo líquido (HPLC), marca Shimadzu, Serie 10A vp, utilizando columna Shim-pack CLC-ODS, longitud = 15 cm y detector UV, bajo un sistema Isocrático. Las condiciones de trabajo para realizar la cuantificación de los conservantes fueron: Fase móvil una mezcla de Metanol:acetonitrilo:Acido cítrico 5 mM (estabilizada a un pH de 4) en una proporción de 1:2:7, Flujo 1 ml/min, Temperatura del horrno de la columna 45 oC, Presión de trabajo de 81 kgf/cm2, Longitud de onda: 230 nm. El Volumen inyectado: 20 l y Blanco solvente:Agua desionizada. El tratamiento de datos fue realizado en C-R5A CHROMATOPAC, filo 0, método 41. Las curvas patrones de benzoato de sodio y sorbato de potasio reflejaron buenos coeficientes de correlación, obteniéndose valores de R2= 0.9968 y 0,9995 respectivamente, lo cual demuestra que existe buena proporción respecto a las concentraciones de estudio. Se dosificaron muestras de jugo de limón con 300 mg/l para realizar la cuantificación de las mismas y se obtuvieron buenos porcentajes de recuperación respecto al valor teórico de dosificación de las mismas.

Introducción Los conservantes, sustancias químicas de conservación destinados a inhibir y controlar el crecimiento de microorganismos en los alimentos, es un pauta esencial de los procesos de producción y necesarios, no sólo para evitar la acción microbiana, sino también para establecer buenos sistemas de producción y evitar las pérdidas que sobre proceso o consumo se produce en los alimentos y que por su composición, permiten la proliferación del crecimiento bacteriano. La regulación de estos, cada día está mas controlada debido a que se establecen criterios de calidad sobre los productos que se compran, condiciones de dosificación y reacciones patológicas. Los conservantes alimentarios, mas usados son el Acido Benzoico y Acido Sorbico y sus respectivas sales (por ser mas solubles), utilizados en toda clases de alimentos, estos se encuentran también presentes en forma natural en algunos vegetales. Existen pues razones poderosas para el control de los conservantes, los organismos oficiales correspondientes, a la hora de autorizar el uso de un determinado aditivo tienen en cuenta que éste sea un auxiliar del procesado correcto de los alimentos y no un agente para enmascarar unas condiciones de manipulación sanitaria o tecnológicamente deficientes, ni un sistema para defraudar al consumidor engañándole respecto a la frescura real de un alimento. El objetivo del presente trabajo es la Estandarizadión de un método analítico para determinar Sorbato de potasio y Benzoato de sodio en jugos de frutas por Cromatografía Líquida de Alta Resolución.

Materiales y Método Sustancia de referencia Benzoato de sodio: E211 Fórmula: C6H5COONa No de CAS: 532-32-1 Peso Molecular: 144.11 Pureza: 99.0 – 100.5 %

Sorbato de Potasio: E202 Fórmula: CH3CH:CHCH:CHCOOK No de CAS: 24634-61-5 Peso Molecular: 150.22 Pureza: mayor a 99 %. Sustancias de ensayos. Muestras de jugo de limón lista para diluir y cuantificar, jugo de limón natural para preparar la muestra y jugo de limón dosificadas con sorbato de potasio y benzoato de sodio a 300 mg/l. Reactivos y solventes (Calidad HPLC). Metanol grado HPLC ( 99,9%), Acetonitrilo grado HPLC (99,9%), Acido cítrico p.a. (99.5%), citrato de sodio p.a.(99.8%), Hexacionaferrato de potasio (II) Trihidratado (99%, M=422.41), Sulfato de Zinc heptahidratado (98%, M=287.55), Agua calidad desionizada (0,06 us) Condiciones de Medida(.2). Las condiciones de trabajo en HPLC para realizar la cuantificación de los conservantes fueron: Fase móvil una mezcla de Metanol:acetonitrilo:Acido cítrico 5 mM (estabilizada a un pH de 4) en una proporción de 1:2:7, Flujo 1 ml/min, Temperatura del horrno de la columna 45 oC, Presión de trabajo de 82 kgf/cm2, Longitud de onda: 230 nm. El Volumen inyectado: 20 l y Blanco solvente:Agua desionizada. Preparación de soluciones para la curva patrón y cuantificación. Mezcla de soluciones madres de Benzoato de sodio y Sorbato de potasio son preparadas pesando alrededor de 0,015 g de cada uno y enrasando con agua destilada a un volumen de 50 ml. Estas soluciones contienen 300 mg de conservante por litro de solución. Se preparon diluciones destinadas al establecimiento de la curva patrón en las siguientes concentraciones:15, 30, 60 y 180 mg/ml. Muestras de ensayo. Las muestras analizadas fueron jugo de limón (A y B) pertenecientes al primer Ensayo Interlaboratorio en Conservadores en bebidas analcoholicas del Instituto Nacional de Tecnología Industrial (INTI), además de muestras preparadas por el Centro de Investigación y desarrollo de Tecnología de Alimentos (CIDTA), las mismas que fueron dosificadas con los conservantes en estudio en una concentración de 300 mg/l.

CIDTA

Preparación de las muestras y Extracción del conservante. Como la muestra A es una muestra de jugo de limón ya preparada esta fue diluida e inyectada directamente en HPLC. Tanto la muestra B como la muestra dosificada en CIDTA, fueron preparadas de la siguiente manera: Se peso entre 1,5 a 10 g de jugo de limón se disolvieron con 20 ml de agua destilada y se llevó a baño de agua a 60°C por 30 minutos. Se enfrió y se adicionó 10 ml de reactivo Carrez I y 10 ml de reactivo Carrez II sucesivamnete, enrasasando luego a un volumen de 100 ml. La muestra fue filtrada a través de papel filtro y luego en filtros de 0,45 um para inyectar en HPLC. Cálculo de la concentración en la muestra. La concentración de cada conservante en las muestras es determinada a través de la curva patrón pasada en el curso de la misma secuencia de inyección, aplicando la siguiente formula:

Conc. de Conserv. (mg/kg) = DilPV

M

FExtrCVitC ..

Donde:

C vit. C extr. = Concentración de Benzoato ó Sorbato en la muestra obtenida con la curva patrón (g/ml)

VF = Volumen final al que se diluye la muestra (ml)

PM = Masa tomada para el ensayo (g) Dil = Factor de dilución (si lo hubiese)

Resultados y Discusión Cuantificación de los conservantes en las muestras Según las condiciones de medida, la curva patrón de Benzoato de sodio y = 71842x + 531152C con R2 = 0.9968, y Sorbato de potasio y = 51630x + 217646C nos muestran valores de coeficiente de determinación (R2) superior al valor de referencia (0.996) (ver cuadro N°1 y cuadro Nº2), además la buena resolución del pico cromatográfico (fig.1) con tiempo de retención de 11,2 y 13,1 min para Benzoato y Sorbato. nos aseguran que para el rango lineal establecido (15 – 300 mg/l) existe una respuesta proporcional de las áreas calculadas respectos a las concentraciones de estudio. Según las muestras dosificadas con soluciones de benzoato y sorbato ambas en concentraciones de 300 mg/l se observaron buenos porcentajes de recuperación respecto al valor de osificación (ver cuadro Nº 1 y 2), además de la buena resolución de los picos cromatográficos donde se observa claramente la presencia de benzoato de sodio y sorbato de potasio en los tiempos de retención mencionados anteriormente (Ver fig. 2).

Fig. 1. Cromatogramas de Benzoato de sodio y sorbato de potasio presentes en la curva patrón. Cuadro N°1. Establecimiento de la curva patrón de Benzoato de sodio y cuantificación de las muestras dosificadas. ENSAYO INTERLABORATORIO Nº1 (CONSERVANTES EN JUGOS)PRODUCTO: Benzoato de sodio FECHA: 14-09-06INSTRUMENTO DE MEDIDA: HPLC SHIMADZU Serie 10A vpColumna: Tipo: Shim-pack CLC-ODS (C18) Longitud (cm): 15Fase móvil: Metanol:Acetonitrilo:Acido Citrico 5mM (pH:4,01) (Estabilizado con citrato de sodio)

Proporción : 1:2:7Presión (Kg/cm2): 81 Bomba A Flujo (ml/min): 1,0

Detector: UV: longitud de onda (nm): 230Inyección: T(°C): 45 Volumen inyectado (ul): 20Tiempo de retención (min): 11,2Tratamiento de datos: file 0, C-R5A CHROMATOPACSOLVENTE: Agua desionizada

CONCENTRACIONES DE TRABAJO Ref. R² = 0,9968 0,996

Conc.(ug/ml) Superficie Conc.real Respuesta Ordenada Origen = 531152(ug/ml) (%) Pendiente = 71842

15,062 1381919 11,842 78,6%15,062 1354537 11,461 76,1%30,124 2432208 26,461 87,8%30,124 2436562 26,522 88,0%60,249 5094545 63,520 105,4%60,249 5058386 63,016 104,6%

180,747 14443956 193,657 107,1%180,747 14059478 188,306 104,2%301,245 21570345 292,852 97,2%301,245 21883872 297,216 98,7%

Muestras Superficie Conc.real Conc. Conc. Promedio (ug/ml) (mg/kg) (mg/100g) (mg/kg)

Jugo A-14 (4) 3585356 42,51 678,25 67,82Jugo A-14 (5) 5742012 72,53 691,94 69,19Jugo A-14 (6) 7803865 101,23 713,44 71,34Jugo B-12 (4) 14870339 199,59 475,52 47,55Jugo B-12 (5) 13874009 185,72 463,34 46,33Jugo B-12 (6) 13218929 176,61 440,72 44,07Blanco matriz 0 -7,39 -18,41 -1,84 Recuperación %

Limón -1 (sin tx) 5424949 68,12 170,15 17,02 113,4Limón -2 (sin tx) 4810764 59,57 148,70 14,87 99,1Limón -1 (con tx) 2100148 21,84 144,70 14,47 96,4Limón -2 (con tx) 1929274 19,46 129,61 12,96 86,3

459,86

Peso muestra (g)

1,5670

10,493310,021010,0180

694,542,62063,5473

10,0408

15,0154

10,014915,0933

10,0084

y = 71842x + 531152R2 = 0,9968

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

0 100 200 300 400

Fuente: Elaboración propia en base a datos experimentales

Fig. 2 Cromatogramas de la muestra A de jugo de limón. Cuadro N°2. Establecimiento de la curva patrón de Sorbato de potasio y cuantificación de las muestras dosificadas. ENSAYO INTERLABORATORIO Nº1 (CONSERVANTES EN JUGOS)PRODUCTO: Sorbato de potasio FECHA: 14-09-06INSTRUMENTO DE MEDIDA: HPLC SHIMADZU Serie 10A vpColumna: Tipo: Shim-pack CLC-ODS (C18) Longitud (cm): 15Fase móvil: Metanol:Acetonitrilo:Acido Citrico 5mM (pH:4,01) (Estabilizado con citrato de sodio)

Proporción : 1:2:7Presión (Kg/cm2): 81 Bomba A Flujo (ml/min): 1,0

Detector: UV: longitud de onda (nm): 230Inyección: T(°C): 45 Volumen inyectado (ul): 20Tiempo de retención (min): 13,1Tratamiento de datos: file 0, C-R5A CHROMATOPACSOLVENTE: Agua desionizada

CONCENTRACIONES DE TRABAJO Ref. R² = 0,9995 0,996

Conc.(ug/ml) Superficie Conc.real Respuesta Ordenada Origen = 219064(ug/ml) (%) Pendiente = 51706

15,345 867507 12,541 81,7%15,345 938615 13,916 90,7%30,690 1828069 31,119 101,4%30,690 1821082 30,983 101,0%61,380 3434926 62,196 101,3%61,380 3468480 62,844 102,4%184,14 9822884 185,740 100,9%184,14 9857407 186,408 101,2%306,90 16232185 309,698 100,9%306,90 15806507 301,465 98,2%

Muestras Superficie Conc.real Conc. Conc. Promedio (ug/ml) (mg/kg) (mg/100g) (mg/kg)

Jugo A-14 (4) 799552 11,23 179,11 17,91Jugo A-14 (5) 1074110 16,54 157,76 15,78Jugo A-14 (6) 1472833 24,25 170,89 17,09Jugo B-12 (4) 1191183 18,80 44,79 4,48Jugo B-12 (5) 1155345 18,11 45,17 4,52Jugo B-12 (6) 1073417 16,52 41,23 4,12Blanco matriz 1056666 16,20 40,33 4,03 Recuperación %

Limón -1 (sin tx) 3267966 58,97 147,29 14,73 98,2Limón -2 (sin tx) 3552607 64,47 160,94 16,09 107,3Limón -1 (con tx) 1366820 22,20 147,07 14,71 98,1Limón -2 (con tx) 1484679 24,48 163,01 16,30 108,7

10,0408

15,0154

10,014915,0933

10,0084

43,73

Peso muestra (g)

1,5670

10,493310,021010,0180

169,252,62063,5473

y = 51706x + 219064R2 = 0,9995

02000000400000060000008000000

1000000012000000140000001600000018000000

0,000 100,000 200,000 300,000 400,000

Fuente: elaboración propia en base a datos experimentales

Conclusión La cuantificación de los conservantes por esta metodología ofrece buenos porcentajes de recuperación en relación al valor de dosificación de las muestras los cuales revelan un porcentaje de recuperación entre 90 a 109%. Se obtuvieron buenas resoluciones de los picos cromatográficos tanto para la curva patrón como para las muestras analizadas. Las curvas de calibración de Benzoato de sodio y Sorbato de potasio reflejaron buenos coeficientes de correlación para las concentraciones en estudio obteniéndose coeficientes de 0,9968 y 0,9995 respectivamente, además hubo buena repetibilidad de las áreas obtenidas de una misma concentración. Se pudo comparar resultados de muestras analizadas (muestra dosificada) con tratamiento y sin tratamiento donde se obtuvieron porcentajes de recuperación similares. Por tal motivo la estandarización de la presente metodología permite determinar el contenido de conservantes tanto de Benzoato de sodio como Sorbato de potasio presentes en muestras de jugos de frutas y bebidas analcoholicas.

Referencias

1. Manual de Amálisis Fisico-Químicos de Alimentos, Agua y

Suelos. Ministerio de Salud. Instituto de Salud Pública de Chile Subdepartamento Laboratorios del Ambiente. 1998.

2. Methods of Análisis in Health Science, 2005. pag. 301-306.

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